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CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA –CONCYT-

SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA-SENACYT-

FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -FONACYT-

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACIA

UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA

INFORME FINAL

COMPOSICIÓN QUÍMICA Y ACTIVIDAD INMUNOMODULADORA Y

BIOCIDA DE BASIDIOMICETOS COMESTIBLES DE GUATEMALA

PROYECTO FODECYT No. 30-2007

MA. QB. MARGARITA PAZ DE RAMÍREZ

Investigadora Principal

GUATEMALA, JULIO DEL 2011

ii

AGRADECIMIENTOS

La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del

Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología -FONACYT-, otorgado por La Secretaría

Nacional de Ciencia y Tecnología -SENACYT- y al Consejo Nacional de Ciencia y

Tecnología –CONCYT-

iii

AGRADECIMIENTOS

A la Universidad de San Carlos de Guatemala y Facultad de Ciencias Químicas y

Farmacia por el aval institucional, la infraestructura brindada, materiales y equipo para la

ejecución del proyecto.

Al Laboratorio de Investigación de Productos Naturales (LIPRONAT), Bioterio y Unidad

de Bioensayos por brindarnos la infraestructura, materiales y personal que colaboró para

la ejecución del proyecto.

Al Servicio de Micología de la Escuela de Química Biológica, especialmente al Lic.

Osberth Morales por su asesoría en el campo de los hongos.

Al Departamento de Citohistología de la Escuela de Química Biológica, en especial a las

Licenciadas Ma. Eugenia Paredes Sánchez e Isabel Gaitán Fernández por su

incondicional colaboración en el desarrollo de todo el proyecto.

A los investigadores asociados del proyecto, Lic. Armando Cáceres y al Dr. Oscar Cóbar

por su asesoría y apoyo.

A los auxiliares de investigación: Licda. Keila Mariana Guerrero, Licda. Egly Alvarez,

Licda. Dina Córdova y Lic. Roberto Cáceres.

A las estudiantes de Química Biológica: Nancy González, Silvia Oliva, Kristel Ramírez,

Claudia Rodríguez y Stephanie Sánchez.

iv

RESUMEN

Las diferentes culturas en el mundo, incluyendo Guatemala, han atribuido a los hongos

muchas propiedades nutricionales y medicinales a lo largo de la historia. Uno de los

aspectos más importantes de los basidiomicetos es la reciente demostración en algunas

especies asiáticas de actividad inmunomoduladora y adaptógena, además de sus

propiedades alimenticias. El presente proyecto generó información sobre seis especies de

hongos macromicetos comestibles que crecen en diferentes regiones del país, evaluando

la actividad de sus extractos acuoso y etanólico, contra diferentes especies microbianas,

así como larvas de insectos y su posible toxicidad a nauplios de Artemia salina. Uno de

los principales objetivos fue también establecer su potencial inmunomodulador,

evaluando su acción sobre dos sistemas inmunes mayores: la linfoproliferación y el

sistema de complemento. Se realizó un tamizaje de sus compuestos químicos,

metabolitos primarios y secundarios, así como su contenido mineral.

Las especies estudiadas fueron los hongos comestibles Armillariella polymyces, Boletus

edulis, Cantharellus lateritius, Neolentinus ponderosus, Lactarius deliciosus y Amanita

garabitoana.

La recolección e identificación de las especies estuvo a cargo de un especialista, quien

preparó muestras de herbario y realizó la caracterización final, generando fichas técnicas

de cada una de las especies.

Los extractos preparados fueron estudiados de acuerdo a procedimientos de operación

estándar que fueron validados oportunamente.

La actividad antimicrobiana, larvicida y citotóxica fue pobre en las seis especies, a

excepción de Amanita garabitoana (extracto acuoso), quien mostró actividad contra

Staphylococcus aureus y Escherichia coli.

El hongo A. polymyces mostró una actividad inhibitoria sobre el sistema de complemento

en sus dos vías con una CI50 de 1.37 µg/mL.y el extracto acuoso de Boletus edulis, fue el

único que mostró una actividad estimuladora de la linfoproliferación a una concentración

efectiva mínima (CEM) de 125 μg/mL.

Los metabolitos secundarios encontrados en las especies estudiadas fueron saponinas,

principios amargos, flavonoides, azúcares reductores y azúcares 2-desoxigenadas. A.

garabitoana presentó dentro de su composición mineral la mayor cantidad de elementos

químicos Potasio (K), Hierro (Fe), Níquel (Ni), Cobre (Cu), Zinc (Zn), Manganeso (Mn),

y Rubidio (Rb). Mientras que C. lateritius presentó los niveles de concentración más

altos de los elementos: Potasio (K), Hierro (Fe), Cobre (Cu), Zinc (Zn). Finalmente N.

ponderosus presentó una menor presencia de elementos químicos, encontrándose Potasio

(K), Hierro (Fe), Níquel (Ni) y Zinc (Zn).

v

ABSTRACT

Different cultures in the world, including Guatemala, have appointed several properties to

mushrooms, namely nutritional and medicinal throughout history. One of the most

important issues regarding to basidiomicetes is the recently demonstration of

immumomodulative and adaptogenic activity in some asian species, added to their edible

properties. This project generated information about six edible macromycetes that grow

wildly in different regions of the country, of which watery and etanol extracts activities

were studied. Such extracts were evaluated against several microbial species, insect

larvae and their possible toxicity against Artemia salina. One of the main tasks was to

establish their immunomodulative potential, by testing their action on two major immune

responses: lymphoproliferation and the complement system. A chemical screening was

performed, for the identification of their metabolites and mineral content.

The species studied were the edible mushrooms Armillariella polymyces, Boletus edulis,

Cantharellus lateritius, Neolentinus ponderosus, Lactarius deliciosus and Amanita

garabitoana.

Collect and identification of species were performed by a specialist who was in charge of

herbarium samples preparation, final characterization, and prepared technical card of

each species.

The extracts obtained were tested according to standard operation procedures (SOP),

previously validated.

Antimicrobial, larvicide and cytotoxic activities were poor in all species, except for

aqueous extract of Amanita garabitoana which showed activity against Staphylococcus

aureus and Escherichia coli.

A. polymyces showed inhibitory activity on both paths of the complement system, with a

CI50 value of 1.37 µg/mL. The aqueous extract of Boletus edulis was the only one that

showed a stimulatory activity on the lymphoproliferation assay, with a Minimal Effective

Concentration (MEC) of 125 μg/mL.

Secondary metabolites found were: saponines, bitter principles, flavonoids, and sugars.

A. garabitoana showed a mineral content of potassium, iron, nickel, copper, zinc,

manganese and rubidium. C. lateritius showed the highest levels of potassium, iron,

copper and zinc. Finally, N. ponderosus showed the least presence of chemical elements,

which were potassium, iron, nickel and zinc.

vi

TABLA DE CONTENIDOS

RESUMEN iv

ABSTRACT v

TABLA DE CONTENIDOS vi

LISTA DE TABLAS viii

LISTA DE FIGURAS ix

PARTE I

I.1 INTRODUCCIÓN 1

I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 3

I.2.1 Antecedentes (Trabajo, experiencias en Guatemala) 3

I.3 OBJETIVOS E HIPÓTESIS 4

I.4 METODOLOGÍA 5

I.4.1 Localización 5

I.4.2 Variables 6

I.4.3 Indicadores 6

I.4.4 Estrategia metodológica 7

I.4.5 Métodos 7

I.4.5.1 Universo 7

I.4.5.2 Muestra 7

I.4.5.3 Exatracción contínua por percolación 7

I.4.5.4 Concentración por rotavapor 8

I.4.5.5 Ensayo hemolítico de actividad sobre la vía alterna de complemento 9

I.4.5.6 Ensayo hemolítico de actividad del complemento en la vía clásica 12

I.4.5.7 Ensayo de Linfoproliferación 16

I.4.5.8 Tamizaje de la actividad antibacteriana in vitro 21

I.4.5.9 Tamizaje de la actividad antimicótica in vitro 23

I.4.5.10 Tamizaje de la actividad antilevadura invitro 26

I.4.5.11 Concentración Inhibitoria Mìnima 27

I.4.5.12 Tamiizaje de la actividad larvicida 28

PARTE II. MARCO TEÓRICO

II.1 Uso de los basidiomicetos en Guatemala

II.2 Los basidiomicetos como inmunomoduladores y biocidas

II.3 Composición química de los basidiomicetos

II.4 Información de los basidiomicetos comestibles del estudio

PARTE III RESULTADOS

40

40

41

48

49

53

PARTE IV

IV.1 CONCLUSIONES 65

IV.2 RECOMENDACIIONES 67

IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 68

IV.4 ANEXOS 74

Anexo 1 Obtención de extractos 74

Anexo 2 Citotoxicidad 74

vii

Anexo 3 Actividad larvicida 75

Anexo 4 Actividad antifúngica 75

Anexo 5 Actividad antimicrobiana 79

Anexo 6 Actividad inmunomoduladora 80

Anexo 7 Cuantificación de linfoproliferación. Ensayo con XTT 81

Anexo 8 Sólidos extraíbles 81

Anexo 9 Tamizaje fitoquímico 83

Anexo 10 Afiche

Anexo 11 Fichas técnicas de los hongos

PARTE V. INFORME FINANCIERO

85

86

92

viii

LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Dilusión del suero

Tabla 2. Principales especies de basidiomicetos comestibles detectados en

Guatemala

Tabla 3. Rendimiento de los extractos etanólicos al 95% y acuosos

obtenidos de la materia vegetal de varios hongos comestibles

16

32

45

Tabla 4. DL50 contra Artemia salina de los extractos etanólicos y acuosos

de hongos comestibles

46

Tabla 5. Actividad larvicida contra larvas de A. aegypti y A. albimanus 47

Tabla 6. Actividad antifúngica de extractos etanólicos al 95% 47

Tabla 7. Actividad antifúngica de extractos acuosos de hongos comestibles 48

Tabla 8. Actividad antimicrobiana de extractos etanólicos al 95% 48

Tabla 9. Actividad antimicrobiana de extractos acuosos 48

Tabla 10. Actividad inmunomoduladora para el ensayo linfoproliferativo 49

Tabla 11. Determinación de Concentración Efectiva Mínima de extractos

acuosos de B. edulis y C. lateritius para el ensayo linfoproliferativo

49

Tabla 12. Actividad sobre el Sistema de Complemento 50

Tabla 13. Determinación de CI50 del ensayo hemolítico para la valoración de

la vía clásica del Sistema de Complemento

50

Tabla 14. Determinación de CI50 del ensayo hemolítico para la valoración de

la vía alterna del Sistema de Complemento

51

Tabla 15. Cantidad de sólidos extraíbles con diferentes conc. de solvente 51

Tabla 16. Prueba de alcaloides 52

Tabla 17. Prueba de flavonoides y antocianinas 52

Tabla 18. Prueba de antraquinonas 52

Tabla 19. Prueba de cardenólidos y bufadienólidos 53

Tabla 20. Prueba de esteroides y triterpenoides 53

Tabla 21. Prueba de saponinas 53

Tabla 22. Prueba de taninos 53

Tabla 23. Prueba de glicósidos cianogénicos 54

Tabla 24. Prueba de esteroles insaturados 54

Tabla 25. Prueba de cumarinas 54

Tabla 26. Prueba de azúcares reductores 54

Tabla 27. Prueba de polisacáridos 55

Tabla 28. Cromatografía en capa fina de alcaloides 55

Tabla 29. Cromatografía en capa fina de flavonoides y antocianinas 55

Tabla 30. Cromatografía en capa fina de saponinas 56

Tabla 31. Cromatografía en capa fina de principios amargos 56

Tabla 32. Cromatografía en capa fina de aceites volátiles 57

Tabla 33. Resultados de la investigación de metabolitos secundarios 58



Tabla 36. Análisis de composición mineral 59

ix

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Cascada del sistema de complemento

Figura 2. Suero Fetal Bovino

Figura 3. Separación de la capa de linfocitos con Histopaque

Figura 4. Placa de inoculación

Figura 5. Resultados de actividad antibacteriana

Figura 6. Lectura de resultados actividad antimicótica

Figura 7. Cajas cuadriplate con control negativo, diferentes concentracionesy

estrías de siembra.

Figura 8. Larvas de Aedes aegypti y ciclo de vida

Figura 9. Obtención de extractos para ensayos

11

17

19

23

23

25

28

30

74

Figura 10. Actividad citotóxica de extractos 74

Figura 11. Actividad larvicida de extractos 75

Figura 12. Actividad antifúngica de extractos contra A. niger 75

Figura 13. Actividad antifúngica de extractos contra M. gypseum 76

Figura 14. Actividad antifúngica de extractos contra T. rubrum 77

Figura 15. Actividad antifúngica de extractos contra T. mentagrophytes 77

Figura 16. Actividad antifúngica de extractos contra A. fumigatus 78

Figura 17. Actividad antifúngica de extractos contra A. flavus 79

Figura 18. Actividad antimicrobiana de los extractos acuosos 79

Figura 19. Fases de separación de linfocitos 80

Figura 20. Placa de revelado con XTT 81

Figura 21. Proceso de percolación de sólidos extraíbles 81

Figura 22. Evaporación a sequedad 82

Figura 23. Cantidad de sólidos extraídos 82

Figura 24. Tamizaje fitoquímico 83

Figura 25. Preparación de cromatoplaca para CCF 83

Figura 26. Placa para investigación de alcaloides 84

Figura 27. Placa cromatográfica vista bajo luz UV 84

1

PARTE I

I.1 INTRODUCCIÓN

Los hongos están ampliamente distribuidos en todo el planeta y prosperan en casi todos

los climas: tropicales, subtropicales, templados y fríos, donde existan los elementos

indispensables para su existencia: materia orgánica y agua. El número de hongos

macroscópicos sobre la tierra es estimado actualmente de unas 140,000 especies, de las

cuales solamente 10% son conocidas por la ciencia (Wasser, 2007).

Los basidiomicetos u hongos macroscópicos son importantes seres en el equilibrio de la

naturaleza. Por un lado, son indicadores de biodiversidad y participan en la degradación

de desechos, y por otro, son una fuente emergente de alimentos sanos a través de

oligoelementos y otros compuestos químicos producidos ecológicamente.

A lo largo de la historia las diferentes culturas y sociedades del mundo han atribuido a

los hongos muchas propiedades. Los hongos comestibles han sido muy apreciados por

su sabor y textura, características que han sido reforzadas por su reconocido valor

alimenticio que ha convertido a muchas especies en un alimento nutricional de primera

clase. En los últimos veinte años se incrementó el interés sobre las especies comestibles

conocidas como hongos de “especialidad”, término aplicado a los hongos distintos al

tradicional y más conocido como hongo botón, Agaricus bisporus, cuya producción

representa más de la mitad de la de todos los hongos en el mundo. Las especies de

hongos de especialidad han incrementado su popularidad y estudios han demostrado en

ellos un contenido de proteína de alta calidad , así como una buena fuente de fibra

dietética, vitaminas B y C y minerales. Sus niveles de lípidos son bajos, pero la relación

entre las grasas insaturadas y las saturadas es alta (Breene, 1990).

Estudios sobre la composición química de varias especies de hongos comestibles han

establecido la necesidad de investigar la actividad biológica de muchos de sus

componentes. Culturas milenarias como la china y japonesa, han atribuido acción

medicinal a los hongos y han sido cultivadoras y consumidoras de algunas especies

particulares de hongos, tales como shiitake (Lentinula edodes), hongo paja (Volvariella

volvacea), hongo ostra (Pleurotus spp.), y enokitake (Flammulina velutipes). Chang en

1996 propuso que algunos hongos comestibles tenían además de su valor nutricional,

efectos saludables y curativos, estimando que alrededor de la mitad de los hongos que

son consumidos como alimento en el mundo podría tener valor nutracéutico y medicinal

e hizo énfasis en la necesidad de más estudios sobre el potencial medicinal de los hongos.

