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CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -CONCYT- SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -SENACYT-

FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -FONACYT- CENTRO GUATEMALTECO DE INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN

DE LA CAÑA DE AZÚCAR -CENGICAÑA-

INFORME FINAL

“CARACTERIZACIÓN DE CEPAS DEL HONGO Metarhizium anisopliae Metchnikoff Y DETERMINACIÓN DE SU PRESENCIA EN EL SUELO, A

TRAVÉS DE MARCADORES MOLECULARES”

PROYECTO FODECYT 066-2006

ANDREA MALDONADO, Ph.D. Investigador Principal

GUATEMALA, 15 DE OCTUBRE DE 2009.

engicaña

EQUIPO DE TRABAJO:

ANDREA MALDONADO, Ph.D. Investigador Principal

WERNER OVALLE, M.Sc.

Investigador Asociado

JOSÉ MANUEL MÁRQUEZ, M.Sc. Investigador Asociado

JOSÉ LUIS QUEMÉ, Ph.D.

Investigador Asociado

AGRADECIMIENTOS La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología, -FONACYT-, otorgado por La Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología -SENACYT- y al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología -CONCYT-

OTROS AGRADECIMIENTOS: Además, los autores agradecen: - Al Dr. Jürg Enkerli, Dra. Cristina Pilz y el personal del Instituto Agroscope, FAL

Reckenholz, Zurich, Suiza, por los conocimientos compartidos durante la capacitación.

- Al Ing. Agr. Luis Molina y la Licda. Bioq. Karla Ponciano del Instituto de Ciencia y

Tecnología Agrícolas, ICTA, por su ayuda durante la fase de laboratorio y en el análisis de bandas de los geles.

- Al Ing. Agr. Amílcar Sánchez, M.Sc. e Ing. Agr. Julio Berdúo de la Facultad de

Agronomía de la Universidad de San Carlos de Guatemala, por su valiosa colaboración con los termocicladores para la realización de reacciones PCR.

- Al Laboratorio de Producción de Metarhizium del ingenio La Unión, por proporcionar

cepas de Metarhizum anisoplie para la caracterización. - Al Laboratorio de Biológicos del ingenio Pantaleón, por proporcionar larvas de

Galleria mellonella. - A los Departamentos de Control de Plagas de los ingenios La Unión y Palo Gordo, y

al Departamento de Investigación del ingenio Pantaleón, por la toma de muestras de suelo en campo.

- Al Dr. Mario Melgar, por su apoyo y la revisión final del informe.

CONTENIDO Pag. RESUMEN ………………………………………………………………………………………..…... i SUMMARY ……………………………………………………...………………….……………….… ii PARTE I

I.1 INTRODUCCIÓN ………………………………………………...……………………… 2 I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA I.2.1 Antecedentes en Guatemala ……………………………………................................ 4 I.2.2 Justificación del trabajo de investigación ………………………............................... 4 I.3 OBJETIVOS I.3.1 General …………………………………………………………................................ 6 I.3.2 Específicos ………………………………………………………………………….. 6 I.4 MATERIALES Y MÉTODOS I.4.1 Materiales I.4.1.1 Localización …………………………………………………………………. 7 I.4.1.2 Cepas de Metarhizium anisopliae ………………………............................... 8 I.4.1.3 Insectos ……………………………………………………………………… 8 I.4.1.4 Reactivos, kits, instrumentos, equipo y software especial …………………... 9 I.4.2 Métodos

I.4.2.1 Cultivo de Metarhizium anisopliae ………………………………………… 11

I.4.2.2 Obtención de ADN I.4.2.2.1 Producción de micelio en medio líquido ………............................. 13 I.4.2.2.2 Extracción de ADN ……………………………………….............. 13 I.4.2.3 Caracterización molecular de cepas de M. anisopliae I.4.2.3.1 Polimorfismos de ADN amplificados al azar, RAPDs ………….... 14 I.4.2.3.2 Microsatélites o Repeticiones de Secuencias Simples, SSRs …….. 17 I.4.2.3.3 Análisis de los datos ………………………………………………. 19

I.4.2.4 Determinación de la presencia de M. anisopliae en el suelo ........................... 19 I.4.2.4.1 Cultivo del hongo por infección de larvas ………………………..… 23 I.4.2.4.2 Cultivo monospórico del hongo …………………………………..… 25 PARTE II

II. MARCO TEÓRICO

II.1 Control biológico ……………………………………………………………………... 29 II.2 Hongos entomopatógenos …………………………………………………………….. 31 II.3 Metarhizium anisopliae …………………………………………...…………………. 31

CONTENIDO Pag. II.4 Plagas de la caña de azúcar

II.4.1 Chinche salivosa ………………………………………………………............... 33 II.4.2 Gallina ciega ……………………………………………………………………. 34

II.5 Control biológico de plagas de la caña de azúcar con M. anisopliae II.5.1 Control biológico de Chinche salivosa con M. anisopliae……………………… 35 II.5.2 Control biológico de Gallina ciega con M. anisopliae……………………...….. 36

II.6 Permanencia de M. anisopliae en el suelo ………………………………………...…. 37 II.7 Marcadores genéticos ……………………………………………………………........ 39 II.8 Polimorfismos de ADN Amplificados al Azar, RAPDs ……………………………… 41

II.8.1 Aplicación de RAPDs en estudios de cepas de M. anisopliae …………………. 42 II.9 Microsatélites o Repeticiones de Secuencias Simples, SSRs ………………………… 43

II.9.1 Aplicación de microsatélites en estudios de cepas de M. anisopliae ……...…... 44 PARTE III

III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

III.1 Caracterización molecular de 26 cepas de la colección del Laboratorio de Entomología de CENGICAÑA ……………………………………………… 46

III.2 Determinación de la presencia de M. anisopliae en el suelo ………................ 51 III.2.1 Finca Carrizales, Ingenio La Unión ...………………………………… 51 III.2.2 Finca La Libertad, Ingenio Palo Gordo ………………………………. 54 III.2.3 Finca El Bálsamo, Ingenio Pantaleón …………………….................... 55 III.2.4 Finca Los Tarros, Ingenio La Unión ………………………………….. 57

PARTE IV

IV.1 CONCLUSIONES ……………………………………………………………………… 61 IV.2 RECOMENDACIONES ………………………………………………………………... 62 IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ………………………………………………….. 63 IV.4 ANEXOS

IV.4.1 Anexo I: Muestreos de suelo en campos comerciales y parcelas de ensayo …….. 69 PARTE V

V.1 INFORME FINANCIERO ................................................................................................. 74

LISTADO DE CUADROS: Pag.

Cuadro 1: Cepas de Metarhizium anisopliae incluidas en el estudio …………... 8 Cuadro 2: Componentes de las reacciones RAPD ………………………………. 15 Cuadro 3: Primers RAPD utilizados para caracterizar 26 cepas de Metarhizium

anisopliae …………………………………………………………….

17 Cuadro 4: Componentes de las reacciones SSR …………………………………. 17 Cuadro 5: Primers SSR utilizados para caracterizar 26 cepas de Metarhizium

anisopliae …………………………………………………………….. 18

Cuadro 6: Aplicaciones de Metarhizium anisopliae en parcelas muestreadas …. 21 Cuadro 7: Porcentaje de recuperación de las cepas aplicadas en cada parcela

muestreada…………………………………………………………….. 59

LISTADO DE ILUSTRACIONES: Pag.

Figura 1: Pasos para extraer ADN de Metarhizium anisopliae ………………... 16 Figura 2: Pasos para obtener Metarhizium anisopliae de muestras de suelo en

medio semiselectivo ………………………………………………….. 22 Figura 3: Pasos para obtener Metarhizium anisopliae de muestras de suelo,

infectando larvas de Galleria mellonella …………………………….. 24 Figura 4: Pasos para obtener cultivos monospóricos de Metarhizium anisopliae

de las colonias aisladas de la muestras de suelo …………………….... 27 Figura 5: Geles de agarosa que muestran los resultados obtenidos con el primer

CK06 en el análisis de 26 cepas de Metarhizium anisopliae ……….. 47 Figura 6: Geles de agarosa que muestran los resultados obtenidos con el primer

H02 en el análisis de 26 cepas de Metarhizium anisopliae ………….. 47 Figura 7: Gel de poliacrilamida que muestra los resultados obtenidos con el

primer AY842942 en el análisis de 26 cepas de Metarhizium anisopliae …………………………………………………………….. 48

Figura 8: Gel de poliacrilamida que muestra los resultados obtenidos con el

primer AY842948 en el análisis de 26 cepas de Metarhizium anisopliae …………………………………………………………….. 48

Figura 9: Dendrograma que muestra la similitud genética de 26 cepas de

Metarhizium anisopliae, de acuerdo con la información obtenida por medio de marcadores moleculares, según el índice de Dice (1945) …. 49

Figura 10: Geles de poliacrilamida que muestran los resultados obtenidos al

correr PCRs de las esporas de las cepas PLADYSA, PL-43 y Yara 10 50 Figura 11: Geles de poliacrilamida que muestran los resultados obtenidos al

correr PCRs de las esporas de hongo recuperadas del suelo de la finca Carrizales, del ingenio La Unión ……………………………………... 52

Figura 12: Gel de poliacrilamida que muestra los patrones obtenidos al correr dos microsatélites con las cepas aparentemente nativas de la finca Carrizales, ingenio La Unión, y de las cepas CG de la colección del Laboratorio de Entomología ………………………………………….. 53


correr PCRs de las esporas de hongo recuperadas del suelo de la finca La Libertad, del ingenio Palo Gordo …………………………………. 54


correr PCRs de las esporas de hongo recuperadas del suelo de la finca El Bálsamo, del ingenio Pantaleón …………………………………… 56


correr PCRs de las esporas de hongo recuperadas del suelo de la finca Los Tarros, del ingenio La Unión ……………………………………. 58

ABREVIACIONES Abreviación Significado ADN Ácido Desoxirribonucléico ARSEF Colección de hongos entomopatógenos del Servicio de

Investigación Agrícola del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos

ºC Grados centígrados CENGICAÑA Centro Guatemalteco de Investigación y Capacitación de la Caña

de Azúcar dNTPs Desoxinucleótidos trifosfato et al. Y otros, y colaboradores. Del latín: et altri g gramos ha Hectáreas l litros lb/pulg2 Libras por pulgada cuadrada M Molar µg Microgramos mg Miligramos min Minuto(s) µl Microlitro ml Mililitro mM Milimolar msnm metros sobre el nivel del mar N En coordenadas geográficas: Norte O En coordenadas geográficas: Oeste pb Pares de bases PCR Reacción en cadena de la Polimerasa, del inglés: Polymerase

Chain Reaction RAPD Polimorfismos de ADN Amplificados al Azar, del inglés:

Random Amplified Polymorphic DNA rpm Revoluciones por minuto s Segundo(s) sp Especie SSR Repeticiones de Secuencias Simples, del inglés: Simple Sequence

Repeats Tm Toneladas métricas U Unidades. Forma de medir la concentración de las enzimas V Voltios

GLOSARIO Término Definición Amplificación Acción que realiza la enzima polimerasa cuando

hace copias de una molécula de ADN o fragmento de ella

Desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs) Unidades que conforman una molécula de

ADN. Están compuestos por una base (purina o pirimidina), un azúcar (deoxirribosa) y un grupo fosfato

Electroforesis Método de separación de partículas con diversas

cargas eléctricas, por ejemplo, ácidos nucléicos, proteínas, péptidos. La mezcla a ser separada se coloca dentro de un medio de soporte (por ejemplo ADN, en un gel de agarosa). A esto se aplica corriente eléctrica y los componentes de la mezcla se separarán de acuerdo a su tamaño, el cual se deduce posteriormente, comparando su posición con la de estándares de tamaño conocido.

Dendrograma Tipo de representación gráfica o diagrama de datos

en forma de árbol (Dendro = árbol) que organiza los datos en subcategorías que se van dividiendo en otros hasta llegar al nivel de detalle deseado (asemejándose a las ramas de un árbol que se van dividiendo en otras sucesivamente).

Gen Unidad física fundamental de la herencia que

transmite información de una célula a otra y por ende, de una generación a otra. Un gen es una secuencia específica de nucleótidos de ADN que representan un código que al ser reconocido por enzimas específicas, se traduce en una proteína.

Genoma La totalidad de información genética contenida en

cada célula de un organismo. Marcador molecular Región dentro de una molécula de ADN, ligada a

un gen y que sirve para detectar este último y ubicarlo. También se denomina así a una secuencia característica de un organismo que sirve para identificarlo o detectar su presencia en una población.

Término Definición Microsatélites También conocidos como SSRs o Repeticiones de

Secuencias Simples, son loci polimórficos presentes en el ADN nuclear que consisten en repeticiones de motivos de 1 a 6 nucleótidos que se ubican uno tras otro. Generalmente se encuentran en zonas no codificantes del ADN. Son neutros, co-dominantes y poseen una alta tasa de mutación, lo que los hace muy polimórficos. La variabilidad que presentan para su uso como marcadores moleculares, radica en el número de repeticiones y no de la secuencia repetida en sí. Son utilizados en una gran gama de aplicaciones en el campo de la genética, como parentescos y estudios de poblaciones.

Nucleótidos Unidades que conforman una molécula de ácido

nucleico (ver “Deoxirribonucleótido”). Están compuestos por una base (purina o pirimidina), un azúcar (ribosa) y un grupo fosfato. Para el ADN y ARN existen cuatro Adenina, Citosina, Guanina y Timina (sustituida por Uracilo en el caso del ARN).

Oligonucleótido Cadena de ADN o ARN compuesta por menos de

20 nucleótidos Pares de bases En una molécula de ácido nucleico de cadena doble,

es un par de nucleótidos complementarios: A-T y G-C (ver “Secuencia complementaria”). La longitud de una molécula de ADN se mide en pares de bases.

PCR La Reacción en Cadena de la Polimerasa es aquella

a través de la cual se sintetizan artificialmente fragmentos de una molécula de ADN. Esto se lleva a cabo por medio de la repetición de ciclos de temperaturas que consisten en: desnaturalizar la molécula original de ADN, a 95ºC, luego se deben acoplar los primers, a 35-65ºC y por último, se amplifica el fragmento a 72ºC. Forman parte de ella los dNTPs, que son las unidades que conforman la molécula de ADN; la enzima polimerasa, que es la que los une y los primers, a partir de los cuales la enzima sintetiza los fragmentos.

Término Definición Polimerasa Enzima que construye cadenas de polímeros a partir

de un primer. La ADN Polimerasa sintetiza moléculas de ADN, así como la ARN Polimerasa sintetiza las de ARN.

Polimorfismo Existencia de diferencias entre individuos de una

población, cuando diversas formas de un mismo gen están presentes en dicha población

Polinucleótido Cadena de ADN o ARN compuesta por más de 20

nucleótidos Primer También llamado cebador o iniciador, es un

oligonucleótido utilizado por la enzima polimerasa para comenzar a realizar copias de una molécula de ADN

RAPDs (Polimorfismos de ADN Amplificados al Azar)

Método para identificar diferencias entre genomas de distintos individuos por medio de PCR, con un solo primer (generalmente de 10 bases), el cual se acopla con la secuencia complementaria de la molécula de ADN en posiciones no determinadas. Los productos de la reacción generan patrones genéticos de los individuos.

