CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA –CONCYT-

SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA-SENACYT-

FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -FONACYT-

DIAGNOSTICO MOLECULAR, S.A.

INFORME FINAL DEL PROYECTO

“ D E S A R R O L L O D E U N P C R M U L T IP L E X P A R A

ID E N T IF IC A R L A S P R IN C IP A L E S E S C H E R I C H I A

C O L I C A U S A N T E S D E D IA R R E A IN F A N T IL E N

G U A T E M A L A ”

PROYECTO FODECYT No. 039-2006

Olga R. Torres,

Investigadora Principal

GUATEMALA, MAYO 2011

FODECYT 039-2006 2

i. RESUMEN

La segunda causa de morbilidad y mortalidad en niños preescolares de Guatemala continúa siendo la diarrea,

que ocasiona de 8 a 11 episodios de diarrea por niño por año, conllevando retraso en su crecimiento y desarrollo y

resultando en alta mortalidad cuando ataca a infantes malnutridos o coincide con otro episodio de infección

severo. Parte del problema es que patógenos altamente virulentos y prevalecientes en nuestro medio pasan

inadvertidos porque no se pueden diagnosticar ya que no existen herramientas de diagnóstico que permitan

conocer la magnitud del problema. Este es el caso de la E.coli enterotoxigénica, patógeno número uno en el área

rural y en pacientes severamente enfermos por diarrea que requieren hospitalización en el Roosevelt. Tomando

ventaja de los avances en tecnología molecular aplicada al diagnóstico microbiano, se propuso desarrollar un

método de diagnóstico basado en la amplificación de secuencias blanco por medio de la reacción de polimerasa en

cadena (PCR) multiplex: varios primers usados simultáneamente para detectar las diferentes toxinas de ETEC

(lábil y estable) y los factores de virulencia de EPEC (eae y bpf). Como resultado de el presente proyecto se logró

desarrollar un método que detecta simultáneamente los genes que codifican las enterotoxinas termolábil (lt) y

termoestables humana (sth) y porcina, (stp) de la E. coli enterotoxigénica (ETEC) y de los pilis formadores de

"bucles" (bpf) en la E. coli enteropatógena (EPEC), así como el gen eae que codifica la intimina, proteína que

permite la adhesión en contacto íntimo con las células intestinales y del gen agg de la E. coli enteroagregativa

(EAEC). Doce primers que reconocen regiones específicas en los extremos 3’ y 5’ de cada uno de los genes antes

indicados constituyen la base del PCR multiplex aquí reportado. El proceso requirió prueba de las secuencias

propuestas en el protocolo seguidas por otras secuencias más idóneas hasta que se logró obtener reacciones

reproducibles con cepas control conocidas para la producción de las toxinas de E. coli LT, STh y STp, primero,

luego se agregaron los genes de eae y bpf para EPEC y finalmente las del gen agg de la EAEC. Se estandarizaron

las condiciones del PCR para lograr la amplificación de las secuencias seleccionadas, utilizando ADN procedente

de cepas de referencia de ETEC, EPEC y EAEC provistas por el laboratorio de referencia de la OMS para ETEC,

por la Dra. Ann-Mari Svennerholm a quien se visitó en diciembre de 2006 en el caso de ETEC y del Center for

Disease Control and Prevention de Atlanta en los Estados Unidos, en el caso de la EPEC y la EAEC. Asimismo,

se probó el desempeño del método con otras cepas de E. coli causantes de diarrea por otros mecanismos, como la

E. coli enterohemorrágica, la E. coli enteroagregativa y la E. coli enteroinvasiva, para asegurarnos de que no

dieran reacciones cruzadas. Finalmente, el método se validó con una colección de cultivos de Escherichia coli,

identificados previamente por métodos de ELISA, considerados estándar cuando se planteó el proyecto,

almacenados a -70°C y finalmente se analizaron muestras de niños con y sin diarrea. Adicionalmente a los

objetivos propuestos inicialmente, se evaluó el uso de pooles para el tamizaje de muchas muestras en las cuales

predominan las negativas (muestras no diarreicas o de poblaciones inmunes, por ejemplo), método que permite el

análisis simultáneo de hasta diez cepas, economizando tiempo y recursos. Finalmente, otro importante producto

adicional a los objetivos propuestos fue la validación del PCR multiplex en ADN extraído directamente de

muestras fecales diarreicas usando filtros FTA, obteniéndose buenos resultados con heces sin diluir, lo que

permite un diagnóstico rápido de ETEC, EPEC y EAEC sin cultivo, en unas cuantas horas, lo cual tiene utilidad

clínica en casos pediátricos severos.

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ii. ABSTRACT

Diarrheal diseases are the second most important cause of morbidity and mortality in pre-school children of

Guatemala, who suffer an estimate of 8 to 11 episodes of diarrhea per child per year, which result in growth and

development retardation. Part of the problem is that microbial pathogens that are virulent and highly prevalent in

our country are unrecognized because of the lack of diagnostic tools implemented for routine testing so that the

real importance of these pathogens is realized by the medical community. Enterotoxigenic E. coli is the number

one pathogen found in diarrhea cases observed in children living in rural areas of Guatemala, but also are the most

important pathogen found among children hospitalized due to severe diarrhea that compromises their life. EPEC

and EAEC are among the important causes of severe and persistent diarrhea in children. Taking advantage of the

technological advances now available, this project proposed the development of a diagnostic method for ETEC,

EPEC, and EAEC the most prevalent diarrheagenic E. coli´s in Guatemala, based on polymerase chain reaction

amplification of virulence genes, using all primers in one single reaction tube. The results are that indeed such

multiplex PCR method was developed and tested in known and unknown samples with good reproducibility and

specificity and sensitivity. It detects simultaneously the genes that code for enterotoxigenic E. coli labile toxin,

stable toxin human and stable toxin porcine the EPEC coding genes for bundle forming factor bpf and the intimin

gene eae, as well as the agg gene of EAEC. A total of 16 primers are mixed together with dinucleotides, enzyme,

buffer and after 39 cycles of amplification, specific bands of know molecular weight are obtained when the genes

are present in the E. coli isolated from diarrheagenic stools. The methodology was to test the proposed sequences

first and then to try new sequences that did not interfere with one another, until a set of sequences was found to

allow the simultaneous determination of ETEC toxin genes (lt, sth, stp,), EPEC virulence genes(eae and bpf), and

the agg determinant for enteroaggregative E. coli (EAEC). Then the methodology conditions were standardized

using DNA from reference strains obtained from the ETEC WHO collaborating Center in Goteborg and from

CDC in Atlanta for EPEC and EAEC. The performance of the method was tested with other strains that are

associated with diarrhea such as enterohemorrhagic E. coli, , and enteroinvasive E. coli as well as with

Salmonellas, Shigellas, Proteus spp, Vibrio cholera, Pseudomonas, S. aureus, and others to assure no cross

reactions were seen. Finally the method was validated with a culture collection of Escherichia coli, previously

identified as ETEC or non-ETEC by the Goteborg ELISA test, which were preserved frozen at -70°C.

Additionally and beyond the proposed objectives a pool method was developed to test for ETEC in non-diarrheic

samples as a cheap, rapid screening test, among samples that were mostly negative, an approach that allows the

simultaneous screening of up to ten strains, reducing the cost of labor, reagents and the time of testing. Also, an

addition to the protocol was the testing and standarization of the method in direct, undiluted fecal material using

DNA extracted with FTA filters and the same multiplex PCR. This gave good results and permits direct testing

thus avoiding the cost and time for fecal culture and isolation of E. coli colonies, providing an important method

for clinical follow up of severe diarrhea cases among the pediatric population.

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III. iii. Breve biografía académica de la autora

Olga R. Torres de Matute es guatemalteca, graduada de química bióloga de la USAC (1981) y de microbióloga

molecular en el grado de Master of Science de Cornell University, Ithaca, N. Y. (1988). Su primer trabajo fue

como ayudante de cátedra en el departamento de Microbiología de la Facultad de Ciencias Químicas y

Farmacia de la USAC, luego ocupó el cargo de Profesora de Microbiología en la misma unidad académica.

En 1985 inició su relación laboral con el INCAP como investigadora de la Unidad de Nutrición Infección y en

el mismo año obtuvo una beca Fulbright con la cual asistió a Cornell University. A su retorno en 1988 ocupó

de nuevo el cargo de investigadora en NI del INCAP. En 1994 asumió la jefatura de la unidad y en octubre de

2005 salió del INCAP para establecer el laboratorio Diagnóstico Molecular, S. A. el cual dirige y el Centro de

Investigaciones en Nutrición y Salud, CIENSA que funciona como una ONG de investigación. Ha colaborado

en múltiples investigaciones relacionadas con resistencia antimicrobiana, etiología y diagnóstico de diarreas,

inocuidad de alimentos y fumonisinas, ensayos de vacunas contra diarrea y ensayos clínicos de

antimicrobianos contra diarrea del viajero. Asimismo ha organizado y participado en muchas capacitaciones

en métodos moleculares dirigidos a profesionales centroamericanos. Ha sido invitada a dar conferencias en

diversos países sobre su trabajo por la OMS, el IICA, el CDC, el USDA, Netropica y otros. Cuenta con 26

publicaciones científicas.

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PROYECTO FODECYT No. 039-2006

Olga R. Torres,

Investigadora Principal

GUATEMALA, MAYO DE 2011

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Derechos de Autor (Copyright)

FODECYT 039-2006 7

v. AGRADECIMIENTOS:

La realización de este trabajo ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del Fondo Nacional de

Ciencia y Tecnología –FONACYT-, otorgado por la secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología –

SENACYT- y al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología – CONCYT-. Se agradece el apoyo técnico de

las QB’s Wanda González y Lilian Martínez, así como Cecilia Díaz de Mayorga y del Dr. Stephen Savarino

por enviarnos cepas de referencia. El apoyo técnico de la Dra. Patricia Saravia Otten.

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vi. PREFACIO

Diagnóstico Molecular, S.A., es un laboratorio especializado, moderno y acreditado que brinda servicios de

análisis de alimentos y agua, análisis clínico, microbiología especial, biología molecular e investigación.

En el campo de la investigación se han realizado varias investigaciones sobre epidemiología de diarrea en niños y

vacunas en visitantes. El diagnóstico de diarreas de difícil detección como las de E. coli diarreogénica se han

logrado con base en métodos basados en la Biología Molecular moderna. Los mismos no se encuentran

disponibles en muchos laboratorios del país, pero en el estudio que aquí se presenta, se validó un PCR multiplex

de punto final, haciendo notar que ahora ya se cuenta con el equivalente en PCR de tiempo real.

En nuestro país los estudios de Epidemiología Molecular son pocos y tomando en cuenta que la diarrea infantil es

un problema de salud pública y que uno de los principales agentes causales de diarrea bacteriana es Escherichia

coli enterotoxigénica, responsable del 17.9% de los episodios en el área rural y del 26% de las diarreas severas

deshidratantes que ameritan atención hospitalaria, se hace necesario la implementación de técnicas rápidas y

específicas, como lo es el caso de un PCR Multiplex, para realizar diagnóstico diferencial de Escherichia coli

diarreogénica.

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vii. TABLA DE CONTENIDOS DEL INFORME FINAL DEL PROYECTO DE

INVESTIGACIÓN

“Desarrollo de un PCR multiplex para identificar las principales Escherichia coli

causantes de diarrea infantil en Guatemala”

FODECYT 039-2006

i. Resumen

ii. Abstract

iii. Breve Biografía académica de la autora

iv. Copyright

v. Agradecimientos

vi. Prefacio

vii. Tabla de Contenidos

viii. Lista de ilustraciones

ix. Lista de tablas

x. Lista de abreviaturas

xi. Glosario

PARTE I

I.1 INTRODUCCIÓN 13

I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 16

(Antecedentes y Justificación del trabajo de investigación)

I.3 OBJETIVOS 19

I.3.1 Objetivo General

I.3.2 Objetivos Específicos

I.4 METODOLOGIA (Descripción detallada de la Metodología) 20

I.4.1 Localización del estudio 20

I.4.2 El Método 20

I.4.3 Técnica Estadística 23

I.4.4 Equipo, reactivos y materiales utilizados 23

PARTE II

II.1 MARCO TEORICO 31

PARTE III

III.1 RESULTADOS ALCANZADOS 44

III.2 DISCUSION DE RESULTADOS 55

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PARTE IV

IV.1 CONCLUSIONES 57

IV.2 RECOMENDACIONES 59

IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 60

IV.4 ANEXOS 65

PARTE V

V.1 INFORME FINANCIERO 66

VIII. LISTA DE ILUSTRACIONES

Fotografía 1: Desarrollo de PCR Multiplex para la Detección de Escherichia coli diarreogénicas:

ETEC, EAEC, EPEC y EHEC

Fotografía 2: PCR Multiplex corrido solamente para los genes que codifican las toxinas de ETEC:

LT, STP y STH

Fotografía 3: PCR corrido para factores de virulencia de EPEC: BFP y EAE.

Fotografía 4: Estandarización de PCR Multiplex para la Detección Simultánea de Toxinas de ETEC y

EPEC (LT, STP) y factores de virulencia de EPEC (BFP y EAE)

Fotografía 5: PCR para amplificación de factores de virulencia de EAEC: AGGR.

Fotografía 6: Estandarización individual del PCR Multiplex de toxinas de EHEC: VT1 y VT2.

Fotografía 7: Estandarización PCR Multiplex de bajo costo para toxinas de ETEC en pooles de cinco

muestras.

Fotografía 8: Transferencia de tecnología a Panamá y Honduras. PCR de toxinas de ETEC.

Tabla No. 1 Genes de Virulencia a estudiar

IX. LISTA DE TABLAS

Tabla No. 1: Genes de virulencia a estudiar

Tabla No. 2: Cepas estándar de E. coli y sus factores de virulencia

Tabla No. 3: Secuencia de primers seleccionados para el PCR Multiplex 039-2006 para ETEC, EPEC, EAEC

y EHEC

Tabla No. 4: Preparación de la mezcla maestra para PCR Multiplex de ETEC, EPEC y EAEC (detección

simultánea)

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X. LISTA DE ABREVIATURAS

ETEC: E. coli enterotoxigénica; LT: Toxina Lábil, ST: Toxina estable, STp: Toxina estable porcina, STh:

toxina estable humana, CF: factores de colonización

EPEC: E. coli enteropatógena; bpf: pili formador de bucles o “bundle forming factor”, eae: factor de adherencia

y eliminación

EAEC: E. coli enteroagregativa; aggr: gen regulador de la expresión de factores de patogenicidad de EAEC

EHEC: E. coli enterohemorrágica

EIEC: E. coli enteroinvasiva

OMS: Organización Mundial de la Salud

CDC: Centro de control y prevención de enfermedades de Estados Unidos

ATCC: American Type Culture Collection

Kb: Kilobases

DNTP`s: residuos de dinucleótido-fosfatos

F: forward

R: reverse

HPLC: Cromatografía líquida de alta presión

TAQ: Endonuclease termoestable

°C: grados centígrados

UV: Ultravioleta visible

Pb: pares de bases

IMVIC: Indol, Movilidad, Voges-Proskauer, Citratos

SOP: Standard Operating Procedure o Procedimiento Operativo Estandarizado

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XI.GLOSARIO

PCR: La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés (Polymerase

Chain Reaction), es una técnica de biología molecular desarrollada en 1986 por Kary Mullis, cuyo

objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN en particular, partiendo de un

fragmento original o molde.

PCR MULTIPLEX : PCR en la cual se amplifica más de una secuencia en una misma reacción. Emplea

dos o más pares de cebadores (o primers) en un único tubo con el fin de amplificar simultáneamente

múltiples segmentos de ADN. Consiste en combinar en una única reacción varios cebadores (o primers)

de los sistemas que se quieren amplificar simultáneamente, junto con el resto de los reactivos de la

reacción en cantidades suficientes. Sus ventajas: se obtiene la información de varios loci en una sola

reacción, menor cantidad de molde para el análisis, menor cantidad de reactivos, rápida construcción de

base de datos.

PCR DE TIEMPO REAL: Reacción de PCR cuya principal característica es que permite cuantificar la

cantidad de ADN o ARN presentes en la muestra original, o para identificar con una muy alta

probabilidad, muestras de ADN específicas a partir de su temperatura de fusión (también denominado

valor Tm, del inglés meeting temperatura).

PRIMER O INICIADOR O CEBADOR: Son secuencias cortas, de 20-24 pares de bases de largo,

normalmente de 18 a 22, que son reconocidos por la polimerasa permitiendo iniciar la reacción. Deben

estar situados enfrentados y a no mucha distancia. Delimitan la zona de ADN a amplificar.

AMPLIMERO: Producto de amplificación por la PCR.

EPEC: Abreviatura de Escherichia coli enteropatogénica, es el agente causal predominante de diarrea en

niños que viven en países en vía de desarrollo. EPEC interacciona con las células epiteliales

produciendo una lesión histopatológica característica conocida como “adherencia / destrucción” o lesión

A/E (attaching and effacing). En la producción de la lesión A/E por EPEC, se observan cambios

importantes en el citoesqueleto de la célula hospedera, los cuales incluyen a la acumulación de actina

polimerizada formando una estructura parecida a una copa o pedestal. La adherencia inicial está

relacionada a la producción de la fimbria BFP (Bundle Forming Pilus), el cual se requiere para la

producción de diarrea por EPEC.

ETEC: Abreviatura de Escherichia coli enterotoxigénica, se parece mucho a V. cholerae, se adhiere a la

mucosa del intestino delgado, no la invade, y elabora toxinas que producen diarrea. No hay cambios

histológicos en las células de la mucosa y muy poca inflamación. Produce diarrea no sanguinolenta en

niños y adultos, sobre todo en países en vías de desarrollo, aunque los desarrollados también se ven

afectados.

IV.