Dado que los datos existentes sobre los hongos no son tan fuertes como los de los

vegetales crucíferos para la prevención y el tratamiento de enfermedades serias como el

cáncer, la hipercolesterolemia, la deficiencia inmune causada por VIH, etc., desde finales

del siglo veinte fue planteada la necesidad de realizar estudios sobre la potencial

capacidad medicinal de estos organismos (Chang, 1996).

2

Los hongos medicinales han establecido historia de su uso en las terapias orientales

tradicionales. La investigación contemporánea ha validado y documentado mucho del

conocimiento ancestral. El campo interdisciplinario de la ciencia que estudia los hongos

medicinales ha florecido y ha ido demostrando crecientemente las propiedades potentes y

únicas de compuestos extraídos de una gran cantidad de especies en las últimas tres

décadas. Actualmente el campo está siendo desarrollado en un área muy fructífera. La

práctica clínica moderna en Japón, China, Corea y otros países asiáticos descansa en

preparaciones derivadas de hongos. La medicina oriental ancestral ha remarcado la

importancia de diversas especies de hongos, principalmente de Ganoderma lucidum

conocido como ling zhi o reishi y de Lentinus edodes o shiitake. Reishi ha sido valorado

tanto por sus propiedades medicinales como espirituales y fue considerado símbolo de

augurio de felicidad y buena fortuna, buena salud y longevidad.

También en Rusia y otros países europeos los hongos han jugado un papel importante

como curativos de enfermedades que afectan a sus poblaciones, especialmente las rurales.

Las especies más importantes en estas áreas rurales han sido Iononotus obliquus,

Fomitopsis officinalis y Fomes fomentarius, las cuales eran usadas en el tratamiento de

enfermedades gastrointestinales, distintas formas de cáncer y asma bronquial, entre otros.

En Mesoamérica existe una larga historia del uso tradicional de hongos curativos,

especialmente especies del género Psilocybe. Hay una gran diversidad de especies de

basidiomicetos que prevalecen en la zona mesoamericana dada la mezcla de condiciones

climáticas que favorecen su crecimiento, a pesar de que la micobiota tropical es muy

pobremente conocida. Según Guzmán, a pesar de que existen grandes tradiciones pre-

hispánicas en el uso de hongos como alimento, medicina y en ceremonias religiosas, éstas

han sido influenciadas por la civilización moderna. Algunas especies comúnmente

comercializadas en los mercados populares de México son también usadas en la medicina

tradicional, tales como Clitocybe gibba, Lactarius indigo, Langermannia gigantea,

Lycoperdon perlatum, Pleurotus djamor y Ustilago maydis, así como varias especies de

poliporos. Describe que hay más de cuarenta tipos de enfermedades que las personas

combaten con hongos, entre ellas: constipación, conjuntivitis, diabetes, diarrea,

disentería, epilepsia, enfermedades de la piel y neumonía (Guzmán 2007).

Con tan basta diversidad en el mundo, los hongos son objeto actualmente de evaluación

tanto por su valor y aceptabilidad nutricional, como por sus propiedades farmacológicas.

Estos constituyen una vasta fuente de potenciales y nuevos productos farmacéuticos.

En la medicina moderna, particularmente, los hongos macroscópicos presentan una

ilimitada fuente de polisacáridos y complejos polisacárido-proteína con propiedades anti-

cáncer e inmunoestimulantes. Muchos, si no todos los basidiomicetos, contienen

polisacáridos biológicamente activos en sus cuerpos fructíferos, en sus micelios y en los

caldos de cultivo.

Las actividades biológicas y medicinales que son actualmente el principal interés de

estudio en estos hongos son sus efectos antitumorales, inmunomoduladores,

antioxidantes, cardiovasculares, anti-hipercolesterolemia, antivirales, antibacterianos,

antiparasitarios, hepatoprotectores y antidiabéticos.

3

En Guatemala gracias a las distintas zonas de vida del país, existe una gran diversidad de

hongos y un consumo heredado por tradición, lo cual es notorio en la población

campesina del altiplano. Sin embargo pocos trabajos de investigación han sido realizados

para conocer la diversidad, distribución, usos, cultivo y mejora de su producción a nivel

comercial. A pesar de que existe un gran depósito de información cultural sobre hongos

en las distintas etnias de Guatemala, éste no ha sido recopilado y debidamente valorado.

Esta información constituye conocimiento científico que debe ser rescatado, desarrollado

y divulgado, para evitar su desaparición y aprovechar este recurso de mejor manera.

I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

I.2.1 Antecedentes (Trabajo, experiencias en Guatemala)

I.2.1.1 Bioensayos de inmunomodulación realizados en Guatemala

Durante la última década, la Unidad de Bioensayos de la Facultad de Ciencias

Químicas y Farmacia, USAC, ha estandarizado y puesto a punto, ensayos in vitro que

han sido aplicados para la investigación del papel inmunomodulador de diversos

extractos vegetales. A través de estos ensayos ha sido posible la estimación del poder

inhibidor o estimulante de muchos extractos de plantas sobre la linfoproliferación

(Alvarez, 2006) y sobre el sistema de complemento (Castillo, Osorio, Paz & Cáceres,

2005). El creciente interés por los hongos macroscópicos en Guatemala nos lleva a la

búsqueda no solamente de sus propiedades nutricionales sino también de sus atributos

como medicinales o como coadyuvantes en el manejo y/o control de enfermedades. Para

ello se hace necesaria la valoración de extractos obtenidos de especies de basidiomicetos

comestibles de Guatemala, aplicando los protocolos de los ensayos de linfoproliferación

y modulación del sistema de complemento.

I.2.1.2 Marco conceptual: La inmunomodulación es la modificación del curso espontáneo

de las reacciones inmunitarias. Las sustancias inmunomoduladoras son aquellas capaces

de promover o deprimir la habilidad de un individuo de establecer una respuesta inmune

o defenderse contra patógenos y tumores. Dichas sustancias competen al estudio de la

inmunofarmacología, la cual explora las alternativas químicas y naturales que representen

una posibilidad terapéutica útil. Su aplicación y desarrollo se debe a la asociación de

desórdenes como alergias, enfermedades infecciosas, enfermedades auto inmunes y

cáncer con un desbalance en el sistema inmune.

Los inmunomoduladores pueden dividirse en dos categorías: los específicos y los no

específicos. Los inmunomoduladores específicos son administrados junto con antígenos

y bajo esta situación son conocidos como adyuvantes. Su función será la de aumentar la

inmunogenicidad específica del antígeno. Los inmunoestimulantes inespecíficos del

antígeno tienen efecto sobre todas las respuestas inducidas durante la fase de actividad

del producto empleado. Los inmunosupresores inespecíficos se aplican simultáneamente

a todas las respuestas inmunitarias mientras dura la acción del producto utilizado; esto se

logra mediante la destrucción de las células linfoides, por irradiación o por inyección de

productos químicos o biológicos (Bomford, 1988).

II.2.1.3 Marco referencial: Desde la antigüedad los hongos desempeñan múltiples e

importantes roles para la humanidad. En países orientales, donde el uso con fines

terapéuticos de hongos comestibles ha sido practicado por generaciones, se ha descrito

4

que los basidiomicetos poseen actividad inmunomoduladora. La importancia de dicha

actividad radica en que estos alimentos pueden ser empleados en el tratamiento o

prevención de enfermedades degenerativas o depresoras del sistema inmune (Masihi,

2002). En los últimos años se ha incrementado el número de publicaciones que destacan

propiedades inmunoestimulantes o acción anti-inflamatoria y anti-cáncer en diversas

especies de hongos macromicetos, validando su uso ancestral. Actualmente existen

productos derivados de estos hongos que han probado su utilidad en la medicina moderna

en condiciones patológicas como enfermedades autoinmunes, hiperlipidemias, tumores

malignos y en el Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA), entre otros

(Mahajna, Yassin, Zaidman, Nevo & Wasser, 2005) (Aung, 2005) (Elisashvili, Asatiani,

Kachlishvili, Kenkebashvili, Khardaziani, Metreveli… Tsiklauri, 2007).

Existe en Guatemala también un gran interés por los hongos; sin embargo, la mayoría de

estudios realizados han sido enfocados en la caracterización taxonómica y mejoramiento

genético, siendo nulos los orientados a la inmunomodulación, ya que este aspecto ha sido

evaluado solamente en plantas.

Seis especies de hongos comestibles, los cuales son comercializados popularmente en los

mercados del país fueron el material de estudio en el presente proyecto. La identidad de

los basidiomicetos recolectados fue confirmada por métodos de identificación

taxonómica del Servicio de Micología de la Escuela de Química Biológica. Tres especies

más fueron estudiadas en un Seminario de Investigación de la misma Escuela.

I.3 OBJETIVOS E HIPOTESIS

I.3.1 Objetivo General

Evaluar la composición química y la actividad inmunomoduladora y biocida de

hongos silvestres y cultivados usados en Guatemala como alimento.

I.3.2 Objetivos Específicos

I.3.2.1 Recolectar seis hongos comestibles (cinco especies silvestres y una

especie cultivada) y determinar su taxonomía.

I.3.2.2 Procesar (secar y esterilizar) en condiciones apropiadas los especímenes

colectados.

I.3.2.3 Establecer bioensayos inmunomoduladores y biocidas para evaluar los

especímenes.

I.3.2.4 Obtener un extracto polar y uno apolar de los especímenes colectados.

I.3.2.5 Caracterizar microscópicamente los basidiomicetos en estudio.

I.3.2.6 Determinar la actividad inmunomoduladora y biocida de los extractos

obtenidos.

I.3.2.7 Caracterizar la composición química y el análisis proximal de los hongos y

extractos.

I.3.2.8 Preparar una Ficha Técnica de cada hongo colectado que incluya los

resultados obtenidos.

I.3.2.9 Difundir los resultados a nivel nacional e internacional.

5

I.3.3 Hipótesis

Por lo menos uno de los basidiomicetos colectados tiene composición química y

actividad biológica interesante para su desarrollo como un alimento funcional novedoso.

I.4 METODOLOGIA

I.4.1 Localización

El presente proyecto fue llevado a cabo en la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia,

de la Universidad de San Carlos en las siguientes instalaciones: Servicio de Micología de

la Escuela de Química Biológica, laboratorio de la Unidad de Bioensayos y Laboratorio

de Productos Naturales (LIPRONAT).

Para la colecta de hongos en estudio, primero se tramitó el permiso para entrar a los

bosques comunales ante las Municipalidades correspondientes y se contactaron a

personas conocedoras y proveedores de hongos de los lugares seleccionados, a quienes se

les retribuye por día de colecta y se les explica el proyecto a fin de poder contar con su

consentimiento para la documentación de sus conocimientos y toma de fotografías.

Para la realización de la colecta de hongos en bosques, se utilizo el protocoló de muestreo

oportunista (Matta 1,999), una vez colectados los ejemplares se empacaron en papel

parafinado y luego se transportaron en hieleras en condiciones de refrigeración al

laboratorio. Los ejemplares colectados en bosques se utilizaron con el único fin de

documentar la presencia de la especie en el lugar, dada la cantidad requerida en peso

seco, no es posible obtenerla en las colectas de campo.

Para la obtención de los hongos utilizados para los análisis del proyecto, se recurrió a los

vendedores de hongos locales, los cuales se contactaron en los mercados Municipales de

cada región, los cuales proporcionaron los volúmenes requeridos.

Se procedió a describir las características macro y microscópicas de los hongos

adquiridos en los mercados. Se midieron las estructuras del píleo, himenio y estípite y se

anotaron las coloraciones y reacciones químicas de los tejidos fúngicos ante diferentes

reactivos específicos (Cifuentes 1,984, Kornerup 1,989).

Las descripciones realizadas se compararon con la bibliografía correspondiente, para

identificar correctamente los hongos colectados (Bessette 1,997 y 2,000, Calonge 1,998,

García, et al 1,998, Phillips 1,991, Læssøe, et al 1,996).

Preservación de los hongos colectados

Los hongos ya descritos se partieron y colocaron en deshidratadoras a 65°C durante tres

días, una vez secos se coloca una muestra (3 a 5 ejemplares) en bolsas de polipapel,

identificadas con el nombre del hongo, número de referencia, lugar y fecha de colecta,

además de su respectiva descripción y se procede a su incorporación en la Micoteca de

Macrohongos de Guatemala “Lic. Rubén Mayorga Peralta”, de la Unidad de

Biodiversidad, Tecnología y Aprovechamiento de Hongos –BioTAH-, del Departamento

6

de Microbiología de la Escuela de Química Biológica de la Facultad de Ciencias

Químicas y Farmacia de la Universidad de San Carlos de Guatemala.

Los hongos restantes se colocaron en bolsas plásticas selladas y rotuladas para ser

utilizadas en la realización de los ensayos de laboratorio.

Localidades de muestreos de hongos

Se seleccionaron los lugares donde los hongos se encuentran con más abundancia y fácil

accesibilidad con los pobladores de la región, siendo estos Ixchiguán, San Marcos, San

Juan Comalapa, Chimaltenango, San Pedro Carcha, Alta Verapaz, San Raymundo,

Guatemala y Técpan, Chimaltenango.

Los ejemplares de Neolentinus ponderosus, fueron cultivados y donados por la Unidad

de Biodiversidad, Tecnología y Aprovechamiento de Hongos –BioTAH, del

Departamento de Microbiología de la Escuela de Química Biológica.

Cantharellus lateritius fue colectado en el municipio de San Raymundo, Departamento

de Guatemala, latitud 14° 45’ 56” N; longitud, 90º 35’ 46” O y 1,570 MSNM,

Temperatura promedio de 24°C.

Armillariella polymyces fue colectado en el municipio de San Pedro Carchá, Alta

Verapaz, latitud 15° 28’ 39” N; longitud, 90° 18’ 38” O y 1,282 MSNM, con un rango de

temperatura de 13°C mínima y 24°C máxima.

Boletus edulis fue adquirido en la cooperativa de Ixchiguán, Depto. de San Marcos,

latitud 15° 09’ 51” N; longitud, 91º 56’ 00” O y 3,200 MSNM. Registra un rango de

temperatura de 8-20°C.

Neolentinus ponderosus proviene del municipio San Mateo Ixtatán, Huehuetenango

latitud 15° 49’ 49” N; longitud, 91º 28' 35” O y 2,540 MSNM y un rango de temperatura

de 9-22°C.

Lactarius deliciosus del municipio de San Juan Comalapa, Chimaltenango, latitud 14°

44’ 24” N; longitud, 90º 53’ 15” O y 2,115 MSNM, temperatura de 13-25°C.

Amanita garabitoana de Tecpán Guatemala, Chimaltenango, latitud 14º 45’ 37” N;

longitud, 90º 59’ 30” O y 2,286 MSNM, rango de temperatura de 12.6-24.8°C.

I.4.2 Variables

I.4.2.1 Variables dependientes: composición química y actividad biológica

I.4.2.2 Variables independientes: basidiomicetos comestibles de Guatemala

I.4.3 Indicadores

I.4.3.1 Publicaciones con la información química y biológica de las especies de

basidiomicetos estudiadas

7

I.4.3.2 Colección de especímenes, registrados y depositados en Micoteca Lic. Rubén

Mayorga Peralta

I.4.3.3 Seis extractos etanólicos de las especies de hongos llevados a sequedad

I.4.3.4 Seis extractos acuosos de las especies estudiadas

I.4.3.5 Presencia de metabolitos secundarios por ensayos fitoquímicos

I.4.3.7 Determinación de la actividad biológica por bioensayos

I.4.3.9 Fichas técnica de las seis especies evaluadas

I.4.4 Estrategia metodológica

I.4.4.1 Recopilar información relevante y elaborar fichas técnicas de las especies

estudiadas para difundir la información, conservar material de referencia para su

utilización en otros sectores, tanto académicos como empresariales.

