Diagnóstico Genético Prenatal

Defectos CongénitosFrecuencia: 3% de los Recién Nacidos Vivos

. Genéticos: . Cromosómico . Monogénico

. Poligénicos o Multifactoriales

. Ambientales: . Agentes Físicos. Agentes

Biológicos . Agentes Químicos

. Aún Desconocidos

Defectos CongénitosAgentes ambientales -Teratología

Un teratógeno es un agente ambiental (droga o

químico, radiación, infección, etc.) que interfiere

con el desarrollo normal del embrión o feto y

que da como resultado la pérdida de embarazo,

malformaciones, restricción del crecimiento

intrauterino (RCIU) o cambios conductuales en

el recién nacido.

Factores ambientales

Anomalías de origen ambiental

• Agentes físicos: Radiaciones ionizantes

• Agentes químicos: Alcohol

Medicamentos

Exposición laboral

• Agentes biológicos: Citomegalovirus (CMV)

Toxoplasmosis

Rubeola

Parvovirus B19

• Métodos no invasivos

• Métodos invasivos

• Diagnóstico Genético de Pre-implantación (PGD)

Clasificación del diagnóstico prenatal

En el feto

En el embrión previo a la implantación

• El screening es un método que aplicado a nivel masivo

evalúa riesgos individuales. Un screening positivo indica

que el paciente tiene riesgo elevado para la enfermedad

buscada, y que por lo tanto se podría beneficiar con un

procedimiento diagnóstico más preciso como la

amniocentesis o la aspiración de vellosidades coriónicas.

• Actualmente el screening prenatal de anomalías de

cromosomas incluye la edad materna y los antecedentes

reproductivos, análisis bioquímicos en sangre de la madre

y datos de la ecografía (ej.: translucencia nucal).

Tendencia actual: screening a todas las embarazadas que deseen realizar algún tipo de estudio

• Imágenes - Ecografía (2D, 3D, 4D)

- Doppler

- Resonancia Magnética

- Tomografía Computada Helicoidal

• Marcadores bioquímicos en sangre materna

• Ácidos nucleicos fetales en sangre materna

Métodos No Invasivos de Diagnóstico Prenatal

Translucencia Nucal y Hueso Nasal

Feto de 12 semanas con hueso nasal presente (flecha corta) y translucencia nucal de 1,9 mm (flecha larga).Interpretación: bajo riesgo para anomalías de cromosomas.

Translucencia Nucal (TN) y Hueso Nasal (HN)

Feto de 12 semanas con HN presente y TN de 1,2 mm. Bajo riesgo para anomalías de cromosomas

Feto de 12 semanas con HN ausente (flecha) y TN de 8 mm (*). Alto riesgo para anomalías de cromosomas. Luego del asesormiento se realizo aspiración de vellosidades coriónicas.Cariotipo: 47,XY,+21

*

Ácidos nucleicos libres en sangre materna

•ADN y ARN

•Real-time PCR

•A partir de la 6ta semana de amenorrea

•Permite identificar secuencias no presentes en la madre

• Factor Rh del feto en madres Rh negativas sensibilizadas

• Sexo fetal (enfermedades ligadas al X)

• Mutaciones paternas: dominantes y recesivas

•Se podría realizar diagnóstico prenatal de anomalías de cromosomas

Seguimiento de la paciente Rh negativa sensibilizada

Curva de Amplificación

Rh neg

Rh pos

ADN fetal libre en sangre materna

AMNIOCENTESISAMNIOCENTESIS

PUNCIÓN DE PUNCIÓN DE VELLOSIDADES VELLOSIDADES

CORIÓNICASCORIÓNICAS

CORDOCENTESISCORDOCENTESIS

OTROSOTROS

Métodos Invasivos de Diagnóstico Prenatal

Aspiración de vellosidades coriónicas

Amniocentesis

Cordocentesis

Cariotipo fetalIdentifica enfermos

Respuesta definitiva

MUESTRA: Cualquier tejido con células nucleadas que estén en división celular

Laboratorio en diagnóstico prenatal

Citogenética clásica

Citogenética molecular (FISH)

Análisis bioquímicos

Análisis moleculares

PCR

Real-time PCR

QF-PCR

CGH

Microarrays

Cariotipo con bandeo G: 46,XY

Metafase Cariotipo

Trisomía 21: 47,XX,+21

• tienen poca disponibilidad

• tienen un costo elevado

• presentan riesgos fetales

Métodos Invasivos de Diagnóstico Prenatal

Tienen certeza, pero ...