FODECYT 039-2006 13

PARTE I

I.1 INTRODUCCION

Escherichia coli, previamente conocida como la bacteria fecal más abundante y no patógena para el intestino, es

ahora clasificada como E. coli patógena y no patógena. Dentro del grupo patógeno se encuentran las Escherichia

coli diarreogénicas, las cuales se subdividen en cinco categorías que son: E. coli enteropatógena (EPEC), E. coli

enterotoxigénica (ETEC), E. coli enterohemorrágica (EHEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC) y E. coli

enteroagregativa (EAEC). Todas son patógenas al ser humano y con excepción de E. coli enteroinvasiva, todas

han sido documentadas en nuestro país como agentes causales de diarrea infantil En Guatemala, aunque no se

cuenta con un sistema de vigilancia activa de diarreas, existen estudios prospectivos y transversales realizados en

comunidades rurales, hospitalarias y peri-urbanas, que han demostrado que un niño menor de cinco años sufre de

ocho a once episodios de diarrea anualmente (Cruz, J. R. 1989; Cruz, J. R., 1992., Svennerholm, A-M, 2005,

Lemus, O. 2007). La ETEC es una importante causa de diarrea en niños de países en desarrollo y en turistas que

visitan regiones endémicas para ETEC. Las ETEC aisladas del hombre pueden producir una enterotoxina lábil

(LT), una enterotoxina estable (ST) o ambas (LT, ST) (Sack, RB 1980). La ST puede clasificarse en dos

genotipos: STa y STb, de los cuales el que se asocia con cepas que producen diarrea en el ser humano es STa

(también conocida como ST I), codificado por el gen estA, mientras que la STb (ó STII) predomina en cepas de

ETEC de origen animal. Existen dos distintos subtipos de STa: STh (ó STIb) ya que se consideraba previamente

de origen humano y STp que se consideraba de origen porcino (Rao, M 1985). Existen varias formas alélicas del

gen estA,los dos alelos que codifican STp y STh se han encontrado en cepas de ETEC aisladas de seres humanos

(Moseley, SL.1983), variantes de STa que son muy similares en estructura y función. La STh consiste de 18

amino ácidos y la STp de 19; ambas variantes contienen seis residuos de cisteína y la mayoría de epitopos en la

molécula de ST son conformacionales (Rao, M 1985). Tanto la STh como la STp se unen a receptores específicos

del borde de cepillo de la membrana del intestino delgado para activar el sistema de guanilil-ciclasa-GMP cíclico,

resultando en diarrea (Guarino A, 1987). Los métodos tradicionales del ratón lactante y de ELISA no permiten la

discriminación entre los dos subtipos de STa: STh y STp. Inicialmente esta diferenciación se realizaba

únicamente por medio de hibridación con sondas de ADN (Nishibushi M, 1989; Steinland, H 2003), en la

actualidad por PCRs desarrollados para este fin (Bolin I, 2006) y por lo tanto la distribución relativa de los

genotipos STh y STp entre aislados humanos, no se ha reportado con frecuencia, aunque sí es factible de

diagnosticar.

En un estudio conducido en Guinea Bissou, Sommerfelt (2002) reportó usando sondas de ADN, que las variantes

de ETEC asociadas con diarrea eran solamente las productoras de STh sola o en combinación con LT, pero que

las cepas productoras de STp no producían diarrea en niños (Steinsland, H et al. 2002). Como parte de los

estudios colaborativos conducidos entre O. Torres, la Dra. Svennerholm y el Dr. Bourgeois, se comparó la

distribución de STh y STp en ETEC aislada de niños de Guatemala, Bangladesh y Egipto, así como la encontrada

en ETEC aislada de turistas que viajaron a Guatemala desde Estados Unidos o Canadá, usando PCR y nuevos

primers para STh diseñados y evaluados conjuntamente con los descritos previamente para STp (Woodward, MJ

1992). Usando estos métodos de PCR, Bolin, I y colaboradores (2006) reportaron que en Guatemala y Egipto,

las cepas productoras de STp comúnmente están asociadas con diarrea y que no hay diferencia entre la

distribución relativa de los genotipos STh y STp entre ETECs aisladas de viajeros con diarrea o de individuos

asintomáticos visitando las mismas áreas. Esta información fue un reto para el proyecto propuesto, pues indicaba

la necesidad de incluir una nueva variante en el multiplex, la STp.

La etiología de los agentes de diarrea varía entre regiones, sin embargo, en Guatemala los principales

agentes de diarrea bacteriana son E. coli enterotoxigénica causante del 17.9% de los episodios en el área rural y

FODECYT 039-2006 14

del 26% de las diarreas severas, deshidratantes que ameritan atención hospitalaria, (Torres, O. 2006.; Lemus, O.

2006), mientras que EPEC causa el 5.8% de los casos (información generada por este estudio). Sin embargo,

EPEC se asocia con el 17.8% de casos de diarrea persistente, cifra que la coloca como la principal causa de

diarrea de más de catorce días de duración en nuestro medio (Cruz, JR. 1992). La EAEC se asocia con casos de

diarrea persistente, con recurrencia de diarrea persistente y con deterioro nutricional y fue altamente prevalente en

niños de edad preescolar de regiones rurales de Guatemala en estudios hechos en la década de los 80’s (Cruz JR,

1989; Cruz, JR, 1992); los efectos sobre el estado nutricional y eventualmente sobre la vida del paciente, son

altamente indeseables (Mata, L, 1992; Martorell, R. 1977), por lo que el país debe contar con métodos sencillos y

objetivos para su detección. El panorama infeccioso no ha cambiado mucho en ciertas regiones del país desde los

años 70, cuando se reportaba que por cada 100,000 niños de 1-4 años, 500 morían por diarrea mientras que en los

Estados Unidos esa cifra es menor a tres (Behar, 1979; Cruz, JR, 1992; Mata L. 1978).

El diagnóstico diferencial de Escherichia coli diarreogénica era sumamente complejo pues requería de

instalaciones de bioterio de ratones para la prueba de ETEC ST, de histocultivos para la prueba de ETEC LT y de

EAEC y de gran cantidad de antisueros específicos para la de EPEC además de ser laboriosas, consumían muchas

horas laborables y eran poco objetivas en el caso de diagnostico por microscopía como el de EAEC (Cruz JR,

1989; Cruz JR 1992, Mathewson, 1985). Por lo tanto, se restringían a laboratorios de investigación, o de

referencia, sumamente especializados, que pudiesen costear la implementación de bioensayos como el del ratón

lactante para E. coli productora de toxina estable (Gianella, 1976), el ensayo de las células Y-1 para E. coli

productora de toxina lábil (Donta, 1974) las pruebas de serología para E. coli enteropatógena (Ewing, 1986,

Mathewson, 1985) y las pruebas de adherencia a células Hep-2 para EAEC y EPEC (Cravioto, 1979; Nataro, J

1998). Más recientemente, con el desarrollo de anticuerpos monoclonales dirigidos contra las toxinas lábil o

estable de ETEC, así como contra los factores de colonización (López-Vidal, Y 1988; Svennerholm, AM 1986,

1983), los métodos de referencia cambiaron hacia ELISAs directos (LT) ó indirectos (ST). Los antisueros

utilizados para la clasificación serológica de las E. coli´s son la base para el diagnóstico tradicional de EPEC,

mismos que no se encuentran comercialmente disponibles, por lo que su uso se restringe a laboratorios de

referencia nacionales de países desarrollados (Ewing, WH, 1986). Recientemente, se cuestiona la clasificación

fenotípica de la EPEC, proponiéndose un método alternativo, genético, para identificarla con objetividad (Nataro,

J. 1998, Nataro, J 2007) el cual se basa en la detección de dos determinantes: eaeA y bpf.

La E. coli entero agregativa o EAEC fue definida originalmente por su patrón típico en células Hep 2. Se

asocia con diarrea en una serie de ambientes clínicos, incluyendo la diarrea endémica en niños tanto en países

pobres como industrializados, diarrea epidémica, diarrea del viajero a países en desarrollo y como diarrea

persistente entre pacientes inmunocromprometidos. Su patogenicidad se ha confirmado en estudios con

voluntarios y por su implicación en brotes epidémicos. Se han definido varios ensayos sencillos como pruebas

preliminares para la identificación de EAEC, que incluyen la observación simple de un biofilm sobre poliestireno

(Yamamoto, 1992), sondas de ADN (Baudry, B 1990) como alternativas a la adherencia en células Hep-2 que

requiere instalaciones para histocultivos. En este caso, los métodos moleculares ayudaron a definir su naturaleza

diarreogénica. Clínicamente, la diarrea por EAEC se acompaña por signos y síntomas de leve inflamación, con

dolor abdominal y fiebre, pero las heces usualmente no contienen leucocitos fecales o sangre. En la actualidad se

recomienda el diagnóstico específico por medio de la amplificación del gen regulador AggR (Sarantuya, J. 2004),

gen que se utilizó para el PCR multiplex aquí propuesto.

Durante la última década, se han desarrollado pruebas genéticas y moleculares que han eliminado la

necesidad de esa infraestructura tan sofisticada de histocultivos y bioterio, pues con el advenimiento del PCR

(Mullis, KB, 1993) se pueden ahora hacer todos los diagnósticos diferenciales de las E. coli diarreogénicas por

amplificación de los determinantes de virulencia de cada una de ellas. Un PCR multiplex tiene la ventaja de que

solamente se requiere de instalaciones de biología molecular relativamente de poco costo y bastante accesibles,

que en la actualidad ya se encuentran disponibles incluso en el Laboratorio Nacional de Salud del Ministerio de

FODECYT 039-2006 15

Salud Pública de Guatemala, del Seguro Social, así como de las principales universidades del país. El método

ideal deberá ser fácil de implementar, reproducible, sensible y específico y permitir la detección rápida de genes

estructurales y de virulencia de diversos patógenos. Estos métodos ofrecen ventajas sobre los métodos clásicos,

fenotípicos, cuyos resultados exigen la expresión genética, a veces es un proceso muy difícil y delicado en

términos de condiciones del ensayo. Los métodos genéticos obvian todo el paso de la expresión fenotípica con lo

que los ensayos se simplifican sobremanera. Otra ventaja de este tipo de pruebas es que el equipo e

infraestructura requeridos sirven para múltiples propósitos, lo cual es una ventaja cuando se cuenta con escaso

presupuesto. Entre las desventajas de los métodos genéticos, particularmente los de amplificación como el PCR,

sobresale la susceptibilidad a contaminación cruzada, que exige infraestructura que separe físicamente la campana

de trabajo donde se preparan las mezclas de reactivos (cuarto blanco) con exclusividad y la aplicación de una

técnica laboratorial cuidadosa para no acarrear moléculas amplificadas en los pasos anteriores a nuevas (Harris,

E. 1988).

Se han publicado métodos basados en la amplificación genética por PCR para detectar los genes de toxina

estable (st), toxina lábil (lt) de la ETEC (Olsvik, O. 1993)) y pilus formador de "bucles" de la EPEC (bfp), así

como de los genes aggR, aggA, affA, agg3 de la EAEC (Giron, JA 1991; Giron, JA 1993; Nataro, JP 2005;

Huang, DB 2006). Existen también métodos comerciales, dentro de ellos uno que detecta en heces el ADN de

ETEC (Stacy-Phipps, S 1995). Un PCR multiplex es aquél en el que se detectan varios genes simultáneamente y

por lo consiguiente, ahorra tiempo y recursos al dar varias respuestas en una sola prueba. Se propuso un PCR

multiplex para toxina lábil, toxina estable de ETEC, el pili formador de bucles de EPEC y el gen aggr de EAEC,

con lo que se detectarían directamente en una muestra estos tres patógenos.

En el presente proyecto se formuló un PCR multiplex basado en 16 primers (cebadores o iniciadores)

específicos, para las toxinas LT y STh, STp de ETEC, los determinantes eaeA y bpf de EPEC, el gen aggR de

EAEC, y los genes vt1 y vt2 de EHEC, basados en las secuencias publicadas sobre los genes de interés. Se tuvo

acceso al método de referencia de la OMS para ETEC, por lo que fueron estas secuencias las que se usaron para

preparar los primers y a este grupo se agregaron los iniciadores de la EPEC y EAEC, tomando ventaja de la

colaboración prestada por la Dra. Ann-Mari Svennerholm (Bolin, I 2006). Se combinaron en un solo PCR

multiplex, el cual se probó con cepas estándar conocidas como productoras de LT, STh ó STp, que fueron

provistas por la Dra. Ann-Mari Svennerholm, directora del laboratorio de referencia de la OMS para E. coli

enterotoxigénica, así como cepas estándar obtenidas en la American Type Culture Collection y cepas provistas

por el CDC para EPEC y EAEC y validado con cepas previamente diagnosticadas por los métodos estándar y

almacenadas como cultivos stock congeladas a -70°C.

FODECYT 039-2006 16

I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

I.2.1 ANTECEDENTES EN GUATEMALA

Aunque estamos en el siglo XXI, el poco desarrollo del área rural guatemalteca así como la débil

infraestructura sanitaria de regiones remotas del país, resultan en que la segunda causa de morbilidad y mortalidad

en niños Guatemaltecos es la enfermedad diarreica aguda. Se han reportado que los niños del área rural padecen

de 8 a 11 episodios de diarrea por niño por año y de 5 a 8 en regiones urbanas, diez por ciento de los cuales se

convierten en diarrea persistente (Cruz, JR. 1992, Svennerholm, AM. 2005, Lemus, O. 2007), la cual deteriora las

reservas de micro y macro nutrientes y conlleva a desnutrición crónica.

Guatemala es un país montañoso y con muchos accidentes geográficos dentro de su relativamente

pequeño y densamente poblado espacio; hay regiones remotas de poca población rural, que carecen de acceso a

servicios de salud. En la actualidad el cambio global, la sobrepoblación, el avance del frente poblacional que

consume los bosques, la falta de agua potable y la contaminación de las aguas superficiales ejercen presión sobre

los microorganismos y han emergido cepas altamente virulentas en todo el mundo y re-emergido antiguos males

como la tuberculosis. Para muchas enfermedades se han creado vacunas, pero casi todas las que afectan

mayormente a la población pobre de países en desarrollo se han quedado atrás porque el motor que mueve la

investigación y el desarrollo tecnológico reside en el poder adquisitivo de los países desarrollados. De tal forma

que en nuestras regiones remotas, un niño con diarrea puede no encontrar acceso oportuno de salud y esa diarrea

puede resultar en la muerte, porque no existen vacunas contra la diarrea. Desafortunadamente, a pesar de que se

cuenta con herramientas como terapia de rehidratación oral, lactancia materna exclusiva y promoción de la

higiene personal, tres intervenciones sencillas que reducen el impacto de las diarreas, las mismas no son de uso

masivo en nuestro país ya que la mayoría de las mujeres de las zonas rurales no tienen educación formal, más del

60% son analfabetas y está demostrado que el nivel de educación de la madre está directamente relacionado con el

desarrollo de sus hijos. La vacuna contra rotavirus, por ejemplo, no se ha aplicado masivamente en nuestro país y

se reserva para quienes tienen el poder económico para pagarla. Más aún, los antibióticos se dispensan

libremente en farmacias, por curanderos (quienes muelen las pastillas y dan “polvitos mágicos” a su clientela) e

inclusive en tiendas del área rural se venden pastillas sueltas de antimicrobianos, práctica que promueve el abuso

y mal uso de los mismos promoviendo presión selectiva hacia la resistencia antimicrobiana que dificulta y

encarece y dificulta el tratamiento de infecciones severas.

La infraestructura sanitaria de Guatemala es pobre. Solamente el 60% de la población tiene acceso a agua

entubada y la potabilidad de la misma se garantiza únicamente en las grandes ciudades como Guatemala. Al no

tener agua corriente, es difícil promover el lavado frecuente de manos pues las amas de casa deben acarrear el

agua por grandes distancias. El alto costo de la vida afecta también a los habitantes de regiones remotas, pues la

brecha entre ellos y el desarrollo cada día es mayor.

No obstante, la infraestructura laboratorial de Guatemala ha ido fortaleciéndose poco a poco y en 2008, el

Laboratorio Nacional de Salud cuenta con varios termocicladores y un laboratorio con cuarto blanco y

congeladores adecuados para poder implementar diagnósticos basados en pruebas moleculares (O. Torres, 2008).

Asimismo, el Seguro Social ha implementado sofisticadas mediciones de carga viral por PCR y poco a poco, el

personal profesional ha sido capacitado en métodos moleculares y la masa crítica en microbiología ha ido

aumentando, a pesar de la falta de recursos impide que el laboratorio sea un brazo importante que asuma el

liderazgo, se han hecho grandes avances en la última década. No obstante, la información disponible sobre

etiología de diarreas en Guatemala es escasa y no existen reportes periódicos basados en laboratorio sobre los

agentes de diarreas infecciosas en el país. Guatemala ha sufrido las consecuencias de esta falta de información al

FODECYT 039-2006 17

perder 45,000 fincas exportadoras de frambuesa debido a que se vinculó a este producto con brotes de diarrea por

Cyclospora cayetanensis en la década pasada en Estados Unidos y Canadá (Katz D 1995).

Entre 1999 y 2000 se condujo una vigilancia para diarrea sanguinolenta a través de los estudiantes de EPS

de la escuela de QB de la USAC. Se recolectaron 110 casos de diarrea sanguinolenta, 110 controles de diarrea no

sanguinolenta y 110 controles sin diarrea. La vigilancia fue pasiva, a través de muestras que llegaron a los sitios

de trabajo de los EPSs. El objetivo era determinar la prevalencia de E. coli entero hemorrágica como causante de

diarrea sanguinolenta. La EHEC se buscó por medio de PCR corrido en ADN extraído de cinco colonias de E.

coli pero simultáneamente se buscaron otros entero patógenos como Shigella, Salmonella, Campylobacter y

parásitos. Dos resultados fueron inesperados ya que los casos se asociaron principalmente con Shigella flexneri y

no con EHEC –no se encontró ningún caso de EHEC ni de síndrome hemolítico urémico- y la edad de los

pacientes osciló entre 15 y 69 años, a diferencia de lo que se esperaba que era en niños preescolares (Urréjola, MI

2001).