I.4.4.2 Colectar material micológico en su sitio de origen, identificarlo, secarlo y

almacenarlo adecuadamente para garantizar resultados confiables y

reproducibles.

I.4.4.2 Preparar extractos polares y apolares para identificar la presencia de metabolitos

secundarios por ensayos fitoquímicos y estudiar su actividad biológica.

I.4.4.3 Establecer los procedimientos analíticos para determinar la actividad

inmunomoduladora de linfoproliferación y del sistema de complemento en las

especies estudiadas.

I.4.4.4 Capacitar personal profesional en los procedimientos analíticos y bioensayos

para evaluar la actividad inmunomoduladora y su composición química.

I.4.5 Métodos

I.4.5.1 Universo: Hongos comestibles de Guatemala.

I.4.5.2 Muestra: Extractos etanólicos y acuosos de los hongos comestibles Armillariella

polymyces, Boletus edulis, Cantharellus lateritius, Neolentinus ponderosus, Lactarius

deliciosus y Amanita garabitoana.

I. 4.5.3 Extacción contínua por percolación: La percolación consiste en hacer pasar el

disolvente a través de la materia seca hasta su extracción completa. La percolación

simple comprende la extracción exhaustiva de la droga con el disolvente siempre

renovado. En pequeña escala, la percolación se realiza en aparatos denominados

percoladores los cuales son de cuerpo cilíndrico o cónico y están provistos de un grifo en

la parte inferior para regular el flujo de solvente.

I.4.5.3.1 Equipo y materiales

Algodón

Balanza semianalítica

Erlenmeyers

Papel filtro

Percolador de vidrio o acero inoxidable

Vaso de precipitar

8

I.4.5.3.2 Procedimiento

En un percolador previamente limpio y seco, colocar un poco de algodón en

la parte inferior y papel filtro cortado de acuerdo al diámetro del percolador.

Pesar la cantidad de materia vegetal a utilizar de acuerdo al tamaño del

percolador.

Humedecer el material vegetal con el disolvente adecuado para la extracción,

utilizando un vaso de precipitar.

Transferir todo el material al percolador y agregar disolvente hasta cubrir el

material vegetal (hasta una pulgada sobre el nivel de materia vegetal).

Dejar reposar el tiempo necesario para llevar a cabo la extracción lo que

dependerá la cantidad de la materia vegetal (24-48 horas).

Abrir la llave de la parte inferior y dejar gotear el líquido a una velocidad

adecuada.

Recoger el líquido en un erlenmeyer e ir añadiendo suficiente disolvente

extra, según se requiera, hasta obtener el volumen de disolvente agregado al

inicio.

El material sólido que ha quedado, se presiona fuertemente y el líquido

obtenido se añade al percolado obtenido anteriormente.

La solución obtenida puede utilizarse para producir extractos o tinturas. Para

preparar extractos, el líquido obtenido (menstruo) se concentra en un

rotavapor o en un equipo similar y se repite la operación hasta que se agote la

droga con el disolvente recuperado; las tinturas solo se ajustan a volumen en

función de la concentración deseada (1:5, 1:8 o 1:10).

I.4.5.4 Concentración por rotavapor

La concentración representa la etapa siguiente al proceso de extracción. El proceso de

concentración busca aumentar el contenido de sólidos totales en el extracto con la

finalidad de alcanzar un determinado contenido del residuo seco, producir extractos

blandos, como etapa preliminar en la producción de extractos duros. Los extractos

también pueden ser concentrados para la extracción en contracorriente con disolventes no

miscibles, con miras a la fabricación de extractos purificados o el aislamiento de

sustancias puras.

El equipo necesario para la concentración con recuperación de disolventes es el

evaporador rotatorio, cuyo funcionamiento se basa en los siguientes principios:

colocación de la muestra en un balón de evaporación a 40˚C que rota a una velocidad

constante produciendo una película que aumenta la superficie de evaporación, generación

de vacío entre 30 y 300 mbar con la ayuda de una bomba sin aumentar la temperatura, y

condensación del vapor del disolvente en el refrigerante conectado a un sistema de

enfriamiento que luego es colectado en un balón.

I.4.5.4.1 Materiales y equipo

Balón de 1000 mL

Disolvente (etanol, metanol, diclorometano, hexano, pentano, etc.)

9

Rotavapor (Balón de evaporación, condensador, bomba de vacío, refrigerante

y balón de colecta)

Sistema de enfriamiento o circulación de agua


Verificar que estén conectadas todas las conexiones eléctricas.

Colocar el balón colector y fijarlo con la llave respectiva.

Agregar agua al baño de calentamiento.

Encender el baño y mantener la temperatura entre 50-60˚C. Dependiendo del

equipo puede haber pérdidas de 10-20˚C entre el baño de calentamiento y el

interior del balón de evaporación, en todo caso el balón de evaporación no

deberá tener una temperatura mayor de 40˚C.

Revisar que la llave de alimentación del refrigerante esté cerrada.

Llenar el balón con el percolado hasta la mitad.

Colocar el balón con la muestra y sujetar al vástago con la llave

correspondiente.

Encender el botón que permite girar el balón que contiene la muestra a una

revolución adecuada (50 a 80 revoluciones).

Conectar un sistema de enfriamiento (bomba de agua) y agregar hielo a la

hielera. Dejar que enfríe unos cinco minutos.

Mantener siempre el refrigerante frío cambiando regularmente los hielos.

Encender la bomba de vacío durante el tiempo necesario para iniciar la

destilación.

Cuando haya iniciado la destilación, apagar la bomba de vacío.

Encender la bomba de vacío cuantas veces sea necesario hasta que se haya

agotado el disolvente del balón de evaporación o ya no destile ningún líquido,

lo que querrá decir que el vacío de nuestra bomba no es suficiente para

vaporar la mezcla de disolventes contenida en el balón de evaporación.

I.4.5.5 Ensayo hemolítico de actividad sobre la vía alterna del complemento

El sistema de complemento está compuesto por aproximadamente treinta proteínas que

interaccionan entre sí y que amplifican la respuesta humoral. Su activación y fijación a

microorganismos constituye un mecanismo efector del sistema inmune, que facilita la

eliminación del antígeno, genera una respuesta inflamatoria. Este sistema está compuesto por cuatro unidades funcionales: la vía clásica, la vía alterna, la unidad de amplificación y la ruta terminal. Las primeras dos son las principales vías de activación, y funcionan por

interacción de proteínas. La determinación de la activación del complemento por la vía

clásica y alterna se basa en la hemólisis de eritrocitos de carnero sensibilizados con

anticuerpos de conejo anti-eritrocitos de carnero, al activarse este sistema en donde los

eritrocitos actúan como activadores y células blanco. Tras esta activación se produce la

lisis de eritrocitos liberándose hemoglobina, la cual es medida y utilizada como parámetro

en la medida de la actividad del complemento. En la vía alterna se debe inactivar la vía

clásica utilizando ácido etilenglicol tetra-acético (EGTA) como agente quelante de calcio

(necesario para su activación).

10

Figura 1. Cascada del sistema de complemento

1.4.5.5.1 Equipo y material

Autoclave

Balanza Analítica

Campana de flujo laminar

Congelador

Centrifuga

Hemocitómetro de Neubauer

Incubadora

Lector de ELISA

Refrigeradora

Espectrofotómetro

Placas de microtitulación estériles de 96 pozos, fondo en U con tapadera

Pipetas de 10uL, 50uL, 100uL, 200uL, 1000uL

Pipetas Pasteur

Tubos de ensayo

Tubos Eppendorf de 0.5 y 2.0 mL

Tubos de 50 mL

Tubos plásticos de 15 mL

Mezcla de suero humano normal (MSH)

Mezcla de suero humano inactivado

Droga Patrón (Ciclosporina, Levamisol o Difur)

Solución salina

Agua destilada

Agua desmineralizada

Solución Alsever

11

Eritrocitos de conejo y de carnero

Anticuerpo contra eritrocitos de carnero (AMBOCEPTOR) Dilución 1:100

Amortiguador salino de veronal concentrado 5 veces (VSB), como solución

madre

VSB^ (no aditivos)

VSB+2 (0.5mM de Mg+2 y 0.15 mM de Ca+2)

EGTA-VB (2.5 mM de Mg+2 y 8mM de etilenglicol-bis(beta-aminoetileter)-

N,N,N’,N’-ácido tetraacético (EGTA)).

Agua Milli-A


Lavado de eritrocitos

Mezclar 4 mL de los eritrocitos con 6 ml de solución salina en un tubo de

plástico de 15 mL.

Centrifugar a 2500 rpm durante 5 minutos.

Eliminar el sobrenadante utilizando una pipeta, resuspender el botón en 10

mL de solución salina y volver a centrifugar a 2500 rpm durante 5 minutos.

Repetir el proceso anterior. Tras la tercera centrifugación guardar el botón de

células en hielo.

Preparación de la suspensión de eritrocitos

Resuspender el botón de células (500 µL) en 9.5ml de EGTA-VB en un tubo

de 50 mL, mantener en hielo.

Mezclar 100 µL de esta suspensión con 4.9 ml de agua desmineralizada en un

tubo de 15 mL.

Determinar la densidad óptica a 410 nm. La concentración de eritrocitos debe

ser ajustada a 4 x 108 células/mL, cuya densidad óptica es de 0.522;

utilizando la siguiente fórmula:

Mantener la suspensión eritrocítica en hielo.

Volumen de EGTA-VB = (V inicial) x [(OD medida – 0.522) / 0.522]

Dilución de las muestras en placas de microtitulación en U

Agregar 50 μL de EGTA-VB a los pozos en las filas B a G.

Agregar 100 μL de muestra en solución en triplicado a la fila A.

Transferir 50 μL de la solución en la fila A a la fila B y después mezclar.

Transferir 50 μL de la fila B a la siguiente fila. Repetir ester procedimiento

hasta la fila G.

Descartar 50 μL de la mezcla final en la fila G.

Preparación de controles de actividad hemolítica

Añadir 50 μL de EGTA-VB a los pocillos H1 a H3. H1-H3 será la actividad

del extracto. H4-H6 será el blanco (suero inactivado).

Añada 100 μL de EGTA-VB a los pocillos H7-H9 (0% de hemólisis).

12

Añadir 100 μL de agua desionizada a los pocillos H10-H12 (100% de

hemólisis).

Preparación de la dilución del suero y preincubación

Añadir 500 μL de la solución de suero inactivado con 500 µl de EGTA-VB.

Agregar 25 μL de esta solución a A3-G3, A6-G6,A9-G9,A12-G12 y H4-H6.

Mezclar 1 mL de suero humano con 1 mL de EGTA-VB. Agregar 25 μL de

esta solución a A1-H1, A2-H2, H3, A4-G4, A5-G5, A7-G7, A8-G8, A10 –

G10 y A11-G11.

Cubrir la placa y preincubar a 37º C durante 30 minutos.

Incubación

Añadir 25 μL de la suspensión de eritrocitos de conejo a cada pozo.

Incubar a 37º C durante 30 minutos.

Medición de la hemólisis

Centrifugar las microplacas a 2500 rpm, durante 2 minutos.

Añadir 200 μL de agua desmineralizada a los pocillos de otra placa de fondo

plano.

Medir la densidad óptica a 405 nm en un lector de ELISA.

Cálculos

Determinación de la actividad sérica

(% lisis) = 100 X Media OD405 (H1, H2, H3) – Media OD405 (H4, H5, H6)

Media OD405 (H10, H11, H12) – Media OD405 (H7, H8, H9)

Actividad inhibidora de la muestra respecto al control

Ejemplo para la concentración más alta de la muestra 1, A1, A2 y A3. Valores de OD405.

(Media de A1-A2) – A3 = Problema – Blanco del problema

(Media de H1-H3) – (media de H4 – H6) = Control – Blanco, será el 100% de Actividad.

% Inhibición = 100 – (Problema – Blanco problema/Control – Blanco) 100

I.4.5.6 Ensayo hemolítico para evaluar actividad del complemento en la vía clásica

El sistema de complemento está compuesto por aproximadamente treinta proteínas que

interaccionan entre sí y que amplifican la respuesta humoral. Su activación y fijación a

microorganismos constituye un mecanismo efector del sistema inmune, que facilita la

eliminación del antígeno, genera una respuesta inflamatoria. Este sistema está compuesto por cuatro unidades funcionales: la vía clásica, la vía alterna, la unidad de amplificación y la ruta terminal. Las primeras dos son las principales vías de activación, y funcionan por

interacción de proteínas. La determinación de la activación del complemento por la vía

clásica y alterna se basa en la hemólisis de eritrocitos de carnero sensiblizados con

anticuerpos de conejo anti-eritrocitos de carnero, al activarse este sistema en donde los

13

eritrocitos actúan como activadores y células blanco. Tras esta activación se produce la

lisis de eritrocitos liberándose hemoglobina, la cual es medida y utilizada como parámetro

en la medida de la actividad del complemento. En la vía alterna se debe inactivar la vía

clásica utilizando ácido etilenglicol tetraacético (EGTA) como agente quelante de calcio

(necesario para su activación).

I.4.5.6.1 Equipo y material

Autoclave

Balanza Analítica

Campana de flujo laminar

Congelador

Centrifuga


Incubadora

Lector de ELISA

Refrigeradora

Espectrofotómetro

Placas de microtitulación estériles de 96 pozos, fondo en U con tapadera

Pipetas de 10uL, 50uL, 100uL, 200uL, 1000uL

Pipetas Pasteur

Tubos de ensayo

Tubos Eppendorf de 0.5 y 2.0 mL

Tubos de 50 mL

Tubos plásticos de 15 mL

Mezcla de suero humano normal (MSH)

Mezcla de suero humano inactivado

Droga Patrón (Ciclosporina, Levamisol o Difur)

Solución salina

Agua destilada


Solución Alsever

Eritrocitos de conejo y de carnero

Anticuerpo contra eritrocitos de carnero (AMBOCEPTOR) Dilución 1:100

Amortiguador salino de veronal concentrado 5 veces (VSB), como solución

madre

VSB^ (no aditivos)

VSB+2 (0.5mM de Mg+2 y 0.15 mM de Ca+2)

EGTA-VB (2.5 mM de Mg+2 y 8mM de etilenglicol-bis(beta-aminoetileter)-

N,N,N’,N’-ácido tetraacético (EGTA)).

Agua Milli-A

14


Preparación de los eritrocitos sensibilizados con el anticuerpo

Lavado

Mezclar 2 mL de los eritrocitos con 8 mL de solución salina en un tubo de

plástico de 15 mL.

Centrifugar a 2500 rpm durante 5 minutos.

Eliminar el sobrenadante utilizando una pipeta, resuspender el botón en 10

mL de solución salina y volver a centrifugar a 2500 rpm durante 5 minutos.

Repetir el proceso del paso c. Tras la tercera centrifugación guardar el botón

de células en hielo.

Preparación de la suspensión de eritrocitos

Resuspender el botón de células (500 µL) en 9.5ml de VSB+2 en un tubo de

50 mL, mantener en hielo.

Mezclar 100 µL de esta suspensión con 4.9 mL de agua desmineralizada en

un tubo de 15 mL.