SSRs (Repeticiones de Secuencias Simples)

Ver microsatélites.

i

RESUMEN El hongo Metarhizium anisopliae Metchnikoff, es patógeno para más de 200 especies de

insectos plaga de cultivos de importancia económica. El control biológico con hongos

entomopatógenos reduce la dependencia de productos químicos. En Guatemala, en caña de

azúcar y otros cultivos se realizan aplicaciones aéreas de M. anisopliae para controlar

adultos de Chinche salivosa (Homoptera:Cercopidae) y se investiga sobre aplicaciones

terrestres para controlar ninfas de la misma especie y otras plagas del suelo, como Gallina

ciega (Coleoptera:Scarabaeidae) y Chinche hedionda (Hemiptera:Cydnidae). Por carecer de

una metodología, en Guatemala no existían estudios de la sobrevivencia del hongo en el

suelo después de su aplicación. Con la presente investigación se implementó un método

para caracterizar molecularmente la colección de cepas utilizadas en la zona cañera

guatemalteca, y para determinar la permanencia del hongo en el suelo después de su

aplicación. Se estudió la situación de dos lotes bajo condiciones de manejo comercial y dos

ensayos con una sola aplicación terrestre de hongo. En todos los casos se comprobó la

presencia del hongo en el suelo y se determinó que, por lo menos tres meses después de

realizar una aplicación terrestre, el hongo permanece viable en el suelo. Además, en una de

las parcelas muestreadas se encontraron cepas cuyos patrones genéticos no corresponden a

cepas conocidas, por lo cual se consideran nativas.

ii

SUMMARY Metarhizium anisopliae Metchnikoff, is a fungus found to be a pathogen for more than

200 of species of insects considered as agricultural pests. Biological control by

entomopathogenic fungi reduces the dependence on chemical products. In Guatemala, for

sugarcane and other crops, M. anisopliae is applied aerially to control adults of

Froghoppers (Homoptera:Cercopidae), and research is being carried out on terrestrial

applications to control nymphs of this species and other soil pests, such as White grubs

(Coleoptera:Scarabaeidae) and Stinkingbug (Hemiptera:Cydnidae). No methodology had

previously been established, thus, in Guatemala there were no studies on the survival of the

fungus in the soil after its application. Therefore, with the present investigation a

methodology was implemented to molecularly characterize the collection of strains used in

the Guatemalan sugarcane planting area, and to determine the permanence of the fungus in

the soil after its terrestrial application. We studied the situation of two lots under sugarmill

management conditions, as well as two trial plots where only one terrestrial application was

performed. In all cases the presence of the fungus was confirmed, and it was determined

that at least three months after terrestrial application, the fungus remains viable in the soil.

In addition, from one of the sampled plots strains were collected, whose genetic profiles do

not correspond to any known strain, therefore they are considered as indigenous strains.

1

PARTE I

2

I.1 INTRODUCCIÓN

La caña de azúcar es uno de los cultivos de mayor importancia en el país y uno de

los mayores generadores de divisas, ya que 72% del total de azúcar producido se exporta.

Actualmente se cultivan aproximadamente 220,000 hectáreas, convirtiéndose así en un

importante generador de empleo.

Las plagas que causan las mayores pérdidas en caña de azúcar son la Chinche

salivosa (Aeneolamia postica y Prosapia simulans) y las plagas del suelo, como la Gallina

ciega (Phyllophaga sp.), Chinche hedionda (Scaptocoris talpa) y Picudo (Sphenophorus

sp.).

Para combatir estas plagas, la industria azucarera guatemalteca, ha optado por

utilizar agentes de control biológico como alternativa o suplemento de insecticidas

químicos que, como se sabe, tienen efectos tóxicos en organismos inocuos, incluyendo

animales y seres humanos.

Dentro de las prácticas realizadas, la aplicación aérea del hongo Metarhizium

anisopliae Metchnikoff para controlar adultos de Chinche salivosa

(Homoptera:Cercopidae) es una práctica muy común. Además, actualmente se investiga

sobre aplicaciones terrestres para controlar ninfas de la misma especie y otras plagas del

suelo, como Gallina ciega (Coleoptera:Scarabaeidae) y Chinche hedionda

(Hemiptera:Cydnidae), por lo que existen cuatro laboratorios de producción del hongo

ubicados en los ingenios La Unión, Santa Ana, Pantaleón y Magdalena. Sin embargo, aún

quedan dudas sobre la mejor forma de aplicación, si el control se realiza por la aplicación

de una determinada cepa o si es que existen cepas nativas en el suelo que se podrían

aprovechar.

Considerando que la aplicación de marcadores moleculares ha sido útil para el

estudio de especies animales, vegetales y microbianas, se consideró que serían una

herramienta adecuada para identificar la presencia de M. anisopliae en muestras de suelo,

3

pues están basados en la información genética de los organismos, contenida en la cadena de

Ácido Desoxirribonucléico, ADN.

En M. anisopliae se han realizado estudios moleculares con dos tipos de

marcadores: los Polimorfismos de ADN Amplificados al Azar, RAPDs, por sus siglas en

inglés (Random Amplified Polymorphic DNA), por los equipos de trabajo de Fegan et al.

(1993) y Bidochka et al. (1994). Y también se han utilizado microsatélites o Repeticiones

de Secuencias Simples, SSRs (Simple Sequence Repeats) por Enkerli et al. (2005).

Con estos antecedentes y, teniendo en cuenta que en Guatemala no se han realizado

estudios de permanencia del hongo en el campo, el Centro Guatemalteco de Investigación y

Capacitación de la Caña de Azúcar -CENGICAÑA- presentó una propuesta de

investigación al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología -CONCYT-, para realizar una

investigación sobre el tiempo que el hongo permanece en el suelo después de su aplicación.

Para ello, primero se caracterizó la colección de cepas con que cuenta la

agroindustria, y luego se procedió a tomar muestras de suelo, aislar hongo en medio de

cultivo o usando larvas trampa cuando hubo necesidad, y aplicar marcadores moleculares

para determinar la identidad de la cepa.

Se caracterizaron 26 cepas de M. anisopliae de la colección con que cuenta la

agroindustria azucarera y los muestreos se realizaron en dos lotes bajo condiciones de

manejo comercial y dos parcelas de ensayo del Programa de Manejo Integrado de Plagas de

CENGICAÑA.

En uno de los lotes comerciales se encontraron cepas que se consideran nativas y

que podrían aprovecharse en el control de plagas del área.

4

I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

I.2.1 Antecedentes en Guatemala

En Guatemala las plagas que causan las mayores pérdidas en caña de azúcar son la

Chinche salivosa (Aeneolamia postica y Prosapia simulans), con un índice de daño

estimado en 3,223 libras de azúcar por hectárea, por cada adulto por tallo; además de las

plagas del suelo, como la Gallina ciega (Phyllophaga sp.) y la Chinche hedionda

(Scaptocoris talpa), con un índice de daño de 156 y 13.4 libras de azúcar por hectárea,

respectivamente, por cada insecto presente en un metro cuadrado (Márquez y López, 2006).

Actualmente se realizan aplicaciones aéreas y terrestres de M. anisopliae para

controlar adultos y ninfas de Chinche salivosa (Homoptera:Cercopidae), utilizando una

dosis de 5x1013 esporas/ha, en 35,751 ha, que representa el 66% del área con algún control

(CENGICAÑA, 2009). Las cepas más utilizadas son Yara 10, CG93-3 y PLADYSA.

Además, CENGICAÑA investiga sobre aplicaciones terrestres para controlar otras

plagas del suelo, como Gallina ciega (Coleoptera:Scarabaeidae) y Chinche hedionda

(Hemiptera:Cydnidae), donde la cepa NB ha demostrado un mejor control de Gallina ciega

(CENGICAÑA, 2009). Sin embargo, aún quedan dudas sobre la mejor forma de aplicación,

si el control se realiza por la aplicación de una determinada cepa o si existen cepas nativas

en el suelo que se podrían aprovechar (Comunicación personal con el Dr. Daniel Peck,

2006).

I.2.2 Justificación del trabajo de investigación

Debido a que un estudio de permanencia del hongo en el suelo no se había llevado a

cabo en Guatemala, CENGICAÑA propuso un proyecto de investigación al Consejo

Nacional de Ciencia y Tecnología -CONCYT- para determinar, por medio de marcadores

moleculares, la permanencia del hongo en el suelo después de su aplicación y, de este

5

modo, contribuir en la toma de decisiones para definir la forma y frecuencia de aplicación,

además de investigar si existe alguna cepa nativa en el suelo que se pueda aprovechar.

Dado que el control de plagas con M. anisopliae es una práctica cada vez más

común también en el control de plagas de otros cultivos, se considera que los resultados de

este estudio también serán útiles para otros productores que lo aplican.

6

I.3 OBJETIVOS

I.3.1 General

Utilizar los marcadores moleculares como una herramienta que ayude a orientar los

programas de control biológico de plagas.

I.3.2 Específicos

- Caracterizar molecularmente las diferentes cepas del hongo Metarhizium

anisopliae que se utilizan en control biológico de plagas de caña de azúcar en

Guatemala.

- Evaluar dos tipos de marcadores moleculares e identificar el más apropiado para

caracterización de cepas de Metarhizium anisopliae.

- Determinar el tiempo de permanencia del hongo viable en el suelo después de su

aplicación.

- Detectar la presencia de cepas nativas.

7

I.4 MATERIALES Y MÉTODOS

I.4.1 Materiales

I.4.1.1 Localización

Los experimentos de laboratorio se llevaron a cabo en las

instalaciones de CENGICAÑA, ubicado en finca Camantulul, km 92.5

carretera al Pacífico, en el municipio de Santa Lucía Cotzumalguapa,

departamento de Escuintla, con coordenadas geográficas 91º3'19.33" O de

longitud y 14º 19'50.02 N de latitud y a 300 msnm. Los muestreos de suelo

se llevaron a cabo en cuatro fincas de tres ingenios, ubicadas en:

- Finca Carrizales, Ingenio La Unión:

(Lote comercial)

91º 10’ 18.99” O

14º 12’ 13.11” N

62 msnm

- Finca La Libertad, Ingenio Palo Gordo:

(Lote comercial)

91º 25’ 49.60” O

14º 23’ 57.28” N

113 msnm

- Finca El Bálsamo, Ingenio Pantaleón:

(Parcela de ensayo)

91º 1’ 41.05” O

14º 13’ 8.89 N

155 msnm

- Finca Los Tarros, Ingenio La Unión:

(Parcela de ensayo)

90º 59’ 25.32” O

14º 22’ 16.84” N

620 msnm

8

I.4.1.2 Cepas de Metarhizium anisopliae

Las cepas caracterizadas forman parte de la colección del Laboratorio

de Entomología de CENGICAÑA, que consiste en cepas nativas aisladas en

ensayos de investigación y cepas importadas de Nicaragua, Costa Rica y los

Estados Unidos, éstas últimas de la Colección de Cepas de Hongos

Entomopatógenos -ARSEF- (por sus siglas en inglés), del Servicio de

Investigación Agrícola del Departamento de Agricultura de los Estados

Unidos, USDA-ARS (por sus siglas en inglés), ubicado en la universidad de

Cornell, Ithaca, Nueva York. (Cuadro 1).

I.4.1.3 Insectos

Larvas de palomilla de los apiarios, Galleria mellonella.

CUADRO 1: Cepas de Metarhizium. anisopliae incluidas en el estudio.

No. Cepa Proveniencia No. Cepa Proveniencia 1 2135 ARSEF* 14 2139 ARSEF 2 1046 ARSEF 15 CG93-3 CENGICAÑA 3 2469 ARSEF 16 NB Nicaragua 4 2982 ARSEF 17 3621 ARSEF 5 2134 ARSEF 18 1858 ARSEF 6 CG01-04 CENGICAÑA** 19 472 ARSEF 7 CG01-02 CENGICAÑA 20 346 ARSEF 8 CG02-7 CENGICAÑA 21 977 ARSEF 9 CG01-05 CENGICAÑA 22 1066 ARSEF

10 1859 ARSEF 23 1901 ARSEF 11 Yara 10 Costa Rica 24 2136 ARSEF 12 798 ARSEF 25 1912 ARSEF 13 CG03-8 CENGICAÑA 26 1897 ARSEF

Fuente: Laboratorio de Entomología de CENGICAÑA. *Cepas importadas de ARSEF: Agricultural Research Service Collection of Entomopathogenic Fungal Cultures. US Department of Agriculture, EE UU. **Cepas nativas encontradas por CENGICAÑA: Centro Guatemalteco de Investigación y Capacitación de la Caña de Azúcar

9

I.4.1.4 Reactivos, kits, instrumentos, equipo y software especial:

Los reactivos, kits, instrumentos y equipo utilizados para realizar el

estudio se listan a continuación:

Reactivos Marca Aceite mineral Farma Química, S.A. Ácido acético glacial Merck Ácido clorhídrico Merck Ácido etilendinitrilotetraacético, sal disódica, EDTA

Fermont

Acrilamida para electroforesis de ADN Merck Agar Merck Agarosa para electroforesis de ADN Mercury Agua desmineralizada Salvavidas Amonio persulfato Merck Azul de bromofenol Merck Bromuro de etidio Merck Carbonato de sodio anhidro Merck, Sigma Cicloheximida Sigma Cloruro de potasio Sigma D-glucosa Sigma Desoxinucleótidos trifosfato, dNTPs Mercury Dodine Riedel de Haen Estreptomicina, sal de sulfato Sigma Etanol Sigma Extracto de levadura Oxoid Formaldehído 37% Sigma Formamida Sigma Fosfato de potasio monobásico Sigma Fosfato de sodio dibásico Sigma ΦX174 Hae III Digest, marcador molecular de 1353 pb

Sigma

Hidróxido de sodio J.T. Baker Marcadores de peso molecular 100BPS y 200BPS Mercury

Metacrilato de 3-trimetoxisilil Sigma Metanol al 99% Sigma Nitrato de amonio Sigma Nitrato de plata Merck N’N’-metilendiaclilamida Sigma N,N,N’N’-tetrametilendiamina (TEMED) Merck, Sigma

Oligonucleótidos Integrated DNA Technologies, Inc. Peptona de carne digerida en páncreas Oxoid

10

Reactivos Marca Persulfato de amonio Sigma Polimerasa de Thermus acquaticus (5U/µl)

Mercury

pUC18 Msp I Digest, marcador molecular de 501 pb

Sigma

Sacarosa Merck Sigmacote® Sigma Sodio docecilsulfato Merck Sodio pirofosfato tetrabásico decahidratado Sigma

Sulfato de magnésio heptahidratado Merck, Sigma Tetraciclina Sigma Thiabendazole Bayer Tiosulfato de sodio pentahidratado Merck, Sigma Tris(hidroximetil)aminometano Merck Urea Merck Xilencianol Sigma

Kits Marca PureLinkTM Plant, Total DNA Purification Kit

Invitrogen

Instrumentos Marca Bandeja de electroforesis horizontal, 20×20 cm

C.B.S. Scientific

Bandeja de electroforesis horizontal, 7×10 cm

Thermo

Bandeja de electroforesis vertical, 33×42 cm

VWR

Micropipetas (0.5-10 µl, 10-100 µl y 100-1000 µl)

Research, Eppendorf

Micropipeta de 2-20 µl y pipeta de 1-5 ml

Transferpette, Brand

Micropipeta multicanal 10-100 µl, 8 canales

Research, Eppendorf

Pipeta dispensadora Multipette, Eppendorf Pipeta de 1-5 ml Poseidon

11

Equipo Marca Agitador Maxi Rocker LAB-LINE Agitador orbital Daigger Autoclave Sterilmatic Balanza analítica Metler Baño maría Premlab Bomba de vacío Melch Cámara de flujo laminar LABCONCO Centrífuga Hermle Congelador (-20ºC) Barnstead Estereoscopio Stemi 2000-C ZEISS Estufa-agitador Corning Fuente de luz Schott KL-750 ZEISS Fuente de poder de 300 V VWR Fuente de poder de 3000 V C.B.S. Scientific Horno de microondas Mabe Microscopio de contraste de fases UNILUX-12

Kyowa

Refrigerador RCA Regulador de voltaje, UPS Tripp-Lite Sistema de fotodocumentación Polaroid Termociclador Mastercycler, Eppendorf Termos Aladin Transiluminador UVP Vortex IKA

Software especial NTSYSpc versión 2.11Q Applied Biostatistics, Inc. GelWorks UVP

I.4.2 Métodos

I.4.2.1 Cultivo de Metarhizium anisopliae

En el Laboratorio de Entomología de CENGICAÑA las cepas se

encuentran conservadas en viales con medio sólido de Haba (Vicia faba) y

aceite. Para proceder a la extracción del material genético, fue necesario

12

producir colonias en medio de Haba. Para ello se siguió la metodología

descrita por Alemán y Ovalle (1998) que consistió en:

1- Se introdujo un asa al vial y se tomó una porción de la colonia, luego, con

el asa se rayó el medio sólido de Haba. Se incubó a 26ºC, bajo condiciones

de oscuridad por tres días y luego con luz, hasta que se observó

esporulación.