En un niño desnutrido, un episodio de diarrea aguda severo puede desembocar en la muerte cuando no

recibe atención médica oportuna y en nuestro medio, 10% de los casos de diarrea aguda resultan en diarrea

persistente que conlleva a falta de crecimiento y desarrollo y desnutrición crónica (Cruz et al., 1989). Desde los

años 70, Leonardo Mata estudió y describió detalladamente los patógenos asociados con infección intestinal en el

libro Los niños de Santa María Cauqué (SMC), publicado por MIT en la década de los 70’s, el cual resume diez

años de investigación prospectiva en una cohorte de niños de SMC, en donde resalta la falta de infraestructura

sanitaria y de educación formal de las madres. Las publicaciones de José Ramiro Cruz en los 90’s, que reportan

estudios de diarrea persistente llevados a cabo en Santa María de Jesús (SMJ), reportan un panorama muy similar

al de SMC, con infecciones múltiples y una impresionante falta de saneamiento ambiental, 20 años más tarde. No

obstante, observaciones hechas por la autora de este reporte permitieron conocer que en SMJ se dio un avance

grande en infraestructura sanitaria que resultó en la reducción significativa de las infecciones múltiples y de la

prevalencia de bacterias y virus entéricos en Santa María de Jesús. Sin embargo, la diarrea continúa siendo la

causa número uno ó dos de consulta, pero la comunidad adoquinó las calles y cementó sus patios y de esa forma

se redujo la prevalencia de una buena parte de las diarreas. Esta misma observación fue hecha en SMC, por Mata

L. & O. Torres, 2001. Lamentablemente casi el 50% de la población preescolar de Guatemala tiene desnutrición

crónica que se manifiesta como baja talla para edad, lo que multiplica el riesgo de mortalidad por diarrea.

Estudios más recientes desarrollados por O. Torres en la presente década permitieron estudiar la diarrea

aguda durante tres estaciones lluviosas en Santa María de Jesús, en niños menores de tres años de edad, pero

mayores de 6 meses, en estudios financiados por la OMS (a Svennerholm, AM) y por las Universidades de

Goteborg y de Johns Hopkins (A. L. Bourgeois), con el objeto de caracterizar los determinantes de virulencia de

las ETEC que afectan a la población pediátrica en nuestro país, ya que durante los estudios del Dr. Cruz, no se

ahondó en la ETEC pues el énfasis de los mismos era la diarrea persistente. El patógeno más frecuentemente

asociado con diarrea bacteriana aguda tanto en el área rural como en niños hospitalizados por diarrea severa en la

ciudad de Guatemala, es la E. coli enterotoxigénica seguida de la E. coli enteropatógena, mientras que en SMJ

ETEC es la principal causa seguida de Campylobacter jejuni (Svennerholm AM, 2005; Lemus, O 2006).

Estudios de la década de los 90 también identificaron a la E. coli enteroagregativa (EAEC) y a la E. coli

enteropatógena (EPEC) como agentes bacterianos que ocasionan diarreas severas y requieren hospitalización para

proteger la vida de los pacientes (Cruz, JR 1990) y con diarrea persistente (Cruz JR et al. 89 y 92).

EL PCR o reacción de la polimerasa en cadena por sus siglas en inglés, es un proceso cuyo desarrollo

ameritó un premio Nóbel (Dr Kary B. Mullis, 1993) y revolucionó el desarrollo de la ingeniería genética, de la

biología molecular, así como las técnicas de diagnóstico en salud. Este método permite multiplicar un segmento

de un gen dado a partir de material genético complejo, millones de veces en unas pocas horas, lo cual es de gran

significancia para la investigación bioquímica y genética.

FODECYT 039-2006 18

En el PCR se mezclan secuencias específicas que por su tamaño pequeño se conocen como

oligonucleótidos (cebadores, iniciadores o primers), que rodean a un gen de interés, se separan en dos hebras

desnaturalizándolos a 94°C y luego enzimas capaces de sintetizar ADN más los cuatros dinucleótidos, iones de

Mg++ en condiciones óptimas para que la enzima lleve a cabo sus funciones de sintetizar nuevas hebras, se repite

en varios ciclos (usualmente 25 a 30), y como resultado el gen se ha multiplicado en proporción geométrica y es

entonces detectable por curvas en gráficos o bien por geles de agarosa o de acrilamida. En este caso los genes

amplificados fueron los de las toxinas lábil y estables (LT y STh, STp) de E. coli enterotoxigénica (ETEC) y los

de los pilis formadores de bucles, el bpf y gen eaeA de E. coli enteropatógena, así como el AggR de EAEC. Los

primers o iniciadores tienen secuencias escogidas a partir de las reportadas en la literatura y disponibles en bases

de datos globales, en las bibliotecas virtuales de la internet, se sintetizan in vitro, se secan y los envían a

Guatemala en una semana. Las enzimas y otros reactivos se adquieren en el extranjero y se deben enviar

congelados, con hielo seco, y es esta logística la más complicada pues los mismos no se encuentran disponibles en

el mercado local, excepto bajo pedido expreso. Todos los reactivos pueden mantenerse congelados a -20°C

(Harris, E 1998).

En el presente caso, los primers y las condiciones de amplificación constituyen el reactivo objeto del

desarrollo de la presente investigación, pues deben diseñarse, probarse para reproducibilidad y validarse para que

reconozcan los genes blanco de forma sensible y específica, a partir de las secuencias de ADN publicadas para los

mismos. Además deben poder mezclarse sin inhibirse mutuamente ni producir bandas espurias, inespecíficas,

permitiendo amplificar los genes blanco de forma sensible, específica, reproducible y consistente a partir del

ADN de las bacterias.

I.2.2 JUSTIFICACIÓN DEL TRABAJO DE INVESTIGACIÓN

ETEC es el principal patógeno que causa diarrea del viajero en nuestro medio (Sack, D. 2007, Frech, S

2008), seguido de norovirus (Chapin, AR 2005) y de EAEC (Taylor, DN 2006). Estudios realizados en turistas

que visitan Antigua Guatemala en los cuales O. Torres ha participado como investigadora principal a cargo de los

análisis de laboratorio en el país, indican que del 40 al 50% sufren diarrea del viajero, el 50% de estos casos se

asocia con ETEC y una proporción elevada se enferma tan seriamente que suspenden sus planes vacacionales

porque no pueden desplazarse lejos de su hotel (Sack, D 2007, Frech, S 2008). Asimismo, se encontró a EAEC

como el segundo patógeno en importancia después de la ETEC como causante de diarrea del viajero (Zhi Dong

Ziang, O. Torres & L. Bourgeis, datos no publicados; Frech, S 2008, Taylor DN, 2006). La ETEC productora de

toxina estable tanto humana como porcina se asocia con diarrea en niños y turistas que visitaron Antigua

Guatemala (Bolin, I 2006).

El diagnóstico de todas las E. coli´s diarreogénicas constituye un reto para los laboratorios de referencia,

por lo que en general pasan desapercibidas en países como el nuestro, a pesar de que se ha documentado su

importancia en la epidemiología local. En 2003, O. Torres dirigió la transferencia tecnológica del diagnóstico de

ETEC por ELISA al INISA de Costa Rica, donde su contraparte principal fueron las Dras. Ximena Cortés y

Rosario Achí, con apoyo de la Dra. Svennerholm. Su identificación por métodos tradicionales requiere capacidad

de histocultivos, grandes colecciones de antisueros poli y monoclonales y procesos sumamente laboriosos, lentos

y muy caros, accesibles tan solo en laboratorios de referencia y necesitan alta capacidad técnica y gran

infraestructura de laboratorio para llevarlos a cabo. La alternativa con métodos moleculares, es una opción

atractiva porque con el mismo equipo se pueden identificar todas las cepas de E. coli diarreogénicas.

FODECYT 039-2006 19

I.3 OBJETIVOS

1.3.1 OBJETIVO GENERAL: Desarrollar un PCR multiplex para la detección y diferenciación

simultánea de ETEC, EPEC y EAEC los principales tipos de E. coli productoras de diarrea en

niños guatemaltecos.

1.3.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS:

1.3.2.1 Diseñar un primer que reconozca una región común en el extremo 5´ de los genes st y lt

en ETEC; eae y bpf en EPEC y aggr en EAEC respectivamente.

1.3.2.2 Establecer las condiciones metodológicas apropiadas, que permitan la detección y

diferenciación simultáneas de estos genes en E. coli's aisladas de heces diarreicas.

1.3.2.3 Validar el método con E. coli's previamente identificadas, en el estudio prospectivo sobre

diarrea persistente, realizado en Santa María de Jesús, disponibles en los ceparios del

INCAP.

1.3.2.4 Confirmar los resultados con hibridación con sondas de ADN de los genes de virulencia

sth, stp, lt, eae, bfp y aggr marcadas con digoxigenina y detectadas colorimétricamente.

FODECYT 039-2006 20

I.4 METODOLOGIA

1.4.1. Localización del estudio: el trabajo se realizó en el Laboratorio Diagnóstico Molecular, ubicado en el

Edificio Multimédica, Boulevard Vista Hermosa 25-19, zona 15 Vista Hermosa I, oficina 1009.

1.4.2. El Método

Un PCR multiplex es aquél en el que se detectan varios genes simultáneamente y por lo consiguiente,

ahorra tiempo y recursos al dar varias respuestas en una sola prueba. Se propuso desarrollar y validar un PCR

multiplex para detectar las variantes de E. coli que se asocian con un alto porcentaje de diarrea infantil en

Guatemala. El método desarrollado detecta la toxina lábil y las toxina estables (porcina y humana) de ETEC, el

pili formador de bucles de EPEC y el factor aggr de la E. coli enteroagregativa con lo que se detectan en ADN

extraído directamente de colonias (lactosa positivas) aisladas en agar MacConkey que se asumen son de E. coli,

estos tres patógenos. Los genes de virulencia a estudiar se detallan en la tabla 1. El mismo método se aplicó

exitosamente a muestras de ADN extraídas por el método del filtro FTA a partir de heces diarreicas de niños y

turistas enfermos con diarrea aguda.

TABLA 1: GENES DE VIRULENCIA A ESTUDIAR

E. coli diarreogénica Abreviatura Gen de virulencia blanco del PCR Función

E. coli enterotoxigénica ETEC Toxina Lábil (LT)

Toxina Estable Humana (STh)

Toxina Estable Porcina (STp)

Codifica tox. Termolábil

Codifica tox. termoestable

Codifica tox. termoestable

E. coli enteropatógena EPEC Pilus formador de "bucles" (bpfA)

Factor de adherencia de EPEC (eaeA)

E. coli enteroagregativa EAEC (aggr)

Eco R I sequence of pCVD432 (pCVD)

Regulador global de la

virulencia de EAEC

Fuente: Bolin, I., 2005, Van Nuyen, T. 2005, Nataro, J. 2007.

En el presente proyecto formulamos primers específicos, basados en las secuencias publicadas sobre los genes de

interés (Moseley, 1983, Yamamoto, 1984; Girón 1993, Bolin, 2006, Nataro JP 2005, 2007) que permiten

combinar los ensayos independientes en un solo PCR multiplex, el cual se va a probar con cepas previamente

diagnosticadas por los métodos estándar y almacenadas como cultivos stock.

El diagnóstico diferencial de las tres variedades de E. coli más importantes en la etiología de las diarreas

infantiles en Guatemala, E. coli enterotoxigénica (ETEC), E. coli enteropatógena (EPEC) y E. coli

enteroagregativa (EAEC), es especializado, como se indicó anteriormente y no se encuentra al alcance de los

laboratorios de servicio de nuestro país. Sin embargo, el diagnóstico preciso evita el uso inapropiado de

antimicrobianos con la consiguiente reducción de resistencia antimicrobiana en nuestro medio, pues ambas son

diarreas autolimitantes. Asimismo, permite describir la etiología y epidemiología de diarreas en niños, lo cual

FODECYT 039-2006 21

permite hacer estudios de brotes e implementar medidas de intervención para reducir la transmisión de estos

patógenos, tan importantes causas de diarrea infantil de nuestro país.

El proyecto aquí reportado fue un proyecto de investigación y desarrollo de una prueba de laboratorio para el

diagnostico de diarreas bacterianas causadas por ETEC, EPEC y EAEC. Para ello se usaron como cepas

conocidas, E. coli´s previamente aisladas en estudios realizados en Santa María de Jesús y el Hospital

Roosevelt, de los cuales O. Torres fue la investigadora principal, que fueron analizadas por ELISA y

anticuerpos monoclonales (método estándar de oro), colección que sirvió para validar el método desarrollado, o

bien por amplificación genética en el caso de las EAEC´s. La prueba desarrollada detecta los genes de

virulencia de ETEC, EPEC y EAEC por amplificación genética de secuencias blanco a través de la síntesis de

fragmentos de ADN de peso molecular conocido. La especificidad del método se comprobó por medio de una

prueba de Chi cuadrado y por sondas de ADN marcadas. El desarrollo de dicho método requirió el diseño y

selección de primers o iniciadores que luego fueron probados en ensayos de amplificación, mismos que fueron

optimizados según la secuencia de los primers y el largo del amplicón. El mayor reto fue el de reunir en un solo

tubo doce pares de primers y obtener, con el ADN extraído según el método de mas bajo precio (ebullición) un

resultado confiable y reproducible para los factores de virulencia buscados. Por ello no se describen variables,

indicadores, población, hipótesis, ni muestra. A continuación se describe el trabajo de laboratorio asociado con

este proyecto FODECYT.

Primers: Los primers o iniciadores son oligonucleótidos de 20-24 pares de bases de largo (15-16). En el presente

proyecto se obtuvieron primers fabricados en los Estados Unidos por Invitrogen, por medio de proveedores

nacionales como Bionuclear, S. A. LDM le entregaba las secuencias a Bionuclear y ellos los mandaban a

sintetizar y nos los entregaban puestos en LDM.

Para un PCR multiplex se requieren ya sea un primer en común y primers específicos para amplificar

simultáneamente los genes de virulencia de nuestro interés (16, 17) sth, stp, lt, eae, bfp y aggr, o bien ocho pares

de primers que se dirijan a los diferentes genes blanco. Los primers usados en este proyecto fueron seleccionados

haciendo uso de programas de identificación y alineamiento de secuencias genéticas, disponibles en el programa

de dominio público denominado Data Gene Bank y disponible en Internet:

http:\\www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi?Jform=0. Este programa indica los pasos a seguir para obtener las

secuencias deseadas, de forma bastante amigable. En el caso de sth, stp y lt se recibieron las secuencias

recomendadas por el laboratorio de referencia de OMS, por colaboración de la Dra. Ann-Mari Svennerholm,

directora del mismo, (Bolin, I. 2006), por lo que estas fueron usadas para contar con una prueba válida

globalmente. Para el gen aggr existen secuencias publicadas, recomendadas por el laboratorio del Dr. James

Nataro quien es el líder en investigación en esta bacteria, por lo que las mismas fueron las incorporadas en el

ensayo (Nataro, J. P. 2007).

Estandarización del Método de Amplificación: Para establecer y estandarizar condiciones de

amplificación con las que se obtuviesen bandas fuertes, de pesos moleculares fáciles de diferenciar para los tres

genes de interés, reproduciblemente, se determinaron los buffers y concentraciones de cloruro de magnesio,

concentraciones de nucleótidos, concentración de enzima y temperaturas y tiempos de incubación y número de

ciclo óptimos usando cultivos positivos conocidos. Asimismo se seleccionaron las condiciones de gel de agarosa

y estándares de peso molecular, velocidad, buffers, tiempo de corrimiento para separar las bandas y de fotografía

para documentarlas (15-16). Las condiciones reproducibles se alcanzaron después de muchos intentos fallidos, y

las mismas se describen en la sección de resultados.

El primer paso en el desarrollo del PCR multiplex fue correr todos los loci separadamente usando el

mismo programa de PCR. En un contexto ideal, observaríamos todas las bandas fuertes y sin bandas

inespecíficas. En la práctica, no todos los primers nos dieron este resultado ideal, a excepción de las tres bandas

para las toxinas de ETEC STp, STh y LT. Inicialmente se usaron cepas de Escherichia coli de referencia,

FODECYT 039-2006 22

disponibles en la American Type Culture Collection (ATCC) y de estudios anteriores realizados por O. Torres

cuando estaba en INCAP. Las cepas estándar se describen en la tabla siguiente.

TABLA 2: CEPAS ESTANDAR DE E. COLI Y SUS FACTORES DE VIRULENCIA

Tipo de diarreogenicidad

Factor de

Virulencia

Identificación

Descripción

E. coli enterotoxigénica Toxina estable

(STp)

SMJ 70059 Cepa control positivo para la toxina

estable porcina

E. coli enterotoxigénica Toxina lábil LT

y toxina estable

STh

SMJ

70071

Cepa control positivo para toxina

lábil y toxina estable humana

E. coli enterotoxigénica Toxina lábil LT SMJ

70083

Cepa control positivo para toxina

lábil humana

E. coli enteropatógena Eae CDC

0128 ab: 56-54

Cepa control positivo para uno de los

serogrupos más comúnmente

asociados con diarrea en Guatemala

E. coli enteropatógena Eae y

bpf

CDC

O111a, O111b:B

148-57

Cepa control positivo para uno de los

serogrupos más comúnmente

asociados con diarrea en Guatemala

E. coli enteroadherente (EAEC) EAEC aggr LDM-IOMAI

1637

Cepa enteroadherente positiva para

aggr trabajada por el laboratorio del

Dr. Herbert DuPont y Zhi Dong

Ziang

E. coli enteroadherente (EAEC) EAEC aggr 17-2 (W605) Enteric Diseases Department

Dr. Stephen Savarino E.coli

enteroadherente (EAEC)

EAEC aggr 042

Enteric Diseases Department

Dr. Stephen Savarino

E. coli no patógena Ninguno ATCC 25922 Cepa control negativo

Vibrio cholerae 01 clásico Ogawa Toxina de cólera

Ctx A, ctx B

ATCC 14035 Cepa productora de toxina, como control

cruzado negativo, para medir

especificidad del método

E. coli enteroinvasiva ipaH EIEC O121:MN Control negativo para medir

especificidad del método

E. coli enterohemorrágica SLT I & SLT II

(VT1, VT2) y

EAE

CDC 10407 Control negativo para medir

especificidad del método control positivo

EHEC

Shigella flexneri 6 No relacionados CDC

S. flex 6

Control negativo cruzado, para medir

especificidad del método

Salmonella B No relacionados INCAP 950056 Control negativo cruzado para medir

especificidad del método

Staphylococcus aureus No relacionados ATCC 25923 Control negativo para medir

especificidad del método

EHEC VT1, VT2, EAE ATTCC 35150 Control negativo para medir

especificidad del método control positivo

EHECC

FODECYT 039-2006 23

Validación del Método: Para validar el método desarrollado, se aplicó a cepas previamente identificadas por

ensayos por ELISA, corroboradas en el laboratorio de referencia de ETEC de la OMS por la Licda. Gudrun

Wiklund con apoyo de la Dra.Ann-Mari Svennerholm, que fueron parte del estudio colaborativo financiado por

OMS entre 2001 y 2005. En el caso de las EPEC, se usaron cultivos liofilizados provenientes del CDC. En el

caso de la EAEC se diagnosticó por adherencia en células Hep-2 y por hibridación con sondas marcadas para aggr

y fue obtenida en un estudio de diarrea del viajero, confirmada por el laboratorio del Dr. Herbert DuPont y por la

Dra. Zhi Dong Ziang, en la Universidad de Texas en Houston, así como cepas de referencia que fueron donadas y

enviadas a Guatemala por el Dr. Stephen Savarino del Servicio Naval de Estados Unidos. Estas cepas se

encuentran almacenadas en congelación a -70°C en el caso de ETEC y EAEC y una vez recuperadas del

liofilizado, también para las EPEC. Las cepas ATCC fueron obtenidas en forma liofilizada en asas descartables

de Remel. Para obtener células viables de los stocks, se inocularon en caldo tripticasa soya suplementado con

10% de sangre de carnero estéril, luego transferidas a agar sangre y finalmente almacenadas a –70°C en caldo

tripticasa soya con 20% de glicerol (9, 20).