Determinar la densidad óptica a 410 nm. La concentración de eritrocitos debe

ser ajustada a 4 x 108 células/mL, cuya densidad óptica es de 0.522;

utilizando la siguiente fórmula:

Volumen de VSB+2 = (V inicial) x [ (OD medida – 0.522) / 0.522]

Mantener la suspensión eritrocítica en hielo.

Sensibilización de los eritrocitos (ShEA)

Mezclar 1 mL de la dilución1:100 Amboceptor con 7 ml de VSB+2, en un

tubo de 50 ml.

Añadir 8 mL de la suspensión de eritrocitos e incubar a temperatura ambiente

durante 10 minutos.

Centrifugar a 2500 rpm durante 5 minutos. Eliminar el sobrenadante y

resuspender el botón en 16 mL de VSB+2.

Mantener la solución en hielo.

Dilución de las muestras en placas de microtitulación en U

Agregar 50 μL de VSB +2 a los pozos en las filas B a G.

Agregar 100 μL de muestra en solución en triplicado a la fila A.

Transferir 50 μL de la solución en la fila A a la fila B y después mezclar.

Transferir 50 μL de la fila B a la siguiente fila. Repetir ester procedimiento

hasta la fila G.

Descartar 50 μL de la mezcla final en la fila G.

15

Preparación de controles de actividad hemolítica

Añadir 50 µL de VSB+2 a los pocillos H1 a H3. H1-H3 será la actividad del

extracto. H4-H6 será el blanco (suero inactivado).

Añada 100 µL de VSB+2 a los pocillos H7-H9 (0% de hemólisis).

Añadir 100 µL de agua Milli-A a los pocillos H10-H12 (100% de hemólisis).

Preparación de la dilución del suero y preincubación

Añadir 50 µL de la solución de suero inactivado (63 µL de suero inactivado

+ 5 mL de VSB+2) a los pocillos H4-H6 y blancos de las muestras.

Mezclar 125 µL de extracto con 10 mL de VSB+2 y añadir 50 µL a los

pocillos control y muestras problema(suero mas extracto).

Cubrir la placa y preincubar a 37º C durante 30 minutos.

Tabla 1. Dilusión del suero

Cantidad de

placas

Dilución de Suero Activo Dilución de Suero Inactivo

Suero Activo VSB++

Suero

Inactivo

VSB++

2 150 uL 6 mL 63 uL 5 mL

3 250 uL 10mL 94.5 uL 7.5 mL

4 375 uL 15 mL (alcanza hasta

para 5 placas)

126 uL 10 mL

5 500 uL 20 mL 157.5 uL 12.5 mL

6 625 uL 25 mL 189 uL 15 mL (alcanza hasta

para 8 placas)

7 750 uL 30 mL 220.5 uL 17.5 mL

8 875 uL 35 mL 252 uL 20 mL

9 1000 uL 40 mL 283.5 uL 22.5 mL

10 1125 uL 45 mL 315 uL 25 mL

11 1250 uL 50 mL 346.5 27.5 mL

12 1250 uL de suero activo + 50

mL de VSB++

alcanzan hasta

para 17 placas

346.5 uL de suero inactivo +

27.5 mL de VSB++

alcanzan

hasta para 15 placas

Incubación

Añadir 50 µL de los eritrocitos sensibilizados (ShEA) a cada pocillo

Incubar a 37º C durante 60 minutos.

Medición de la hemólisis

Centrifugar las microplacas a 2500 rpm, durante 2 minutos.

Añadir 200 µL de agua desmineralizada a los pocillos de otra placa de fondo

plano.

16

Medir la densidad óptica a 405 nm en un lector de ELISA.

Cálculos

Determinación de la actividad sérica

(% lisis) = 100 X Media OD405 (H1, H2, H3) – Media OD405 (H4, H5, H6)

Media OD405 (H10, H11, H12) – Media OD405 (H7, H8, H9)

Actividad inhibidora de la muestra respecto al control

Ejemplo para la concentración más alta de la muestra 1, A1, A2 y A3. Valores de OD405.

(Media de A1-A2) – A3 = Problema – Blanco del problema

(Media de H1-H3) – (media de H4 – H6) = Control – Blanco, será el 100% de Actividad.

% Inhibición = 100 – (Problema – Blanco problema/Control – Blanco) 100

Cálculo de la CI50

Se realiza la gráfica de % de inhibición versus Log concentración, con la recta de

regresión obtenida (al menos 4-5 valores significativos) se extrapola el valor del 50% de

inhibición para obtener la CI50.

I.4.5.7 Ensayo de linfoproliferación

El ensayo está basado en la ruptura de una sal de tetrazolio amarilla (XTT) que es

reducida a un producto coloreado y soluble, por la actividad enzimática mitocondrial

presente en células metabólicamente activas. Esto es debido desdoblamiento del XTT

incorporado por los linfocitos viables, tratados con dos lectinas de actividad conocida

(ConA y PHA), que se libera produciendo tal compuesto cromógeno; el cual puede ser

directamente cuantificable mediante la lectura de absorbancia en un espectrofotómetro de

placas a 450 nm, o un lector de ELISA; el aumento de absorbancia es proporcional al

número de linfocitos viables. Así mismo la linforpoliferación puede ser medida al

realizar un conteo directo de los linfocitos presentes en la suspensión de células por

unidad de volumen, en donde se considera como un resultado positivo al aumento o

disminución del recuento comparado con la lectina y un control negativo.

I.4. 5.7.1 Equipo y material

Campana de Flujo laminar

Centrífuga

Espectofotómetro de placas o lector de ELISA


Incubadora 37ºC

Placas estériles de 96 pozos, de fondo plano, con tapadera

Pipetas de, 50 uL, 100 uL, 200 uL

Pipetas Pasteur

Tubos de ensayo

Tubos Vacutainer con EDTA de 5 mL

Tubos de 50 mL

17

Sangre o suspensión de linfocitos

Histopaque

Sal de tetrazolio (XTT ó Hidrato ácido de 3`-[1-(fenilaminocarbonil)-3,4-

tetrazolio]- bis (4-metoxi-6nitro( bencen-sulfónico de sodio)

Lectinas de ConA y PHA

Metosulfato de phenacina (PMS)

Dimetil formamida

Solución de Türk

Acido acético

Cristal violeta

Medio de cultivo Roswell Park Memorial Institute (RPMI)

RPMI-FBS (medio de cultivo más 10 % de suero fetal bovino)

Buffer Salino de Fosfatos (PBS)

Gentamicina

EDTA (sal disódica o tripotásica del ácido etilendiaminotetraacético)

Figura 2. Suero Fetal Bovino


I.4.5.7.2.1 FASE I: Preparación de soluciones y suspensiones:

Preparación de PBS

Agregar un sobre de PBS en 1000 mL de agua destilada, usando un balón

aforado. Homogeneizar.

Chequear que el PBS tenga un pH de 7.4 antes de meterlo al autoclave.

Meter al autoclave el PBS preparado.

18

Preparación de RPMI-FBS: cada placa de 96 pozos requiere 7 mL de RPMI-FBS, el cual

se suplementa así:

Descongelar y atemperar suero fetal bovino.

300 mg de L-glutamina + 1000 mL de RPMI-1640 (puede que haya RPMI ya

suplementado con L-glutamina) .

Por cada 90 mL de RPMI suplementado agregar 10 mL de suero fetal bovino

(FBS).

Filtrar en un filtro de 0.20um.

Dilución de Extractos

Para cada placa de 96 pozos se emplea alrededor de 1.5 mL de RPMI-FBS.

Preparar RPMI-FBS de la siguiente forma:

300 mg de L-glutamina + 1000 mL de RPMI-1640 (puede que haya RPMI ya

suplementado con L-glutamina).

Por cada 90 mL de RPMI agregar 10 mL de suero fetal bovino (FBS).

Filtrar el RPMI-FBS en un filtro de 0.20um antes de diluir los extractos.

Pesar 1mg extracto por cada 1 ml RPMI-FBS que se vaya a emplear (es decir,

relación 1:1).

Mezclar el extracto con el RPMI-FBS guardando siempre la relación 1mg

extracto/1 mL RPMI-FBS.

Sellar con parafilm totalmente, previniendo filtraciones, y luego sonicar 45

minutos

Filtrar extracto diluido en un filtro de 0.20um por duplicado.

Sellar con parafilm. Almacenar el restante en refrigeración y verificar

periódicamente ausencia de contaminación.

Preparación de Solución de Trabajo de Lectina (Mitógeno): para cada placa de 96 pozos

se requiere 5 mL de solución de trabajo de lectina.

Preparación de solución Stock de Lectina:

9 mg de lectina (Phaseolus vulgaris) + 1mL de RPMI sin FBS.

Preparación de solución de trabajo de Lectina:

Mezclar 100 uL de Solución Stock de Lectina + 9 mL de RPMI-FBS.

Filtrar solución de trabajo de Lectina en un filtro de 0.20um (esta solución

debe tener una concentración final de 5ug/mL).

Preparación de Suspensión de Linfocitos

Separación de linfocitos:

Extraer al menos 10 mL de sangre con EDTA a un individuo sano. 10 mL de

sangre con EDTA podrían ser suficientes para llenar hasta 3 cajas de 96

pozos.

En un tubo cónico estéril de 50 mL agregar Histopaque y enseguida agregar

SUAVEMENTE sangre con EDTA en relación 1:1. Pueden ser 5mL de

Histopaque + 5 mL de sangre

NO MEZCLAR

Centrifugar 30’ a 1800 rpm (4’ en frío y 26’ a temperatura ambiente)

19

Usando pipeta Pasteur estéril con bulbo, extraer la capa de mononucleares

que queda entre el plasma y el Histopaque.

Colocar los mononucleares en un tubo nuevo estéril de 15 mL, con cuidado

de no aspirar mucha cantidad de plasma.

Procurar obtener de 2 a 3 mL de mononucleares.

Figura 3. Separación de la capa de linfocitos con Histopaque

Lavado de linfocitos:

Agregar a los mononucleares obtenidos, 3 mL de RPMI y homogenizar

suavemente con pipeta estéril.

CON MUCHO CUIDADO, mezclar los linfocitos con el RPMI.

Centrifugar a 1400 rpm por 10’ (2’ en frío y 8’ a temperatura ambiente).

Decantar sobrenadante.

Asépticamente, agregar 2 ml de RPMI, mezclar suavemente con una pipeta

Pasteur estéril.

Agregar RPMI hasta 15 mL.

Mezclar con cuidado y repetir lavado por 2 veces más. A la última

centrifugación, decantar sobrenadante, agregar 2 ml de RPMI-FBS estéril,

mezclar suavemente.

Realizar recuento de blancos haciendo dilución de 1:10.

Calcular el número de linfocitos por mL así:

Linfocitos/mL= # células en 4 cuadros X FD X 1 X 104

Ajustar la concentración de linfocitos a 5X106 cel/mL. En cada cuadrante, lo

ideal es contar 125 ± 5 para alcanzar la concentración de 5X106 cel/mL, o

bien trabajar a doble o triple de esta concentración

20

I.4.5.7.2.2 FASE II: Reto linfoproliferativo

Llenado de placa: usar placas de 96 pozos, estériles y de fondo plano, las cuales se llenan

de la síguete forma:

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B

C

D

E

F

G

H

Fila A1→A12: 100 uL de extracto de un mismo hongo.

Filas B→G: 50 uL de RPMI-FBS filtrado (estéril).

H1→H6: 50 uL de RPMI-FBS.

H7→H12: 100 uL de RPMI-FBS.

Transferir 50 uL del extracto de las filas A →G, recordar homogeneizar en

cada pozo antes de transferir.

Descartar 50 uL de toda la fila G.

A TODA LA PLACA: agregar 50 uL de solución de trabajo de Lectina

(solución de trabajo ya filtrada).

Agregar 50 uL de suspensión de Linfocitos:

Filas A →G en las columnas: 1-2, 4-5, 7-8, 10-11

H1→H6

50 uL de RPMI-FBS a las Filas A →G en las columnas: 3, 6, 9 y 12.

Sellar placas con parafilm.

Homogeneizar la placa con golpes suaves.

Incubar placas a 37ºC en microaerofilia, por 4 días.

I.4. 5.7.2.3 FASE III: Revelado de placa

Usando microscopio de luz invertida:

Los pozos sin linfocitos deben estar límpidos.

Los pozos sin linfocitos deben estar turbios y con agregados celulares

Preparar 5ml de solución de trabajo de XTT por cada placa:

Solución Stock de XTT:

Pesar 1mg de XTT por cada 1 mL de RPMI (1mg/1mL)

Mezclar. Proteger de la luz envolviendo en papel aluminio.

Preparar solución Stock de PMS protegiendo siempre de la luz:

Pesar 1.53 mg de PMS por cada 1 mL de agua destilada (esto equivale a

una concentración de 5 mM).

Mezclar, el color adecuado es amarillo. Proteger de la luz envolviendo en

papel aluminio.

21

Preparar solución de trabajo de XTT:

5mL de solución XTT +25 uL de solución de PMS, filtrar en filtro de

0.20um

Mezclar y proteger de la luz

Mezclar los pozos de la placa suavemente Y SIN FORMAR BURBUJAS.

A toda la placa: agregar 50 uL de solución de trabajo de XTT.

Incubar a 37ºC por 2H, protegiendo toda la placa de la luz.

Si se usa RPMI sin rojo de fenol, todos los pozos que contienen linfocitos

deben virar a tonos naranja.

Transcurridas las 2H de incubación, leer las placas a longitud de onda de 450

nm.

Leer una placa idéntica a la empleada en el ensayo la cual servirá de blanco.

Interpretar resultados.

I.4.5.8 Tamizaje de la actividad antibacteriana in vitro

Las bacterias son organismos de vida libre que tienen curvas de crecimiento máximo de

24 a 48 horas en medios artificiales específicamente diseñados. El tamizaje de la

actividad antibacteriana consiste en poner de manifiesto la inhibición del crecimiento de

una bacteria determinada en condiciones estándar con una concentración previamente

determinada como punto de corte (500-1000 mg/mL) de un extracto, fracción o

compuesto obtenidos de una droga vegetal.


Agar Muller Hinton

Asa de nicromo en argolla

Autoclave

Cajas de petri simples

Caldo tripticasa soya

Campana bacteriológica

Campana bacteriológica con flujo laminar

Etanol al 50%

Etanol al 70%

Incubadora a 36°C

Mechero

Pipetas automáticas

Puntas amarillas de 200 L

Puntas azules de 1000 L

Plantilla para siembra

Refrigeradora

Solución salina

Tubos con tapón de rosca de 15 mL

22


Disolución del extracto

En la balanza analítica pesar 30 mg de extracto a ensayar y disolverlo en 3

mL de etanol al 50% (hacer cálculos para determinar el volumen de extracto

necesario para realizar el ensayo).

Agitar en un vortex hasta que este bien disuelto. Si no se disuelve utilizar un

sonicador. En el caso de extractos con disolventes apolares agregar 25uL de

dimetilsulfoxido (DMSO).

Filtrar el extracto.

Filtración de extracto

Trabajar la filtración en la campana de flujo laminar (previamente limpia, ver

PEO de limpieza de campana).

Aspirar el extracto utilizando una jeringa estéril de 5 mL.

Desenroscar la aguja y enroscar en la jeringa el filtro de 0.45 um de diámetro.

En un frasco estéril recibir el filtrado haciendo pasar la disolución del

extracto por el filtro lentamente.

Preparación de Agar-Planta

Preparar tubos con 9.0 mL de agar Mueller Hinton (dos tubos por cada

extracto o compuesto a trabajar). Esterilizar a 121°C durante 15 min, dejar

enfriar a 50°C.