Indicaciones Principales de Diagnóstico Prenatal Invasivo

• Edad materna avanzada

• Hijo previo con anomalía de cromosomas

• Padres portadores de rearreglos cromosómicos

• Detección ecográfica de una malformación

• Riesgo elevado por screening prenatal

• Obtención de material para análisis de ADN

Aspiración de Vellosidades

coriónicasAmniocentesis Cordocentesis

Edad gestacional

a partir de las 11 semanas

A partir de las 16 semanas

A partir de las 18 semanas

Tiempo para el resultado

7 días 21 días 5 a 10 días

Riesgos de pérdida de embarazo

0,5%-1% 0,3%-1% 2%-3%

Certeza 99,5% 99,9% 99,9%

Características de los estudios de cariotipo prenatal

Mosaicismo en Vellosidades Coriónicas

Presencia de más de una línea celular, con distintos cariotipos, en

el tejido estudiado.

46,XY46,XY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

EMBRIÓNEMBRIÓN PLACENTAPLACENTA

46 46 XYXY46 46

XYXY46 46 XYXY

46 46 XYXY46 46

XYXY46 46 XYXY

46 46 XYXY

46 46 XYXY46 46

XYXY46 46 XYXY

46 46 XYXY

46,XY46,XY 45,X45,X

46 46 XYXY

46 46 XYXY

46 46 XYXY

46 46 XYXY

46 46 XYXY

46 46 XYXY

46 46 XYXY

46 46 XYXY

46,XY46,XY

45 45 XX

46 46 XYXY

46 46 XYXY

46 46 XYXY

46 46 XYXY

46 46 XYXY

46 46 XYXY

46 46 XYXY

46 46 XYXY

46 46 XYXY

46 46 XYXY

46 46 XYXY

46 46 XYXY

46 46 XYXY

46 46 XYXY

46 46 XYXY

45 45 XX

45 45 XX

45 45 XX

45 45 XX

45 45 XX

45 45 XX

46 46 XYXY

46 46 XYXY

46 46 XYXY

Error mitótico Error mitótico postcigóticopostcigótico 45,X/46,XX45,X/46,XX

Mosaicismo Confinado a la Placenta

Mosaicismo Confinado a la Placenta

47,XY,+247,XY,+2

4477

4477

4477

4477

44

77

44

7744

7744

7744

66

44

66

44

7744

77

EMBRIÓNEMBRIÓN PLACENTAPLACENTA

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY44

6 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

46 ,XY46 ,XY 46, XY46, XY 47, XY,+247, XY,+2

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

46 ,XY46 ,XY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

Error meiótico y Error meiótico y rescate trisómicorescate trisómico

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

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44

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47474747

4747

4747

46,XY/47,XY,+246,XY/47,XY,+2

Mosaicismo placentario y fetal

47,XY,+2147,XY,+21

4477

4477

4477

4477

44

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44

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66

44

66

44

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EMBRIÓNEMBRIÓN PLACENTAPLACENTA

446 6 XXYY44

6 6 XXYY

446 6 XXYY44

6 6 XXYY

446 6 XXYY

46 ,XY46 ,XY 46, XY46, XY 47, XY,+2147, XY,+21

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

46 ,XY46 ,XY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

Error meióticoError meiótico

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

446 6 XXYY

44

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7744

7744

77

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44

7744

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47474747

4747

4747

46,XY/47,XY,+2146,XY/47,XY,+21

47, XY,+2147, XY,+21

44

77

44

7744

77 44

7744

77 44

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77

MOSAICISMO en Vellosidades Coriónicas

Implicancia clínica

•Cromosoma involucrado

•Causa por la que se realizó el estudio prenatal

•Ecografía fetal normal o patológica

•¿Qué hacer?

•Amniocentesis: cariotipo y FISH

FISH en diagnóstico prenatal

• Mosaicismo de trisomía 21 en

vellosidades coriónicas.