En este paso se utilizaron cincuenta cepas conocidas de ETEC, diez de EPEC y dos de EAEC ya

previamente diagnosticadas. Todas las cepas que nos entregaron como EAEC estaban muertas, pues se

encontraban preservadas en agar con aceite mineral y tapones de corcho bañados en cera, no congeladas como el

resto. Se obtuvieron dos cepas del estudio de IOMAI terminado en 2007 (Frech, S, et al. 2008. Lancet). El

personal encargado del cepario, que labora en el laboratorio de bacteriología de LDM se encargó de sacar las

cepas y entregarlas a las encargadas del proyecto en forma codificada. De esta manera, esta parte del estudio fue

ciego para evitar sesgos de identificación por parte del personal de LDM encargado de realizar los PCR's.

Confirmación de Resultados: Para confirmar los resultados del PCR multiplex, se llevó a cabo una hibridación

de Southern de los productos de amplificación, con sondas de ADN marcadas con digoxigenina, sintetizadas a

partir de los genes sth, stp, lt, eae, bfp y aggr por medio de PCR, según recomendaciones del fabricante

(Boheringer-Mannheim). Es importante hacer notar que ambas investigadoras guatemaltecas tienen experiencia

en la preparación, manejo y detección de sondas de ADN marcadas colorimétricamente (21 - 23).

1.4.3 TECNICA ESTADISTICA

Los resultados obtenidos con el PCR multiplex aquí desarrollado y que en adelante será denominado PCR

multiplex ETEC/EPEC FODECYT 39/2006, fueron analizados en una tabla de 2x2 por Chi cuadrado, para

obtener la sensibilidad, la especificidad y valores predictivos positivo y negativo.

1.4.4 EQUIPO, REACTIVOS Y MATERIALES UTILIZADOS

Computadora con acceso a internet para el diseño de primers

10 X Buffer Invitrogen

DNTPs Invitrogen

Primer 1 a 16 listados en la Tabla 3

Agua HPLC

MgCl2 Invitrogen

TAQ Invitrogen

Pipetas blancas para 0.5 a 10 uL, 10 a 20 uL, 20 a 100 uL, 100 a 1000 uL

Tips con filtro del cuarto blanco para 0.5 a 10 uL, 10 a 20 uL, 20 a 100 uLy 1000 uL

Bloque congelador

Hielo picado

Agua para HPLC del cuarto blanco

Micro/Centrífuga de mesa para mezcla maestra

Vortex

Tubos Eppendorf de 1.5 mL, 0.5 mL y 0.2 uL

FODECYT 039-2006 24

Guantes cuarto blanco

Gradillas blancas

Picador de hielo y recipiente para hielo picado

Bata cuarto blanco

Pipetas grises para 0.5 a 10 uL, 10 a 20 uL, 20 a 100 uL, 100 a 1000 uL

Tips con filtro del cuarto gris para 0.5 a 10 uL, 10 a 20 uL, 20 a 100 uLy 1000 uL

Microcentrífuga

Baño de María hirviendo

Asa en punta

Mechero

Vortex

Agua para HPLC del cuarto gris

Tubos Eppendorf de 1.5mL y 0.5 ml

Gradillas grises

Guantes cuarto gris

Cepas control ETEC LT+, ETEC STh+, ETEC STp+

Refrigerador cuarto gris

Pipetas negras para 0.5 a 10 uL, 10 a 20 uL, 20 a 100 uL, 100 a 1000 uL

Tips con filtro del cuarto negro para 0.5 a 10 uL, 10 a 20 uL, 20 a 100 uLy 1000 uL

Tubos Eppendorf de 1.5mL y 0.5 mL

Gradillas negras

Refrigerador cuarto negro

Agarosa

Balanza

Buffer TBE 5x

Bromuro de Etidio

Termociclador

Transiluminador

Cámara Cannon con cono

Congeladores a -20°C y a -70°C

Horno de microondas

Diseño de primers:

Los primers o iniciadores son oligonucleótidos de 20-24 pares de bases de largo (15-16). Para un PCR

multiplex, en teoría se requieren un primer en común y primers específicos para amplificar simultáneamente los

genes de virulencia (16, 17) que estamos buscando. En este caso sth y stp, lt para ETEC y bfp y eae para EPEC,

así como aggr para EAEC. En este caso no se desarrolló un solo primer en común, debido a que los genes de

toxina estable, sth y stp que codifican para la toxina estable humana y la toxina estable porcina, son de muy corta

longitud y no se logró una secuencia común con los otros genes, a pesar de extensas búsquedas con programas de

identificación y alineamiento de secuencias genéticas, disponibles en el programa de dominio público

denominado “Data Gene Bank” y disponible en el sitio de Internet:

http:\\www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi?Jform=0, programa que indica los pasos a seguir para obtener las

secuencias deseadas, de forma bastante amigable. Hubo un factor no planificado en la selección de los primers de

ETEC. En octubre/noviembre de 2006, la IP viajó a Goteborg, Suecia invitada por la OMS para presentar datos

de la epidemiología de ETEC en Guatemala, generados en un proyecto colaborativo con la Dra. Ann-Mari

Svennerholm y financiado por OMS. En esta reunión la OMS anunció que el laboratorio de la Dra. Svennerholm

había sido nombrado el Centro de Referencia para ETEC por la OMS y por lo tanto, el Rector del diagnóstico

laboratorial de este patógeno en el mundo. Al contarle a la Dra. Svennerholm de este proyecto, ella y su técnica,

FODECYT 039-2006 25

Gudrun Wiklund, compartieron el método de PCR para detectar los genes de las toxinas de ETEC, mismo que se

convirtió en el método avalado por la OMS. Ante esto, la IP decidió introducir este como parte del PCR

multiplex para asegurarnos que la metodología seleccionada fuera válida ante la OMS. Para EPEC y EAEC los

primers fueron seleccionados usando el recurso Blast. Los primers seleccionados se listan en la tabla 3.

Estandarización del Método de Amplificación: Para establecer y estandarizar condiciones de

amplificación y que se obtuvieran bandas fuertes, de pesos moleculares fáciles de diferenciar para los genes de

interés, reproduciblemente, se determinaron los buffers y concentraciones de cloruro de magnesio,

concentraciones de nucleótidos, concentración de enzima y temperaturas y tiempos de incubación óptimos usando

cultivos positivos conocidos o estándar (15-16).

El proceso inicial consistió en amplificar gen por gen, de forma individual, para determinar si se amplificaba con

las condiciones elegidas para el PCR multiplex.

Inicialmente se usaron cepas de Escherichia coli de referencia, entregadas por el laboratorio de referencia

de la OMS para ETEC, por el CDC de Atlanta para EPEC u obtenidas de la American Type Culture Collection

(ATCC). Este fue un aporte de LDM al proyecto, el cual no había sido contabilizado en la contrapartida, pues se

obtuvieron de investigadores y colaboradores de otros proyectos de la IP. Las cepas usadas se describen en la

tabla 2.

FODECYT 039-2006 26

PRIMER Y SECUENCIA

PESO

MOLECULA

R Y

MOLECULA

DETECTADA

REFERENCIA LARG

O (PB)

PESO

MOLE

CULA

R

CONT

ENIDO

GC

TEMP

MEL-

TING

°C

AUTO-COMPLE-

MENTARIE-DAD

Primer 1: ST forw kb -

AGTGGTCCTGAAAGCATG-

sth: 64 pb

Bolin, I. 2006 18 5563.7 50 48 Ninguna

Primer 2: ST Gr -

TACAAGCAGGATTACAACAC-

20 6103.1 40 48 Ninguna

Primer 3: STP F1 –

TCTTTCCCCTCTTTTAGTCAG-

stp: 166 pb

Bolin, I. 2006 21 6389.1 43 50 Ninguna

Primer 4: STP R2 –

ACAGGCAGGATTACAACAAAG-

21 6481.3 43 50 Ninguna

Primer 5: LT kb forw –

ACGGCGTTACTATCCTCTC-

lt: 274 pb

Bolin, I. 2006 19 5714.8 53 51 Ninguna

Primer 6: LT kb rev -

TGGTCTCGGTCAGATATGTG-

19 5849.9 47 49 Ninguna

Primer7: eae F -

CACACGAATAAACTGACTAAAATG-

eae: 376 pb Vu Nguyen, 2005 24 7346.9 33 51 Ninguna

Primer8: eae R -

AAAAACGCTGACCCGCACCTAAAT-

24 7283.8 46 56 Ninguna

Primer 9: bfp F –

TTCTTGGTGCTTGCGTGTCTTTT-

bfp: 367 pb

Vu

Nguyen, 2005

23 7024.6 43 53 Ninguna

Primer 10: bfp R –

TTTTGTTTGTTGTATCTTTGTAA-

23 6982.6 26 46 Ninguna

Primer 11: aggrF –

CTGGCGAAAGACTGTATCAT--

aggr: 630 pb Nataro, J. P. 2007 20 6141.1 45 50 Ninguna

Primer 12: aggrR --

CAATGTATAGAAATCCGCTGTT--

22 6733.5 36 49 Ninguna

Primer 13: vt1A –

GAAGAGTCCGTGGGATTACG

vt1: 130 pb Vu

Nguyen, 2005

20 6222.1 55 54 Ninguna

Primer 14: vt1B –

AGCGATGCAGCTATTAATAA

20 6149.1 35 46 Ninguna

Primer 15: vt2 A --

ACCGTTTTTCAGATTTTGCACATA

Vt2: 298 pb Vu

Nguyen, 2005

24 7292.8 33 51 Ninguna

Primer 16: vt2 B --

TACACAGGAGCAGTTTCAGACAGT

24 7385.9 46 56 Ninguna

TABLA 3: SECUENCIA DE PRIMERS SELECCIONADOS PARA EL PCR MULTIPLEX 039-2006 PARA ETEC, EPEC, EAEC Y EHEC

FUENTE: FODECYT 039-2006

FODECYT 039-2006 27

EXTRACCION DE ADN DE COLONIAS

1. Aislar 5 colonias en Agar MacConkey o Agar Nutritivo (se usa para las cepas estándar).

2. Se toma una asada de media colonia aislada y se introduce en un eppendorf de 1.5 ml que

contenga 500 μl de agua grado HPLC.

3. Colocar el eppendorf en baño María a 100 ºC durante 20 minutos.

4. Al tener los 5 eppendorfs con el ADN extraído, se toman 100 μl de cada uno y se agregan a un

eppendorf, para preparar un solo pool de cada paciente.

5. Almacenar a –20 ºC.

EXTRACCION DE ADN DE HECES DIARREICAS POR MEDIO DE FILTROS FTA

1. Transferir 5 uL de muestra de heces a los filtros FTA

2. Secar los filtros con las muestras sobre una placa caliente a 60°C por una hora

colocando una hoja de papel secante entre las muestras y la placa para evitar que se

queme.

3. Colocar los filtros en un recipiente plástico y lavar por un minuto dos veces seguidas

con la solución FTA de lavado.

4. Lavar dos veces con solución de lavado TE agitando por dos minutos cada uno.

5. Colocar los filtros en la placa caliente a 60°C por 45 minutos

6. Sacar un trozo del filtro procesado usando un sacabocados desinfectado y colocar en un

tubo para PCR

7. Para el PCR usar 96 uL de master mix y agregarla directamente al tubo que contiene el

filtro. Si se usa la cantidad de 48 uL se evapora y no hay amplificación satisfactoria.

CONDICIONES DEL PCR MULTIPLEX PARA DETECCION

SIMULTÁNEA DE ETEC, EPEC Y EAEC:

Desnaturalización a 94°C por 4 minutos

39 ciclos de: 20 segundos a 94°C (desnaturalización)

30 segundos a 55°C (hibridación de primers en secuencias blanco)

10 segundos a 72°C (extensión)

Extensión final a 72°C por 7 minutos.

Tiempo requerido: 2 horas

En el termociclador Techne se tarda 1 hora con 38 minutos.

FODECYT 039-2006 28

TABLA 4: PREPARACION DE LA MEZCLA MAESTRA PARA EL

PCR MULTIPLEX DE ETEC, EPEC Y EAEC (DETECCION

SIMULTANEA)

Reactivo MARCA CONCENTRACION μl/tubo Total

Tubos

Vol.

Tota

l

10 X Buffer Gibco 10 X 5.0 N 5*n

DNTPs Invitrogen 2.5 mM 2.0

Primer 1: ST forw

kb

Invitrogen 100 mM 1.0

Primer 2: ST Gr Invitrogen 100 mM 1.0

Primer 3: STP F1 Invitrogen 100 mM 1.0

Primer 4: STP R2 Invitrogen 100 mM 1.0

Primer 5: LT kb

foro

Invitrogen 100 mM 1.0

Primer 6: LT

kbrev

Invitrogen 100 mM 1.0

Primer 7: eae F Invitrogen 100 mM 0.6

Primer 8: eae R Invitrogen 100 mM 0.6

Primer 9: bfp F Invitrogen 100 mM 0.4

Primer 10: bfp R Invitrogen 100 mM 0.4

Primer 11: aggr F Invitrogen 100 mM 1.0

Primer 12: aggr R Invitrogen 100 mM 1.0

Primer 13: vt1 a Invitrogen 100 mM 1.0

Primer 14: vt1 b Invitrogen 100 mM 1.0

Primer 15: vt2 a Invitrogen 100 mM 1.0

Primer 16: vt2 b Invitrogen 100 mM 1.0

Agua HPLC Merck 23.8

MgCl2 Gibco 50 Mm 0.9

TAQ Gibco 5 U/ul 0.3

Volumen Mezcla 44.0

Volumen Muestra 6.0

Volumen Total 50.0

FUENTE: FODECYT 039-2006

FODECYT 039-2006 29

PREPARACION DE MUESTRAS PARA AMPLIFICACION DEL DNA BLANCO

Se calcula el número total de tubos de muestras y se agrega un control negativo del cuarto blanco y tres

controles positivos para ETEC LT+, STp+ y STh+. Este es el factor por el que se multiplica el volumen

por tubo para obtener el volumen por reactivo a agregar para preparar la mezcla maestra. Esta mezcla

maestra se prepara en el cuarto blanco, en un Eppendorf de 1.5 mL, dentro de la campana de flujo

laminar, con el filtro encendido, midiendo rápida y precisamente cada ingrediente. Se usa un bloque

congelado a -20°C ó a -70°C, pero al sentir que el bloque se descongela se debe usar hielo picado.

Debe trabajarse rápido para prevenir que se hibridicen entre sí mismos los primers y se mire una ancha

banda de dímeros de primers o primer dimers.

AMPLIFICACION DE GENES DE VIRULENCIA

El PCR se corre en el termociclador Perkin Elmer, con el programa ETEC/EPEC multiplex: incuba por

4 minutos a 94°C, luego se corren 39 ciclos como sigue: 20 segundos a 94°C (desnaturalización del

ADN blanco, 30 segundos a 55°C para hibridación entre primers y las hebras separadas del ADN

blanco y 10 segundos a 72°C para extensión de nuevo ADN por la polimerasa Taq, para finalmente

dejar por 7 minutos a 72°C para que se extiendan por la polimerasa Taq las reacciones que quedaron a

medias y luego se mantienen los tubos a 10°C hasta que se sacan del termociclador. Este proceso lleva

2.5 horas. Al terminarlo se deben poner los tubos sin demora en frío para evitar presencia de una banda

muy ancha de primer dimers o bien correrlo de una vez en el gel. El proceso de amplificación lleva

alrededor de 2.5 horas.

En el termociclador Techne 512 se tarda 1 hora con 38 minutos únicamente.

PREPARACIÓN DEL GEL

1. Para la preparación del gel se deben preparar 150 mL de TBE 0.5 X (15 mL de TBE 5X + 135 mL

de Agua destilada estéril).

2. El gel a utilizar debe ser de 2% de agarosa. Pesar 3 gramos de Agarosa Sigma y disolverlo en los

150 mL de TBE 0.5X.

3. Colocar en el microondas por alrededor de 2 minutos, agitar constantemente. Disolver todos los

cristales.

4. Esperar a que se enfríe un poco aproximadamente 65 ºC (hasta donde la piel lo tolere) y agregar 5

μl de bromuro de etidio 10 mg/ml.

5. Verter en un molde. Esperar que se solidifique y meter en el refrigerador. Quitar lentamente los

peines para no romper los posos ni levantar el gel.

FODECYT 039-2006 30

INOCULACIÓN DEL GEL

1. Sumergir el gel en el buffer de corrida (TBE 5X) a manera de cubrir bien los posos.

2. Colocar primero el marcador de peso molecular (50 pb). Se utilizan 2 μl de marcador + 3 μl de

buffer de carga.

3. De cada muestra servir 20 μl de producto + 3 μl de buffer de carga.

4. Al terminar de servir las muestras colocar nuevamente el marcador de peso molecular.

5. Conectar a la fuente de poder con un voltaje de 20 mAmp por 2 horas.

TOMA DE FOTOGRAFIA

1. Al pasar las dos horas se coloca el gel en su molde sobre el transiluminador y se enciende la luz

UV.

2. Se observan las bandas y si los controles positivos y negativos se observan bien y se puede calcular

el peso molecular de las bandas observadas, se procede a tomar una foto con el cono y la cámara

Cannon.