En una caja de petri simple agregar 1.0 mL de la solución del extracto filtrado

(este debe tener una concentración de 10 mg/mL) y los 9 mL de agar Mueller

Hinton. Tapar la caja y homogenizar con movimientos circulares. La

concentración final que se obtiene es de 1 mg/mL.

Dejar solidificar e incubar a 36°C por 24 h, para comprobar esterilidad.

Guardar en refrigeración hasta el momento de usar.

Preparación del inóculo

Purificar el microorganismo a ensayar inoculándolo en una caja de petri con

agar tripticasa soya, incubar 36°C durante 24 h.

Inocular una asada del cultivo puro microbiano en un tubo con 5.0 mL de

caldo Tripticasa soya, incubar a 36°C durante 24 h.

Diluir 0.05 mL de la suspensión anterior en 4.95 mL de solución salina estéril

al 0.85% (dilución 1:100).

Demostración de la actividad antibacteriana

Inocular en las cajas con agar-Planta una asada de cada uno de los

microorganismos siguiendo el patrón de la plantilla. Hacer cuatro repeticiones

por microorganismo. Dejar reposar durante 5-10 min e incubar a 36°C

durante 24 h.

Utilizar como control negativo 9 mL de agar Muller Hinton mezclándole 1

mL de etanol al 50%.

23

Figura 4. Placa de inoculación

Interpretación de resultados

Actividad negativa: crecimiento homogéneo a lo largo del inóculo.

Actividad positiva: no hay crecimiento homogéneo a lo largo del inóculo.

Contaminación: presencia de microorganismos fuera de la inoculación.

Figura 5. Resultados de actividad antibacteriana

I.4.5.9 Tamizaje de la actividad antimicótica in vitro

Los hongos son organismos de vida libre que tienen curvas de crecimiento máximo de 7-

28 días en medios artificiales específicamente diseñados. El tamizaje de la actividad

antimicótica consiste en evidenciar in vitro como un extracto, fracción o compuesto

derivado de una droga vegetal inhibe el crecimiento de un hongo en condiciones estándar.

Siempre y cuando se maneje una concentración previamente determinada conocida como

punto de corte (entre 500-1000 mg/mL).

24


Agar Saboraud

Agar-agar

Agitador

Alcohol al 50%

Autoclave

Cajas de petri simples

Camara de Neubauer

Campanillas de Durham

Dextrosa

Etanol al 50%

Fosfato diácido de potasio

Incubadora a 27°C

Incubadora a 37°C

Papel parafilm

Peptona




Refrigeradora

Regla graduada en milimetros

Sulfato de sodio

Tubos con tapón de rosca de 15 mL

Viales


Preparación de medio de cultivo

Preparar tubos con 13.5 mL de agar Sabouraud.

Esterilizar durante 15 minutos a 121°C, dejar enfriar a 50˚C y agregar 1.5 mL

del extracto de la planta a probar (Dilución 1:10). Agitar. La concentración

final que se tiene es de 1 mg/mL.

Verter en cajas de Petri estériles, dejar solidificar e incubar a 36˚C durante 24

horas para chequear esterilidad.

Guardar en refrigeración hasta el momento de su uso.

Preparación de inóculo

Preparar medio de Takashio (Sabouraud modificado para producción de

esporas) con los siguientes ingredientes:

Dextrosa 0.6 g

NaSO4 0.3 g

KH2PO4 0.3 g

Peptona 0.3 g

Agar-agar 6.0 g.

25

Agregarlo a 300 mL de agua, disolver, verter 6 mL en tubos con tapón de

rosca, esterilizar en autoclave y dejar solidificar con el mayor declive posible.

Incubar 48 horas a 25oC para descartar contaminación.

Sembrar en este medio los hongos a ensayar e incubar a 27˚C durante 21 días

hasta obtener un crecimiento homogéneo (aproximadamente 15 días).

Agregar a cada tubo 2 mL de agua destilada estéril y desprender el hongo con

ayuda de una varilla.

Trasvasar el material obtenido a viales con tapa de rosca. Agitar 1 minuto en

agitador y hacer un conteo de esporas en cámara de Neubauer.

Llevar la suspensión a 100 esporas/µl = 1 x 105 esporas/mL

(aproximadamente 10 esporas/cuadrante) y almacenar en viales estériles en

refrigeración.

Inoculación de hongos filamentosos en placa

Abrir cuatro agujeros en las cajas con agar-planta, con campanillas de

Durham de 5 mm de diámetro. En forma equidistante.

Tomar 30 µl de la suspensión de esporas y depositar en los agujeros. Incubar

a 27oC por 14 días.

Hacer un total de 4 repeticiones en la misma forma, usar una caja con agar

Sabouraud como control negativo.

Las cajas control constituyen cajas de agar Sabouraud (13.5 ml) con 1.5 ml de

Alcohol al 70%. Es decir que llevan el mismo procedimiento que se emplea

para realizar cajas de agar-planta solamente que en lugar de llevar la

suspensión con el extracto, llevan etanol al 70%.

Lectura e interpretación de los resultados

Medir el diámetro de la colonia del hongo en mm.

Calcular el porcentaje de inhibición, comparando el diámetro contra el de las

colonias en las cajas control.

Tomar como positivos los extractos que reducen el diámetro de la colonia en

un 75%.

Figura 6. Lectura de resultados actividad antimicótica

Caja Control con

crecimiento del

hongo

Caja de agar planta

con inhibición de

crecimiento

26

I.4.5.10 Tamizaje de la actividad antilevadura in vitro

Las levaduras son organismos de vida libre que tienen curvas de crecimiento máximo de

48-72 horas en medios artificiales específicamente diseñados. El tamizaje de la actividad

antilevadura consiste en evidenciar in vitro como un extracto, fracción o compuesto

derivado de una droga vegetal inhibe el crecimiento de un hongo levaduriforme en

condiciones estándar. Siempre y cuando se maneje una concentración previamente

determinada conocida como punto de corte (entre 500-1000 mg/mL).


Agar Muller Hinton

Agar Saboraud


Asa de nicromo en argolla

Autoclave

Cajas de petri


Etanol al 50%

Incubadora a 36°C




Refrigeradora

Solución salina isotónica

Tubos con tapón de rosca


Preparación de medio de cultivo

Preparar tubos con 9.0 mL de agar Mueller Hinton.

Esterilizar a 121°C durante 15 minutos, dejar enfriar a 50˚C y agregar 1.0

mL de extracto de la planta a probar (Dilución 1:10) Agitar. La concentración

final que se tiene es de 1 mg/mL.

Verter en cajas de Petri estériles, dejar solidificar, e incubar a 36˚C por 24

horas para chequear esterilidad.

Guardar en refrigeración hasta el momento de uso.


Sembrar la cepa en una caja con agar Sabouraud e incubar a 36˚C por 48

horas.

Tomar un inóculo del cultivo fresco, sembrar en 5 mL de caldo Tripticasa

Soya e incubar 24-48 horas. Tomar con una pipeta estéril 0.5 mL y suspender

en 4.5 mL de solución salina estéril (dilución 1:10).

Inoculación de levaduras en placa

Inocular con asa la suspensión de levaduras en cada sección según plantilla.

Incubar a 36oC durante 48 horas

27

Para el control negativo, sembrar por estrías la levadura en una caja con agar

Sabouraud.

Lectura e interpretación de los resultados




I.4.5.11 Concentración inhibitoria mínima (CIM)

Consiste en la cuantificación de la concentración mínima de un extracto, fracción o

compuesto (originado de una droga vegetal) que previene el crecimiento visible de

microorganismos, es decir, que ha demostrado su actividad en una prueba de tamizaje

previo. Para su realización se emplean diluciones seriadas del extracto y concentraciones

constantes del microorganismo y se evalúa el crecimiento del microorganismo en un

ensayo estandarizado similar al que sirvió de tamizaje.


Agar Muller Hinton

Asa de nicromo

Autoclave

Cajas de petri cuadriplate


Etanol al 50%

Incubadora a 36°C


Puntas amarillas de 200L

Puntas azules de 1000L

Refrigeradora

Solución salina isotónica

Tubos de tapón de rosca de 15 mL


Preparación de Agar-Planta

Preparar tubos con 3.6, 3.8, 3.9, 4 mL de agar Mueller-Hinton.

Esterilizar a 121°C durante 15 minutos, dejar enfriar a 50°C y agregar la

solución del extracto disuelto (concentración de 10 mg/mL) en una caja

cuadriplate de la siguiente manera:

3.6 mL de agar + 0.4 mL de la solución de extracto = 1.0 mg/mL



Un cuadrante con 4.0 mL de agar como control negativo.

Dejar solidificar e incubar a 36°C por 24 horas, para comprobar esterilidad.

Guardar en refrigeración hasta el momento de usar.

28


Purificar el microorganismo a ensayar inoculándolo en un tubo con 8 mL de

agar Muller Hinton inclinado, incubar 36°C durante 24 horas.

Inocular una asada del cultivo puro microbiano en un tubo con 5.0 mL de

caldo Tripticasa soya, incubar a 36°C durante 48 horas.

Diluir 0.05 mL de la suspensión anterior en 4.95 mL de agua solución salina

estéril (dilución 1: 100).

Demostración de la concentración inhibitoria mínima

Inocular tres estrías en cada uno de los cuadrantes de la caja e incubar a 36oC

por 24 horas. Dejar reposar durante 5-10 minutos e incubar a 36°C durante

24 horas.

Interpretación de resultados




Figura 7. Cajas cuadriplate con control negativo, diferentes concentraciones y estrías de

siembra.

I.4.5.12 Tamizaje de la actividad larvicida

Los artrópodos hematófagos (insectos) son importantes transmisores de infecciones por

protozoarios, tienen un ciclo biológico en el que presentan varios estadíos con

características morfológicas y fisiológicas diferentes. Se reproducen por ovoposición en

fuentes de agua estancada donde desarrollan varios estados larvarios. Al madurar se

transforman en insectos voladores que perpetúan la especie y mantienen la enfermedad.

Los diferentes estados de las larvas se pueden enfrentar a diluciones de extractos para

determinar su actividad larvicida en un modelo in vitro usando una concentración de 100

g/mL para el tamizaje y concentraciones decrecientes para determinar la dosis larvicida.

29


Agua de chorro

Balanza analítica

Estereóscopo

Huevos de Aedes aegypti y Anopheles albimanus

Microplacas




Vaso de precipitar de 500 mL


Cultivo de larvas de Aedes aegypti y Anopheles albimanus

Colocar en un vaso de precipitar 200 mL de agua del chorro y dejar reposar

por 48 horas.

Agregar aproximadamente 40 mg de huevecillos de Aedes aegypti y

Anopheles albimanus

Incubar por 24 horas a temperatura ambiente.

Determinación de la Citotoxicidad

En la balanza analítica pesar 1 mg del extracto a ensayar y disolver con 1 mL

de agua de chorro reposada. Disolver con un vortex.

En la microplaca agregar por triplicado (en tres pozos diferentes) 100 L del

extracto disuelto y 100 L de agua del chorro reposada con 10-15 larvas.

Para preparar en control negativo se coloca en otro pozo 200 l de agua del

chorro reposada con 10-15 larvas.

Incubar a temperatura ambiente (25-28oC) en un lugar oscuro durante 24

horas.

Contar en el estereóscopo el número de larvas muertas y determinar la CL100

(concentración letal al 100%).

Interpretación

La prueba de tamizaje es positiva si todas las larvas están muertas.

Si el % de larvas muertas es 100%, calcular la CL100, para ello repetir la

prueba utilizando dosis de 0.5, 0.15 y 0.124 mg/mL.

30

Figura 8. Larvas de Aedes aegypti y ciclo de vida

31

PARTE II

MARCO TEÓRICO

II.1 Uso de los basidiomicetos en Guatemala

En 1968 se publican varios artículos que hacen referencia a los hongos de piedra,

pequeños monolitos que habían sido descrito por Sapper en 1898 y Borhegyi en 1957 y a

los que se les atribuye concordancia en el simbolismo de algunos hongos en los códices

mayas y que sugieren un importante uso ritual por dichas culturas, principalmente por su

efecto alucinógeno (Lowy, 1968; 1971; 1972). Así mismo, se describe el conocimiento y

uso por la población quiché de A. caesarea (Lowy, 1974). Estos estudios

etnomicológicos concluyen que las poblaciones nativas de Guatemala tienen un amplio

conocimiento y uso de los basidiomicetos, considerándola una cultura micofílica (Lowy,

1975). Estudios posteriores confirman el uso de hongos alucinógenos por las culturas

nativas, juntamente con especímenes botánicos y animales conocidos por estas mismas

propiedades (Torres, 1984).

Con respecto al uso de basidiomicetos en la alimentación, el primer estudio en Guatemala

fue publicado en 1948, donde se describe la venta en mercados de Amanita caesarea,

Cantharellus cibarius y Schizophyllum commune (Sharp, 1948). En 1983 se realiza un

estudio de los macromicetos de venta en mercados de la ciudad de Guatemala y los

municipios de Mixco y San Juan Sacatepéquez, detectándose especies de Cantharellus,

Lactarius, Ramaria y Amanita (Argueta, 1983). Posteriormente, se describe una nueva

especie de hongo comestible en Chimaltenbango, Morchella guatemalensis (Guzmán et

al., 1985) y el comercio de Pseudofistulina radicata en Santiago Atitlán (Guzmán, 1987).

Un estudio importante sobre los macromicetos comestibles de venta en Guatemala fue el

realizado durante 1988-90 en las 22 cabeceras departamentales del país, en búsqueda de

lugares de venta de hongos comestibles en los mercados locales. Este amplio estudio

demostró la presencia de 18 especies correspondientes a 15 géneros de basidiomicetos,

sobresaliendo 9 géneros que fueron detectadas en varios departamentos (Sommerkamp,

1990). Durante 2001-2002 fueron recolectados 600 especímenes de hongos comestibles

en 21 comunidades de 10 departamentos del país, encontrándose los hongos detectados

anteriormente (Tabla 1) y 21 especies no descritas para Guatemala anteriormente (Bran et

al., 2003). Esta información sirvió de base para la selección de las especies de estudio en

el presente proyecto (Tabla 1).

32

Tabla 2. Principales especies de basidiomicetos comestibles detectados en Guatemala

Género Nombre popular Colectas1

Colectas2

Cantharellus cibarius Fr. Anacate 10 Si

Amanita cesarea (Scop. Ex Fr.)

Grev.

San Juan 7 Si

Ramaria botrytis (Fr.) Rick. Manitas, barbas de

conejo

7

Lactarius deliciosus (L. ex Fr.)

S.F.Gray

Shara, cabeza de shara 5 Otras

especies

Agaricus campestres (L. ex Fr. Hongo de mayo, hongo

blanco

4 Si

Pseudofistulina radicata (Schw.) Fr. Hongo de guachipilín 3

Schizophyllum radicata (Schw.)

Burd.

Orejita de palo 2

Boletus edulis Bull. Ex Fr. Pancita 2 Si

Russula lepida Fr., R. virescens Fr. Guacamaya 2 Otra especie

Laccaria major G.M.Mueller Si

Pleurotus ostreatus Pleurotus, hongo ostra Otra especie Fuente:

1 número de departamentos de Guatemala en los que se detectaron según Sommerkamp Y (1990)

Cuaderno DIGI No. 3-90; 2Bran MC et al. (2003) Rev. Cient. Ed Esp. 1(1):5-24

Finalmente es de mencionar que también han sido detectadas algunas intoxicaciones por

la ingestión de hongos, reportándose casos mortales de envenenamiento por hongos

tóxicos (Logemann et al., 1987).