2- Al esporular se hizo una suspensión de esporas y con ella se inoculó

insectos (preferiblemente ninfas de Chinche salivosa) para revigorizar la

cepa, es decir, para que mantuviera su capacidad de infección.

3- El insecto se colocó en una cámara húmeda a 26ºC y bajo luz. Cuando los

insectos murieron se cambiaron a una nueva cámara húmeda y se colocaron

bajo las mismas condiciones de temperatura y luz.

4- Cuando los insectos se cubrieron de esporulaciones, se procedió a aislar el

hongo en medio de Haba, haciendo un toque sobre las esporas de la colonia

con una aguja de disección y luego 4-5 toques sobre el nuevo medio de Haba

sólido. Los platos se incubaron bajo las mismas condiciones de temperatura

y luz ya descritas.

Soluciones utilizadas:

Medio de Haba

Cocer 75 g de Habas secas en agua desmineralizada,

Añadir 20 g de azúcar y 15 g de agar.

Aforar a un litro con agua desmineralizada.

Esterilizar a una presión de 18 lb/pulg2 y una temperatura de 120ºC.

Cuando tenga una temperatura de 60ºC, añadir 500 mg de Cloranfenicol.

13

I.4.2.2 Obtención de ADN

I.4.2.2.1 Producción de micelio en medio líquido

Debido a que la cantidad de ADN que se obtiene de las

esporas es limitada, la extracción de ADN se hizo a partir de micelio

del hongo. Para producir suficiente cantidad de micelio, se utilizó

Medio Completo, MC, líquido. El procedimiento que se siguió es

una modificación del descrito por Enkerli et al. (2004):

1- En un matraz Erlenmeyer se colocó 50 ml de MC y se esterilizó a

una presión de 18 lb/pulg2 y 120ºC durante 20 minutos. Se añadió al

medio 50 mg/l de Estreptomicina después de esterilizado.

2- Posteriormente, en la cámara de flujo laminar se cortó un trozo de

1 cm × 1 cm de medio sólido con esporas y se colocó dentro de un

matraz Erlenmeyer de 125 ml, que contenía 50 ml de MC estéril.

3- Se incubó en un agitador orbital a 100 rpm durante 48 horas a

temperatura ambiente, esto para evitar esporulación y permitir

desarrollo de micelio.

I.4.2.2.2 Extracción de ADN

1- Para asegurar la pureza del ADN, los cultivos se revisaron al

microscopio a través de montajes, antes de proceder a la extracción

del material genético.

2- Para extraer el ADN se separó el micelio del medio. Esto se hizo

por medio de un sistema de vacío, que consiste en una bomba

conectada a un kitasato que a su vez tiene un filtro en la parte

14

superior (ver Figura 1). Al vaciar el contenido del matraz sobre el

filtro y aplicar el vacío por presión negativa de aire, el medio pasó al

recipiente y el micelio permaneció en el filtro.

3- Para que el material genético no se degradara, el micelio se

sumergió en nitrógeno líquido, se congeló y se maceró dentro de un

mortero.

4- Se pesó 100 mg y se procedió a extraer inmediatamente el ADN.

Para esto se utilizó el kit comercial PureLinkTM Plant, Total DNA

Purification Kit (Invitrogen No. Cat. K1830-01), siguiendo las

instrucciones del fabricante.

Solución utilizada:

Medio Completo, MC

Con calor, mezclar 0.36 g de KH2PO4, 1.6 g de Na2HPO4, 1 g de

KCl, 0.6 g de MgSO4.7H2O, 0.7 g de NH4NO3, 5 g de extracto de

levadura, 10 g de glucosa.

Aforar a un litro con agua desmineralizada.

I.4.2.3 Caracterización molecular de cepas de M. anisopliae

I.4.2.3.1 Polimorfismos de ADN Amplificados al Azar, RAPDs

Los componentes de las reacciones RAPD se describen en el

Cuadro 2. Las reacciones se realizaron con los primers descritos en

el Cuadro 3, siguiendo la metodología desarrollada por Fegan et al.

(1993).

15

El programa de PCR utilizado fue el siguiente:

94ºC 5 min 1 ciclo

94ºC 1 min

40 ciclos 37ºC 1 min

72ºC 2 min

72ºC 5 min 1 ciclo

El resultado se observó en un gel de agarosa 1.3 por ciento,

aplicando una corriente de 5 V/cm y teñido con bromuro de etidio.

CUADRO 2: Componentes de las reacciones RAPD.

Componente Concentración del stock

Concentración por reacción

Volumen por reacción

dmH2O 1× 1× 13.15 µl Búfer de

PCR 10× 1× 2 µl

MgCl2 50 mM 3.75 mM 1.5 µl dNTPs 10 mM 250 µM 0.5 µl Primer 10 µM 0.4 µM 0.8 µl

Taq polimerasa 5 U/µl 1.5 U 0.3 µl

ADN/tubo (extraído por medio del PureLinkTM Plant Total DNA Purification kit de Invitrogen No. Cat. K1830-01) 2 µl

TOTAL 20 µl Fuente: Fegan et al. (1993).

16

Figura 1: Pasos para extraer ADN de Metarhizium anisopliae.

a) Para producir micelio, en medio MC se sembró una porción de medio con esporas y se agitó a 100 rpm por 48 horas a temperatura ambiente.

b) Con una bomba de vacío se separó el micelio del medio.

c) El micelio se congeló y maceró en nitrógeno líquido.

d) Se extrajo el ADN con un kit comercial.

Fuente: Proyecto FODECYT 066-2006.

17

CUADRO 3: Primers RAPD utilizados para caracterizar 26 cepas de Metarhizium anisopliae.

No. Código Secuencia 5’-3’ 1 F06 GGGAATTCGG 2 F07 CCGATATCCC 3 F08 GGGATATCGG 4 F10 GGAAGCTTGG 5 H01 GGTCGGAGAA 6 H02 TCGGACGTGA 7 CK06 GCTTCGATACG 8 CK09 TCACGATGCA 9 CK12 CGACGTTCAA 10 CK16 ATCGATCGAG 11 A (Universal M13) TTATGTAAAACGACGGCCAGT 12 B GACAGACAGACA 13 C CGACTGTCGG

Fuente: Los primers 1-6 pertenecen a los kits F y H de la casa comercial Operon Technologies y los primers 7-10 corresponden a secuencias de CSIRO, Australia (Fegan et al., 1993). Los primers 11-13 fueron utilizados en el estudio de Bidochka et al. (1994)

I.4.2.3.2 Microsatélites o Repeticiones de Secuencias Simples,

SSRs

Los componentes de las reacciones SSR se describen en el

Cuadro 4. La metodología fue adaptada de la descrita por Enkerli et

al. (2005), utilizando los primers diseñados por ellos (ver Cuadro 5):

CUADRO 4: Componentes de las reacciones SSR.

Componente Concentración del stock

Concentración por reacción

Volumen por reacción

dmH2O 1× 1× 10.7 µl Búfer de PCR 10× 1× 2 µl

MgCl2 50 mM 2.5 mM 1 µl dNTPs 10 mM 200 µM 0.4 µl

Primer F 10 µM 0.2 µM 0.4 µl Primer R 10 µM 0.2 µM 0.4 µl

Taq polimerasa 5 U/µl 0.5 U 0.1 µl ADN/tubo (extraído por medio del PureLinkTM Plant Total DNA Purification kit de Invitrogen No. Cat. K1830-01) 5 µl

TOTAL 20 µl Fuente: Enkerli et al. (2005).

18

El programa de PCR utilizado fue el siguiente:

95ºC 4 min 1 ciclo

95ºC 30 s

No. de ciclos diferente para

cada primer

Diferente para cada primer (Ver Cuadro 5)

30 s

72ºC 40 s

72ºC 7 min 1 ciclo

CUADRO 5: Primers SSR utilizados para caracterizar 26 cepas de Metarhizium anisopliae.

No. No. Accesión Secuencia 5’3’ Temperatura Acoplamiento

(ºC) 1 AY842937 F: AGGAAGTCAAATAGAATACGTACCG 44 R: CCTTTTGTCGCTTGCTTG 2 AY842938 F: CAAGTTTACGCATATTGGTTACGATA 56 R: TCACCGGCCATCTCATTAGAT 3 AY842939 F: GACGGTATATTTATGATCAGCTCG 56 R: TCGGGAACTAGACTTTAAGTATCAC 4 AY842940 F: CCGTACTTGGTACATATTCCTGATG 56 R: GGGATGTCCGCATTCGAA 5 AY842942 F: CGACATTTCACCGTTGTACATATG 56 R: GGACTGGGAGTTTGGAGCTC 6 AY842943 F: AATTATAAAACTGAAGAAACAGAAA 44 R: GTGTTCCTAGTGACCTCCTTACT 7 AY842944 F: CCCGAGGCCTGTAGTCTACG 50 R: TTTCCTGGAAAGGCAAGAACTT 8 AY842945 F: CATGCTCCGCCTTATTCCTC 56 R: GGGTGGCGAAGAAGTAGACG 9 AY842946 F: TTTATTGTGGTTGGAGATGCCA 50 R: CATGATAAAAGGTCATGTTTGCC

10 AY842948 F: GCATCATCGACGACGACATTA 56 R: TTACGATGGCAACGATGCA

11 AY842949 F: GTCAGTAGCTGCAAATCCTTGAG 50 R: AATTAAGGGAGAGAGGCGAAG

12 AY842950 F: TTGTTCCATTCGTCTCATCGG 56 R: AGTCGGAATCAGAGCCAGAAGTA

Fuente: Enkerli et al. (2005).

Los resultados de cada reacción se visualizaron en un gel de

poliacrilamida al 5%, teñido con nitrato de plata.

19

I.4.2.3.3 Análisis de los datos

Para determinar la similitud genética entre materiales, luego

de obtener las bandas en los geles, se tomó una foto, en el caso de

agarosa y se escanearon los de poliacrilamida. Cada imagen se cargó

con el software Gel Works (UVP), que convierte la figura en una

matriz binaria, colocando “1” donde una banda está presente y “0”

donde está ausente.

Los datos de presencia/ausencia de bandas fueron utilizados

para cuantificar la similitud genética por el coeficiente de Dice

(1945), Sa,b.

Sa,b = 2N/na+nb

Donde Sa,b es el coeficiente de la similitud que existe entre

las cepas a y b; N es el total de coincidencia positiva entre las cepas

a y b; na y nb son el total de bandas presentes en cada cepa a y b,

respectivamente (Harvey y Botha, 1996). Los resultados del

coeficiente de Dice fueron utilizados para generar una matriz de

similitud, la cual fue interpretada gráficamente a través del método

de agrupamiento UPGMA, utilizando el software NTSYSpc (Rohlf,

2003).

I.4.2.4 Determinación de la presencia de M. anisopliae en el suelo

Para determinar la permanencia de M. anisopliae en el suelo después

de su aplicación, se realizaron muestreos de suelo en dos campos

comerciales cultivados con caña de azúcar, bajo las condiciones normales de

cultivo y aplicaciones de M. anisopliae, y en dos parcelas de ensayo del

Programa de Manejo Integrado de Plagas de CENGICAÑA en las cuales se

20

aplicó M. anisopliae al suelo. El Cuadro 6 describe las aplicaciones en cada

parcela muestreada. Los campos comerciales se comenzaron a muestrear en

el mes de abril y mayo 2008, respectivamente, y las parcelas de ensayo en

junio y julio 2008, respectivamente. El último muestreo en todos los casos se

realizó en el mes de septiembre de 2008. Un informe detallado del

procesamiento de las muestras de suelo se incluye en el Anexo I.

Para tomar las muestras, se marcaron seis surcos distribuidos a lo

ancho del lote y las muestras se extrajeron siempre del mismo surco, en

diferentes puntos, al pie de la macolla, a aproximadamente 20 cm de

profundidad, siguiendo la recomendación de Sallam et al. (2007). El suelo

de los seis puntos se mezcló dentro de un saco y se obtuvo una porción más

pequeña que se trasladó al laboratorio. De cada muestra se obtuvieron

porciones de 20 g de suelo que se mezclaron con 100 ml de una solución de

1.8 g/l de sodio pirofosfato tetrabásico decahidratado (Na4P2O7.10H2O) para

favorecer la disgregación y se colocaron en un agitador orbital a 120 rpm

por tres horas. Luego de 15 segundos de sedimentación, se tomaron 100 µl y

se sembraron en un plato con medio semiselectivo sólido, utilizando una

varilla doblada. Los platos se incubaron a 26ºC bajo condiciones de luz y

luego de 8-10 días se pudo observar crecimiento de diversas colonias. En los

casos donde se encontraron colonias de M. anisopliae, se aisló a medio de

Haba, de la forma en que se describe en el paso 4 de la metodología descrita

anteriormente para el cultivo de Metarhizium anisopliae (ver Figura 2).

21

CUADRO 6: Aplicaciones de Metarhizium anisopliae en parcelas muestreadas. Localización Tipo de parcela Descripción de la aplicación Cepa

aplicada No. de

Muestras

Finca Carrizales, Ingenio La Unión

Lote comercial

- Incorporado al suelo con el aporque en maíz quebrado, 14 de abril, 2008. Dosis: 5×1013 esporas/ha. - Aplicación aérea de hongo en maíz quebrado, 8 de mayo, 2008. Dosis: 5×1013 esporas/ha. - Aplicación aérea de hongo en maíz quebrado, 24 de junio, 2008. Dosis: 5×1013 esporas/ha. - Aplicación aérea de suspensión de esporas en agua, 9 de septiembre, 2008. Dosis: 1×1013 esporas/ha.