3. Al encender la cámara puede centrarse la foto y se ajusta al mayor tamaño posible.

4. Una vez tomada la foto se pasa a la computadora para documentar el resultado del experimento.

FODECYT 039-2006 31

PARTE II

II.1 MARCO TEORICO

Las enfermedades diarreicas ocasionan 4,000 millones de casos cada año. Son la segunda mayor

causa de muerte de niños menores de cinco años, y ocasionan la muerte de 1,8 millones de niños

cada año. La diarrea asociada con infección puede durar varios días y puede privar al organismo del

agua y las sales necesarias para la supervivencia. La mayoría de las personas que fallecen por

enfermedades diarreicas, en realidad mueren por una grave deshidratación y pérdida de líquidos a

pesar de que, desde el desarrollo de las terapias de rehidratación oral, esas muertes no se deberían

dar. Así mismo, lactancia materna y mejor higiene ayudan a reducir la enfermedad diarreica. Los

niños malnutridos o inmunodeprimidos son los que presentan mayor riesgo de enfermedades

diarreicas potencialmente mortales, así como los habitantes de regiones remotas, que tienen que

caminar días para llegar a un servicio de salud.

La enfermedad diarreica es un problema importante de salud pública porque los niños que padecen

de diarrea crecen menos que quienes no la presentan. En contraste, la enfermedad respiratoria no

afecta las tasas de crecimiento (Martorell, R. et al, 1975 a y b).

Se define como diarrea la deposición, tres o más veces al día (o con una frecuencia mayor que la

normal para la persona) de heces sueltas o líquidas. La deposición frecuente de heces formes (de

consistencia sólida) no es diarrea, ni tampoco la deposición de heces de consistencia suelta y

“pastosa” por bebés amamantados. La diarrea suele ser un síntoma de una infección del tracto

digestivo, que puede estar ocasionada por diversos organismos bacterianos, víricos y parásitos. La

infección se transmite por el consumo de alimentos o agua contaminada, o bien de una persona a

otra como resultado de una higiene deficiente. Las enfermedades diarreicas pueden tratarse con una

solución de agua limpia, azúcar y sal, y con comprimidos de zinc.

Hay tres tipos clínicos de enfermedades diarreicas:

la diarrea acuosa aguda, que dura varias horas o días, y comprende el cólera;

la diarrea con sangre aguda, también llamada diarrea disentérica o disentería; y

la diarrea persistente, que dura 14 días o más.

Cada año, se producen unos dos mil millones de casos de diarrea en todo el mundo.

Las enfermedades diarreicas son una causa principal de mortalidad y morbilidad en la niñez en el

mundo, y por lo general son consecuencia de la exposición a alimentos o agua contaminados. En

todo el mundo, alrededor de mil millones de personas carecen de acceso a fuentes de agua

mejoradas y unos 2500 millones no tienen acceso a instalaciones básicas de saneamiento. La diarrea

causada por infecciones es frecuente en países en desarrollo.

En 2004, las enfermedades diarreicas fueron la tercera mayor causa de muerte en países de ingresos

bajos, donde ocasionaron el 6,9% de los fallecimientos. Son la segunda mayor causa de muerte de

FODECYT 039-2006 32

niños menores de cinco años, tras la neumonía. De los 1,5 millones de niños que fallecieron por

enfermedades diarreicas en 2004, el 80% tenían menos de dos años.

En países en desarrollo, los niños menores de tres años sufren, de promedio, tres episodios de

diarrea al año. Cada episodio priva al niño de nutrientes necesarios para su crecimiento. En

consecuencia, la diarrea es una importante causa de malnutrición, y los niños malnutridos son más

propensos a enfermar por enfermedades diarreicas.

La amenaza más grave de las enfermedades diarreicas es la deshidratación. Durante un episodio de

diarrea, se pierde agua y electrolitos (sodio, cloruro, potasio y bicarbonato) en las heces líquidas,

los vómitos, el sudor, la orina y la respiración. Cuando estas pérdidas no se restituyen, se produce

deshidratación.

La diarrea es un síntoma de infecciones ocasionadas por muy diversos organismos bacterianos,

víricos y parásitos, la mayoría de los cuales se transmiten por agua con contaminación fecal. La

infección es más común cuando hay escasez de agua limpia para beber, cocinar y lavar. Las dos

causas más comunes de enfermedades diarreicas en países en desarrollo son los rotavirus y

Escherichia coli.

En el mundo se han realizado numerosos estudios sobre la causa de la enfermedad diarreica aguda

(EDA). Entre los reportados en los últimos años en América Latina, se destacan los realizados por

Olarte en México, quien trabajó con niños desde 0 hasta 3 años, dicho autor encontró algún agente

enteropatogénico en el 70 % de los casos de diarrea y en 31 % de los controles. Los agentes más

frecuentemente identificados fueron: Escherichia coli enterotoxigénica (ETEC, 17 %), Shigella sp.

(11 %) y Escherichia coli enteropatógena (EPEC 10 %). El virus Norwalk se identificó en 5 % de

los casos, Salmonella sp. 4 %, Giardia lamblia en 5 %, Adenovirus en 3 % y Entamoeba

histolytica sólo en 0,7 %. Por su parte, Trujillo y otros , en Colombia, en un estudio con 100 niños

de todas las edades, identificaron 115 microorganismos en 78 pacientes, entre los cuales 15 se

destacan ETEC termoestable (27), Rotavirus (25), EPEC (28), Campylobacter sp. (10), Salmonella

enteritidis (6), ETEC termolábil (5), trofozoitos de Giardia lamblia (4), Shigella (3), trofozoitos de

Entamoeba histolytica (4), Salmonella typhi (2) y Salmonella paratifica B (1). Ixta-Rodríguez y

otros, en un estudio llevado a cabo en México en niños desde 0 hasta 15 años, encontraron EPEC en

4 % de los casos, seguida de Klebsiella sp., Salmonella sp. y Shigella sp. con 24,6; 11,5 y 7,8 %,

respectivamente.2,3 Así mismo, es importante destacar el trabajo realizado por Notario y otros en

Argentina, en niños menores de 5 años, donde reportan los enteropatógenos, EPEP (26,1 %), ETEC

(9,7 %), Shigella (8,5 %), Rotavirus (5,1 %), Giardia (3,6 %), Campylobacter (3,2 %) y Salmonella

(2,4 %). En Venezuela es importante mencionar los estudios realizados por Urrestarazu y otros en

Caracas, quienes analizaron 182 muestras de niños menores de 2 años, encontraron ETEC en 41,8

%; EPEC en 12,2 %; Klebsiella pneumoniae en 11,2 %; Campylobacter jejuni en 9,2 %; Rotavirus

en 14,1 %; Giardia lamblia en 3,5 % y Entamoeba histolytica en 3,5 %. Como se puede apreciar,

los agentes bacterianos se encuentran entre los principales agentes causales de las diarreas

infecciosas en prácticamente todos los países del mundo, sin que Guatemala sea una excepción.

La Escherichia coli, en su hábitat natural, vive en los intestinos de la mayor parte de los mamíferos

sanos. Es el principal organismo anaerobio facultativo del sistema digestivo. En individuos sanos,

es decir, si la bacteria no adquiere elementos genéticos que codifican factores virulentos, la bacteria

actúa como un comensal formando parte de la microbiota y ayudando así a la absorción de

nutrientes. En humanos, la Escherichia coli coloniza el tracto gastrointestinal de un neonato

adhiriéndose a las mucosidades del intestino grueso en el plazo de 48 horas después de la primera

FODECYT 039-2006 33

comida. Se parece mucho a V. cholerae, se adhiere a la mucosa del intestino delgado, no la invade,

y elabora toxinas que producen diarrea. No hay cambios histológicos en las células de la mucosa y

muy poca inflamación. Produce diarrea no sanguinolenta en niños y adultos, sobre todo en países en

vías de desarrollo, aunque los desarrollados también se ven afectados.

Escherichia coli, previamente conocida como la bacteria fecal más abundante y no patógena para el

intestino, es ahora clasificada en dos grupos: E. coli diarreogénica y E. coli no diarreogénica, ésta

es un importante miembro de la microbiota fecal normal y su presencia se considera un indicador

de contaminación fecal. Las Escherichia coli diarreogénicas, se subdividen en cinco categorías: E.

coli enteropatógena (EPEC), E. coli enterotoxigénica (ETEC), E. coli enterohemorrágica

(EHEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC) y E. coli enteroagregativa (EAEC) (Nataro, J 2007).

Para determinar el grupo patógeno al que pertenecen Kauffman desarrolló un esquema de

serotipificación que continuamente varía y que actualmente tiene 176 antígenos somáticos (O), 112

flagelares (H) y 60 capsulares (K). El antígeno “O” es el responsable del serogrupo; la

determinación del antígeno somático y flagelar (O:H) indica el serotipo, el cual en ocasiones se

asocia con un cuadro clínico en particular. La serotipificación de E. coli requiere de gran número de

antisueros. Como hay pocos laboratorios que la realizan, se prefiere identificar las cepas mediante

sus factores de virulencia empleando ensayos in vitro como por ejemplo ensayos de adherencia en

células Hep-2 y ensayos de toxigenicidad en células. También se pueden realizar ensayos in vivo,

como el asa ligada o la prueba de Sereny, así como ensayos inmunológicos y pruebas de biología

molecular, para poner de manifiesto la presencia de fragmentos de genes involucrados en el

mecanismo de patogenicidad y que sirvan de marcadores moleculares. Las ETEC colonizan la

mucosa del intestino delgado por medio de pilis o fimbrias que tienen diversas formas denominadas

CFA (colonization factor antigens), siendo su principal mecanismo de patogenicidad la síntesis de

alguna o ambas enterotoxinas llamadas toxina termolábil (LT) y toxina termoestable (ST). Sus

genes están en un plásmido que también puede tener información genética para los CFA´s, aunque

algunos genes de ST se han encontrado en transposones. Las toxinas LT y ST aumentan el nivel

intracelular de cAMP y cGMP respectivamente, que se encuentran en la membrana de las células

intestinales, provocando la salida de agua e iones. Las ETEC son importantes en lactantes,

principalmente en niños menores de dos años, y en particular durante los primeros seis meses de

vida.

Todas son patógenas al ser humano y con excepción de E. coli enteroinvasiva, todas han sido

documentadas en nuestro país como agentes causales de diarrea infantil (Cruz, JR 1986, Cruz, JR

1992). En Guatemala, aunque no se cuenta con un sistema de vigilancia activa de diarreas, existen

estudios prospectivos realizados en comunidades rurales, hospitalarias y peri-urbanas, que han

demostrado que un niño menor de cinco años sufre de ocho a once episodios de diarrea anualmente

(Cruz, J. R. 1986, 1992). A nivel mundial las E. coli diarreogénicas no se buscan rutinariamente en

los laboratorios clínicos, debido a la falta de métodos diagnósticos rápidos, asequibles, y de bajo

costo. No obstante, en múltiples estudios de investigación se ha demostrado que las E. coli

diarreogénicas son una de las principales causas de diarrea en niños en países en vías de desarrollo

y algunas de éstas E. coli están siendo reconocidos como importantes enteropatógenos en países

desarrollados. La diseminación de las E. coli diarreogénicas es por contaminación fecal de agua o

alimentos. La ETEC y EAEC no solo están asociados a diarrea en niños, sino que también son los

principales agentes etiológicos de la diarrea del viajero.

Las manifestaciones clínicas de cada una de las E.coli diarreogénicas varían en relación a los

diferentes mecanismos de producción de enfermedad. ETEC coloniza el intestino delgado y secreta

enterotoxinas (termo-lábil y termo-estable) que producen una diarrea secretoria. La diarrea se

FODECYT 039-2006 34

caracteriza por ser acuosa, sin sangre, con dolor abdominal, nauseas, vómitos y escasa fiebre. La

enfermedad usualmente se autolimita en 3 a 5 días, pero puede durar más de una semana.

En Guatemala, la etiología de los mismos varía entre regiones, sin embargo, los principales agentes

de diarrea bacteriana son E. coli enterotoxigénica causante del 17.9% de los episodios en el área

rural, mientras que EPEC causa el 5.8% de los casos. Sin embargo, EPEC se asocia con el 17.8%

de casos de diarrea persistente, cifra que la coloca como la principal causa de diarrea de más de

catorce días de duración en nuestro medio. La EPEC se asocia con casos de diarrea persistente,

cuyos efectos sobre el estado nutricional y eventualmente sobre la vida del paciente, son

indeseables (INCAP, datos no publicados, Cruz JR, 1986, 1992). El panorama infeccioso no ha

cambiado en ciertas regiones del país desde los años 70, cuando se reportaban que por cada 100,000

niños de 1-4 años, 500 morían por diarrea mientras que en los Estados Unidos esa cifra es menor a

tres ( Behar, M 1970).

En 1962, Pierce y colaboradores reportaron que el 13 % de niños de edad preescolar con diarrea y

el 6% sin diarrea, presentaba Shigella spp y aducían la necesidad de evaluar el rol de bacteria como

causa de diarrea en Guatemala. En 1965, Leonardo Mata y colaboradores reportaron una epidemia

de más de 1200 casos en niños de edad preescolar que se observó a lo largo de 25 meses y dentro de

los cuales sobresalieron 30 casos de Shigella dysenteriae A1 (bacilo de Shiga) en niños del área

rural de Guatemala, de los cuales hubo un fallecido. Solamente 3.5% de los casos se asociaron con

Escherichia coli enteropatógena (EPEC) y en el 82.5% de los casos no se aisló ningún patógeno

bacteriano.

Mata L. (1978) estudió una cohorte de niños de Santa María Cauqué desde el nacimiento hasta los

siete años de edad. Concluyó que la infección es uno de los factores primordiales asociados con la

reducida ingesta de calorías y proteínas durante el período crítico de aparición de la malnutrición y

mortalidad en la niñez. Mata concluye que previniendo la infección y en particular la diarrea se

puede mejorar significativamente la ingesta alimenticia, la nutrición y el crecimiento de la niñez

guatemalteca. En esta cohorte de 45 niños se estudió la historia natural de infección por Giardia

lamblia durante los primeros tres años de vida. Todos los niños tuvieron por lo menos una

infección por Giardia, cuya prevalencia alcanzó el 20.2% y la incidencia fue de 5.3%, para finales

del 3er. año de vida. El número promedio de infecciones por G. lamblia por niño incrementó del

0.7 en el primer año a 3.6 en el tercer año. Más del 40% de estas infecciones duró entre 2 y seis

semanas o más y se asociaron con diarrea acuosa. La velocidad de ganancia de peso fue

significativamente menor en niños con Giardia que en niños libres de este patógeno (p=0.03). La

duración de los episodios de Giardiasis y su asociación con diarrea fueron dos de los factores

asociados con alteración del crecimiento, sugiriendo que la infección por Giardia puede tener

efectos deletéreos independientes en el crecimiento. Algo similar observó J. R. Cruz con EPEC en

Santa María de Jesús en los años 1986-88 (datos no publicados, INCAP).

Delgado y col, reportaron en 1983 los resultados de un estudio conducido por INCAP entre 7,000

niños indígenas preescolares, en Patulul. Los mismos apoyan la hipótesis que las consecuencias

negativas de la diarrea son más significativas entre niños malnutridos y demuestran el efecto

positivo de un programa simplificado de salud sobre el estado nutricional de niños con desórdenes

gastrointestinales.

Cruz y colaboradores reportaron en 1989 que estudiaron 1280 muestras fecales recolectadas de

casos de diarrea y controles sin diarrea durante dos años en la Colonia el Limón, un área marginal

urbana de la ciudad de Guatemala. El 8.3% de los casos de diarrea se asociaron con

Cryptosporidium parvum, mientras que el mismo sólo se observó en 0.6% de los controles sin

FODECYT 039-2006 35

diarrea. La mayoría de infecciones se observó durante los meses de febrero a mayo, al final de la

estación seca. Los autores reportaron que la presencia de animales domésticos (perros, gatos o

pollos) y la ausencia de instalaciones sanitarias como un inodoro en la casa, fueron factores de

riesgo importantes para la infección con C. parvum, así como estado nutricional deficiente. Este

estudio fue conducido entre 130 infantes de la colonia El Limón, un área marginal de la ciudad de

Guatemala. Los niños se visitaron semanalmente en el hogar por tres a nueve meses. Los episodios

de diarrea fueron detectados y se realizaron análisis microbianos en muestras fecales. Los niños

fueron pesados y medidos para determinar su estado nutricional. Se encontró que en promedio los

niños sufrieron 5.2 episodios de diarrea por niño por año, 9.4% de los episodios duraron por lo

menos dos semanas. Los niños que eran menores de 6 meses tuvieron más episodios de diarrea

persistente que los niños mayores, con episodios previos de diarrea y el número de

enteropatógenos, así como el antecedente de un episodio de diarrea persistente como factores de

riesgo importantes. E. coli enteroadherente, C. parvum, E. coli enterotoxigénica y Campylobacter

jejuni fueron los patógenos asociados con diarrea persistente. Los autores concluyen que la diarrea

persistente interfiere con la ganancia de peso y el crecimiento de los niños, por lo que tiene un

efecto deletéreo sobre el estado nutricional.

Cruz JR y col reportaron en 1990 un estudio de diarrea en 194 niños del área rural de Guatemala de

0 a 3 años de edad. Estudiaron 385 episodios de diarrea con un total de 485 muestras fecales y 191

muestras tomadas de niños sin diarrea. Cincuenta y siete niños que fueron hospitalizados por

diarrea durante este período, también fueron estudiados. El 14% de los niños con diarrea

excretaron Adenovirus tipos 40 y 41 y el 4.7%, rotavirus, infecciones dobles por estos dos virus se

observaron en ocho niños. Solamente 9 infecciones asintomáticas se observaron con Adenovirus

40,41 y dos con rotavirus. Adenovirus 40,41 y rotavirus son causas importantes de gastroenteritis

ambulatoria en niños con diarrea severa que ameritó hospitalización.