II.2 Los basidiomicetos como inmunomoduladores y biocidas

El uso medicinal de los basidiomicetos ha sido descrito desde la antigüedad. La medicina

tradicional china atribuye propiedades medicinales a varios hongos, describiéndose en el

Pen Ts’ao al menos 16 especies de hongos medicinales [reishi (Ganoderma lucidum),

shiitake (Lentinula edodes), maitake y otros] que son los mejor estudiados. En Occidente,

Plinio recetaba el agárico (Agaricus albus) y Discórides la quinina conk (Fomitopsis

officinalis) como antídotos contra venenos (Hobbs, 1995).

En un estudio reciente de los hongos medicinales sobresale la actividad adaptógena,

inmunomoduladora e inhibidora de la hormona de crecimiento, sobre todo por los

heteropolisacáridos de alto peso molecular.

El concepto de adaptógeno e inmunomodulador, se define como modificador de

respuestas biológicas, su aplicación no debe causar daño o estrés al cuerpo, de ayudar a

adaptarse a los cambiantes retos ambientales y psicológicos y debe tener una acción no

específica, apoyando los sistemas mayores (nervioso, hormonal e inmune) y regulando

funciones fisiológicas.

33

La principal línea de investigación ha sido la actividad inmunomoduladora de las

citocinas, las que tienen efectos sistémicos y locales y juegan un papel importante en el

control de las infecciones.

II.2.1 Interferón: El interferón-α (IFγ) obtenido de suero humano y leucocitos, se

utiliza para tratar leucemia de células peludas, condiloma acuminata causado por el virus

de papiloma humano y el sarcoma de Kaposi en pacientes con VIH. IFα-2A esta

registrado para el tratamiento de la hepatitis B crónica activa y de las infecciones por

hepatitis C, sin embargo solo el 40% de pacientes con hepatitis C responden a esta

terapia. El IFβ obtenido de líneas celulares de fibroblastos FS-4 se utiliza para

enfermedades severas mediadas por virus, así como infecciones virales del oído interno

con pérdida de la audición y está registrado para el tratamiento de esclerosis múltiple. El

IFγ es un potente factor activador de macrófagos, numerosos estudios han demostrado

que confiere protección contra Listeria monocytogens, Francisella tularensis,

Toxoplasma gondii, Pneumocystis carinii, Plasmodium falciparum, Chlamydia

trachomatis, Rickettsia conorii, Paracccidioides brasiliensis y Shigella flexneri (Masihi

et al., 2000).

II.2.2 Factor de necrosis tumoral y estimulador de colonias: Se ha demostrado que

mejoran la actividad contra los virus de encefalomiocarditis, estomatitis vesicular y

sincitial respiratorio. Confiere pro-tección contra Klebsiella pneumoniae, Streptococcus

pneumoniae, Legionella pneumophila, salmone-losis, L. monocytogenes y

Mycobacterium avium. Inhibe infecciones experimentales con especies de Plasmodium,

leishamiasis cutánea, Trypanosoma cruzi y T. gondii en ratones. Están involucrados en la

producción y diferenciación de células de la médula ósea. Se ha demostrado que el M-

CSF induce resistencia contra el virus de la estomatitis vesicular, herpes simple, L.

monocytogenes y Candida albicans; G-CSF estimula la resistencia a infecciones por

Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Serratia marcescens, L. moncytogenes

y C. albicans diseminada (Masihi et al., 2000).

II.2.3 Interleucinas: El tratamiento con IL-1α aumenta la resistencia a infecciones

letales por Brucella abortus, K. pneumoniae, L. monocytogenes, Salmonella

typhimurium, P. aeruginosa y C. albicans en ratones normales y neutropénicos. IL-12

posee actividad protectoras contra Leishmania donovani, L. mayor y L. amazonesnsis;

prolonga la sobrevida de ratones SCID inmunodeficientes infectados con Histoplasma

capsultaum o T. gondii y es critica para la resolución de infección pulmonar por L.

pneumophila. Alivia la anemia inducida por la malaria, inhibe la replicación temprana del

virus de la influenza y cuando se administra intranasalmente con la vacuna de la

influenza, aumenta la sobre-vida luego de un reto letal por el virus de la influenza. La

IL-15 se ha mostrado que sobre regula la respuesta contra C. albicans (Masihi et al.,

2000).

II.2.4 Respuesta celular: Los polisacáridos exhiben efectos terapéuticos por

mecanismos de modulación de la respuesta innata y la proliferación y función de

macrófagos (Masihi et al., 2000). La inyección IV de lentinano aumenta el número

absoluto de monocitos en sangre periférica y el de células progeni-nitoras de macrófago-

34

granulocito en el bazo y médula ósea. El eschizofilano induce la expresión del MSF en

cultivos de médula ósea (Schepetkin & Quinn, 2006). Bao et al. (2001) aislaron esporas

de G. lucidum y sintetizaron seis diferentes derivados del (1→3)-α-D-glucano; los efectos

inmunológi-cos se evaluaron a través de la determinación de su efecto mitógeno en

linfocitos in vivo e in vitro. El estudio demostró que a menor grado de sustitución del

derivado, mayor actividad mitógena presenta-ba el polisacárido, es decir que estimulaba

la proliferación de linfocitos T y B. Los polisacáridos sintetizados más solubles en agua

y con menos sustitución con un grupo carboximetil, son los de elección para estimular

mitogénesis en linfocitos. El polisacárido SHE es un agente inmunomodu-lador aislado

de Salicornia herbacea. Es utilizado con eficiencia en fitomedicamentos por su capa-

cidad de activar a los monocitos e inducir la diferenciación de monocitos a macrófagos.

El efecto de este polisacárido fue medido por Im et al. (2006), usando cultivos de células

RAW de ratones en los que se determinó que la presencia de SHE las activa para que

produzcan citoquinas como TNF-β e IL-1α; los cuales son mediadores en la fagocitosis

de LPS de bacterias y NO el cual puede ser un indicador cuantitativo de la activación de

los macrófagos.

II.2.5 Respuesta humoral: Se han realizado estudios sobre su efecto inmunomodulador

sobre la respuesta humoral, uno de estos fue el desarrollado por Babakhin, quien estudió

la masa micelial del hongo Polyporus squamosus (DPS) como inmunomodulador de la

respuesta IgE (anafilaxis cutánea pasiva) e IgG (ELISA) a la ovoalbúmina (OA) in vivo.

Para esto se utilizaron ratones FI (CBAxC57BL/6). Inyecciones múltiples de DPS en

dosis de 1.5, 15 y 150 mg/Kg, antes de la inmunización primaria o secundaria del ratón

con OA, resultaron en una inhibición dependiente de dosis de ambas respuestas de

anticuerpos. Mientras que la respuesta IgE anti-OA fue suprimida durante todo el

periodo de observación, la respuesta anti-OA IgG fue restaurada al nivel control a la

tercera semana de la inmunización secundaria. Se observó que DPS en diferentes

concentraciones no influenciaron la liberación de histamina de los basófilos de sangre

completa inducida por anti-IgE o alérgenos específicos. Utilizando la metodología

hemolítica de placa, se demostró una supresión significativa de formación de células

IgM-secretoras en ratones F1(CBAxC57BL/6) tratados con diferentes dosis de DPS antes

de la inmunización. DPS inhibió la proliferación in vitro de células humanas

mononucleares sobre-estimulación con PHA. DPS también inhibió, de forma dosis

dependiente, reacción de hipersensibilidad de tipo tardío y reacción GRAFL en la piel,

similar al efecto de la ciclosporina en ratones F1 (CBAxC57BL/6) (Babakhin et al.,

1997].

Ha et al. (2003) alimentaron ratones hembras de 5 semanas de edad a con una dieta que

contenía 0, 0.5, 1, 3 y 5% de micelio de G. lucidum. Luego fueron inmunizadas con 5 μg

de la toxina cólera en los días 7 y 21 de su dieta. La IgA total y específica IgA anti-CT

(antitoxina-cólera) fueron medidas a partir de lavados luminales del intestino delgado,

suero y deposiciones fecales. La respuesta inmune en suero hacia la IgG anti-CT fue

medida por ELISA. Los niveles totales de IgA no se encontraron afectados por la ingesta

del micelio a excepción de la muestra de suero. En contraste, la respuesta de IgA anti-CT

fue reducida en todos las muestras tomadas de los ratones que fueron alimentados con la

dieta conteniendo el micelio a excepción de los las muestras de lavado luminar de

35

intestino delgado de los ratones que tenían dieta de 5% de micelio. La respuesta de IgG

anti-CT del suero fue disminuida únicamente en ratones alimentados con dieta de 3% de

micelio y llegaron a la conclusión que el micelio de G. lucidum reduce la respuesta de

IgA específica de la mucosa en ratones adultos jóvenes inmunizados con la toxina cólera.

II.2.6 Respuesta de citocinas y agentes vasoactivos: Jun-Ho & Yang (1999)

determinaron la presencia de agentes fibrinolíticos en Armillariella mellea, un hongo

comestible de cuyos cuerpos fructíferos se aisló una metaloproteasa capaz de lisar las

cadenas Aα y Bβ del fibrinógeno humano. Los resultados revelaron que la enzima

purificada posee actividad de plasmina y no de activador del plasminógeno. Se observó

que la estabilidad de la enzima se alcanza a pH 7 a 20-80ºC; exhibió inhibición bajo

efectos de EDTA y 1,10-pentantrolina indicando que se trata de una metaloproteasa. No

se observó inhibición por 2-ME y el Hg fue el metal que ejerció inhibición total a

concentración de 1mM. La enzima aislada también mostró actividad fibrinolítica en las

cadenas Aα y Bβ del fibrinógeno humano con la misma eficacia. Estos resultados

indican que la enzima purificada es candidata para ser usada como terapia oral

fibrinolítica. Los polisacáridos aislados de G. frondosa aumentan la producción de IL-2

en pacientes con cáncer de pulmón e hígado como resultado de la activación de

macrófagos (Schepetkin & Quinn, 2006). Kuo et al. (2006) reportaron que G. lucidum

induce la liberación de TNF-α e IL-6 en la sangre. Chen et al. (2004) determinaron por

medio de el uso de ELISA que la fracción F3, de los polisacáridos de G. lucidum, activa

la expresión de IL-1, IL6, IL-12, IFN-γ, TNF-α, GM-CSF, G-CSF y M-CSF, la fracción

F3G1 activa la IL-1, IL-12, TNF-α y G-CSF, F3G2 activa las mismas citocinas que F3 y

F3G3 activa únicamente a IL-1 y TNF-α.

También puede inhibirse la liberación de citocinas. Se determinó que los polisacáridos de

G. lucidum reparan los tejidos ulcerosos de las ratas utilizadas, mediante la inducción de

la ornitina descarboxilasa y la supresión de el FNT-α (Gao et al., 2002). Se encontró que

el extracto acuoso de H. monachella inhibe la liberación de prostaglandina por leucocitos

de rata in vitro (Li et al., 2005).

II.2.7 Efectos radioprotectores: La actividad monocitopoyética de los derivados

polisacáridos fúngicos se ha sugerido que contribuye con efectos radioprotectores. El

tratamiento de ratones con PG101, una fracción soluble en agua aislada del micelio de

Lentinus lepideus, mantiene el número de unidades formadoras de colonias en la médula

ósea irradiada a un nivel similar al no irradiado (Masihi et al., 2000). Lin et al. (2004)

demostraron la utilidad de los hongos comestibles como coadyuvantes en ciertas terapias

por ser hematopoyéticas. La doxorrubricina (DOX), un medicamento quimiotera-péutico

que causa daño a la médula ósea de forma dosis-dependiente, suprime la hematopoyesis

lo cual provoca anemia, linfopenia, trombocitopenia y granulocitopenia. Diferentes

factores de creci-miento y citocinas se han desarrollado para estimular la hematopoyesis

y recuperar los niveles periféricos de los granulocitos luego de la quimioterapia. Se han

aislado glucanos de hongos y bacterias que podrían apoyar directamente la

hematopoyesis aumentando la producción de citocinas.

36

El estudio de Lin et al. (2004) pretendía determinar la factibilidad de utilizar el extracto

de los cuerpos fructíferos de G. frondosa (MDF) como protector de las células madre de

la médula ósea ante la acción de DOX así como determinar si posee la capacidad de

aumentar la recuperación de células progenitoras hematopoyéticas luego de una

depleción por DOX. Para ello, se evaluó la respuesta y efecto dependiente de la dosis en

la médula ósea de ratones, suprimidas utilizando DOX. Se observó que el MDF causa el

incremento de la respuesta CFU-GM de progenitores BMC y la recuperación de la

respuesta CFU-GM luego de la inducción de supresión hematopoyética por DOX, lo cual

demuestra que la toxicidad de DOX en la médula ósea es atenuada por MDF.

II.2.8 Efectos hepatoprotectores: Armillariella tabescens, Artodia camphorat y G.

lucidum demostraron ser hepatoprotectoras al poseer una acción detoxificante sobre la

aflatoxima B1 (AF B1) producida por mohos como Aspergillus flavus y A. parasiticus,

cuya ingestión se produce por los alimentos y está relacionada con cáncer hepático. La

detoxificación de AF B1 se lleva a cabo a través del aislamiento multienzimático de los

extractos (Lu et al., 1998). Liu et al. (2001) realizaron un trabajo para purificar y

caracterizar la enzima ADTZ (Aflatoxina detoxificina) de A. tabescens encargada de

efectuar la actividad detoxificante. Liu et al. (2001) demostraron la efectividad de las

multienzimas de A. tabescens para detoxificar AF B1. Se demostró el efecto

hepatoprotector de A. camphorat mediante un bioensayo utilizando ratas sometidas a

intoxicación por ingestión aguda de etanol. Los datos histológicos de los hígados de las

ratas tratadas con micelio de ambos hongos revelaron tejido cercano a lo normal. El

extracto etanólico de G. lucidum se ha reconocido también como un hepatoprotector, que

puede atribuirse a los polisacáridos de la fracción acuosa y triterpenos de la fracción

alcohólica (Lu et al., 1998; Liu et al., 2001).

II.2.9 Efectos anti-infecciosos: G. lucidum se ha estudiado por su actividad antiviral y

antibacteriana. Otra especie del género, G. tsugae, fue estudiada por su actividad

antiasmática si se consume como suplemento dietario. Se han estudiado también las

actividades de proteínas, péptidos, aminoácidos, nucleósidos, nucleótidos, ARNs,

alcaloides, vitaminas, minerales esenciales, ácidos grasos y sabores; encontrando que

éstos también jugar un papel en la regulación del sistema inmune. Las propiedades

farmacológicas de este hongo se han investigado para determinar si es tóxica o no; y de

serlo, las cantidades y componentes responsables, el cual es un aspecto importante de los

agentes medicinales. Se consume tradicionalmente en formas acuosas cocinadas (sopas,

tes) por lo cual se ha trabajado con el extracto acuoso (Lin et al., 2006; Müller et al.,

2006).

II.2.10 Efectos anticancerígenos: El número de pacientes con cáncer utilizando

suplementos dietarios herbales ha aumentado en la actualidad, por ejemplo, es

recomendado su uso como complemento de las terapias ya aplicadas en pacientes con

cáncer colorectal avanzado (Liu et al., 2007). Se ha enfatizando el uso de constituyentes

dietarios para prevenir la mutagénesis y carcinogénesis por que éstos poseen efectos no

tóxicos. Ha aumenta-do el interés por identificar factores de la dieta que se encuentra

naturalmente presentes en los alimentos y que pueden actuar como anticarcinogénicos

37

potenciales. Los hongos comestibles pueden poseer moléculas con diferentes efectos que

en consecuencia actúan como anticancerígenos.