• Amniocentesis + FISH: en células

de líquido amniótico se observan 3

señales rojas que indican que hay

3 cromosomas 21 y 2 señales

verdes que indican que hay 2

cromosomas 13.

• Diagnóstico final: trisomía 21

FISH en diagnóstico prenatal

Ventajas

• No necesita cultivo celular

• Se pueden analizar

muchas células (>100)

• Resultados en 24-48hs

Desventajas

• Menor exactitud que el

cariotipo convencional

• Alto costo

En diagnóstico prenatal

Detecta TRISOMÍASMONOSOMÍASTRIPLOIDÍAS

• SENSIBILIDAD 95,65 % 99,2 – 100 %

• ESPECIFICIDAD 99,97 %

QF – PCRQuantitative Fluorescence Polymerase Chain Reaction

Amplifica selectivamente secuencias del ADN

Determina el número de copias de una secuencia determinada de ADN

ADN extraído de células NO cultivadas de Vellosidades Coriónicas o Líquido Amniótico

Amplificar regiones de ADN (marcadores polimórficos) específicos de cromosoma (13, 18, 21, X, Y)

Computadora mide la intensidad de la señal fluorescente: determina cantidad de copias

QF – PCRQuantitative Fluorescence Polymerase Chain Reaction

La amplificación de los marcadores genera un producto fluorescente que es directamente proporcional a la cantidad de secuencia target en la muestra inicial

Evaluar simultáneamente hasta 15 STR de loci preseleccionados de ciertos cromosomas

QF – PCRQuantitative Fluorescence Polymerase Chain Reaction

QF – PCRResultado

Resultado: valor numérico correspondiente al área y altura de los picos

En normales heterocigotas para el STR, la misma cantidad de fluorescencia se genera por ambos alelos.

TRISOMÍA:

3 PICOS

2 PICOS DISTINTOS

Tener por lo menos 2 marcadores informativos por cromosoma

VENTAJAS

Resultado RÁPIDO de anomalías cromosómicas numéricas:

Detecta TRIPLOIDÍA

Detecta MOSAICISMO 20 – 30 %

Lectura computarizada

Automatización

Puede amplificar en forma simultánea aproximadamente 15 loci

QF – PCR

VENTAJAS

Mejor que cariotipo convencional y FISH en detectar contaminación materna celular

Procesa muestras simultáneamente

Menor costo

QF – PCR

EUPLOIDE: 46,XX

TRISOMÍA 21

Otras técnicas moleculares aplicadas al diagnóstico prenatal

• MLPA: Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification

• ARRAY – CGH: Array comparative genomic hybridization

MLPAMultiplex Ligation-Dependent Probe

Amplification

VENTAJAS

• Mejor que secuenciación en que detecta deleciones y duplicaciones de exones completos

• Mejor que FISH en que detecta mutaciones pequeño tamaño

• Mejor que PCR ya que ésta no puede evaluar secuencias tan pequeñas

Array-CGH

ARRAY – CGHArray comparative genomic hybridization

• Evalúa cambios en el número de copias (CNV) en el genoma entero causadas por DELECIONES, DUPLICACIONES, ANEUPLOIDIAS, TRANSLOCACIONES DESBALANCEADAS.

• Resolución 50-100 kb

• Análisis simultáneo de 10 a 100 loci

• Algunas plataformas evalúan cambios tan pequeños como un exón.

• No necesita cultivo

• Resultado: 48hs

ARRAY - CGHARRAY - CGH

TIPO ESTUDIO RESOLUCION TIEMPO Cant loci por muestra

COSTO

CARIOTIPO “clásico”

5 – 10 Mb VC: 7 – 10 días

Amnio: 15 – 21 días

Bajo

FISH 1 – 5 Mb 24 – 48 hs Sólo algunas sondas por muestra

Caro

QF-PCR 24 hs HASTA 15 loci Bajo

MLPA 130 – 500 bp 24 hs Hasta 50 loci Muy caro

Array 50 – 100 kb 48 hs Hasta 180.000 loci Muy caro

Reproducción Médica Asistida

Conceptos claves• Conjuntos de métodos biomédicos que conducen a

facilitar o sustituir en parte a los procesos biológicos naturales, deteriorados o inexistentes, que se desarrollan durante la procreación humana.