Cruz y colaboradores reportaron en 1992 resultados del monitoreo de astrovirus en 321 niños

preescolares (0 a 3 años de edad) residentes en el altiplano central de Guatemala, en Santa María de

Jesús, conducido entre febrero de 1987 y febrero de 1989, periodo durante el cual fueron analizados

5000 muestras fecales, incluyendo 1805 correspondientes a 1369 episodios de diarrea, 830

recolectadas durante la semana convaleciente, así como 216 y 244 recolectadas dos y una semana

previas al episodio de diarrea. Especimenes de rutina fueron recolectados una vez al mes de cada

niño que estuvo libre de diarrea por tres semanas consecutivas. Un total de 124 niños (38.6%)

excretaron astrovirus durante el estudio, en 184 infecciones por Astrovirus, 2.4% de las cuales se

dieron en niños sin diarrea. La diarrea asociada con astrovirus tuvo una duración promedio de 5

días y se asocio con vómitos en 8.6% de los casos, con fiebre en 17.1% de los mismos y con

deshidratación en 5.7% de los casos observados, mientras que la inapetencia se observó en 34% de

los casos por Astrovirus y se asoció con pérdida de peso. Los autores concluyeron que la diarrea

por astrovirus contribuye a alta morbilidad en niños pequeños que viven en condiciones de pobreza.

Lemus, O. en su informe final de tesis de grado para QB, en marzo de 2007 reportó que la principal

causa bacteriana de diarrea severa en niños hospitalizados por diarrea severa en el Roosevelt y en el

IGSS de la zona 11, fue E. coli enterotoxigénica que se encontró en 26% de los casos, seguido de

rotavirus encontrado en 19% de los casos, de E. coli enteropatógena en el 15% de los casos y por

adenovirus en 11.4% de los casos. Cryptosporidium parvum fue asociado solamente con 5% de

morbilidad al igual que Cyclospora cayetanensis y Giardia lamblia con 3%. En este estudio no se

buscaron Astrovirus, pero se caracterizaron por primera vez los factores de colonización

encontrados en ETEC asociada con diarreas severas en este país, los cuales no fueron reportados

por Cruz y colaboradores en los estudios de diarrea persistente.

FODECYT 039-2006 36

Torres, O. y colaboradores en un estudio entre 770 niños de la misma comunidad rural donde Cruz

y colaboradores condujeron los estudios reportados en los últimos años de la década de los ochenta

y los primeros de los noventa, encontraron una tasa mucho menor de diarreas que las reportadas por

este grupo. Asimismo, los hallazgos de la década del 2000 indican que el principal patógeno

bacteriano fue ETEC encontrado en 18% de los casos de diarrea y C. jejuni encontrado en el 15%

de los mismos. E. coli enteropatógena (EPEC) y E. coli enteroagregativa (EAEC) no fueron

buscadas en este estudio. A diferencia de los reportes de Cruz et al., la tasa de infecciones

múltiples bajó significativamente así como la prevalencia de Giardia lamblia, C. parvum y C.

cayetanensis la cual no pasó del 3% respectivamente. Astrovirus no fue buscado, pero se

caracterizaron por primera vez los factores de colonización encontrados en ETEC del área rural de

Guatemala, los cuales no fueron reportados por Cruz y colaboradores en los estudios de diarrea

persistente.

El diagnóstico de las E. coli diarreogénicas es difícil. Se basa en el aislamiento de la bacteria en el

coprocultivo, criterios bioquímicos, identificación de serotipos/serogrupos y sobretodo la

identificación de factores de virulencia específicos de cada bacteria (ejm. toxinas, genes de

adherencia, de invasividad). Hoy en día, la identificación basada únicamente en la determinación de

los serotipos, no es del todo correcta, pues muchas de estas bacterias pueden intercambiar material

genético y con ello genes de virulencia que sí determinan su patogenicidad. Para el diagnóstico de

ETEC los laboratorios clínicos usan las placas de MacConkey-sorbitol y la determinación de las

toxinas Shiga usando pruebas comerciales como ELISA y aglutinación en latex. En los últimos

años se está empleando con mayor frecuencia métodos moleculares, como el PCR, para la

identificación de estos patógenos. La demostración de la producción de las toxina LT y STX de E.

coli se puede realizar por un modelo in vitro que permita observar el efecto citopático en cultivo de

células Vero (células de riñón de mono verde), CHO (células de ovario de hamster chino) o HeLa

(células de carcinoma cérvico-uterino) (2,55). Para ello se requiere sembrar la cepa pura aislada del

caso de diarrea en medio de Craig e incubar 24 h a 37ºC, posteriormente por filtración se separan

las bacterias del sobrenadante que contiene la toxina, y se adicionan 20ml del sobrenadante a

cultivos confluentes de células Vero. La toxina y las células se dejan en contacto hasta observar la

aparición de un efecto citotónico (células alargadas) en el caso de toxina LT o bien efecto

citotóxico (células redondas y muertas) debido a la toxina STX. La caracterización y clasificación

de cepas patógenas de E. coli se puede hacer con métodos de biología molecular, una de las

herramientas de diagnóstico más recientes, tal es el caso del uso de sondas para la hibridación en

fase sólida como es el “colony blot”. Las sondas son fragmentos pequeños de DNA que contienen

parte de los genes que codifican para algún factor de virulencia y pueden estar marcadas

radioactivamente con P o no radiactivamente con biotina o digoxigenina y se pueden usar en

ensayos sensibles y específicos para detectar cepas patógenas de interés clínico. Actualmente para

E. coli hay sondas específicas para la toxina termolábil (LT) y termoestable (ST) del grupo ETEC,

para la fimbria Bfp de EPEC, para el locus asociado con invasividad (ial) de EIEC y para la

enterohemolisina (hlyA) de EHEC, entre otros factores de patogenicidad característicos de las

bacterias. El colony blot es la transferencia del DNA de una colonia de bacterias a una fase sólida

que puede ser nylon, papel filtro o nitrocelulosa, para su posterior hibridación. Para esto las

colonias puras, previamente aisladas de pacientes con diarrea, se inoculan directamente en forma

ordenada sobre una placa de agar Luria y se incuban 4 h a 37 °C. Después de este tiempo se coloca

la membrana de nylon sobre la superficie de la placa con las colonias en crecimiento y se incuba

toda la noche. Las bacterias se rompen sobre la membrana y el DNA se desnaturaliza al colocar ésta

en una solución de hidróxido de sodio para posteriormente fijarle el DNA. La hibridación se realiza

con una sonda marcada con digoxigenina, la cual es un fragmento de un gene de virulencia

específico, y se pone de manifiesto empleando un anticuerpo antidigoxigenina conjugado a la

enzima fosfatasa alcalina, cuyo sustrato es el BCIP, y el NBT es el cromógeno que desarrolla un

color negro o café cuando se incuba la membrana a temperatura ambiente y en la oscuridad. Otro

FODECYT 039-2006 37

método es la reacción de polimerización en cadena (PCR), una hibridación en fase líquida, en

donde la hibridación se realiza entre el ADN blanco presente en la muestra y el iniciador, que es

una secuencia conocida de un fragmento específico de un gene involucrado en la patogenicidad de

cepas de E. coli. La muestra puede ser una cepa pura aislada de muestra clínica obtenida de un caso

aislado de diarrea o bien de brotes, de viajeros, de peregrinos o durante desastres naturales.

También puede ser materia fecal o alimentos implicados en brotes en los que se necesita confirmar

la presencia de E. coli.

La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés

(Polymerase Chain Reaction), es una técnica de biología molecular desarrollada en 1986 por Kary

Mullis, cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular,

partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o

molde.

La cepa se siembra por estría y se incuba durante 24 h; a continuación se resuspenden cinco

colonias de bacterias en 0.5 ml de agua y se somete a ebullición para desnaturalizar el DNA. De la

suspensión se toma una alícuota para el tubo donde se realiza la PCR. Los reactivos necesarios para

la PCR de cada muestra son adenina, timina, citocina, guanina, MgCl2, iniciadores y enzima Taq

polimerasa. La síntesis in vitro del fragmento de DNA o amplificación se efectúa mediante cambios

de temperatura en tres fases: una de desnaturalización, una de hibridación y fase de alargamiento,

cuyas condiciones serán diferentes en función del gene que se desea amplificar.

Al finalizar la amplificación se toman alícuotas y se someten a electroforesis en gel de agarosa para

observar la presencia del producto amplificado. En esta prueba se requiere una área destinada a la

preparación de las muestras para PCR y otra sólo para productos de PCR, ya que se debe evitar

posibles contaminaciones con otros productos de PCR que puedan interferir en el resultado de la

prueba y dar falsos positivos. En el InDRE desde 1993 se empezó la estandarización de métodos de

biología molecular como “colony blot” y PCR los cuales desde 1996 se emplean con fines

diagnósticos y como apoyo a la vigilancia epidemiológica, para la caracterización de E. coli

patógena aislada de casos de diarrea y cuyos resultados han sido presentados en diversas reuniones

científicas.

Optimización de la PCR

En la práctica, la PCR puede fallar por varias razones, entre ellas:

La PCR es una técnica de gran sensibilidad, es decir, necesita una mínima cantidad de ADN para

obtener un gran número de copias, así que puede ser muy propensa a errores si se lleva a cabo en

condiciones inadecuadas de esterilidad, que conduzcan a la amplificación de ADN no

correspondiente a la muestra a analizar (y por tanto a conclusiones inciertas). La contaminación con

ADN extraños puede solucionarse con protocolos y procedimientos que separen espacialmente

distintas etapas, y la limpieza exhaustiva de la superficie de trabajo entre la realización de una PCR

y la siguiente. Por ejemplo, en laboratorios de detección genética, se suele hacer una división para

la preparación de la muestra por un lado (donde se cierran los tubos) y otro donde se encuentra la

maquinaria para realizar la PCR. Disponen también de cabinas de seguridad biológica para reducir

vapores cargados de amplicones de enfermedades, y la lejía, las lámparas de UV y psoralenos son

también muy recurridos para esta limpieza extensiva. Las técnicas de diseño de cebadores son

importantes en la mejora de la obtención de productos de PCR y en evitar la formación de

productos falsos. Algunas consideraciones al diseñar estos cebadores son: cada cebador debe

integrar entre 18 y 24 bases. Los cebadores muy cortos hacen que nuestra PCR no sea muy

FODECYT 039-2006 38

específica, y los que se excedan en longitud harán que perdamos rendimiento en la reacción. La

proporción entre bases púricas y pirimidínicas sea 1:1 (40-60% a lo sumo), y que empiecen y

terminen con 1 ó 2 bases púricas. Los cebadores no deben incluir en su secuencia regiones que sean

complementarias entre sí, o se formarán dímeros entre ellos. Existe una gran variedad de

polimerasas disponibles, pudiendo elegir la que más se ajuste a nuestras necesidades. Por ejemplo,

algunas tienen actividades inexistentes en otras o las realizan de forma más eficiente, o funcionan

en intervalos de temperatura en los cuales otras se desnaturalizan o pierden funcionalidad. Los

componentes del tampón de reacción deberán ajustarse a las exigencias de nuestras enzimas. El

termociclador, por supuesto, debe ser capaz de reproducir correctamente los ciclos de la PCR: para

ello, diversas casas comerciales nos ofrecerán termocicladores elaborados con materiales que hagan

más eficaces el desarrollo y el transcurso de las etapas, además de diversas facilidades de manejo.

Dentro del laboratorio, su manejo, mantenimiento y ubicación será clave.

Tipos de PCR

PCR anidada: técnica muy sensible de PCR en la que el producto de una amplificación es utilizado

como molde para realizar una segunda amplificación con cebadores que se ubican dentro de la

primera secuencia amplificada. Este tipo de PCR es muy específica.

PCR in situ: la PCR in situ consiste en una reacción de PCR en secciones histológicas o células,

donde los productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificación. Es realizada sobre

preparaciones fijas en un portaobjetos. En la técnica de PCR in situ se realiza una primera

amplificación de ADN blanco y luego detección mediante hibridación in situ convencional con

sondas de ADN/ARN. De esta manera pueden detectarse cantidades pequeñísimas de genoma. Esta

tecnología es de gran alcance en la capacidad de amplificar específicamente una población de

secuencias de menor representación.

PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR): es una variante de la PCR en la que usamos ARN como

molde inicial en vez de ADN, y emplea una transcriptasa inversa (como Tth) para realizar la

síntesis de un ADN complementario al ARN (ADNc). De esta forma, el desarrollo inicial de una

RT-PCR sería: 1er paso: retrotranscripción a partir del ARN. 2do paso: amplificación a partir de la

primera hebra de ADNc. 3er paso: PCR estándar

PCR en tiempo real o PCR cuantitativa (qPCR): reacción de PCR cuya principal característica es

que permite cuantificar la cantidad de ADN o ARN presentes en la muestra original, o para

identificar con una muy alta probabilidad, muestras de ADN específicas a partir de su temperatura

de fusión (también denominado valor Tm, del inglés melting temperature). Se puede dividir en las

técnicas basadas en fluorocromos no específicos y en las técnicas basadas en sondas específicas. En

las técnicas basadas en fluorocromos el ADN, que ve multiplicada su cantidad con cada ciclo, se

une al fluorocromo (generalmente SYBR Green) produciendo fluorescencia que es medida por el

termociclador apto para PCR en tiempo real. Permite cuantificar sólo una secuencia por reacción

pero tiene la ventaja de utilizar cebadores normales para su realización. Es mucho más económica

que la que usa sondas específicas. Las técnicas basadas en sondas específicas utilizan una sonda

unida a dos fluorocromos que hibrida en la zona intermedia entre el cebador directo (forward) y el

inverso (reverse); cuando la sonda está intacta, presenta una transferencia energética de

fluorescencia por resonancia (FRET). Dicha FRET no se produce cuando la sonda está dañada y los

dos fluorocromos están distantes, producto de la actividad 5'-3' exonucleasa de la ADN polimerasa.

Esto permite monitorizar el cambio del patrón de fluorescencia y deducir el nivel de amplificación

del gen. La mayoría de estos inconvenientes se han solucionado con la introducción de la PCR

realizada en tiempo real (Q-PCR), que elimina cualquier proceso post-PCR puesto que monitoriza

FODECYT 039-2006 39

la progresión de la amplificación en el momento en que ocurre. A diferencia de la PCR

convencional (en punto final), que mide la acumulación del ADN al final de un número

predeterminado de ciclos, con Q-PCR esto se hace durante el proceso de amplificación usando

fluorescencia, de forma que su aumento es proporcional a la cantidad de ADN formada. El proceso

se puede automatizar fácilmente usando un sistema que realice la amplificación (termociclador) y

que a su vez sea capaz de leer fluorescencia. Existe una amplia oferta de aparatos en el mercado. La

mayoría pueden trabajar con las diversas opciones de marcado fluorescente y son "abiertos", es

decir, permiten programar las condiciones de amplificación y lectura de forma que su uso no queda

limitado a unos reactivos determinados.

PCR múltiplex: PCR en la cual se amplifica más de una secuencia en una misma reacción. Emplea

dos o más pares de cebadores en único tubo con el fin de amplificar simultáneamente múltiples

segmentos de ADN. Consiste en combinar en una única reacción todos pares de cebadores de los

sistemas que queremos amplificar simultáneamente, junto con el resto de los reactivos de la

reacción en cantidades suficientes. Sus ventajas: se obtiene la información de varios loci en una

sola reacción, menor cantidad de molde para el análisis, menor cantidad de reactivos, rápida

construcción de base de dato.

Variaciones de la PCR básica

PCR específica de alelo: esta técnica de diagnóstico o clonación es usada para identificar o utilizar

los polimorfismos de una sola base (SNPs).

PCR "assembly": consiste en la síntesis artificial de largas secuencias de ADN, realizando para ello

la PCR en un fondo de oligonucleótidos largos con secuencias solapantes cortas.

PCR asimétrica: es usada para amplificar preferentemente una cadena del ADN original con

respecto a la otra.

PCR de colonia: mediante esta técnica, colonias de bacterias Escherichia coli pueden ser

rápidamente examinadas para construcciones viables de vectores de ADN.

Amplificación dependiente de helicasa: esta técnica es muy parecida a la PCR convencional, pero

en ella se emplea la enzima helicasa y una temperatura constante en lugar de la polimerasa de ADN

y los ciclos repetidos de desnaturalización-extensión.

PCR hot-start: esta técnica reduce la amplificación inespecífica durante las etapas iniciales de la

PCR.

PCR específica de intersecuencia (ISSR): se trata de un método de PCR para su uso en huella

genética, que amplifica regiones entre repeticiones de secuencia simple para producir una huella

genética única de longitudes de fragmento amplificadas.

PCR inversa: es un método usado para poder realizar la PCR cuando sólo es conocida una

secuencia interna. Muy útil en la identificación de secuencias que flanquean insertos genómicos.

PCR mediada por ligación: este método usa pequeños linkers de ADN ligados al ADN de interés y

múltiples cebadores hibridando estos linkers.

PCR específica de metilación (MSP): se usa para detectar metilaciones en islas CpG de ADN

genómico.

FODECYT 039-2006 40

Amplificación Múltiple Dependiente de Sonda (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification

o MLPA): permite amplificar varias secuencias objetivo con un único par de cebadores, evitando

así las limitaciones de resolución de la PCR multiplex.

PCR cuantitativa: se usa para medir la cantidad de un producto de PCR (preferentemente en tiempo

real).

PCR-TAIL: la PCR termal de entrelazado asimétrico es usada para aislar una secuencia

desconocida que flanquea una secuencia conocida.

PCR touchdown: se trata de una variante de la PCR que se emplea cuando se desconoce la

secuencia exacta de los extremos de la secuencia a amplificar, de modo que se asume que puede

existir alguna base desapareada en el alineamiento cebador-secuencia. Su finalidad es reducir el

fondo no específico bajando gradualmente la temperatura de hibridación a lo largo del progreso de

la PCR.

PAN-AC: este método usa condiciones isotermas para la amplificación, y puede ser usado en

células vivas.

En el presente proyecto se formularon primers específicos, basados en las secuencias publicadas

sobre los genes de interés (18-19) que permitieron combinar los ensayos independientes en un solo

PCR multiplex, el cual se va a aprobar con cepas previamente diagnosticadas por los métodos

estándar y almacenados como cultivos stock. Al diseñar primers para PCR hay que evaluar al

menos seis aspectos para tener la secuencia óptima.

Largo del oligonucleótido: debe ser entre 18 y 24 bases. Los primers más largos (30-35

bp) pueden ser mejores para métodos multiplex.

Tm: Es deseable que los dos primers tengan una temperatura de disociación (meelting

Temperature) cercana, no separada por más de 5° C. Si la diferencia en Tms de los primers

es alta, la Tm inferior puede incrementarse si se aumenta el largo del primer en el término

3´ (eso también puede contribuir a mantener el tamaño del locus amplificado, constante.)