El hongo más estudiado por su actividad antitumoral es G. lucidum. La investigación se

ha centrado en dos puntos principales: la determinación de las líneas celulares malignas

contra las cuales el hongo tiene acción y la identificación de los compuestos y

mecanismos causantes de la acción, involucrando a los polisacáridos como los

responsables del efecto antitumoral (Kuo et al., 2006). Estos componentes biológicos que

tienen la capacidad de inhibir el crecimiento de células cancerosas y metástasis, son

polisacáridos del extracto acuoso (β-D-glucanos) y triterpenos y su acción se lleva a cabo

por la modulación del sistema inmune, la detención del ciclo celular, disparando la

apoptosis y suprimiendo la angiogénesis (Johnston, 2005). El extracto alcohólico y la

fracción triterpénica de dicho hongo poseen efecto antitumoral a consecuencia de

actividad citotóxica sobre células tumorales; mientras que múltiples estudios confirman

que polisacáridos antitumorales no poseen citotoxicidad directa contra las células

tumorales, sino que muestran profundos efectos inmunomoduladores en el hospedero (Lu

et al., 2004; Kou et al., 2006).

Se han propuesto mecanismos diferentes y complementarios a la modulación del sistema

inmune por los cuales extractos de G. lucidum son capaces de inhibir o disminuir la

proliferación de células cancerígenas; una de ellas es evitando la adhesión de las células

malignas y otra la producción de citocinas. Wu et al. (2006) examinaron los efectos de

diferentes preparaciones de esporas de G. lucidum en la adhesión de células malignas del

carcinoma de pecho humano al tratar monocapas celulares. El experimento indicó que G.

lucidum inhibe la adhesión de las células cancerosas a diferentes niveles. Los

polisacáridos aislados de cuerpos fructíferos que crecieron sobre leños de madera,

exhibieron la mayor actividad inhibitoria de la adhesión celular, un efecto que es

dependiente de la concentración. Los polisacáridos purificados también exhibieron

inhibición de la adhesión celular en varios modelos de matrices moleculares. Un análisis

con Western Blot indicó que la expresión de la 1-integrina fue reducida grandemente,

mientras la expresión de β-actina no fue afectada, lo que sugiere una actividad específica

de los productos de G. lucidum sobre la 1-integrina.

Lakshmi et al. (2006) determinaron la actividad antimutagénica in vivo, de extractos

metabólicos de cuerpos fructíferos de G. lucidum. También evaluaron la

antimutagenicidad in vitro así como el efecto del extracto sobre las fosfatasas alcalinas y

transaminasas a consecuencia de la actividad de benzo [α]pireno. El benzo [α]pireno es

un compuesto que puede atacar las macromoléculas celulares como UNAM RNA,

proteínas y membranas, causando disfunción y daño celular. Los resultados de este

estudio revelaron que el extracto metanólico de G. lucidum es capaz de disminuir los

niveles de mutagénesis inducidos por este compuesto.

Se ha estudiado el efecto de los polisacáridos de PG-S en la función de macrófagos y

linfocitos T y en el crecimiento de células leucémicas. Demostraron que el polisacárido

posee un fuerte efecto estimulador en ambas células para promover la síntesis y

liberación de varias citocinas (IL-1 β, IL-6, IFN-γ , TNFα); las cuales son importantes

para montar una respuesta antitumoral mediada por células efectivas. PG-S y el medio de

38

cultivo de células mononucleares normales no tuvieron actividad tumoricida, pero el

medio condicionado para células mononucleares activadas con PSG inhibieron

fuertemente el crecimiento de células leucémicas. Anticuerpos neutralizantes de IFN γ y

TNFα resaltaron grandemente la inhibición del crecimiento de células tumorales

inducidos por células mononucleares activadas por PSG de medio condicionado. Esto

confirma que la actividad antitumoral de estas últimas fue derivada principalmente de las

citocinas elevadas, especialmente IFN γ y TNFα que indujeron apoptosis y

diferenciación celular en líneas celulares leucémicas tratadas con PSG (Lu et al., 2004).

Los estudios realizados indican que G. lucidum posee acción sobre una gran cantidad de

líneas celulares. Las propiedades antitumorales del cuerpo fructífero, esporas y micelio,

así como los extractos pueden atribuirse a sus diversos constituyentes químicos y puede

implicar su uso como un quimiopreventivo o como agente terapéutico potencial. Los

polisacáridos aislados potencian la producción de citocinas, las cuales suprimen la

proliferación de células leucémicas HL-60 y U937. Müller et al. (2006) analizaron estas

líneas celulares además de Blin-1 y RPMI8226 para apoptosis mediada por G. lucidum

dependiente de dosis y descubrieron que induce apoptosis dependiente de dosis en todas

las líneas celulares analizadas. La habilidad de G. lucidum de alterar la transmembrana

mitocondrial se investigó en células mieloides HL-60 y U937. Se observó una

disminución del potencial de la membrana mitocondrial dependiente de la dosis. El

Western blot mostró un incremento de la proteína p21WAF1

dependiente de la dosis y el

tiempo, comparadas con células U937 tratadas, respecto a las células control. La

preparación de citospina y la tinción a 13 líneas celulares demostró que causa

multinucleación prominente en las células HL-60 y demostró ser capaz de disminuir el

crecimiento de células de sarcoma en ratones y de inducir la expresión de IL1, IL-6,

INFγ, TNFα, GM-CSF, F-CSF, M-CSF en monocitos, macrófagos y linfocitos T. Kim et

al. (2006) estudiaron si G. lucidum y D. chrysantha eran capaces de aumentar el efecto de

apoptosis e inhibición en el crecimiento de células leucémicas HL-60, a través de

compuestos con actividad antitumoral. Los resultados muestran que ambos extractos

individualmente empleados impidieron el crecimiento clonal de células leucémicas HL-

60 a concentraciones específicas (Lu et al., 2004; Müller et al., 2006; Kim et al., 2006;

Liu et al., 2007).

Se han aislado triterpenos de extractos alcohólicos y de la fracción etil acetato de los que

aproximadamente 20 de diversa naturaleza química han mostrado citotoxidad contra un

panel de líneas celulares de tumores humanos y murinos. Los triterpenos pueden inhibir

el crecimiento de células de hematoma Huh-7; además inhibe el crecimiento primario y

metástasis de células de carcinoma de pulmón de Lewis insertadas en ratón (Bao et al.,

2001; Lin et al., 2004).

El extracto alcohólico del cuerpo fructífero de G. lucidum inhibe la proliferación de

células MCF-7 de cáncer de seno a través de la regulación positiva de p21 y de

regulación negativa de la ciclina d1 lo que induce abortos. Los resultados indican que los

extractos son capaces de inhibir el crecimiento y migración in vitro de células

cancerigenas de vejiga humana. Otros estudios indican que G. lucidum inhibe el

crecimiento de líneas celulares cancerígenas tales como células PC-3 de la próstata. Se ha

39

reportado que de forma dependiente del tiempo y dosis, inhibe la proliferación celular e

induce apoptosis de HT-29, una línea celular de carcinoma de colon humano y MDA-

MB-231 y MCF-7 líneas celulares de cáncer de seno, así como actividad antitumoral en

el cáncer colorectal (Lu et al., 2004; Müller et al., 2006; Russell & Paterson, 2006). De

los cuerpos fructíferos de Ganoderma amboiense se aisló el ácido ganodérico X (GAX),

uno de los componentes más potentes. Las células HuH-

durante 24 horas disminu-yeron en un 50% y mostraron menos tumorigenicidad,

sugiriendo que GAX promueve eficientemente la muerte de células cancerígenas que

además, manifestaron la deflación típica de la apoptosis. Li et al. (2005) sugieren que G.

lucidum posee su efecto anticancerígeno mediado por apoptosis.

La fracción D de G. frondosa, una glicoproteína con seis cadenas principales β-1,

frecuentemente unidos con β-1, muestra efectos antitumorales mediante la activación de

células inmunocompetentes. Se ha sugerido que la destrucción tumoral también es

inducida por la infiltración celular local del tumor. Matsui et al. (2001) descubrieron que

la fracción D induce la angiogénesis in vivo y engrandece la capacidad de migración y

proliferación de la células normales HVEC in vitro. Los extractos solubles en etanol de

Lentinula edodes disminuyeron significantemente la proliferación de células CH72 de

carcinoma de piel de ratón, redujeron la proliferación celular e indujeron la apoptosis en

relación dependiente de tiempo y dosis en células de carcinoma pero no tiene efecto sobre

las células no tumorales C50.

II.3 Composición química de los basidiomicetos

II.3.1 Polisacáridos: Los polisacáridos aislados de fuentes botánicas (hongos, algas,

líquenes y plantas superiores) han cobrado importancia debido a su amplio espectro de

propiedades terapéuticas y su relativa baja toxicidad. Se ha aislado una gran cantidad de

polisacáridos inmunoestimuladores con diferente estructura química. La mayoría de

estos polisacáridos son β-glucanos, tales como lentinan de L. edodes, eschizophillano de

Schizophyllum commune, kresitna de Coriolus versicolor, grifolan de G. frondosa y

escleroglucano de Sclerotinia sclerotiorum. Formas modificadas de los mismos, más

solubles, mejoran las actividades microbicidas de los neutrófilos y macrófagos pero

carecen de efectos activadores directos; por lo tanto, aumentan la defensa del hospedero

mediante leucocitos, sin activar completamente estas células, lo que los ha reconocido

como un inmunomodulador útil. Estos compuestos han demostrado que reducen los

porcentajes de infecciones postoperación y reducen el tiempo de hospitalización en

ensayos clínicos (Schepetkin & Quinn, 2006).

Los principales polisacáridos asociados con la inmunomodulación son los glucanos. Se

ha reconocido una gran cantidad de receptores en células inmunes que reconocen y unen

β-glucanos. El poli-(1-6)--glucotriosil-(1–3)--glucopiranoseglucano (PGG-glucano) se

deriva de la pared celular de las levaduras. Se ha administrado a pacientes quirúrgicos

con alto riesgo de infecciones postoperativas para reducir significativamente las

complicaciones infecciosas, disminuir la necesidad de antibiótico administrado por vía

intravenosa y disminución de estadía en la unidad de cuidados intensivos. En un estudio

se demostró que la administración de PGG-glucano, disminuían las infecciones post-

operativas serias o la tasa de mortalidad en un 39% (Misihi et al., 2000).

40

El lentinano es un 1-3-β-glucano que se utiliza en Japón como adyuvante en la terapia

antitumoral; se ha demostrado que puede conferir protección contra el virus de la

influenza, Listeria y prevenir recaídas de M. tuberculosis. Glucanos de levaduras podrían

aumentar la resistencia contra el virus del herpes simple (I y II) y de la hepatitis murina,

inducir respuesta no específica contra infecciones por K. pneumoniae y proteger a

pacientes de sepsis, bacteremia y peritonitis causadas por Escherichia coli, S. aureus y P.

aeruginosa. Se ha sugerido que pueden prolongar la sobrevivencia contra las infecciones

por Plasmodium berghei y L. donovani y reforzar la respuesta antifúngica contra

Candida, Cryptococcus y Sporotichum. Polisacáridos sulfatados, tales como el sulfato de

curdlano han mostrado mejorar la actividad inhibitoria de la replicación del VIH (Misihi

et al., 2000).

II.3.2 Lípidos: Los lípidos de los macromicetos han sido poco estudiados desde los

trabajos iniciales en Agaricus bisporus por Byrne & Brennan (1975) y los estudios

estructurales de sus basidiolípidos derivados (Jennemann et al., 1999). El estudio de la

estructura química de los lípidos de seis basidiomicetos comestibles demostró que son

bastante similares, correspondiendo a glicoinositol-fosfofingolípidos del tipo de

ceramidas (Jennemann et al., 2001). Algunos hongos presentan lectinas con actividades

reguladoras del crecimiento, como proliferativas o antiproliferativas, lo que podría

indicar una actividad reguladora de la linfoproliferación (Wang et al., 2003).

II.4 Información de los basidiomicetos comestibles del estudio

II.4.1 Amanita cesarea (Scop. Ex Fr.) Grev.

Nombre popular: Hongo de San Juan

Descripción: Hongo de píleo de 7-20 cm de diámetro, convexo a plano, subviscoso, liso,

carnoso, margen estriado, amarillo-anaranjado o anaranjado-rojizo, de láminas

subadheridas con bordes ligeramente aserrados, amarillas o amarillentas. Posee anillo

bien definido, membranoso, colgante y amarillo. De estípite de 5-15 cm de largo, liso o

subescamoso, hueco, blanco a amarillento. Presenta volva gruesa, blanca, prominente,

con bordes libres. contexto tierno y blanco; sabor y olor desagradables. Esporada

blanca. La volva se pierde en los ejemplares de mercado pues los recolectores la

eliminan al colectarlo. El anillo puede descolgarse por la forma de la recolecta o

transporte al mercado. Crece en bosques de pinos y de encinos (Sommerkamp, 1990).

Hábitat y distribución: Crece en bosque de pino y encino (Sommerkamp, 1990).

Usos populares: Hongo altamente apetecido por su delicioso sabor. De venta en

mercados.

Estudios farmacológicos y composición química: No se encontró información.

II.4.2 Boletus edulis Bull. ex Fr. (Boletaceae)

Nombre popular: Rusemit kuk (semita de ardilla), boleto comestible

Descripción: Píleo de 8-15 cm de diámetro, convexo, superficie lisa, seca. Color crema,

café pálido o café canela. Himenio poroso, adherido o deprimido, blanco a amarillo

oliváceo, con poros circulares, pequeños a medianos. Estípite de 5-8 cm de alto por 1.5-5

cm de grosor, claviforme a bulboso, reticulado, blanco o de color café canela pálido. Su

olor es agradable y su sabor es dulce. Posee esporas de 9-12 x 4-6 µm , fusiformes a

elipsoidales, lisas y amiloides (Herrera, 1991) .

41

Hábitat y distribución: Crecen en bosques de Pinus-Quercus, con más de 550 mm de

precipitación pluvial anual. Se ha encontrado a la venta en varios mercados del país,

incluyendo, La Terminal zona 4 (Ciudad de Guatemala) y mercado de Chimaltenango. Es

uno de los hongos que más frecuente-mente se encuentran en Mixco y San Juan

Sacatepéquez (Argueta, 1983; Herrera, 1991).

Usos populares: Es uno de los hongos más apreciados en la cocina internacional,

principalmente la francesa e italiana. En Guatemala son igualmente apreciados.

II.4.3 Cantharellus cibarius Fr.

Nombre popular: Anacate; cantarula; q’axul (flauta amarilla, idioma Kaqchikel); q’axuul

(flauta amarilla en idioma K’iche); kanxul (flauta amarilla en idioma Chuj) y xuul (flauta,

en idioma Mam)

Descripción: Presentan color naranja o amarillo en todo el carpóforo. Se caracteriza por

poseer un buen sabor, afrutado y un poco picante; aroma delicado a durazno. Su

sombrero o píleo mide de 42-100 mm de diámetro, es plano convexo de superficie lisa a

finamente fibrilosa y cerosa, posee margen ondulado o lobulado y encorvado, de 3-9 cm

de diámetro. Color amarillo 68/A

en el centro, que se aclara a un tono amarillo 56/A

hacia el

margen. Contexto de 10 mm de grosor, consistencia carnosa-esponjosa color amarillo

pálido 52/A

. Posee venas decurrentes, anastomosadas, de hasta 5 mm de altura, superficie

cerosa, color amarillo opaco 58/A

. Pie o estípite sólido, cónico, inclinado de 47-70 mm de

largo. Primero es convexo, después extendido y más tarde deprimido en el centro, para

acabar en forma de embudo. Su superficie es cerosa y de color amarillo 58/A

. Esporada de

color amarillo intenso. Las esporas miden de 7.0-9.0 x 5.0-6.0 μm; tienen forma elípticas,

apiculadas, con pared lisa, inamiloides y hialinas pero con contenido refringente

multigutulado. Posee basidios de 55-110 por 7-9 µm de diámetro con abundantes fíbulas

(Bran et al., 2003).