• No suplantan mediante elementos artificiales o no biológicos al organismo masculino o femenino en la función procreativa.

• Implican la participación de los gametos masculinos y femeninos en el proceso generativo.

• No curan la infertilidad.• Incluyen la intervención de un tercero (el médico, el

biólogo, la sociedad, etc.) en la generación de un nuevo ser humano, por lo cual presentan intensas implicancias bioéticas.

Clasificación

• Técnicas intracorpóreas de reproducción asistida

• Técnicas extracorpóreas de reproducción asistida

Técnicas intracorpóreas de reproducción asistida (I)

• Inseminación artificial (IA)

-Indicaciones: Subfertilidad o infertilidad masculina, vasectomía, oligo / azoospermia, ac. anti-esperma, impotencia. Normalidad anatómica y funcional del aparato reproductor femenino.

-Metodología: 1. Obtención de los espermatozoides y capacitación de los mismos en un medio apropiado 2. Transferencia de los espermatozoides mediante un catéter hasta la vagina.

-Porcentaje de Éxito: 5 a 10% por tratamiento / por ciclo.

Técnicas intracorpóreas de reproducción asistida (II)

- Indicaciones: Infertilidad por razones inmunológicas que impiden la capacitación natural del espermatozoide, existencia de un factor cervical femenino que altere a los espermatozoides, anovulación.

- Metodología: 1. Inducción de la ovulación por hiperestimulación ovárica y recogida de los ovocitos por vía transvaginal. 2. Obtención de los espermatozoides y capacitación de los mismos en un medio apropiado 3. Transferencia, mediante un catéter del óvulo y los espermatozoides hasta la porción ampular de la trompa.

• Transferencia intratubárica de gametos (GIFT)

- Porcentaje de Éxito: 24.5% por tratamiento / por ciclo.

Técnicas extracorpóreas de reproducción asistida (I)

• Fecundación In Vitro con Transferencia de

Embriones (FIVET)

Técnicas extracorpóreas de reproducción asistida (II)

Indicaciones y Factores Pronóstico

Nº de embriones transferidos

Éxito de embarazo

1 11.5%

2 27.5%

3 33.8%

4 36.1%

5 35.1%

6 38.2%

Edad materna Éxito de Embarazo

< 35 años 33.8 %

35 – 39 años 27.5%

> 40 años 11.5 %

Complicaciones de las Técnicas de Reproducción Asistida

• Embarazos múltiples

• Morbi-mortalidad materna y fetal aumentada (abortos, partos prematuros, anemia, eclampsia, polihidramnios, endometritis, malformaciones congénitas, etc.)

• Incremento en los gastos de los servicios de maternidad y neonatología.

• Efectos psicológicos en la madre, pareja y familia

Diagnóstico Genético de

Pre-implantación

Diagnóstico Genético de Pre-implantación (PGD)

• Surgió en la década de 1960, pero a partir de su asociación a IVF, se convirtió en un método de “prevención” de desórdenes genéticos.

• Se encuentra indicado en: edad materna ≥ 36 años, parejas con ≥ 3 IVF fallidos, parejas con MESA o TESA y ≥ 1 IVF fallido, abortos recurrentes, desórdenes monogénicos, anormalidades cromosómicas, cariotipo alterado debido a mosaicismo cromosómico o translocaciones balanceadas.

• En todos los casos en que se efectúe PGD, es imprescindible contar con hiperestimulación ovárica previa y técnicas de reproducción asistida extracorpóreas con el objetivo de generar in vitro múltiples embriones para seleccionar aquellos que no se encuentran afectados.

Desorden genético excluido

Desorden genético detectado Embrión descartado

Incubación

(3 días)

HIBRIDACIÓN FLUORESCENTE IN SITU (FISH)

Cromosoma 13: rojo

Cromosoma 21: verde

Cromosoma 18: celeste

Cromosoma X: azul

Cromosoma Y: dorado

Complicaciones de la PGD

• Daño estructural al embrión (raro)

• Sólo ¼ de los embriones biopsiados puede implantarse satisfactoriamente

• No descarta el mosaicismo genético

• Errores diagnósticos

• El resultado de la PGD debe confirmarse por amniocentesis y biopsia de vellosidades coriónicas