Contenido de purinas: pirimidinas: Debe ser alrededor 1:1 (talvez 40-60%)

Secuencia de pares GC: Idealmente la secuencia del primer debe empezar y terminar con

1-2 pares de GC.

No interacciones primer-primer: Para este propósito, un programa de muy útil y gratuito

es el ¨OligoCalc¨ que se encuentra en el siguiente dirección de Internet

http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html. Este programa calcula las

propiedades del primer tales como longitud, Tm °C, % de GC, y chequear para auto-

hibridación, para las secuencias ingresadas y por lo tanto, ayuda a diseñar programas de

PCR exitosos.

Las secuencias del primer deben alinearse con todas las secuencias de ADN ingresadas en

las bases de datos (usando programas Blast) y chequear para similitudes con secuencias

repetitivas o con otros loci, en distintos sitios del genoma. Si dos loci son muy similares

(por ejemplo a través de especies) es útil diseñar primers que por lo menos en 1-2 bases en

el extremo 3´ son específicas para el locus a amplificar.

FODECYT 039-2006 41

Las condiciones de ciclos y concentraciones de buffer deben ajustarse para cada primer de

forma que la amplificación de los locus sea específica, sin productos secundarios y dé una

banda fuerte de forma reproducible. Si esto no es posible, la secuencia de los primers debe

alargarse 4-5 bases o simplemente cambiarse por completo.

Un PCR multiplex óptimo se alcanza paso a paso. El primer paso es correr todos los pares de

primers mezclados en concentraciones equimorales en forma independiente bajo las mismas

condiciones de amplificación, o reduciendo la temperatura de anidado en 4° C si no se observan

buenas bandas. En el caso de que se obtengan bandas muy débiles para algunos pares, deben

ajustarse las concentraciones de los primers usados. Los primers cuyas bandas son muy débiles o

no se ven deben incrementarse y los de los que sí se amplificaron deben reducirse. La proporción

que permita ver todas las bandas en las mismas condiciones de corrida de PCR es la que debe

estandarizarse. La visualización de las bandas se hace por medio de electroforesis con su

subyacente revelado. Si las bandas de bajo peso molecular se ven débiles, se deben variar las

condiciones del buffer de corrida, poniendo particular atención a la concentración de KCl de 1X

1.2-2x, pero manteniendo la concentración de MgC12 entre 1.5 y 2mM. Se puede probar

reduciendo el tiempo de desnaturalización, así como el tiempo de anidado y la temperatura de

anidado. Se puede probar reduciendo la temperatura y tiempo de extensión. Incrementar la

concentración de primers de la banda débil y reducir las concentraciones de los primers cuyas

bandas son fuertes. Se pueden usar adyuvantes como BSA (0.1 a 0.8 µg/µL) ó DMSO al 5% en

concentración final v/v. Una o varias de estas sugerencias pueden usarse solas o en combinación,

hasta obtener bandas visibles de forma reproducible. Cuando una banda de peso molecular alto del

PCR multiplex es la débil, entonces debe reducirse la concentración de KCl en el buffer hasta 0.7 –

0.8 x manteniendo el cloruro de magnesio entre 1.5 y 2 mM o incrementar la concentración de

cloruro de magnesio hasta 3 ó 4.5 mM pero mantener la concentración de dinucleótidos constante.

Probar incrementando el tiempo de desnaturalización, reducir la temperatura de anidado,

incrementar el tiempo de extensión y la temperatura de extensión. Incrementar los primers de la

banda débil y reducir los de las otras bandas. Probar usando adyuvantes como se indicó en el caso

anterior. Si todas las bandas del multiplex son débiles, debe reducirse la temperatura de anidado en

pequeños pasos (2°C cada vez), reducir la temperatura de extensión a 62-68° C. Incrementar el

tiempo de extensión, incrementar la concentración de ADN blanco, incrementar la concentración

total de primers o ajustar la concentración de enzima polimerasa Taq.

Otro potencial problema de los PCRs multiplex es la presencia de bandas inespecíficas. Cuando se

tiene este problema, se deben usar condiciones más exigentes en la reacción: gradualmente

incrementar la T de anidado, reducir la cantidad de ADN blanco, reducir la cantidad de primers,

reducir la cantidad de enzima, ajustar los buffers dependiendo de si la banda inespecífica es grande:

incrementando levemente el KCl pero manteniendo el cloruro de magnesio constante, o si la banda

inespecífica es pequeña: reducir la concentración de KCl manteniendo la concentración de cloruro

de magnesio constante. También se puede incrementar la concentración de cloruro de magnesio

hasta una concentración final de 3-4.5 mM, manteniendo los dNTPs constantes. Si se prueba todo

esto y no se logra superar el problema de inespecificidad durante la amplificación, debe volverse a

correr las reacciones individualmente por pares de primers, usando una temperatura de anidado

menor que la usual. Comparar los productos inespecíficos para cada locus con los productos

inespecíficos observados en el multiplex. Con este enfoque puede lograr averiguar cuál par de

primers está involucrado en las bandas inespecíficas. Debe hacerse notar que los primers

seleccionados para el PCR multiplex desarrollado, no presentan interacciones primer-primer (las

cuales generalmente se manifiestan como ausencia de un producto más que por la aparición de

bandas inespecíficas).

FODECYT 039-2006 42

Para la visualización de bandas (productos amplificados del material genético o ADN) se utiliza la

electroforesis en gel. La electroforesis en gel de muestras grandes de ADN y ARN se efectúa en

geles de agarosa. La agarosa es un polisacárido formado por galactosas alfa y beta que se extrae de

las algas de los géneros Gellidium y Gracillaria. Es soluble en agua a temperaturas superiores a los

65 °C, dependiendo del grado de sustituciones hidroxietílicas de sus cadenas laterales. Sustituciones

las cuales, se pueden modificar para provocar que la temperatura de gelificación varíe entre los 17 y

los 40 °C. La agarosa es un producto natural que forma una matriz inerte y no tóxica que supone

una herramienta indispensable en gran cantidad de técnicas de biología molecular, bioquímica y

biología celular.

La electroforésis es un proceso que se utiliza para separar macromoléculas en una solución. La

electroforesis en agarosa permite separar moléculas de DNA, cuando éstas son sometidas a un

campo eléctrico y atraídas hacia el polo opuesto a su carga neta. Hay dos fuerzas de acción opuesta

que determinan la velocidad de la partícula. Primero, la fuerza eléctrica atrae en DNA hacia el

electrodo y la intensidad de la atracción es directamente proporcional a la carga. Segundo, la fuerza

de rozamiento se opone a la migración y su intensidad depende del tamaño y la forma de la

partícula. El DNA está compuesto por cuatro nucleótidos que tienen carga negativa y peso

molecular similar. Por lo tanto, la aceleración impuesta por la fuerza eléctrica es igual para

cualquier molécula de ácido nucleico. La diferencia en velocidad de migración estará dada por

diferencias en la fuerza de rozamiento, o sea por la forma y tamaño de la molécula de DNA. En el

caso del DNA doble cadena, la forma es la misma para cualquier molécula, entonces las distintas

moléculas tendrán una velocidad que sólo dependerá de su tamaño, es decir, de su longitud en pares

de bases. Para lograr una separación eficiente se utiliza un medio soporte que aumenta la fricción

recibida por las macromoléculas y reduce la difusión al mínimo. Este medio un polímero orgánico,

conocida como gel, por su consistencia gelatinosa. Las mezclas de DNA de diferentes tamaños se

hacen migrar a través del gel durante cierto tiempo y se obtiene una separación en el que la

distancia migrada por una molécula es inversamente proporcional a su longitud en pares de bases

(tamaño).

El diagnóstico diferencial de Escherichia coli diarreogénica se restringe a laboratorios de

investigación o de referencia. En la década de los 80s, los ensayos de referencia eran bioensayos

como el del ratón lactante para E. coli productora de toxina estable (Gianella, 1976), el ensayo de

las células Y-1 para E. coli productora de toxina lábil (Donta, 1974), y requerían la expresión de las

toxinas, mientras que para E. coli enteropatógena se dependía de laboriosas pruebas de serología

que requieren una extensa colección de antisueros, (Ewing, WH 1986, Mathewson, J 1985,

Cravioto A. 1979) los cuales no se encuentran comercialmente disponibles, por lo que son de difícil

obtención y se restringen a laboratorios de referencia. Más aún, en la literatura moderna, se

cuestiona la clasificación fenotípica de la EPEC, proponiéndose un método alternativo, genético,

para identificarla (Nataro JP 1998). Durante la última década, se han desarrollado diversos

métodos moleculares que permiten la detección rápida, sensible y específica de genes estructurales

y de virulencia de diversos patógenos. Estos métodos ofrecen algunas ventajas sobre los métodos

clásicos, fenotípicos, cuyos resultados exigen la expresión genética, a veces altamente exigente en

términos de condiciones del ensayo. Los métodos genéticos obvian todo el paso de la expresión

fenotípica con lo que los ensayos se simplifican y estandarizan sobremanera. Otra ventaja de este

tipo de pruebas es que el equipo requerido sirve para múltiples propósitos, lo cual es una ventaja en

países pobres. Entre las desventajas de los métodos genéticos, particularmente los de amplificación

como el PCR, sobresale la susceptibilidad a contaminación cruzada, que exige técnica cuidadosa

para no acarrear moléculas amplificadas en los pasos anteriores. Se han publicado métodos basados

en la amplificación genética por PCR para detectar los genes de toxina estable (st), toxina lábil (lt)

FODECYT 039-2006 43

de la ETEC (Olsvik, 1993) y pilus formador de "bucles" de la EPEC (bfp) (Giron, J 1991;

Gunzburg 1995). Existen también métodos comerciales, dentro de ellos uno que detecta en heces el

ADN de ETEC (Stacy-Phipps, S 1995). Un PCR multiplex es aquél en el que se detectan varios

genes simultáneamente y por lo consiguiente, ahorra tiempo y recursos al dar varias respuestas en

una sola prueba. Se propuso un PCR multiplex para toxina lábil, toxina estable de ETEC, el pili

formador de bucles de EPEC, y el gen AggR de EAEC con lo que se detectaría directamente en una

muestra estos tres patógenos.

En el presente proyecto se usaron primers específicos, basados en las secuencias publicadas sobre

los genes de interés (18-19) que permitieron combinar los ensayos independientes en un solo PCR

multiplex, el cual se probó con cepas previamente diagnosticadas por los métodos estándar y

almacenadas como cultivos stock. Múltiples obstáculos se encontraron en la implementación del

método, como productos inespecíficos que para ser removidos requirieron una reducción en el

tiempo de annealing, incremento de la temperatura de annealing, reducción del tiempo de extensión

y reducción de temperatura de la extensión final a 68°, estandarizar la concentración de MgCl2 a 50

mM, estandarizar la concentración y preparación de alícuotas de primers. Todas las secuencias de

los primers fueron evaluadas en el programa oligo, para asegurarnos de que no tenían secuencias

repetitivas que resultaran en auto-annealing. El procesamiento del las master mixes se optimizó

reduciendo el tiempo al mínimo para evitar la formación de primer dimers. Aprendimos que la

solución de dNTP’s es muy sensible a ciclos de congelar y descongelar, por lo que las alícuotas se

prepararon de manera que sirvieran para una corrida de 20 muestras solamente.

El diagnóstico diferencial de las dos variedades de E. coli más importantes en la etiología de las

diarreas infantiles en Guatemala, E. coli enterotoxigénica (ETEC) y E. coli enteropatógena EPEC,

es especializado, como se indicó anteriormente y no se encuentra al alcance de los laboratorios de

servicio de nuestro país. Sin embargo, el diagnóstico preciso evita el uso inapropiado de

antimicrobianos con la consiguiente reducción de resistencia antimicrobiana en nuestro medio, pues

ambas son diarreas autolimitantes. Asimismo, permite describir la etiología y epidemiología de

diarreas en niños, lo cual permite hacer estudios de brotes e implementar medidas de intervención

para reducir la transmisión de estos patógenos, tan importantes causas de diarrea infantil de nuestro

país.

En Guatemala, la infraestructura necesaria para realizar las pruebas de referencia "estándares de

oro" para ETEC no se encuentra disponible en los laboratorios actuales, pues el de referencia de

microbiología del INCAP no está funcionando. Sin embargo, es necesario que se fortalezcan otras

instituciones, sobre todo las dedicadas a la formación de recursos humanos, para promover el

desarrollo de la capacidad diagnóstica y por ende de vigilancia epidemiológica, del país. El

proyecto tiene como sede el Laboratorio Diagnóstico Molecular, S. A, y contó con la valiosa

participación de la M. Sc. Patricia Saravia, profesora del Departamento de Bioquímica de la USAC,

por lo que las metodologías en él desarrolladas estarán disponibles para esa institución, cuando

termine el proyecto.

FODECYT 039-2006 44

PARTE III

III.1 RESULTADOS ALCANZADOS

Se desarrolló y probó ampliamente un método de PCR que permite la identificación y

diferenciación simultánea de E. coli enterotoxigénica productora de toxina estable humana, porcina y/o

lábil y de E. coli enteropatógena perteneciente a los serotipos que circulan más frecuentemente en

diarreas infantiles en Guatemala. Este método tiene una sensibilidad del 93% y una especificidad del

96% contra muestras positivas y negativas previamente diagnosticadas por la OMS para ETEC o por el

CDC. Asimismo, se pueden agregar los primers para EAEC y el gen es detectado.

Usando los primers descritos en la tabla 3 y las condiciones indicadas en la tabla 4 se

obtuvieron resultados reproducibles usando una extracción de ADN por ebullición de las colonias

resuspendidas en 500 uL de agua durante 20 minutos o bien extrayendo ADN directamente de las heces

fecales con método del filtro FTA para los factores de virulencia de ETEC, EPEC y EAEC. Las bandas

de las toxinas lábil, estable porcina y estable humana son diferenciables en un gel de agarosa al 2%,

teñido con bromuro de etidio y observado con luz ultravioleta en la obscuridad, como se puede observar

en las fotografías 1-7. Asimismo, las bandas del factor bpf y del factor eae son distinguibles en gel de

agarosa al 2% bajo las mismas condiciones que para ETEC. Finalmente, los factores de virulencia de

EAEC, aggr y eae son diferenciables, pero el eae se encuentra en común con las EPEC por lo que la

clasificación de EAEC se basa solamente en la amplificación de aggr. Lamentablemente, la colección

de cepas de E.coli enteroagregativa no se encontraba congelada y las colonias se perdieron, por lo que

solo se pudo realizar esta prueba en dos muestras conocidas, de un estudio recién conducido en LDM.

Se desarrolló y validó el uso de pooles para correr hasta cinco muestras con cinco cepas cada

una, simultáneamente, en ámbitos donde ETEC, EPEC y EAEC sean causantes de menos del 20% de

las diarreas agudas. Esta condición se cumplió en muestras recibidas de escolares, en las cuales se

probó esta metodología. La misma consiste en mezclar 100 uL de ADN extraído individualmente de

cada una de cinco colonias lactosa positiva de la misma muestra cultivada en agar MacConkey. De esta

forma, con un solo PCR se pueden evaluar cinco colonias de un mismo sujeto, lo que reduce el costo

del ensayo en un 80%. Cuando se obtiene un resultado positivo, se tienen que repetir las muestras que

dieron positivas en dos puntos convergentes de la tabla y así se determina cuál es la muestra positiva.

Esta metodología se usó desde los años de post-guerra (años 50) para evaluar la presencia de

anticuerpos contra sífilis en los soldados que retornaban a sus países, que eran miles. Aquí se innovó

retomando esta metodología para reducir los costos y hacer factible el estudio en muchas muestras a

bajo costo.

Se estandarizó el PCR en heces diarreicas directas con lo cual el método requiere solamente

cinco horas para dar un diagnóstico preciso. Para ello se usó el sistema de filtros FTA. En el mismo,

en una membrana cargada positivamente se agrega la muestra fecal, que tiene ADN cuya carga neta es

negativa y se adhiere muy fuertemente al papel. Luego se lava el filtro para eliminar impurezas y el

ADN que esta fuertemente unido al papel, permanece allí. Finalmente, un trocito del papel se introduce

en el tubo del PCR y se lleva a cabo la amplificación después de eluir el ADN del papel con reactivo de

elución. Esta estrategia permite la detección de toxinas de ETEC y factores de virulencia de EPEC y

EAEC en muestras diarreicas en un periodo de cuatro horas, pues se evita tener que incubar la muestra

y aislar los enteropatógenos. El costo se incrementa en el costo del kit de FTA prorrateado por

muestra.

FODECYT 039-2006 45

Este método se convierte en una herramienta para implementar, en el mediano plazo, la

vigilancia epidemiológica de ETEC, EPEC y EAEC en la población guatemalteca. Para que este

potencial sea implementado, se gestionarán fondos para un FACYT en el cual se transferirá la

metodología a los profesionales del LNS, del Hospital General, del Hospital Roosevelt de Guatemala,

del Hospital de Antigua y del LABOCLIP de la USAC y otras universidades del país.

La técnica molecular desarrollada es una alternativa viable simple y rápida y disponible en

Guatemala comparada con los métodos tradicionales de identificación de ETEC, EPEC y EAEC que no

se realizan por caros y complejos.

La metodología se usó para complementar análisis de EPEC a una colección de muestras

tomadas en el Hospital Roosevelt. Estos resultados forman parte de un manuscrito que se someterá a

publicación en el Journal of Clinical Microbiology y se puede encontrar entre los anexos.

Validación del Método: Para validar el método desarrollado, se usaron cepas conocidas previamente

identificadas por GM1 ELISA para toxina lábil y para toxina estable por la IP en el INCAP, con

asesoría del laboratorio de la Universidad de Goteborg, Suecia entre los años 2001 y 2004 (según el

procedimiento operativo estándar del Departamento de Medical Microbiology and Immunology,

University of Goteborg, SOP 16:3), las cuales fueron enviadas para confirmación a Goteborg y los

resultados confirmados como exactos en el 99% de los casos. Estas cepas se encuentran almacenadas

en caldo tripticasa soya con 20% de glicero congeladas a -70°C en el caso de las ETEC y liofililzadas a

-70°C en el caso de las EPEC. Para obtener células viables de los stocks, se inocularon en agar

nutritivo o agar sangre y luego se identificaron en agar MacConkey, con pruebas bioquímicas (IMVIC)

para confirmar la identidad de Escherichia coli (9, 20).