PLADYSA

10 muestras: - AA* - 1 dda* - 3 dda - 7 dda - 15 dda - 1 mda* - 2 mda - 3 mda - 4 mda - 5 mda

Finca La Libertad, Ingenio Palo Gordo

Lote comercial

- Dos aplicaciones de suspensión de esporas en agua con bomba de mochila, al pie de la macolla. Dosis: 5×1012 esporas/ha.

PLADYSA

9 muestras: - AA - 1 dda - 3 dda - 7 dda - 15 dda - 1 mda - 2 mda - 3 mda - 4 mda

Finca El Bálsamo, Ingenio Pantaleón

Ensayo de CENGICAÑA

- Una sola aplicación de suspensión de esporas en agua con bomba de mochila al pie de la macolla, 24 de junio, 2008. Dosis: 2×1013 esporas/ha.

CG93-3

8 muestras: - AA - 1 dda - 3 dda - 7 dda - 15 dda - 1 mda - 2 mda - 3 mda

Finca Los Tarros, Ingenio La Unión

Ensayo de CENGICAÑA

- Incorporado al suelo con el aporque mezclado con harina de maíz, 23 de julio, 2008. Dosis: 2×1013 esporas/ha.

472

7 muestras: - AA - 3 dda - 5 dda - 7 dda - 15 dda - 1 mda - 2 mda

Fuente: Proyecto FODECYT 066-2006. * AA = antes de la aplicación; dda = días después de la primera aplicación; mda = meses después de la primera

aplicación.

22

Es importante mencionar que durante el cultivo de muestras de suelo

en medio selectivo se enfrentaron problemas por el crecimiento de

Aspergillus sp. que no permitió el crecimiento de M. anisopliae. El

problema se resolvió añadiendo 4 mg/l del fungicida Thiabendazole, que

inhibe el crecimiento de Aspergillus sp., pero permite el crecimiento de

Metarhizium sp. (Luz et al., 2007).

Figura 2: Pasos para obtener Metarhizium anisopliae de muestras de suelo en medio semiselectivo.

a) Se mezclaron 20 g de suelo con 100 ml de una solución de Na4P2O7

.10H2O y se agitaron a 120 rpm por tres horas.

b) Se sembraron 100 µl en medio semiselectivo.

c) Se incubó a 26ºC bajo condiciones de luz para obtener colonias de hongos.

d) De las distintas colonias que crecieron se identificaron las de M. anisopliae y se aislaron a medio de Haba.

e) Se incubó para obtener únicamente colonias de M. anisopliae.


23

I.4.2.4.1 Cultivo del hongo por infección de larvas

Cuando no fue posible obtener colonias de M. anisopliae en

medio semiselectivo, se procedió a infectar larvas de Palomilla de los

apiarios (Galleria mellonella) con el suelo de la muestra colectada.

Estas larvas fueron criadas en laboratorio, por lo que no presentaban

ningún otro hongo que pudiera contaminar las potenciales colonias

que se recuperaran de las muestras de suelo. El procedimiento

seguido se describe a continuación:

1- Las larvas de G. mellonella se colocaron en un recipiente plástico

con tapadera que contenía la muestra de suelo. Se colocó 10 larvas

por cada muestra.

2- Dado que las larvas se desplazan verticalmente hacia arriba, cada

24 horas se volteó cada recipiente para forzar a que estuvieran en

contacto con el suelo y se infectaran. Después de 10 días se

destaparon los recipientes y se extrajeron las larvas. La mayoría

estaban en estado pupal.

3- Las pupas se desinfectaron en una solución de cloro al 2%, se

lavaron dos veces con agua desmineralizada, estéril y se secaron

sobre papel absorbente. Posteriormente se colocaron en cámaras

húmedas, de la forma en que se describe en los pasos 3 y 4 de la

metodología descrita anteriormente para el cultivo de Metarhizium

anisopliae (ver Figura 3).

24

Figura 3: Pasos para obtener Metarhizium anisopliae de muestras de suelo, infectando larvas de Galleria mellonella.

a) La muestra de suelo se depositaron en cajas con tapadera, donde se infectó las larvas de Galleria mellonella.

b) Después de 10 días se buscaron las pupas de G. mellonella en el suelo.

c) Se eliminó el exceso de tierra y cada pupa se extrajo de la cobertura que forma.

d) Se desinfectaron en una solución de cloro al 2% y se lavaron con agua estéril.

e) Se colocaron en cámaras húmedas y se incubaron.

f) Las que produjeron micelio se colocaron en una nueva cámara húmeda.

g) Se incubó hasta que el hongo esporuló.

h) Se aisló a medio de Haba. i) Se incubó para que las colonias esporularan.


25

I.4.2.4.2 Cultivo monospórico del hongo

Al crecer las colonias de Metarhizium, se procedió a cultivar

esporas individuales para determinar la identidad de la cepa, o

verificar la presencia de otras cepas. El primer paso consiste en

obtener una suspensión de esporas diluida. Para ello se procedió de la

siguiente manera:

1- Se preparó una solución de Tween®, colocando una gota de éste

en 300 ml de agua destilada.

2- En 10 ml de solución de Tween® se depositó un trozo de 5 mm x 5

mm de medio con esporas de una colonia. El tubo se agitó hasta que

se desprendieron todas las esporas y el trozo de medio quedó limpio

(ver Figura 4).

2- Se hizo dos diluciones en serie en proporción 1:10 en agua con

Tween®.

3- Se tomó 60 µl (2 gotas) y se colocó en un plato con una capa fina

de medio agar-agua (15 g de agar por litro de agua). La suspensión se

esparció con una varilla doblada.

4- Los platos se incubaron a 26ºC bajo luz por un período de 24

horas para inducir germinación. En algunos casos fue necesario

incubar por más tiempo.

5- Utilizando un microscopio se localizó esporas germinadas aisladas

en el campo de observación con el objetivo 10× del microscopio, se

cortó con un aislador monospórico esterilizado a la llama. Con este

26

instrumento se obtiene un círculo de medio de cultivo con una

espora.

6- Se sembró dos círculos por caja con medio de Haba y se incubó

bajo las condiciones previamente descritas (ver Figura 4).

7- Cuando se desarrolló la colonia, se procedió a extraer el ADN

siguiendo los pasos previamente descritos (sección Extracción de

ADN, página 13).

8- Con el ADN extraído se procedió a correr reacciones de PCR

como se describe anteriormente (sección Microsatélites o

Repeticiones de Secuencias Simples, SSRs, página 17).

Soluciones utilizadas

Medio semiselectivo

Con calor, mezclar 10 g de peptona de carne digerida en páncreas, 20

g de D-glucosa, 18 g de agar.

Aforar a un litro con agua desmineralizada. Esterilizar a 18 lb/pulg2 y

120ºC. Enfriar a 60ºC y añadir 0.6 g de Estreptomicina, 0.05 g de

Tetraciclina, 0.05 g de Cicloheximida y 4 mg de Thiabendazole.

27

Figura 4: Pasos para obtener cultivos monospóricos de Metarhizium anisopliae de las colonias aisladas de la muestras de suelo.

a) Se colocó un trozo de medio con esporas dentro de un tubo con agua y Tween®.

b) Se sembró en medio agar-agua y se incubó durante 24 horas. Se observó al microscopio.

c) Se localizó una espora germinada.

d) Se cortó la porción de medio que contenía la espora germinada.

e) La porción de medio se sembró en una caja de Petri con medio de Haba.

f) Se incubó para que se desarrollara la colonia.


28

PARTE II

29

II. MARCO TEÓRICO

II.1 Control biológico

En agricultura, control biológico o biocontrol, es el uso de organismos para

reducir poblaciones de plagas, con el objetivo de disminuir su efecto sobre el cultivo. El

control biológico puede utilizarse contra todo tipo de plagas, ya sean organismos

vertebrados, patógenos, malezas o insectos. Los métodos y agentes utilizados son

diferentes para cada tipo de plaga (Stoner, 1996).

Los agentes de control biológico son considerados como alternativas o

suplementos del uso de insecticidas químicos que, como se sabe, tienen efectos tóxicos

en organismos inocuos, incluyendo animales y seres humanos. Además, el uso

indiscriminado de productos químicos provoca que especies económicamente

insignificantes, se tornen en plagas dañinas; por el contrario, cuando se utiliza un

método no tóxico de control, los enemigos naturales tienen más probabilidad de

sobrevivir y reducir el número y daño de organismos plaga (Scholte et al., 2004b,

Stoner, 1996).

En el caso de insectos plaga, existen tres tipos de enemigos naturales (tomado de

Stoner, 1996):

a) Depredadores.

b) Parasitoides.

c) Patógenos.

a) Depredadores: En este caso, se el término se refiere a organismos que se

alimentan de insectos. Los insectos son un alimento importante para muchos

vertebrados, incluyendo aves, anfibios, reptiles, peces y mamíferos.

Generalmente, estos vertebrados insectívoros se alimentan de varias especies y

muy raramente se enfocan en una sola, a menos que ésta sea muy abundante.

30

Entre los depredadores, los insectos son el tipo más comúnmente usado en

control biológico, dado que su presa se constituye en un rango más pequeño de

especies. Estos depredadores, al poseer ciclos de vida más cortos, pueden

también fluctuar en densidad de población, como respuesta a cambios en la

densidad de la población de su presa. Entre los insectos depredadores

importantes se incluyen escarabajos, mariquitas, crisópidos y sírfidos. Arañas y

algunas familias de ácaros también son depredadores de insectos y ácaros plaga.

b) Parasitoides: Los parasitoides son insectos con un estadio inmaduro que se

desarrolla sobre o dentro de un huésped insectil que finalmente muere.

Generalmente los adultos son organismos de vida independiente y en algunos

casos son depredadores. Algunos también recurren a otras fuentes de alimento,

tales como exudados y néctares vegetales, o polen. Dado que los parasitoides

deben estar adaptados al ciclo de vida, fisiología y grado de inmunidad de su

hospedero, muchos de ellos están limitados a una sola especie o algunas pocas

emparentadas entre sí. Por lo tanto, la identificación exacta de las especies del

hospedero y parasitoide es muy importante al querer utilizarlos como medio de

control.

c) Patógenos: Los insectos, al igual que los animales y las plantas son

infectados por bacterias, hongos, protozoos y virus que les causan un

determinado tipo de enfermedad, por lo que se les denomina

“entomopatógenos”. Estas enfermedades pueden reducir el crecimiento y nivel

de crecimiento de una plaga insectil, disminuir o evitar su reproducción, o

matarlos. Además, los insectos también son atacados por nemátodos que, junto

con las bacterias que llevan dentro, les causan una enfermedad o la muerte. Bajo

ciertas condiciones, las enfermedades pueden multiplicarse y esparcirse

naturalmente por la población de insectos, lo que finalmente mata al hospedero,

particularmente cuando la densidad poblacional del insecto es alta.

31

Los agentes de control biológico nativos y los enemigos naturales introducidos,

una vez adaptados al ambiente, son un recurso auto-renovable, dado que ellos

sobreviven alimentándose del insecto plaga y su costo es, únicamente, aquel en el que

se incurra por favorecer su establecimiento en el ambiente.

II.2 Hongos entomopatógenos

Los hongos entomopatógenos son factores clave en la regulación de las

poblaciones de insectos en la naturaleza y han adquirido importancia en el control de

insectos plaga (Charnley, 1997). Aunque los micoinsecticidas aún constituyen un

porcentaje pequeño dentro del mercado total de insecticidas, los hongos

entomopatógenos son la única alternativa de control microbiano para insectos

chupadores que se alimentan de fluidos animales y vegetales y para ortópteros

(principalmente Acrididae) y coleópteros plaga que no tienen ningún patógeno viral o

bacteriano conocido (Fang et al., 2005).

Los hongos entomopatógenos más utilizados como agentes para controlar

insectos plaga, pertenecen a los géneros Beauveria, Verticillium, Paecilomyces,

Tolypocladium y Metarhizium (Scholte et al., 2004a).

II.3 Metarhizium anisopliae

Metarhizium anisopliae Metchnikoff fue descubierto en 1878 parasitando al

Escarabajo de los cereales, Anisoplia austriaca (Hbst.), de donde recibió su epíteto

específico (Allard, 1987). Es un hongo haploide, deuteromiceto, actualmente

reconocido por ser entomopatógeno para más de 200 especies, incluyendo varias

especies de plagas importantes de cinco órdenes de insectos además de arácnidos

(Scholte et al. 2004a). Puesto que, ante al uso de insecticidas químicos este hongo

ofrece una alternativa amigable con el ambiente, es de mucho interés para el control de

plagas de importancia para la agricultura, al igual que la búsqueda de cepas más

virulentas para aplicaciones de control biológico (Bidochka et al., 2001).

32

Metarhizium anisopliae consiste de cuatro variedades, dos de las cuales se

consideran importantes: M. anisopliae var. acridum (anteriormente denominada M.

flavoviridae) encontrada principalmente en especies de Homoptera, y M. anisopliae

var. anisopliae (Metschnikoff) Sorokin, que es la más conocida de las dos variedades.

En insectos terrestres, el ciclo de vida comienza con un conidio que se adhiere a la

cutícula del hospedero, formando un apresorio que penetra la cutícula y que, una vez

dentro, forma las hifas que producen y liberan toxinas, matando al hospedero 4-16 días

después de la infección (dependiendo, principalmente, de la especie del hospedero).

Dichas toxinas incluyen Destruxinas, Swainsinonas y Citocalacina C. Un estudio

histopatológico de tejidos de elatéridos (gusanos alambre) infectados con M.

anisopliae, sugiere que las toxinas (destruxinas) matan al hospedero provocando la

degeneración del tejido por la pérdida de la integridad estructural de las membranas y

luego deshidratación de las células por pérdida de fluidos. Si las condiciones son

cálidas y húmedas, los conidióforos crecen a través de la cutícula y cubren totalmente al

insecto con conidios (Ferron, 1981).

La temperatura óptima de crecimiento para la mayoría de cepas es 27-28ºC,

aunque existen algunas excepciones reportadas, que tienen resistencia al frío o al calor.

Los conidios normalmente requieren una humedad relativa de por lo menos 92% para

poder germinar y cuando la humedad relativa es alta, los conidios pueden tolerar

temperaturas más altas. Sin embargo, conidios almacenados en condiciones secas han

demostrado mayor germinación que conidios almacenados en aceite de parafina (96 vrs.

93%, respectivamente). Las condiciones de almacenamiento han demostrado ser más

críticas para la esporulación y virulencia, que el sustrato sobre el cual se producen los

conidios. (Scholte et al., 2004a). En el Laboratorio de Entomología de CENGICAÑA

las condiciones a las que mejor responde el hongo incluyen medio de cultivo con base

en Haba (Vicia faba), una temperatura de 26ºC y luz permanente (Alemán y Ovalle,

1998).

33

En general, M. anisopliae posee varias características que lo presentan como un

agente microbiano de control muy interesante: causa alta mortalidad en poblaciones de

larvas de laboratorio, el hongo se puede reproducir en cantidades masivas sobre medios

artificiales muy económicos y los conidios se pueden almacenar fácilmente. Además, a

diferencia de Beauveria, su efecto no está limitado a períodos pupales del hospedero

(Scholte et al., 2004a).

Es así que en la zona cañera guatemalteca existen, actualmente, cuatro

laboratorios de producción del hongo ubicados en los ingenios La Unión, Santa Ana,

Pantaleón y Magdalena.