En este paso se utilizaron cincuenta cepas conocidas de ETEC y quince de EPEC, ya

previamente diagnosticadas. El personal encargado del cepario, que labora en el laboratorio

diagnostico molecular pero que no está a cargo de este proyecto se encargó de sacar las cepas y

entregarlas a las encargadas del proyecto codificadamente. De esta forma, esta parte del estudio fue

ciego para evitar cualquier sesgo de identificación por parte del personal encargado de realizar los

PCR's.

ANÁLIS IS ESTADÍST ICO DE LOS DATOS

Cálculo de Sensibilidad y Especificidad del Método PCR Multiplex FODECYT 39/2006:

Los resultados obtenidos con el PCR multiplex aquí desarrollado y que en adelante será denominado

PCR Multiplex ETEC/EPEC FODECYT 39/2006, fueron analizados en una tabla de 2x2 por Chi

cuadrado, para obtener la sensibilidad, la especificidad y los valores predictivos positivos y negativos

del método. Estos análisis fueron realizados por el M.Sc. Jorge Matute ad-honorem, otro aporte a

contrapartida no previsto inicialmente en el presupuesto del proyecto.

Sensibilidad para ETEC: 93% Sensibilidad EPEC: 89%

Especificidad para ETEC: 96% Especificidad EPEC: 94%

Valor Predictivo Positivo para ETEC: 90% Valor predictivo positivo EPEC: 88%

Valor Predictivo Negativo para ETEC: 91% Valor predictivo negativo EPEC: 93%

FODECYT 039-2006 46

Confirmación de Resultados: Para confirmar los resultados del PCR multiplex, se llevó a cabo una

hibridación de Southern de los productos de amplificación, con sondas de ADN marcadas con

digoxigenina, sintetizadas a partir de los genes sth, stp, lt, eae y bfp, por medio de PCR, según

recomendaciones del laboratorio productor (Boheringer-Mannheim). Para este proceso se utilizaron

reactivos donados por la Dra. Svennerholm, otro aporte de contrapartida no presupuestado inicialmente

(21 - 23). Los mismos demostraron bandas claramente positivas para ETEC sth, ETEC stp, ETEC lt y

también para EPEC bfp y eae.

A continuación se muestran las fotografías 1 a 7 de los PCR’s implementados y estandarizados, si bien

limitaciones de disponibilidad de muestras positivas nos limitaron poder validar los resultados para las

EAEC y EHEC, las mismas se corrieron con cepas estándar positivas. La fotografía 8 se muestra para

incluir las actividades de transferencia de tecnología realizadas a Honduras y Panamá a quienes se les

capacitó en esta técnica.

FODECYT 039-2006 47

FOTOGRAFIA 1: DESARROLLO DE PCR MULTIPLEX PARA LA

DETECCION DE ESCHERICHIA COLI DIARREOGENICAS: ETEC,

EAEC, EPEC Y EHEC

FUENTE: FODECYT 039-2006

En esa fotograf ía se muestra e l resultado del PCR mult iplex desarrollado en el

FODECYT 039-2006: los genes que detectan las E. coli’s diarreogénicas se pueden

observar. Detalle de la fotograf ía en los carriles 1 y 13 se observan las escaleras de

peso molecular. En los carriles 2 y 3 se observan el control n egat ivo del cuar to

blanco y el control negativo del cuar to de amplif icación. En el carri l 4 los genes l t

y stp para ETEC productora de toxina lábil y toxina es table porcina. En los carri les

5 y 6 el gen aggr para EAEC. En los carri les 7 y 8 se observan los genes

amplif icados bpf y eae caracter íst icos de la EPEC. En el carr il 9 los genes de

virulencia de EHEC fueron amplif icados: eae (que comparte con EPEC) y vt1 de 130

pb. Siguen las E. coli ATCC 25922 como controles negativo .

FODECYT 039-2006 48

FOTOGRAFIA 2: PCR MULTIPLEX CORRIDO SOLAMENTE

PARA LOS GENES QUE CODIFICAN LAS TOXINAS DE ETEC:

LT, STP Y STH

FUENTE: FODECYT 039-2006

En esta fotografía se muestran condiciones para estandarizar la cantidad de ADN a usar en el PCR

multiplex de ETEC: los carriles 1 y 12 muestran la Escalera de peso molecular. En los carriles 2, 3, 4 y

5 se usaron 4 uL de ADN control (el volumen seleccionado para futuros experimentos) de LT (274 pb),

STp (166 pb) y STh (64 pb). Los cuatro pozos siguientes son con 5 uL y los últimos 4 con 6 uL de

ADN en los cuales ya se observan inhibición por exceso de ADN.

FODECYT 039-2006 49

FOTOGRAFIA 3: PCR CORRIDO PARA FACTORES DE

VIRULENCIA DE EPEC: BFP Y EAE

FUENTE: FODECYT 039-2006

Pozos 1 y 12: Escalera de ADN Pozos 2, 5-10 muestran dos bandas que se ven juntas y representan

eae (376 pb) y bpf (367 pb) los dos determinantes genéticos que detectan la EPEC. El pozo 11 es el

control negativo

FODECYT 039-2006 50

FOTOGRAFIA 4: ESTANDARIZACIÓN DE PCR MULTIPLEX

PARA LA DETECCION SIMULTÁNEA DE TOXINAS DE ETEC Y

EPEC (LT, STP) Y FACTORES DE VIRULENCIA DE EPEC (BFP Y

EAE)

FUENTE: FODECYT 039-2006

En esta fotografía se observan los genes amplificados según condiciones estandarizadas para LT (274

pb), STp (166 pb), eae (376 pb), bpf (367 pb) un control negativo de cuarto negro), una mezcla de ADN

con EPEC y ETEC en el cual se observan las bandas de eae, bpf, LT y STp. Más controles negativos de

cepas ATCC.

FODECYT 039-2006 51

FOTOGRAFIA 5: PCR PARA AMPLIFICACION DE FACTORES DE

VIRULENCIA DE EAEC: AGGR

FUENTE: FODECYT 039-2006

En esta fotografía se observan los genes amplificados según condiciones estandarizadas para la

amplificación del factor de virulencia de la E. coli enteroagregativa: aggr el cual produce una banda

típica diagnóstica a 630 pb. En el carril uno se observa la escalera de peso molecular y en el 2 la cepa

control para EAEC, donada por el Dr. Stephen Savarino.

FODECYT 039-2006 52

FOTOGRAFIA 6: ESTANDARIZACION INDIVIDUAL DEL PCR

MULTIPLEX DE TOXINAS DE EHEC: VT1 Y VT2

FUENTE: FODECYT 039-2006

En esta fotografía se amplificó con fines de estandarización de condiciones para detección de los genes

de virulencia de EHEC, el gen VT2 (298 pb) y el gen VT1 (130 pb), usando como control la cepa de

Escherichia coli ATCC 35150, que se observa en el carril 3. En los carriles anteriores se observan

controles negativos de cuartos blanco y de amplificación.

FODECYT 039-2006 53

FOTOGRAFIA 7: ESTANDARIZACIÓN PCR MULTIPLEX DE

BAJO COSTO PARA TOXINAS DE ETEC EN POOLES DE CINCO

MUESTRAS

FUENTE: FODECYT 039-2006

En esta fotografía se demuestra la amplificación de toxinas de ETEC en muestras corridas en pooles de

diez colonias (5 de cada paciente) en escolares con una baja prevalencia de infección por ETEC. Se

muestran los controles para STp, LT, STh y los resultados positivos y negativos de varios pooles.

FODECYT 039-2006 54

FOTOGRAFIA 8: TRANSFERENCIA DE TECNOLOGIA A

PANAMA Y HONDURAS. PCR DE TOXINAS DE ETEC

FU

ENTE: FODECYT 039-2006

En esta fotografía se observa la estandarización de PCR para ETEC realizado por la colega hondureña,

Dra. Annabelle Ferrera (PhD) a quien se le transfirió la metodología. También se le transfirió a colegas

panameños de la AUPSA (Autoridad Panameña de Seguridad Alimentaria, a cargo de la Dra. Lurys

Burdett Stanziola, PhD).

FODECYT 039-2006 55

III.2 DISCUSION DE RESULTADOS

El proyecto exitosamente desarrolló y validó quedando implementado para su uso rutinario, un

método de PCR multiplex para la detección de los factores de virulencia de las E. coli’s mayormente

asociadas con diarrea en niños preescolares en Guatemala. El método tiene sólidas bases científicas y

sus resultados son comparables con los del laboratorio de referencia para ETEC de la OMS, así como

con los laboratorios líderes en el tema en el caso de EPEC y EAEC.

Una desventaja del método es que requiere de 16 primers mezclados. Esto requiere que se

trabaje pronto cuando se preparan las mezclas maestras para evitar la presencia de una banda gruesa de

dímeros de primers. Se verificó que los primers no tuvieran interacción entre sí usando el programa

oligocalc.

Cuando se trabajan pocas muestras y se pueden preparar las mezclas rápidamente, se observan

menos primer dimers que cuando se trabaja más despacio, como puede observarse en las fotos 1 (sin

primer dimers), comparada con la fotografía 4, que presenta muchos primers dimers.

El PCR multiplex detecta toxinas LT, STh y STp de ETEC más los factores de EPEC eae y bpf,

más la banda aggr de EAEC. La EAEC no pudo ser validada pues solamente se contó con dos cepas

positivas conocidas, corridas por el laboratorio del Dr. DuPont en la Universidad de Texas. La

amplificación de la E. coli enteroagregativa (EAEC) se hizo con cepas estándar provistas por el Dr.

Steven Savarino de la US Navi Research, quien gentilmente nos las envió para este propósito. Una de

las dos cepas da una banda a 630 Kb, claramente diferenciable. No obstante, al correr las muestras

conocidas identificadas como EAEC en Texas por Zhi Dong Tsiang en el laboratorio del Dr.DuPont se

encontró que una de ellas daba bandas inespecíficas. Se redujo el tiempo de annealing y se incrementó

la temperatura de annealing, reduciéndose el tiempo y la temperatura de extensión a 2 minutos a 68°C.

Con esto se redujeron las bandas inespecíficas pero ya no puede formar parte del multiplex, sino se

corre por separado.

Una limitante del método multiplex desarrollado en el presente proyecto para las tres E. coli´s

diarreogénicas era que la banda de la toxina LT daba un poco más débil cuando se amplifica

simultáneamente la eae de EPEC. No obstante, al incrementar la concentración de los primers para LT

este defecto se subsana, como se puede observar en las fotografías No. 3 y 4.

La obtención de primers en Guatemala por medio del CONCYT tiene sus particularidades, ya

que debido a que no se pueden hacer compras en el extranjero con tarjeta de crédito, nos hemos visto

obligados a requerir los primers a distribuidores locales. Ello resultó en errores, por ejemplo el par de

primers para EAEC vino incompleto, solamente una secuencia, lo cual nos atrasó mucho en el

desarrollo del método para EAEC. Recientemente Merck SA anunció que va a traer primers, lo cual

talvez facilita el proceso.

El PCR multiplex fue probado usando pooles de colonias de heces formadas en las cuales se

buscaba ETEC, que se puede observar en la foto No.7. Hasta diez colonias en un mismo tubo,

mezcladas después de ser hervidas independientemente, dieron resultados satisfactorios al probar con

controles positivos y negativos conocidos. Esto es más barato y facilita la aplicación del método para

estudios epidemiológicos. Este método fue validado con un estudio del Dr. Schneider en escolares.

FODECYT 039-2006 56

El método fue exitosamente aplicado a muestras fecales diarreicas, de las cuales se extrajo

ADN usando el sistema de filtros FTA (una especie de kit). A pesar de que el proveedor se tardó casi

un año en traerlo, cuando se tuvo se pudo comprobar que se pueden detectar las E. coli´s diarreogénicas

en unas cuantas horas de trabajo, sin necesidad de cultivo. Esto tiene potencial clínico grande. Se

observa en la fotografía 3.

Asimismo, se dio servicio a la UVG para evaluar las E. coli´s preservadas en congelación de

dos niños que estando bajo vigilancia de uno de sus proyectos, fallecieron de diarrea. En ambos se

detectó ETEC por el método aquí desarrollado. Al grupo de investigadoras del CDC en la UVG se les

facilitó el mismo para que lo implementen a lo interno de su laboratorio.

Se dio capacitación en estos métodos a un grupo de profesionales Panameños que vinieron de

la Autoridad Panameña de Seguridad de Alimentos, AUPSA, quienes estuvieron en el laboratorio por

tres días quienes nos fueron referidos por la Dra. Lurys Burdett Stanziola, jefa de la Dirección de

Control y Análisis de Alimentos Importados. Asimismo, se capacitó a la Dra. Annabelle Ferrera,

profesora de microbiología molecular de la UNAH, en Tegucigalpa, Honduras, quien visitó el

laboratorio también por tres días.

FODECYT 039-2006 57

PARTE IV.

IV. 1 CONCLUSIONES

Objetivo Conclusión

Objetivo General

Desarrollar un PCR multiplex para la

detección y diferenciación simultánea de

ETEC, EPEC y EAEC los principales tipos

de E. coli productoras de diarrea en niños

guatemaltecos.

Se desarrolló un PCR multiplex que

efectivamente detecta y diferencia en forma

simultánea los factores de virulencia de ETEC

(toxinas LT, STp y STh), de EPEC (bpf y eae) y

de EAEC (aggr y eae) a partir de colonias

lactosa positiva aisladas en MacConkey y

hervidas por 20 minutos en 500uL de agua

desmineralizada estéril, en microtubos, o bien a

partir de heces diarreicas por medio del método

FTA (ref bibliográfica).

Objetivos Específicos

1. Diseñar un primer que reconozca una

región común en el extremo 5´ de los

genes st y lt en ETEC; eae y bpf en

EPEC y aggr en EAEC

respectivamente.

Debido a que se trató de hacer nuestro método

congruente con el recomendado por el

laboratorio de referencia de la OMS, este

enfoque ya no se utilizó un primer común, sino

primers separados para cada determinante

buscado, es decir se adaptaron 3 pares de

primers de que fuero desarrollados por el

laboratorio de la U de Goteborg/OMS y se

diseñaron e investigaron otros 3 pares de primers

para EPEC y EAEC. El apoyo brindado por la

Dra. Svennerholm nos permitió incluir en el

método un avance tecnológico del 2006, que

además representa el método del laboratorio de

referencia de OMS para ETEC y que funcionó

bien con los primers diseñados para EPEC y

EAEC.

2. Establecer las condiciones

metodológicas apropiadas que

permitan la detección y diferenciación

simultáneas de estos genes en E. coli´s

aisladas de heces diarreicas.

En este estudio fueron estandarizadas las

condiciones y reactivos publicados en el estudio

realizado en Vietnam por Trung Van Nuyen (57)

y dieron resultados reproducibles para las cepas

estándar de EPEC y EAEC, Se usaron tres pares

de primers recomendados por la Dra. Ann-Mari

Svennerholm, directora del laboratorio de

referencia de la OMS para ETEC, los cuales

están reportados en el estudio publicado por

FODECYT 039-2006 58

Ingrid Bolin (4).

Objetivo específico Conclusión

3. Validar el método con E. coli´s

previamente identificadas, en el estudio

prospectivo sobre diarrea persistente,

realizado en Santa María de Jesús,

disponibles en los ceparios del INCAP.

El método fue validado con cepas aisladas y

diagnosticadas de Santa María de Jesús,

disponibles en el Laboratorio Diagnóstico

Molecular, S.A. No obstante las cepas del

estudio de diarrea persistentes no estuvieron

disponibles.

4. Confirmar los resultados con hibridación

con sondas de ADN de los genes de

virulencia sth, stp, lt, eae, bfp y aggr

marcadas con digoxigenina y detectadas

colorimétricamente.

Los resultados fueron confirmados tanto por

sondas marcadas con digoxigenina (hibridación)

como por pruebas de ELISA con anticuerpos

monoclonales.

Objetivos adicionales alcanzados con

el presente proyecto

Conclusión

1ª. Evaluar el funcionamiento del PCR

multiplex para ETEC, EPEC y EAEC

con ADN extraído directamente de

heces diarreicas.

El método del filtro FTA permitió detectar en

dos horas la presencia de ETEC, EPEC o EAEC

a partir de heces diarreicas.

2ª. Implementar un sistema de pooles de

colonias para detectar ETEC en

muestras fecales donde se espera que la

prevalencia de infección por este

patógeno sea baja.

Se diseñó, probó e implementó el uso de pooles

de diez colonias (provienen de dos pacientes) en

un solo tubo para abaratar la detección de ETEC

en muestras de poblaciones con baja prevalencia

de infección por este enteropatógeno. Este

sistema reduce el precio del análisis a una quinta

parte del costo original, pues permite el análisis

simultáneo de diez colonias de E. coli.

FODECYT 039-2006 59

IV.2 RECOMENDACIONES

1. Se debe obtener una colección de cepas conocidas EAEC + y EAEC – para poder validar el

método para detección de la E. coli enteroagregativa.

2. Se recomienda afinar y validar el método usando “Pooles” de heces directas el cual sería de

suma utilidad para el sector público de laboratorios diagnósticos del país.

3. La logística de adquisición de reactivos de biología molecular siguiendo las normas y pautas de

las leyes de compras estatales es muy difícil de seguir. Cuando se ejecutó el proyecto, Merck

no distribuía este tipo de reactivos y las casas comerciales hacían un esfuerzo por suplir

nuestras necesidades pero muchas veces tuvimos que recurrir a obtener los reactivos en el

extranjero, como una contrapartida del laboratorio para poder avanzar. El CONCYT, debe

promover los mecanismos más ágiles para la compra de reactivos, como los utilizados en este

proyecto para favorecer el desarrollo de la Biología Molecular en el diagnóstico de ciertos

patógenos para laboratorios de referencia acreditados en el país.

FODECYT 039-2006 60

IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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FODECYT 039-2006 65

IV.4 ANEXOS

IV. 4.1 Resumen de artículo pendiente de publicar ¨Toxins and virulence factors of

Enterotoxigenic E. coli in indigeneous children and internacional traveleres to

Guatemala¨.

IV. 4.2 Metodología estandarizada del PCR Multiplex de Escherichia coli Diarreogénica

FODECYT 039-2006 66

PARTE V INFORME FINANCIERO