II.4 Plagas de la caña de azúcar

II.4.1 Chinche salivosa

La plaga que más afecta el rendimiento de la caña de azúcar es la Chinche

salivosa. Éste es un insecto con un aparato bucal picador-chupador que se

alimentan de la savia de especies gramíneas, incluyendo la caña de azúcar.

Aeneolamia postica es la especie más común, representando el 96% de la

población, y Prosapia simulans el 4% restante (CAÑAMIP b, 2004). El estado

ninfal posee el período de mayor duración con variaciones entre 27-44 días para A.

postica y 22-60 días para P. simulans, en tanto que los adultos representan un

período de vida mucho más corto, entre 6 y 15 días (Peck, 2001). En general, el

estado ninfal se caracteriza por la producción de una espuma conocida como

salivazo, dentro del cual debe ocurrir el desarrollo de cinco instares antes de

alcanzar la fase adulta. Tanto las ninfas como los adultos utilizan su estilete para

elaborar túneles de alimentación que siempre finalizan en los elementos del

xilema, una característica muy particular, dado que la mayoría de insectos

chupadores se alimentan del floema. Debido a la baja calidad de la savia del

xilema, la duración de la fase ninfal se prolonga más tiempo que en otros insectos

chupadores, además, los elementos del xilema tienen una presión osmótica

34

negativa, de manera que el insecto debe hacer un mayor esfuerzo para extraer su

alimento y es probable que por ello los cercópidos, como la chinche salivosa, han

desarrollado caracteres anatómicos especiales como el clípeo, en el aparato bucal,

que es utilizado como un músculo de succión. Esto explica la necesidad del estado

ninfal en especies rizófagas como A. postica, de buscar las raicillas de la caña de

azúcar y los pastos para pasar todo este período de su vida en la base de las

plantas. Las raíces superficiales de cualquier cultivo, en general, tienen menor

presión negativa e incluso por la noche ésta disminuye, siendo más fácil para la

ninfa succionar la savia (Márquez et al., 2004).

En estado adulto, el insecto migra hacia las hojas y durante su proceso

alimenticio inyectan una sustancia que destruye e interfiere con la síntesis de

clorofila, alterando así el desarrollo normal de la planta y la acumulación de

sacarosa en los tallos. El período crítico va de los seis a los ocho meses de edad de

la caña de azúcar y la pérdida causada es de 8.21 toneladas de caña por hectárea y

12.82 libras de azúcar por tonelada de caña por cada adulto por tallo (Márquez,

2005).

II.4.2 Gallina ciega

Otra plaga de importancia tanto para la caña de azúcar, como para muchos

otros cultivos es la Gallina ciega, que en el caso de la agroindustria azucarera

guatemalteca está compuesta principalmente por especies del género Phyllophaga

(Coleoptera:Scarabaeidae), siendo las más importantes P. dasypoda, P. latipes y P.

parvisetis. Además, las larvas de varias especies de Phyllophaga causan daños

severos a muchos cultivos en América Central y parte de Sur y Norteamérica.

Entre los cultivos afectados están maíz, papa, pastos, hortalizas, granos básicos,

algunos cultivos perennes y viveros forestales (King y Saunders, 1984).

Las larvas de Gallina ciega causan daños a la planta de caña de azúcar al

alimentarse de las raíces y parte subterránea de los tallos. El primer síntoma es un

35

amarillamiento de las hojas (clorosis). A esto, comúnmente, sigue un crecimiento

raquítico, oscurecimiento en la superficie de los tejidos, acame y muerte en casos

de infestación severa. Generalmente el daño es más severo en las socas y se hace

más evidente en los surcos ubicados a las orillas de los lotes (Cherry, 1991).

Posteriormente, los adultos se alimentan de hojas y brotes tiernos, néctar y los

botones de las flores (CAÑAMIP a, 2004).

En Guatemala, las pérdidas reportadas en caña de azúcar, son de 0.62

Tm/ha por cada larva de Gallina ciega por metro cuadrado de incremento en

campo, en la zona baja, es decir, con altitudes de 0-100 msnm (Márquez y Ralda,

2005) y 0.88 Tm/ha en la zona media: 100-300 msnm (Márquez y Sandoval,

2003).

II.5 Control biológico de plagas de la caña de azúcar con M. anisopliae

II.5.1 Control biológico de Chinche salivosa con M. anisopliae

Metarhizium anisopliae se produce comercialmente en países como

Australia, Sudáfrica, Alemania, Brasil, Guatemala, entre otros muchos, para el

control biológico de plagas en cultivos comerciales.

En el caso de la caña de azúcar, se utiliza en el control de organismos como

Aeneolamia varia saccharina Dist., Aeneolamia postica y Prosapia simulans,

(ambas Homoptera:Cercopidae), que son de las especies de plagas que más

pérdidas provocan en el cultivo. Además, este hongo también ha demostrado ser

efectivo en el control de plagas del suelo como Gallina ciega (Phyllophaga sp.),

Chinche hedionda (Scaptocoris talpa) y Picudo (Sphenophorus sp.).

Para el caso de la Chinche salivosa, cuando M. anisopliae se aplica al

suelo, actúa controlando ninfas y después, al hacerlo sobre la parte aérea de la

planta, controla adultos, reduciendo las poblaciones en 30% (Risco, 1981).

36

Debido a que la chinche salivosa, principalmente del género Prosapia, afecta a

algunos pastos utilizados como alimento para ganado, (Peck, 1993), actualmente

en Guatemala, también se está utilizando el hongo para el control de Chinche

salivosa en pastizales.

En Brasil, Alves (1986) reporta que al aplicar 5 x 1012 conidios/ha de M.

anisopliae, con peso variable, se logró obtener un control de 65-96% de las

poblaciones de Aeneolamia selecta, una plaga de pastos forrajeros en dicho país.

Esta dosis es la misma que se utiliza en la zona cañera guatemalteca para controlar

Chinche salivosa, A. postica y P. simulans (Carrillo et al., 1995; Márquez et al.,

2005). En el año 2003 del área afectada por esta plaga, aproximadamente 4,000 ha

presentaron daño severo. El 73% de las prácticas de control sobre un área de

36,000 ha, se hizo con las cepas del hongo M. anisopliae: CG93-3, híbrido

PLADYSA, Yara 10 y PL 43. En el año 2004 el daño observado se redujo en un

32% respecto al año anterior y a pesar de esto, las pérdidas alcanzaron un valor de

US$ 2,201,960.00, debido tanto a la reducción en tonelaje de caña como a la

reducción en recuperación de sacarosa en fábrica (Márquez et al., 2005).

En Barbados el control de chinche salivosa con M. anisopliae ha tenido

tanto éxito, que los resultados obtenidos con la aplicación se han tomado como

estándar para evaluar diversos métodos de control de esta plaga (Des Vignes y Ali-

Sing, 1998; Des Vignes y Phelps, 1995).

II.5.2 Control biológico de Gallina ciega con M. anisopliae

En Australia el daño causado por Gallina ciega es el que más pérdidas

causa a la agroindustria azucarera, por lo que en este país se han realizado más

estudios encaminados a encontrar una estrategia de control eficiente. Conscientes

del peligro que representa depender de un solo producto químico para controlar

dicha plaga se han destinado muchos recursos a la investigación de métodos de

control biológico como el uso Metarhizium anisopliae. Comercialmente cuentan

37

con el producto denominado BioCane®, cuyo ingrediente activo es M. anisopliae

(Sallam et al., 2007).

En cuanto a investigaciones hechas, destacan los estudios para determinar

la presencia del hongo en el suelo después de su aplicación. Por ejemplo, en un

estudio realizado por Allsopp y Chandler (1989) se indica que una dosis alta del

hongo, aplicada cerca de los esquejes en la fase de plantía puede producir un

ambiente tóxico para Gallina ciega por un período de al menos dos años,

dependiendo del tipo de suelo. Además, reportan que los conidios de Metarhizium

sobreviven bien en el campo por aproximadamente tres años y no parecen ser

afectados por la mayoría de insecticidas y herbicidas cuando éstos son utilizados

en las dosis recomendadas. Luego, en 1990 Samuels et al., a través de un

experimento en campo, también encontraron que el hongo sobrevivió en el suelo

por 30 meses y causó mortalidad en hospederos de Gallina ciega de la especie

Antigrogus parvulus, a un nivel aceptable a escala comercial.

De la misma manera, en la zona cañera guatemalteca se realizan

investigaciones sobre varios métodos de control de esta plaga, dentro de los cuales,

la utilización de la cepa de Metarhizium anisopliae NB, ha demostrado reducir las

poblaciones de larvas de Gallina ciega en un 81.9%, tecnología que presenta una

rentabilidad de 881%, de acuerdo a la investigación realizada por el Centro

Guatemalteco de Investigación y Capacitación de la Caña de Azúcar –

CENGICAÑA- en ingenios azucareros, durante la zafra 2007-2008

(CENGICAÑA, 2009).

II.6 Permanencia de M. anisopliae en el suelo

El uso de M. anisopliae como agente de control biológico se basa en su

capacidad de causar epizootias que mantienen naturalmente controladas las poblaciones

de insectos plaga en el campo, dado que estos tienen la capacidad de auto reproducirse

38

sobre las larvas y adultos, aumentando la concentración de sus propágulos, lo cual

ayuda a su establecimiento en campo (Hidalgo, 2001).

El Programa de Manejo Integrado de Plagas de CENGICAÑA realizó un

estudio de caracterización del comportamiento de la epizootia de las cepas CG93-3 y

Yara 10, que son las más utilizadas en la agroindustria cañera guatemalteca. Cuando

dichas cepas fueron aplicadas en el mes de junio, se encontró que ambas tienen una alta

capacidad de infección sobre adultos, sin encontrar diferencia significativa entre ambas.

Además, se evaluó el parasitismo de las mismas cepas al realizar una aplicación tardía

y, a pesar de ser de menor magnitud, se obtiene un control adecuado incrementando la

dosis de conidias aplicada (CENGICAÑA, 2005).

Recientemente, en 2007, Sallam et al. realizaron un estudio de muestreo de

esporas de M. anisopliae en el suelo por medio de un taladro especial. Los muestreos se

realizaron de 10-40 cm de profundidad y los resultados obtenidos demuestran la

habilidad del hongo de desplazarse por el perfil del suelo e, incluso, a través de los

surcos, aparentemente por el movimiento de los insectos hospederos que se encuentran

en el suelo.

Respecto a la permanencia de M. anisopliae en el suelo, se ha demostrado que

el hongo es capaz de desarrollarse e infectar larvas de Gallina ciega en un rango

bastante amplio de temperaturas, niveles de humedad del suelo y concentraciones de

inóculo en el estado de Florida, Estados Unidos (Raid and Cherry, 1992). Además, en

un trabajo realizado en Australia, donde se estudió la permanencia del protozoo

entomopatógeno Adelina sp., comparándola con la de M. anisopliae, se demostró que

éste último es muy tolerante a las labores agrícolas que se realizan en el campo de

cultivo, encontrándose una sobrevivencia 5 veces mayor que la del protozoo en suelo

desprovisto de cobertura vegetal (Sallam et al., 2003).

También en Australia, con financiamiento de la Corporación para la

Investigación y Desarrollo de la Caña de Azúcar, SRDC (por sus siglas en inglés), en

39

los años 2000-2002 se realizó un estudio que incluyó dos pruebas de persistencia de

esporas del hongo en el suelo donde, después de aplicar 500 g de hongo por hectárea,

encontraron que la supervivencia anual de la cepa FI-1045 en el norte de Queensland

fue de 40-56%, y la de la cepa FI-147 en el sur de la región fue de 49-52%. En el

mismo estudio se determinó que hay muy poca diferencia de sobrevivencia entre

diversas formulaciones (SRDC, 2002).

II.7 Marcadores genéticos

Los marcadores genéticos son entidades heredables que están asociadas a

caracteres económicamente importantes y pueden ser utilizados por los mejoradores

como herramientas de selección (Staub et al., 1996).

De acuerdo a Staub et al. (1996), hay tres clases de marcadores:

a) Marcadores morfológicos

b) Marcadores bioquímicos

c) Marcadores moleculares

a) Marcadores morfológicos: que son características del fenotipo, como

forma, tamaño o color, que distinguen a los organismos entre sí y que son

controladas por un solo locus. Estos son los marcadores genéticos más

antiguos. Sin embargo tienen la desventaja de ser afectados de manera

intensa por el medio ambiente y muchas veces es difícil distinguir si un

cambio observado ha sido provocado por un cambio en el genoma del

individuo o por un cambio en el medio ambiente en el que se desarrolla.

b) Marcadores bioquímicos: que son compuestos producidos durante el

metabolismo de los organismos y han sido utilizados por los mejoradores a

fin de evitar el efecto del medio ambiente en la selección. Estos pueden ser

metabolitos secundarios, proteínas estructurales o enzimas. Los más

40

utilizados son las proteínas de almacenamiento y las isoenzimas. Las

isoenzimas han sido definidas como variantes de una misma enzima, con

igual función, en un mismo individuo (Markert and Moller, 1959). Entre las

ventajas que presentan respecto a los marcadores morfológicos tenemos que

son de origen genético, la codominancia (expresión conjunta de los dos

alelos en un heterocigoto) y la independencia de un gen al efecto del

ambiente. Por otro lado, presentan las desventajas de estar sujetas a

modificaciones después de la traducción del Ácido Ribonucleico (ARN), de

existir únicamente en algunos tejidos y el número limitado de marcadores

para el enorme esfuerzo requerido para obtener suficiente información.

c) Marcadores moleculares: que son fragmentos de ADN que marcan

segmentos cromosómicos, los cuales permiten marcar los genes que

interesan en la investigación. Están basados en variación en el Ácido

Desoxirribonucleico, ADN. Los marcadores moleculares no son afectados

por el medio ambiente, ya que se basan en las propiedades del ADN y la

información genética no cambia aunque los organismos estén sujetos a

condiciones ambientales variadas. La información del ADN es constante en

cualquier parte del organismo y en cualquier etapa del desarrollo (Mendoza-

Herrera y Simpson, 1997).

De acuerdo a estas definiciones, para realizar estudios de permanencia de

microorganismos en el suelo, los marcadores moleculares son los más útiles.

Entre los marcadores moleculares anteriormente utilizados para estudiar M.

anisopliae están los Polimorfismos de ADN Amplificados al Azar, RAPDs, por sus

siglas en inglés (Random Amplified Polymorphic DNA) (Fegan et al., 1993; Bidochka et

al., 1994) y los microsatélites o Repeticiones de Secuencias Simples, SSRs (Simple

Sequence Repeats) (Enkerli et al., 2005).

41

II.8 Polimorfismos de ADN Amplificados al Azar, RAPDs

Los RAPDs fueron desarrollados simultáneamente en 1990 por Williams et al. y

Welsh y McClelland, quienes los describen como una técnica basada en la Reacción en

Cadena de la Polimerasa o PCR (ver glosario) más flexible, donde se realiza una

amplificación con un oligonucleótido o primer corto (diez bases) de secuencia aleatoria

para generar arreglos de fragmentos de ADN particulares de una determinada especie

(Williams et al., 1990; Welsh and McClelland, 1990).

La generación de marcadores RAPDs se basa en la probabilidad de que una

secuencia de ADN homóloga a la del primer, se encontrará en diversos sitios en ambas

cadenas de la plantilla de ADN bajo estudio, a distancias en las que se pueden

multiplicar por medio de PCR. Cuando se cumplen estas características, el primer

simple impulsa la multiplicación exponencial de fragmentos de la cadena de ADN. Es

decir, cada primer de 10 bases promueve la generación de varios productos de ADN,

los cuales se considera que se originan de distintos loci genéticos. Los polimorfismos

resultan de mutaciones o una reorganización de los sitios donde los primers se unen al

ADN. Los productos de la multiplicación de la cadena original se separan en un gel de

agarosa, se observan como bandas y la información sobre los organismos bajo estudio

está dada por la presencia o ausencia de bandas (Waugh, 1997).

Cada banda de ADN puede tratarse como un alelo. Otros alelos para un mismo

locus no se distinguen fácilmente. En un análisis genético, la banda observada en un gel

se considera un marcador dominante. Por lo tanto, la variabilidad dentro de un locus se

desestima con esta técnica, pues organismos homocigóticos o heterocigóticos presentan

el mismo patrón de bandas (Gustafsson and Gustafsson, 1994).

Aunque esto representa algunas desventajas, éstas se compensan con las

numerosas ventajas que presenta la técnica, tales como simplicidad, accesibilidad por

no-especialistas y su potencial de automatización, las cuales han favorecido su amplia

utilización.

42

El análisis con marcadores RAPD presenta dos ventajas clave. Primera, que no

demanda conocimiento previo de la secuencia genética de las especies bajo estudio. Y

segunda, que la técnica no depende de enormes cantidades de ADN para amplificar por

PCR (Lacerda et al., 2001).

A pesar de algunas limitaciones, como menor reproducibilidad, comparándola

con el estudio de alozimas, la naturaleza dominante de los marcadores y la

susceptibilidad a contaminación, generalmente los RAPDs revelan grandes cantidades

de variación y son un método útil en el estudio de relaciones taxonómicas a niveles de

población, especie y algunas veces, incluso de géneros (Lynch and Milligan, 1994).

II.8.1 Aplicación de RAPDs en estudios de cepas de M. anisopliae

En 1993 Fegan et al. demostraron que los RAPDs son útiles para rastrear

cepas entomopatógenas específicas de M. anisopliae, ya que al evaluar 31 cepas

del hongo que infectan plagas de caña de azúcar en Queensland, Australia, les fue

posible distinguir 30 diferentes genotipos de los patrones de RAPDs obtenidos, los

cuales, además, fueron similares entre cepas obtenidas de las mismas localidades

geográficas. La conclusión más importante de esta investigación es que dentro del

taxon M. anisopliae var. anisopliae existe una gran variabilidad.

Por su parte, Bidochka et al. (1994), realizaron también un estudio para

diferenciar 24 cepas de hongos deuteromicetos entomopatógenos, en el que

incluyeron las especies M. anisopliae, M. flavoviridae, especies no identificadas

de Metarhizium y Beauveria bassiana (En total 21 cepas de Metarhizium y 3 de

B. bassiana). El estudio se llevó a cabo con únicamente tres primers y los

resultados demostraron que los RAPDs constituyen una técnica útil para

diferenciar cepas de hongos entomopatogénicos, ya que algunas cepas mostraron

patrones idénticos con uno o dos primers, mas no con los tres. En el caso de las

cepas no identificadas de Metarhizium, al desarrollar sondas marcadoras a partir

43

de cuatro de las bandas características para una especie, fue posible determinar que

se trataba de cepas de M. flavoviridae.

También por medio de RAPDs, en el año 2001, Lopes de Carvalho et al.,

estudiaron cinco mutantes de una cepa de M. anisopliae utilizada en el control de

Mahanarva posticata y Deois flavopicta, que son plagas del cultivo de la caña de

azúcar en Brasil. En esta investigación, los perfiles RAPD hicieron evidentes las

diferencias genéticas entre la cepa original y los cinco mutantes (obtenidos por

radiación gamma).

II.9 Microsatélites o Repeticiones de Secuencias Simples, SSRs

Los microsatélites, también conocidos como SSRs (del inglés Simple Sequence

Repeats) son secuencias hipervariables de ADN que se repiten en tándems de uno a seis

pares de bases que representan una clase de ADN repetitivo comúnmente encontrado en

el genoma nuclear y de los organelos de organismos eucariotas. Estos loci pueden ser

amplificados a través de la Reacción en cadena de la Polimerasa, PCR, utilizando

primers específicos los cuales reconocen secuencias únicas en los flancos de las

regiones hipervariables. De este proceso resulta la producción de ADN en cantidad

suficiente para verse en geles de agarosa o, más comúnmente, de poliacrilamida. Es por

ello que pequeñas cantidades de ADN son suficientes para observar resultados. El uso

de este tipo de marcadores es simple y de alta repetibilidad. Sin embargo, el desarrollo

de primers que identifiquen secuencias microsatélite, funcionales y polimórficas es un

proceso laborioso y caro (Griffiths et al., 1996).

Los SSRs se han empleado en estudios de distancias genéticas y de diversidad

evolutiva en varios organismos (Cerón y Angel, 2001; Matsouka et al., 2002; Zerené,

2002).

44

II.9.1 Aplicación de microsatélites en estudios de cepas de M. anisopliae

La aplicación de microsatélites en estudios de M. anisopliae es más bien

reciente. En 2005, Enkerli et al. identificaron marcadores microsatelites a partir de

genotecas de Metarhizium, diseñando 14 pares de primers para amplificar esta

cantidad de loci, concluyendo que éstos son muy útiles para estudios ecológicos y

análisis de diversidad dentro de la población, así como para identificación,

monitoreo y rastreo de cepas de M. anisopliae, aplicadas como agentes de

biocontrol, debido a que los 14 loci fueron satisfactoriamente amplificados en las

34 cepas estudiadas, las cuales fueron colectadas en distintas localidades de Suiza.

Con base en los trabajos descritos, en este estudio se utilizaron dos tipos de

marcadores: RAPDs y microsatélites o SSRs.

45

PARTE III

46

III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

III.1 Caracterización molecular de 26 cepas de la colección del Laboratorio de

Entomología de CENGICAÑA

Se realizaron 13 reacciones con los RAPDs listados en el Cuadro 3.

Posteriormente, se realizaron 12 reacciones con los SSRs listados en el Cuadro 5. En los

ejemplos de las Figuras 5, 6, 7 y 8 se pueden observar los resultados de las reacciones

con los marcadores RAPD CK06 y H02, y los SSRs AY842942 y AY842948

respectivamente.

En el dendrograma de la Figura 9 se observa que, con un coeficiente de similitud

de 0.80, es decir, con un 80% de similitud, la mayoría de las cepas se mantienen

distantes, formándose únicamente dos grupos: CG01-02 y CG02-7 (CENGICAÑA-

Guatemala) con aproximadamente 85% de similitud y las cepas 2469 y 2982 (ARSEF-

Estados Unidos) con similitud del 89%. Para estos dos casos, la ventaja que representa

su similitud es que, en caso de ser necesario, se puede elegir una de las dos cepas

representativas de cada pareja, la que brinde más facilidades de multiplicación para

utilizarla en el control de plagas.

47

Figura 5: Geles de agarosa que muestran los resultados obtenidos con el primer CK06 en el análisis de 26 cepas de Metarhizium anisopliae.

La columna 1 presenta el patrón de la cepa 2135, la columna 2: 1046, columnas 3 y 4: 2469, columna 5: 2982, columna 6: 2134, columna 7: CG01-04, columna 8: CG01-02, columna 9: CG02-7, columna 10: CG93-3, columna 11: CG01-05, columna 12: 1859, columna 13: Yara 10, columna 14: 798, columna 15: 2139, columna 16: CG93-3, columna 17: CG03-8, columna 18: NB, columna 19: 3621, columna 20: 1858, columna 21: 472, columna 22: 346, columna 23: 977, columna 24: 1066, columna 25: 1901, columna 26: 2136, columna 27: 1912, columna 28: 1897, columna 29: CG93-3, columna 30: control negativo (agua en vez de ADN). Las columnas M contienen un marcador de peso molecular, para referencia.


Figura 6: Geles de agarosa que muestran los resultados obtenidos con el primer H02 en el análisis de 26 cepas de Metarhizium anisopliae.

La columna 1 presenta el patrón de la cepa 2135, la columna 2: 1046, columnas 3 y 4: 2469, columna 5: 2982, columna 6: 2134, columna 7: CG01-04, columna 8: CG01-02, columna 9: CG02-7, columna 10 y 11: CG93-3, columna 12: 1859, columna 13: Yara 10, columna 14: 798, columna 15: CG03-8, columna 16: 2139, columna 17: CG01-05, columna 18: NB, columna 19: 3621, columna 20: 1858, columna 21: 472, columna 22: 346, columna 23: 977, columna 24: 1066, columna 25: 1901, columna 26: 2136, columna 27: 1912, columna 28: 1897 y columna 29: control negativo (agua en vez de ADN). Las columnas M contienen un marcador de peso molecular, para referencia.


48

Figura 7: Gel de poliacrilamida que muestra los resultados obtenidos con el primer AY842942 en el análisis de 26 cepas de Metarhizium anisopliae.


Figura 8: Gel de poliacrilamida que muestra los resultados obtenidos con el primer AY842948 en el análisis de 26 cepas de Metarhizium anisopliae.


En ambos casos las columnas M contienen un marcador de peso molecular para referencia. La columna 1 presenta el patrón de la cepa 2135, columna 2: 1046, columna 3: 2469, columna 4: 2982, columna 5: 2134, columna 6: CG01-04, columna 7: CG01-02, columna 8: CG02-7, columna 9: CG01-05, columna 10: 1859, columna 11: Yara 10, columna 12: 798, columna 13: CG03-8, columna 14: 2139, columna 15: CG93-3, columna 16: NB, columna 17: 3621, columna 18: 1858, columna 19: 472, columna 20: 346, columna 21: 977, columna 22: 1066, columna 23: 1901, columna 24: 2136, columna 25: 1912 y columna 26: 1897.

49

Figura 9: Dendrograma que muestra la similitud genética de 26 cepas de Metarhizium anisopliae, de acuerdo con la información obtenida por medio de marcadores moleculares, según el índice de Dice (1945).


Luego de conocer que la cepa aplicada en dos de las parcelas a muestrear era el

híbrido PLADYSA, se decidió obtener colonias cultivadas en medio de Haba para

caracterizarla. Dado que esta cepa es el resultado de la hibridación de las cepas PL-43 y

Yara 10, se realizaron cultivos monospóricos de las tres cepas, para aplicarle

marcadores moleculares y comparar los patrones de bandas obtenidos. Como se observa

en la Figura 10 a, b y c, con los tres marcadores utilizados las cepas muestran un patrón

idéntico, por lo que se considera que hay un error en la identificación de al menos dos

de ellas.

50

Figura 10: Geles de poliacrilamida que muestran los resultados obtenidos al correr PCRs de las esporas de las cepas PLADYSA, PL-43 y Yara 10.

a b c a) Microsatélite AY842940. Columnas 1-5: PLADYSA, columnas 6-8 (6 y 7 en b) PL-43. Columnas 9-11 (8 y 9 en b): Yara 10.

b) Microsatélite AY842943. Columnas 1-5: PLADYSA, columnas 6 y 7: PL-43. Columnas 8 y 9: Yara 10.

c) Microsatélite AY842946. Columnas 1-5: PLADYSA, columnas 6-8: PL-43. Columnas 9-11: Yara 10.

Las columnas M contienen un marcador de peso molecular, con el tamaño de las bandas indicado en pares de bases.


51

III.2 Determinación de la presencia de M. anisopliae en el suelo

El proceso consistió en correr marcadores moleculares a los ADN extraídos de

las colonias que se aisló de las muestras de suelo, además del testigo que fue la cepa

aplicada, para verificar si lo recuperado fue el hongo aplicado u otra cepa. Se utilizaron

tres marcadores microsatélites que por su especificidad y repetibilidad se consideraron

los más adecuados: AY842940, AY842943 y AY842946 (Ver Cuadro 5).

A Continuación se describen y discuten los resultados obtenidos en cada una de

las cuatro parcelas muestreadas.

III.2.1 Finca Carrizales, Ingenio La Unión

En la finca Carrizales se tomaron muestras de suelo de un lote bajo

condiciones de manejo comercial, el cual, como se describe en la sección de

Materiales y Métodos, consistió en realizar cuatro aplicaciones de PLADYSA:

una terrestre, incorporando el hongo granulado al suelo, es decir, mezclado con

maíz quebrado, y tres aplicaciones aéreas, una de ellas también del hongo

granulado y dos aplicaciones de una suspensión de esporas.

Se realizaron 10 muestreos, desde antes de la primera aplicación hasta 5

meses después. Durante los cultivos de las muestras de suelo en medio

semiselectivo hubo dificultad para recuperar colonias de M. anisopliae 15 días y

un mes después de la primera aplicación. Sin embargo, al introducir larvas de

Galleria mellonella en el suelo (señaladas con una G en la Figura 11), se aisló

hongo en la totalidad de muestras. Sin embargo, como se observa en la Figura 11

a y b, de este lote se aislaron algunas cepas cuyos patrones de bandas difieren del

testigo PLADYSA (señaladas con un asterisco en la Figura 11), incluso aquellas

aisladas antes de la primera aplicación. Se hizo una comparación de patrones de

bandas con los de las cepas CG (nativas) del Laboratorio de Entomología (Figura

52

12), sin embargo, no se encontró ninguna coincidencia clara, por lo que se

considera que es necesario realizar un análisis más profundo de ellas.

La presencia de estas cepas en esa localidad puede estar relacionada con

los hallazgos de Keller et al. (2003), quienes reportan casos en que marcadores

microsatélites diseñados por Enkerli et al. (2001) han detectado cepas de

Beauveria brogniartii, -otra especie de hongo entomopatógeno-, seis años

después de su aplicación al suelo. En el análisis de los factores que pueden estar

relacionados con la sobrevivencia mencionan el tipo de suelo, la presencia del

hospedero y el clima. Sería interesante investigar si sucede lo mismo con M.

anisopliae.

Figura 11: Geles de poliacrilamida que muestran los resultados obtenidos al correr PCRs de las

esporas de hongo recuperadas del suelo de la finca Carrizales, del ingenio La Unión.

a b Columnas 1 y 2: antes de la aplicación, columnas 3 y 4: 1 dda, columnas 5 y 6: 3 dda, columna 7: 7dda, columna 8: 15 dda (aislada de larvas de G. mellonella), columnas 9 y 10: 1 mda (aislada de larvas de G. mellonella), columna 11: 2 mda, columna 12: 3 mda, columna 13: 4 mda, columna 14: 5 mda. Las siguientes cinco columnas corresponden a esporas individuales de PLADYSA, la cepa aplicada, y las columnas M contienen un marcador de peso molecular, con el tamaño de las bandas indicado en pares de bases.

a) Microsatélite AY842940, b) Microsatélite AY842946.

dda: días después de la primera aplicación, mda: meses después de la primera aplicación.


53

Figura 12: Gel de poliacrilamida que muestra los patrones obtenidos al correr dos microsatélites con las cepas aparentemente nativas de la finca Carrizales, ingenio La Unión, y de las cepas CG de la colección del Laboratorio de Entomología de CENGICAÑA.

Columnas 1 a 14: marcador AY842940, columnas 15-28 marcador AY842946. Las muestras se observan en el siguiente orden: columnas 1, 2, 15 y 16: muestras de suelo antes de la aplicación; columnas 3, 4, 17 y 18: 1 dda; columnas 5 y 19: 3 dda; columnas 6 y 20: 2 mda; columnas 7 y 21: 4 mda, columnas 8 y 22: 5 mda; columnas 9 y 23: cepa CG01-04; columnas 10 y 24: cepa CG01-02; columnas 11 y 25: cepa CG02-7; columnas 12 y 26: cepa CG01-05; columnas 13 y 27: cepa CG03-8; columnas 14 y 28: cepa CG93-3. Las columnas M presentan un marcador de peso molecular y el tamaño de las bandas se indica en pares de bases.


54

III.2.2 Finca La Libertad, Ingenio Palo Gordo

En la finca La Libertad también se tomaron muestras de suelo de un lote

bajo condiciones de manejo comercial, el cual, como se describe en el Cuadro 6,

consistió en realizar tres aplicaciones de PLADYSA de una suspensión de

esporas en agua.

En este lote se realizaron nueve muestreos, desde antes de la primera

aplicación hasta cuatro meses después, de los cuales se aisló hongo de todas las

muestras, a excepción de aquella colectada tres días después de la aplicación, a

pesar de haber intentado con medio semiselectivo e infectando larvas de G.

mellonella. En la Figura 13 a, b y c se puede observar que los patrones de todas

las muestras corresponden al del testigo PLADYSA, aún en la muestra tomada

antes de la aplicación, por lo que se considera que el hongo sobrevive de

aplicaciones hechas en años anteriores.

Figura 13: Geles de poliacrilamida con los resultados obtenidos al correr PCRs de las esporas de

hongo recuperadas del suelo de la finca La Libertad, del ingenio Palo Gordo.

a b c Columnas 1 y 2: antes de la aplicación, columna 3: 1 dda, columna 4: 7dda, columna 5 y 6: 15 dda, una de medio selectivo y una de larvas de G. mellonella, respectivamente. La columna 7: 1 mda, columna 8: 2 mda, columna 9: 3 mda, columna 10: 4 mda. Las siguientes cinco columnas corresponden a esporas individuales de PLADYSA, la cepa aplicada y, en el tercer gel, la columna M contiene un marcador de peso molecular, con el tamaño de las bandas indicado en pares de bases.

a) Microsatélite AY842940, b) Microsatélite AY842943, c) Microsatélite AY842946.


55

III.2.3 Finca El Bálsamo, Ingenio Pantaleón

En la finca El Bálsamo se tomaron muestras de suelo de un lote, en el cual

se establecieron parcelas de ensayo del Programa de Manejo Integrado de Plagas

de CENGICAÑA, en el cual se evaluaron diversos métodos para controlar

Gallina ciega (Phyllophaga sp.), uno de los cuales fue la aplicación de una

suspensión de esporas en agua, de la cepa CG93-3 de M. anisopliae, al pie de la

macolla. Como se observa en el Cuadro 6, en esta parcela se realizó una sola

aplicación.

Dado que la aplicación del hongo se realizó en el mes de junio, de esta

parcela se realizaron ocho muestreos, desde antes de la primera aplicación hasta

tres meses después. A excepción de la muestra tomada antes de la aplicación, se

obtuvo hongo de todas las demás muestras, tanto con medio semiselectivo, como

infectando larvas de G. mellonella (señaladas con una G en la Figura 14). En la

Figura 14 a y b se puede observar que todos los patrones de las muestras

corresponden al del testigo CG93-3, que fue la cepa aplicada, lo cual demuestra

que el hongo sobrevive en el suelo por lo menos tres meses después de su

aplicación, en suspensión de esporas en agua.

56

Figura 14: Geles de poliacrilamida que muestran los resultados obtenidos al correr PCRs de las esporas de hongo recuperadas del suelo de la finca El Bálsamo, del ingenio Pantaleón.

a b

Columnas 1 y 2: 1 dda, columna 3 y 4: 3 dda, columna 5 y 6: 7 dda una de medio selectivo y una de larvas de G. mellonella, respectivamente, columnas 8 y 9: 15 dda, una de medio selectivo y una de larvas de G. mellonella, respectivamente. La columna 10: 1 mda, columna 11: 2 mda, columna 12: 3 mda. Luego CG93-3, la cepa aplicada, y las columnas M contienen un marcador de peso molecular, con el tamaño de las bandas indicado en pares de bases.

a) Microsatélite AY842940, b) Microsatélite AY842946.


57

III.2.4 Finca Los Tarros, Ingenio La Unión

En la finca Los Tarros se tomaron muestras de una de las parcelas de un

ensayo del Programa de Entomología de CENGICAÑA, en el cual se evaluaron

diversos métodos para controlar Chinche hedionda (Scaptocoris talpa). La

parcela muestreada corresponde a la aplicación de la cepa 472 de ARSEF, de M.

anisopliae, mezclada con harina de maíz, incorporándola al suelo. En esta parcela

también se realizó una sola aplicación.

En este caso, la aplicación se realizó en el mes de julio, por lo que se

realizaron siete muestreos, desde antes de la primera aplicación hasta dos meses

después. De los muestreos, no fue posible aislar hongo del suelo, 5, 7 y 15 días

después de la aplicación. Sin embargo, uno, dos y tres meses después se encontró

hongo. Como se observa en la Figura 15 a, b y c, antes de la aplicación se

encontró una cepa con un patrón distinto al de 472, que es el mismo que presenta

la muestra colectada 3 días después. En cambio, las colonias obtenidas después

de un mes muestran el patrón de la cepa aplicada.

En el laboratorio se ha observado que el crecimiento de la cepa 472 es más

lento que el de otras, por lo que la ausencia de esporas en las muestras 5, 7 y 15

dda, podría deberse a que la cepa estaba estableciéndose en el suelo. No se

explica por qué la cepa encontrada al inicio no se volvió a recuperar en los

muestreos posteriores.

58

Figura 15: Geles de poliacrilamida que muestran los resultados obtenidos al correr PCRs de las esporas de hongo recuperadas del suelo de la finca Los Tarros, del ingenio La Unión.

a b c

Columnas 1 y 2: antes de la aplicación, columnas 3 y 4: 3 dda, columnas 5 y 6: 1 mda, columnas 7 y 8: 2 mda. La siguiente contiene 472, la cepa aplicada y, en el tercer gel, la columna M contiene un marcador de peso molecular, con el tamaño de las bandas indicado en pares de bases.

a) Microsatélite AY842940, b) Microsatélite AY842943, c) Microsatélite AY842946.


En el Cuadro 7 se presenta un resumen de los resultados obtenidos en las parcelas muestreadas, donde se observa que las cepas PLADYSA, en un caso y CG93-3 contaron con el mayor porcentaje de recuperación en los muestreos de suelo, aunque los porcentajes pueden estar afectados por el número de muestreos.

59

CUADRO 7: Porcentaje de recuperación de las cepas aplicadas en cada parcela muestreada.

Parcela (Nombre de la finca)

Cepa aplicada

No. de muestreo Tiempo

después de la primera aplicación*

Cepa recuperada

Porcentaje de

recuperación de la cepa aplicada

Carrizales PLADYSA

1 Antes Otra

40%

2 1d Otra 3 3d Otra 4 7d PLADYSA 5 15d PLADYSA 6 1m PLADYSA 7 2m Otra 8 3m PLADYSA 9 4m Otra 10 5m Otra

La Libertad PLADYSA

1 Antes PLADYSA

90%

2 1d PLADYSA 3 3d Ninguna 4 7d PLADYSA 5 15d PLADYSA 6 1m PLADYSA 7 2m PLADYSA 8 3m PLADYSA 9 4m PLADYSA

El Bálsamo CG93-3

1 Antes Ninguna

100%

2 1d CG93-3 3 3d CG93-3 4 7d CG93-3 5 15d CG93-3 6 1m CG93-3 7 2m CG93-3 8 3m CG93-3

Los Tarros 472

1 Antes Otra

33%

2 3d Otra 3 5d Ninguna 4 7d Ninguna 5 15d Ninguna 6 1m 472 7 2m 472


60

PARTE IV

61

IV.1 CONCLUSIONES

- Se utilizaron marcadores moleculares como una herramienta que ayude a orientar los programas de control biológico de plagas, pues se implementó una metodología para caracterización y determinación de presencia del hongo en muestras de suelo.

- Se caracterizaron molecularmente las 26 diferentes cepas del hongo Metarhizium

anisopliae que se utilizan en control biológico de plagas de caña de azúcar en Guatemala (ver Cuadro 1 y Figura 9), encontrando variabilidad genética entre la colección de cepas.

- Se evaluaron dos tipos de marcadores moleculares: los RAPDs y los

microsatélites, y se determinó que, por su especificidad y repetibilidad, los más apropiados para caracterizar cepas de Metarhizium anisopliae son los de tipo microsatélite o SSRs (ver Cuadro 5).

- Se determinó que el tiempo de permanencia viable del hongo Metarhizium

anisopliae en el suelo después de una aplicación es por lo menos 90 días.

- Se detectó la presencia de ocho cepas consideradas nativas en el suelo de la finca Carrizales del ingenio la Unión (marcadas con asterisco en la Figura 11), que podrían aprovecharse en el control de plagas.

62

IV.2 RECOMENDACIONES

- Se recomienda utilizar los marcadores moleculares como una herramienta que ayude a orientar los programas de control biológico de plagas.

- Dado que se implementó una metodología para caracterizar molecularmente

cepas del hongo Metarhizium anisopliae, se recomienda que con ella se sigan caracterizando nuevas cepas utilizadas en control biológico de plagas de caña de azúcar.

- Para la caracterización de cepas de Metarhizium anisopliae, se recomienda

utilizar los marcadores microsatélites, pues en el presente estudio se determinó que son los más apropiados, por su especificidad y repetibilidad.

- Respecto al tiempo de permanencia viable del hongo en el suelo, se recomienda

realizar un estudio de cuantificación del hongo Metarhizium anisopliae que sobrevive después de aplicación, para afinar la frecuencia de aplicación.

- Se recomienda profundizar en la investigación de las ocho cepas consideradas

nativas, aisladas en la finca Carrizales del ingenio La Unión.

63

IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Alemán, M. y Ovalle, W. 1998. Producción y manejo del hongo Metarhizium anisopliae

(Metch.) sor. Guatemala, CENGICAÑA 18 p. Allard, G.B. 1987. Prospects for biocontrol of the sugarcane froghopper with particular

reference to Trinidad. Biocontrol News and Information 8(2): 105-115. Allsopp, P. and Chandler, K.J. 1989. Cane grub research and control in Australia since

1970. Proceedings of the International Society of Sugar Cane Technologists 22: 810-817.

Alves, S.B. 1986. Controle microbiano de insetos. 1a Ed. Editora Manole, Sao Paulo Brasil

88-91pp. Bidochka, M.J., Kamp, A.M., Lavender, T.M., Dekoning, J. and De Croos, J.N.A. 2001.

Habitat association in two genetic groups of the insect-pathogenic fungus Metarhizium anisopliae: uncovering cryptic species? Applied Environmental Microbiology 67(3): 1335-1342.

Bidochka, M.J., McDonald, M.A., St. Leger, R.J. and Roberts, D.W. 1994. Differentiation

of species and strains of entomopathogenic fungi by random amplification of polymorphic DNA (RAPD). Current Genetics 25: 107-113.

CAÑAMIP a. Boletines del Comité de Manejo Integrado de Plagas de CENGICAÑA.

Boletín No. 2: Plagas de la raíz en caña de azúcar. Guatemala, junio 2004. CAÑAMIP b. Boletines del Comité de Manejo Integrado de Plagas de CENGICAÑA.

Boletín No. 7: Importancia del control de ninfas de Chinche salivosa (Aenolamia spp.) en gramíneas. Guatemala, julio 2004.

Carrillo, E., Juárez, L., Gómez, R. y Montepeque, R. 1995. Avances del programa manejo

integrado de la chinche salivosa en el ingenio Pantaleón. Memoria. Semana Científica. División Agrícola, Pantaleón 18-22 Dic. 1995 Vol. 1: 77-85.

CENGICAÑA (Centro Guatemalteco de Investigación y Capacitación de la Caña de

Azúcar). 2005. Informe Anual 2004-2005. Guatemala. 102 p. CENGICAÑA (Centro Guatemalteco de Investigación y Capacitación de la Caña de

Azúcar). 2009. Informe Anual 2007-2008. Guatemala. 108 p. Cerón, A.M. y Angel S., F. 2001. Microsatélites: nueva herramienta para estudiar el

genoma de la caña de azúcar. Carta Trimestral 1, CENICAÑA 13-14. Charnley, A.K. 1997. Entomopathogenic fungi and their role in pest control, p. 185-201.

En Wicklow, DT and Soderstrom, BE (ed.), The Mycota IV environmental and microbial relationships. Sringer, Berlin, Germany.

64

Cherry, R.H. 1991. White Grubs in Florida Sugarcane. Institute of Food and Agricultural

Sciences (IFAS), University of Florida. First printed: October 1991. Revised: February 2008. Publication #ENY-664. 3pp.

Des Vignes, W.G. and Phelps, R.H. 1995. A study on frequency of Metarhizium

application for froghopper control on sugarcane in Trinidad. Caroni Research Station Technical Report 1994-1995. 32: 88-90.

Des Vignes, W.G. and Ali-Sing, B. 1998. Comparison of three insecticides (Insectakill,

Conquest and Admire) and Metarhizium for froghopper control at #44Mon Plesir, Caroni. Caroni Research Station Technical Report 1997-1998. 35: 50.

Devotto M., L. y Gerding P., M. 2003. Respuesta de dos aislamientos chilenos de

Metarhizium anisopliae (Metschnikoff) Sorokin a la adición de un protector solar. Agricultura Técnica 63(4): 339-346.

Dice, L.R. 1945. Measures of the amount of ecologic association between species. Ecology

26: 297–302. Enkerli, J., Kolliker, R., Keller, S. and Widmer, F. 2005. Isolation and characterization of

microsatellite markers from the entomopathogenic fungus Metarhizium anisoliae. Molecular Biology Notes 5: 384-386.

Enkerli, J., Widmer, F., Gessler, C. and Keller, S. 2004. Long-term field persistence of

Beauveria brongniartii strains applied as biocontrol agents against European cockchafer larvae in Switzerland. Biological Control 29: 115-123.

Enkerli, J., Widmer, F., Gessler, C. and Keller, S. 2001. Strain-specific microsatellite

markers in the entomopathogenic fungus Beauveria brongniartii. Mycological Research, 105, 1079–1087.

Fang, W., Leng, B., Xiao, Y., Jin, K., Ma, J., Fan, Y., Feng, J., Yang, X., Zhang, Y. and

Pei, Y. 2005. Cloning of Beauveria bassiana chitinase gene Bbchit1 and its application to improve fungal strain virulence. Applied and Environmental Microbiology 71(1): 363-370.

Fegan, M., Manners, J.M., Maclean, D.J., Irwin, J.A.G., Samuels, K.D.Z., Holdom, D.G.

and Li, D.P. 1993. Random amplified polymorphic DNA markers reveal a high degree of genetic diversity in the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae var. anisopliae. Journal of General Microbiology 139: 2075-2081.

Ferron, P. 1981. Pest control by the fungi Beauveria and Metarhizium. In: Burgess HD,

editor. Microbial Control of Pests and Plant Diseases 1970-1980, 24:465-482. London, Academic Press.

65

Graham, G.C., Mayers, P. and Henry, R.J. 1994. A simplified method for the preparation of fungal genomic DNA for PCR and RAPD analysis. Biotechniques 16, 48-50.

Griffiths, A.J.F., Miller, J.F., Suzuki, D.T., Lewontin, R.C. and Gelbart, W.M. 1996.

Introduction to Genetic Analysis. 5th Edition. W.H. Freeman, New York. Gustafsson, L. and Gustafsson, P. 1994. Low genetic variation in Swedish populations of

the rare species Vicia pisiformis (Fabaceae) revealed with RFLP (rDNA) and RAPD. Plant Systematics and Evolution 189: 133-148.

Harvey, M.C. and Botha, F.C. 1996. Use of PCR-based methodologies for the

determination of DNA diversity between Saccharum varieties. Euphytica 89: 257-265.

Hidalgo, E. 2001. Uso de microorganismos para el control de Phyllophaga spp. Hoja

Técnica N° 37. Revista Manejo integrado de Plagas. CATIE. N° 60, junio 2001. Keller, S., Kessler, P. and Schweizer, C. 2003. Distribution of insect pathogenic soil fungi

in Switzerland with special reference to Beauveria brogniartii and Metarhizium anisopliae. Biocontrol 48:307-319.

King, A.B.S. y Saunders, J.L. 1984. Las plagas invertebradas de cultivos anuales

alimenticios en América Central. Londres, UK, TDRI-CATIE/ODA. Lacerda, D.R., Acedo, M.D.P., Lemos F., J.P. and Lovato, M.B. 2001. Genetic diversity

and structure of natural populations of Platimenia reticulata (Mimosoideae), a tropical tree from the Brazilian Cerrado. Molecular Ecology 10: 11-43.

Lopes de Carvalho F., L., Lima da Costa, A.B., Brandao G., L. and Tinti de Oliveira, N.

2001. DNA polymorphism and total protein in mutants of Metarhizium anisopliae var. anisopliae (Metsch.) Sorokin strain E9. Brazilian Journal of Microbiology 32: 93-97.

Luz, C., Netto, M.C. and Rocha, M.F. 2007. In vitro susceptibility to fungicides by

invertebrate-pathogenic and saprobic fungi. Mychopathologia 164(1):39-47. Lynch, M. and Milligan, B.G. 1994. Analysis of population genetic structure with RAPD

markers. Molecular Ecology 3: 91-99. Markert, C.L. and Moller, F. 1959. Multiple forms of enzymes: tissues, ontogenetic, and

species specific patterns. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 45: 753-763.

Márquez, J.M. 2005. Integrated Pest Management Program. CENGICAÑA (Centro

Guatemalteco de Investigación y Capacitación de la Caña de Azúcar) Pre-Congress Tour Papers: 17-21.

66

Márquez, J.M., Barrios, C., Solares, E., Motta, V.H. y Suquén, J. 2004. Evaluación de agentes deshidratantes, repelentes y surfactantes para el control de ninfas de Chinche salivosa (Aeneolamia postica, Homoptera:Cercopidae) en campo. Centro Guatemalteco de Investigación y Capacitación de la Caña de Azúcar, CENGICAÑA. Presentación de resultados de investigación. Zafra 2004-2005: 120-131.

Márquez, J.M., Ortíz, J.M., Montepeque, R., Ralda, G., López, A., Motta, V.H., Solares,

E., Ortíz, A., Recinos, L., López, C. Velásquez, C. y Chajil, E. 2005. Comportamiento del parasitismo de dos cepas de Metarhizium anisopliae sobre adultos de Chinche salivosa (Aeneolamia postica), en condiciones de campo. CENGICAÑA-CAÑAMIP. Centro Guatemalteco de Investigación y Capacitación de la Caña de Azúcar, CENGICAÑA. Presentación de resultados de investigación. Zafra 2004-2005: 59-66.

Márquez, J.M. y López, E. 2006. Nivel de daño económico para las plagas de importancia

en caña de azúcar y su estimación con base en un programa diseñado por CENGICAÑA. Centro Guatemalteco de Investigación y Capacitación de la Caña de Azúcar, CENGICAÑA. Presentación de resultados de investigación. Zafra 2005-2006: 194-200.

Márquez, J.M. y Ralda, G. 2005. Efecto de Gallina ciega (Phyllophaga spp.) y Gusano

alambre (Dipropus spp.) sobre el rendimiento de la caña de azúcar en Guatemala. Centro Guatemalteco de Investigación y Capacitación de la Caña de Azúcar, CENGICAÑA. Presentación de resultados de investigación. Zafra 2004-2005: 67-72.

Márquez, J.M. y Sandoval, F. 2003. Avances sobre las pérdidas causadas por Gallina ciega

(Phyllophaga spp.) en el cultivo de la caña de azúcar. Centro Guatemalteco de Investigación y Capacitación de la Caña de Azúcar, CENGICAÑA. Presentación de resultados de investigación. Zafra 2002-2003: 104-108.

Matsouka, Y., Mitchell, S.E., Kresovich, S., Goodman, M. and Doeley, J. 2002.

Microsatellites in Zea- variability paterns of mutations, and use for evolutionary studies. Theoretical and. Applied Genetics 104: 436-450.

Mendoza-Herrera, A. y Simpson, J. 1997. Uso de marcadores moleculares en la

agronomía. Hemeroteca Virtual ANUIES: http://www.hemerodigital.unam.mx/ANUIES

Peck, D.C. 2001. Memorias, Taller sobre la bioecología y manejo de cercópidos en

gramíneas. CENGICAÑA, Santa lucía Cotzumalguapa, Guatemala, 13-17 de agosto de 2001.

Peck, D.C. 1993. Migratory movement and population dynamics of Prosapia froghoppers

in dairy pastures of Costa Rica. Entomological Society of America National Conference, Indianapolis, IN.

67

Raid, R.N. and Cherry, R.H. 1992. Effect of soil parameters on pathogenicity of the fungus Metarhizium anisopliae to the sugarcane grub Lyggyrus subtropicus (Coleoptera: Scarabaeidae). Florida Entomologist 75(2): 179-184.

Risco, S.H. 1981. Manejo de las plagas en caña de azúcar. VIII Congreso Nacional de la

Sociedad Colombiana de Entomología (SOCOLEN), Medellín, Colombia, 30 de Julio de 1981.

Rohlf, F.J. 2003. Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System (NTSYSpc).

Exeter Sotware, New York. Sallam, M.N., Bakker, P. and Dall, D.J. 2003. Prevalence of soil-borne diseases of

greyback canegrubs with special reference to Adelina sp. Proceedings of the Australian Sugar Cane Technologists 25: 1-8.

Sallam, M.N., McAvoy, C.A., Samson, P.R. and Bull, J.J. 2007. Soil sampling for

Metarhizium anisopliae spores in Queensland sugarcane fields. BioControl 52: 491-505.

Samuels, K., Pinnock, D. and Bull, R. 1990. Scarabeid larvae control in sugarcane using

Metarhizium anisopliae. Journal of Invertebrate Pathology 55: 135-137. Scholte, E.-J., Knols, B.G.J., Samson, R.A. and Takken, W. 2004a. Entomopathogenic

fungi for mosquito control: A review. 24pp Journal of Insect Science 4: 19. Scholte, E.-J., Knols, B.G.J. and Takken, W. 2004b. Autodissemination of the

entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae amongst adults of the malaria vector Anopheles gambiae. Malaria Journal 3/1/45.

SRDC (Sugar Research and Development Corporation, Autralia). 2002. Expanded

registrations for Metarhizium strains against canegrubs. Final Report Summary. http://www.srdc.gov.au/ProjectReports/BSS246.htm

Staub, J.E.; Serquen, F.C. and Gupta, M. 1996. Genetic markers, map construction, and

their application in plant breeding. Horticultural Science 31:729-740. Stoner, K. 1996. Approaches to the Biological Control of Insects. University of Maine

Cooperative Extension Bulletin #7144. 8pp. Waugh, R. 1997. RAPD analysis: use for genome characterization, tagging traits and

mapping. In: Clark, M.S. (Ed.). Plant Molecular Biology - a laboratory manual. Springer Lab Manual. Cambridge, UK. pp. 305-333.

Welsh, J. and McClelland, M. 1990. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary

primers. Nucleic Acids Research 18, 7213-7218.

68

Williams, J.G.K., Kubelik, A.R., Livak, K.J., Rafalski, J.A. and Tingey, S.V. 1990. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Research 18, 6531-6535.

Zerené, M. 2002. Identificación de marcadores moleculares tipo microsatélites asociados a

loci genéticos para calidad panadera en trigos de pan. Tesis para optar al grado de Magister en Ciencias Biológicas con mención en Botánica. Universidad de Chile. Versión electrónica. Consulta realizada el 10 de octubre de 2008. http://www.cybertesis.cl/tesis/uchile/2002/zerene_m/html/index-frames.html

69

IV.4 ANEXOS IV.4.1 Anexo I: Muestreos de suelo en campos comerciales y parcelas de ensayo. PRIMER LOTE MUESTREADO: Ubicación: Ingenio La Unión, finca Carrizales, lote 2-12 Tipo de parcela:

(manejo) Lote comercial

Corte: Soca Cepa aplicada: PLADYSA Fechas de muestreos: No. Código Fecha Tiempo1 LU-Ca-A 14/04/08: Antes de la aplicación 2 LU-Ca-1d 15/04/08: 1 día después de la aplicación 3 LU-Ca-3d 17/04/08: 3 días después de la aplicación 4 LU-Ca-7d 21/04/08: 7 días después de la aplicación 5 LU-Ca-15d 28/04/08: 15 días después de la aplicación 6 LU-Ca-1m 14/05/08: 1 mes después de la aplicación 7 LU-Ca-2m 13/06/08: 2 meses después de la aplicación 8 LU-Ca-3m 14/07/08: 3 meses después de la aplicación 9 LU-Ca-4m 14/08/08: 4 meses después de la aplicación 10 LU-Ca-5m 12/09/08: 5 meses después de la aplicación

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SEGUNDO LOTE MUESTREADO: Ubicación: Ingenio Palo Gordo, finca Libertad, lote 302 Tipo de parcela:

(manejo) Lote comercial

Corte: Soca Cepa aplicada: PLADYSA Fechas de muestreos: No. Código Fecha Tiempo 1 PG-Li-A 29/04/08: Antes de la aplicación 2 PG-Li-1d 07/05/08: 1 día después de la aplicación 3 PG-Li-3d 09/05/08: 3 días después de la aplicación 4 PG-Li-7d 13/05/08: 7 días después de la aplicación 5 PG-Li-15d 20/05/08: 15 días después de la aplicación 6 PG-Li-1m 06/06/08: 1 mes después de la aplicación 7 PG-Li-2m 07/07/08: 2 meses después de la aplicación 8 PG-Li-3m 04/08/08: 3 meses después de la aplicación 9 PG-Li-4m 08/09/08: 3 meses después de la aplicación

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TERCER LOTE MUESTREADO: Ubicación: Ingenio Pantaleón, finca El Bálsamo parcela No. 3, sin Bioflora Tipo de parcela:

(manejo) Ensayo de CENGICAÑA

Corte: Plantía Cepa aplicada: CG93-3

Fechas de muestreos:

No. Código Fecha Tiempo 1 PA-Ba-A 24/06/08: Antes de la aplicación 2 PA-Ba-1d 25/06/08: 1 día después de la aplicación 3 PA-Ba-3d 27/06/08: 3 días después de la aplicación 4 PA-Ba-7d 01/07/08: 7 días después de la aplicación 5 PA-Ba-15d 08/07/08: 15 días después de la aplicación 6 PA-Ba-1m 24/07/08: 1 mes después de la aplicación 7 PA-Ba-2m 25/08/08: 2 meses después de la aplicación 8 PA-Ba-3m 24/09/08: 3 meses después de la aplicación

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CUARTO LOTE MUESTREADO: Ubicación: Ingenio La Unión, finca Los Tarros, lote 14-09 Parcela 102: aplicación de cepa 472 sin Bioflora Tipo de parcela:

(manejo) Ensayo de CENGICAÑA

Corte: Plantía Cepa aplicada: 472 Fechas de muestreos: No. Código Fecha Tiempo 1 LU-Ta-A 15/07/08: Antes de la aplicación 2 LU-Ta-3d 26/07/08: 1 día después de la aplicación 3 LU-Ta-5d 28/07/08: 5 días después de la aplicación 4 LU-Ta-7d 30/07/08: 7 días después de la aplicación 5 LU-Ta-15d 06/08/08: 15 días después de la aplicación 6 LU-Ta-1m 22/08/08: 1 mes después de la aplicación 7 LU-Ta-2m 23/09/08: 2 meses después de la aplicación

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PARTE V

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V.1 INFORME FINANCIERO

Menos (-) Más (+)1 SERVICIOS NO PERSONALES

181 Estudios, investigaciones y proyectos de factibilidad Q 122,000.00 Q 108,220.00 Q 13,780.00 121 Publicidad y propaganda Q 5,000.00 Q 5,000.00 122 Impresión, encuadernación y reproducción Q 2,000.00 Q 2,000.00 141 Transporte de personas Q 19,250.00 Q 3,596.55 Q 15,653.45 Q -

2 MATERIALES Y SUMINISTROS241 Papel de Escritorio Q 1,419.00 Q 1,419.00 Q - 243 Productos de papel o cartón Q 147.00 Q 147.00 Q - 245 Libros, revistas y periódicos Q 30,000.00 Q 6,230.04 Q 23,769.96 254 Artículo de caucho Q 243.00 Q 243.00 Q - 261 Elementos y compuestos químicos Q 3,937.30 Q 83,909.71 Q 79,344.78 Q 627.63 264 Insecticidas, fumigantes y similares Q 594.00 Q 594.00 Q - 266 Productos medicinales y farmaceúticos Q 3,343.30 Q 3,343.30 Q - 269 Otros productos químicos y conexos Q 78,215.00 Q 78,215.00 Q 6,800.00 Q 6,800.00 Q - 272 Productos de vidrio Q 5,000.00 Q 4,945.00 Q 55.00 283 Productos de metal Q 222.00 Q 222.00 Q - 291 Útiles de oficina Q 1,650.65 Q 1,650.65 Q - 292 Útiles de limpieza y productos sanitarios Q 516.80 Q 516.80 Q - 295 Útiles menores médico-quirúrgicos y de laboratorio Q 33,000.00 Q 10,998.45 Q 5,237.82 Q 27,238.57 Q 0.80

3 PROPIEDAD, PLANTA, EQUIPO E INTANGIBLES323 Equipo médico-sanitario y de laboratorio Q 54,050.00 Q 7,335.98 Q 45,567.18 Q 1,146.84

GASTOS DE ADMÓN. (10%) Q 34,851.50 Q 34,851.50 Q - TOTAL 383,366.50Q 104,083.28Q 104,083.28Q 302,134.77Q 46,380.23Q

EJECUTADO SALDOTRANSFERENCIARENGLÓN NOMBRE DEL GASTO APROBADO

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