Reacciones microquímicas: KOH (3%), NaOH (5%), Fenol y H2SO4 (30%): Negativo en

todas las estructuras. Melzer: cambia a color verde y café en la superficie del píleo (Bran

et al., 2003).

Hábitat y distribución: Es un hongo micorrizógeno que vive asociado a planifolios y

coníferas. Su distribución es extensa en los bosques de Pinus y Pinus-Quercus

(Sommerkamp, 1990; Bran et al., 2003).

Usos: Es un hongo ampliamente usado en Guatemala como alimento, muy conocido,

apreciado y de venta en mercados, inclusive en las calles (Sommerkamp, 1990; Bran et

al., 2003).

Características nutricionales: Contiene un 21.5% de proteína, 5% de grasas, 64.9% de

carbohidratos, 11.2% de fibra y 8.6% de cenizas. Contiene aminoácidos esenciales como

isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptófano y valina. En el

carpóforo se ha encontrado la presencia de vitamina A. Cuando está fresco, contiene

entre un 87-90% de humedad, un 3.7-5% de nitrógeno en peso seco. Sus proteínas son de

alta digestibilidad, lo que aumenta con el cocimiento. El análisis de aminoácidos

demostró que posee todos los aminoácidos esenciales aunque algunos en bajas

cantidades, siendo el más limitante el triptófano; el ácido glutámico es el aminoácido más

abundante. Poseen fibra en mayor cantidad que la presente en otros alimentos

consumidos por la población guatemalteca (Pérez, 1990).

42

Propiedades farmacológicas: Wang et al. (2003) purificaron un péptido tipo ubiquitina,

con actividad ribonucleótida. Wang & Ng (2004) aislaron una enzima lacasa dimérica,

una clase de enzimas lignolítica que poseen aplicaciones en biotecnología.

II.4.4 Lactarius deliciosus (L. ex Fr.) S.F.Gray

Nombre popular: Lactario delicioso, níscalo, hongo de pino, hongo royo, rovellón, seta

de cardenillo, senderilla, senderuela, seta de los corros de bruja y ninfa.

Descripción: Píleo de 4-10 centímetros de diámetro, convexo y a veces deprimido en el

centro, con el margen enrollado hacia abajo, pudiendo extenderse, liso, víscido al estar

húmedo, secándose rápidamente; anaranjado-amarillento con círculos concéntricos más

oscuros. Lámionas apretadas, delgadas, adnadas y algo decurrentes, anaranjado-

amarillentas, se manchan de verde al lastimarse. El estípite es de 2-5 centímetros de

largo, firme, grueso, cilíndrico y poco atenuado en la base, huevo con la edad, anaranjado

pálido. El contexto es duro, compacto, blanco-anaranjado y al corte segrega un látex

anaranjado que cambia a verde al contacto con el aire. La esporada es blanca cremosa.

Las esporas son de 7-10 por 6-8 µm, redondas o poco elípticas y ornamentadas

(Sommerkamp, 1990).

Hábitat y distribución: Ampliamente distribuido en el mundo; sus especies son conocidas

por ser ectomicorrícicas. Es un género de importancia actual no sólo por su función

micorrícica sino por la producción de setas comestibles. Se encuentra distribuido en

muchas partes del planeta, especialmente en el Hemisferio Norte, en el Geotrópico, Sur-

Este de Asia, Oceanía. Se encuentran en África y en América del Sur por su dispersión

evolutiva o por introducción del hombre. Del género se reportan al menos 16 especies en

Guatemala, la mayor parte asociada a pinos (L. deliciosus, L. indigo, L. salmoneus var.

salmoneus, L. subpurpureus), encinos (L. chrysorrheus, L. torminosus, L. fragilis, L.

piperatus, L .rimosellus, L. volemus var. volemus) abetos (L. mexicanus, L. salmonicolor,

L. uvidus).

Usos populares: En Guatemala existe una gran demanda para su consumo, ya que es un

hongo silvestre de fácil recolección, lo cual facilita su obtención y venta. Es muy

frecuente su venta en épocas de fructificación que van de mayo a noviembre.

Estudios farmacológicos: A pesar de su alto consumo como alimento, se conoce poco

sobre su actividad farmacológica, ya que a nivel mundial los estudios han sido enfocados

en caracterización ectomicorrícica durante las fases de formación micelial, así como de

sus metabolitos.

Composición química: Su análisis proximal en peso seco indica; Proteína total 27.42%,

grasa 6.72%, carbohidratos 27.6% y cenizas 5.92%. Entre sus metabolitos mas

caracterizados están las lectinas, sesquiterpenos con actividad antioxidante, e isomerasas

presentes en la biosíntesis de terpenoides.

II.4.5 Neolentinus ponderosus

Las especies que conforman el género Neolentinus estuvieron incluidas dentro del género

Lentinus (Pegler, 1983). Sin embargo, Redhead & Ginns (Redhead & Ginns, 1985),

indicaron que si bien, las especies de Neolentinus no tienen diferencias microscópicas

significativas con las de Lentinus, el primero causa pudrición café en la madera y el

segundo causa pudrición blanca. Esta característica permitió separar ambos géneros

(Redhead & Ginns, 1985).

43

Neolentinus se clasifica taxonómicamente de la manera siguiente (Hawksworth, et al,

1995):

Reino: FUNGI; Phylum: Basidiomycota; Clase: Basidiomycetes, Subclase:

Agaricomycetidae, Orden: Polyporales, Familia: Polyporaceae, Género: Neolentinus

(Redhead & Ginns, 1985)

Características macroscópicas y microscópicas:

La morfología del género es extremadamente variable, en la mayoría de los casos, el

basidiocarpo tiene un estípite bien desarrollado, en posición central, el cual se continúa

con el píleo. El basidiocarpo puede ser grande y robusto en especies tales como N.

lepideus y N. ponderosus (Pegler, 1983).

La superficie del píleo está esencialmente formada por un epicutis; en muchos casos el

píleo es fibriloso radialmente, escamoso o densamente piloso. El pileipellis usualmente

está formado por hifas generativas, con fíbulas, aunque es frecuente encontrar hifas

esclerificadas especialmente hacia el centro del píleo (Redhead & Ginns, 1985).

El himenio es lamelar, decurrente al estípite. Las láminas son triangulares en sección.

Muchas especies desarrollan anastomosis e intervenaciones, resultando en una condición

subporoide que posiblemente indique un ancestro polyporal. Trama lamelar regular

(Redhead & Ginns, 1985).

El sistema hifal generalmente es dimítico, aunque algunas especies pueden presentar un

sistema trimítico. El tipo de hifas secundarias, está constituido por hifas generativas y

esqueléticas o ligadoras-esqueléticas (Pegler, 1983).

Las basidiosporas generalmente son cilíndricas, hialinas, inamiloides, no dextrinoides, de

pared delgada y lisa (Pegler, 1983).

II.4.6 Armillariella polymyces

Descripción: Hongo de píleo globoso, convexo, que va de color café-rosa a café-

amarillento; es de contexto firme y blanco con olor agradable. (Sommerkamp, 1990).

Hábitat y distribución: Puede crecen en conjunto al pie de árboles frutales,

principalmente manzano y durazno (Sommerkamp, 1990).

Usos populares: Hongo de venta en mercados para su consumo en Tactic y San Mateo

Ixtatán en los departamentos de Alta Verapaz y Huehuetenango, respectivamente (Bran,

2003).

Estudios farmacológicos y composición química: el micelio de Armillariella tabescens

(Scop. Ex Fr.) Emel syn. Posee actividad hepatoprotectora por intoxicación con etanol

(Lu 1998). También se ha encontrado actividad detoxificante contra aflatoxinas B1

mediante la acción de enzimas aisladas de esporas de A. tabescens (Liu 2001). Las

multienzimas del hongo han exhibido su capacidad detoxificante contra las aflatoxinas

por medio de la modificación de su estructura química (Liu 2006). Armillariella mellea

también ha sido reportada como fuente de una metaloproteasa capaz de lisar las cadenas

alfa y beta del fibrinógeno humano, postulándose como candidata para la terapia

fibrinolítica (Kim 1999).

44

PARTE III

RESULTADOS

III.1 OBJETIVO I.

Recolectar seis hongos comestibles (cinco especies silvestres y una especie cultivada)

y determinar su taxonomía.

Fueron seleccionados los lugares donde los hongos se encuentran con más abundancia y

fácil accesibilidad: Ixchiguán, San Marcos, San Juan Comalapa, Chimaltenango, San

Pedro Carcha, Alta Verapaz, San Raymundo, Guatemala y Técpan, Chimaltenango.

Los ejemplares de Neolentinus ponderosus, fueron cultivados y donados por la Unidad

de Biodiversidad, Tecnología y Aprovechamiento de Hongos –BioTAH, del

Departamento de Microbiología de la Escuela de Química Biológica.

Cantharellus lateritius fue colectado en el municipio de San Raymundo, Armillariella

polymyces fue colectado en el municipio de San Pedro Carchá, Alta Verapaz, Boletus

edulis fue adquirido en la cooperativa de Ixchiguán, Depto. de San Marcos, Neolentinus

ponderosus proviene del municipio San Mateo Ixtatán, Huehuetenango, Lactarius

deliciosus del municipio de San Juan Comalapa, Chimaltenango y Amanita garabitoana

de Tecpán Guatemala, Chimaltenango.

Para la obtención de los hongos utilizados para los análisis del proyecto, se recurrió a los

vendedores de hongos locales, los cuales se contactaron en los mercados Municipales de

cada región, los cuales proporcionaron los volúmenes requeridos.

III.2 OBJETIVO 2.

Procesar en condiciones apropiadas los especímenes colectados.

Preservación de los hongos colectados: los hongos fueron partidos y colocados en

deshidratadoras a 65°C durante tres días; una vez secos se colocó una muestra (3 a 5

ejemplares) en bolsas de polipapel, identificadas con el nombre del hongo, número de

referencia, lugar y fecha de colecta, además de su respectiva descripción y se procedió a

su incorporación en la Micoteca de Macrohongos de Guatemala “Lic. Rubén Mayorga

Peralta”, de la Unidad de Biodiversidad, Tecnología y Aprovechamiento de Hongos –

BioTAH-, del Departamento de Microbiología de la Escuela de Química Biológica de la

Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia de la Universidad de San Carlos de

Guatemala.

Los hongos restantes se colocaron en bolsas plásticas selladas y rotuladas para ser

utilizadas en la realización de los ensayos de laboratorio.

45

III.3 OBJETIVO 3.

Establecer bioensayos inmunomoduladores y biocidas para evaluar los especímenes.

La unidad de Bioensayos ha estandarizado los ensayos de actividad biocida e

inmunomoduladora de extractos vegetales. En el caso del presente proyecto, los

protocolos de ensayo fueron puestos a punto para la aplicación de los mismos en

extractos provenientes de hongos macroscópicos o basidiomicetos.

III.4 OBJETIVO 4.

Obtener un extracto polar y uno apolar de los especímenes colectados. Las muestras de hongos deshidratadas fueron sometidas a condiciones de maceración,

percolación y extracción.

El porcentaje de rendimiento de extracto con etanol al 95% y con agua fue muy variable,

observándose los resultados en la tabla 3.

Tabla 3. Rendimiento de los extractos etanólicos al 95% y acuosos obtenidos de la materia vegetal de varios

hongos comestibles

HONGO COMESTIBLE SOLVENTE

UTILIZADO

PORCENTAJDE DE

RENDIMIENTO

(%)

Armillariella polymyces Etanol 95% 7.43

Agua 8.20

Boletus edulis Etanol 95% 17.84

Agua 36.00

Cantharellus lateritius Etanol 95% 1.099

Agua 2.50

Neolentinus ponderosus Etanol 95% 19.05

Agua 20.10

Lactarius deliciosus Etanol 95% 28.21

Agua 23.40

Amanita garabitoana Etanol 95% 16.15

Agua 17.30 Fuente: FODECYT 30-2007

III.5 OBJETIVO 5.

Caracterizar microscópicamente los basidiomicetos en estudio.

Se procedió a describir las características microscópicas de los hongos adquiridos en los

mercados. Se midieron las estructuras del píleo, himenio y estípite y se anotaron las

coloraciones y reacciones químicas de los tejidos fúngicos ante diferentes reactivos

específicos (Cifuentes 1,984, Kornerup 1,989).

Las descripciones realizadas se compararon con la bibliografía correspondiente, para

identificar correctamente los hongos colectados (Bessette 1,997 y 2,000, Calonge 1,998,

García, et al 1,998, Phillips 1,991, Læssøe, et al 1,996). Los resultados fueron

consignados en las fichas técnicas que fueron elaboradas de los hongos estudiados

(Anexo

46

III.6 OBJETIVO 6.

Determinar la actividad inmunomoduladora y biocida de los extractos obtenidos.

Los resultados de los ensayos aplicados para determinar la actividad biológica de los

hongos se describen a continuación.

III.6.1 Citotoxicidad

A los extractos analizados se les determinó la actividad citotóxica contra A. salina para

evaluar su inocuidad, encontrándose que la CL50 fue mayor a 1 mg/mL para todos los

extractos (Tabla 4).

Tabla 4. DL50 contra A. salina de los extractos etanólicos 95% y acuosos de hongos

comestibles


UTILIZADO CL50

Armillariella polymyces Etanol 95% -

Agua -

Boletus edulis Etanol 95% -

Agua -

Cantharellus lateritius Etanol 95% -

Agua -

Neolentinus ponderous Etanol 95% -

Agua -

Lactarius deliciosus Etanol 95% -

Agua -

Amanita garabitoana Etanol 95% -

Agua - (-) actividad citotóxica >1mg/mL

Fuente: FODECYT 30-2007

III.6.2 Actividad larvicida

A los extractos analizados se les determinó la actividad larvicida contra las larvas de los

cuatro estadíos de los mosquitos A. aegypti y A. albimanus, encontrándose que la CL50

fue mayor a 1 mg/mL para todos los extractos (Tabla 5).

47

Tabla 5. Actividad larvicida contra larvas de A. aegypti y A. albimanus de los extractos

de hongos comestibles.


UTILIZADO

CL50

Aedes

aegypti

Anopheles

albimanus

Armillariella polymyces Etanol 95% - -

Agua - -

Boletus edulis Etanol 95% - -

Agua - -

Cantharellus lateritius Etanol 95% - -

Agua - -

Neolentinus ponderous Etanol 95% - -

Agua - -

Lactarius deliciosus Etanol 95% - -

Agua - -

Amanita garabitoana Etanol 95% - -

Agua - - (-) actividad larvicida >1mg/mL


III.6.3 Actividad antifúngica

A los extractos etanólicos al 95% se les determinó su actividad antifúngica,

encontrándose que ninguno presenta actividad a una concentración de 1mg/mL (Tabla 6).

Tabla 6. Actividad antifúngica de extractos etanólicos al 95% de hongos comestibles

HONGOS

PATÓGENOS

HONGOS COMESTIBLES

A.

polymyces

B.

edulis

C.

lateritius

N.

ponderosus

L.

deliciosus

A.

garabitoana

Aspergillus flavus - - - - - -

Aspergillus fumigatus - - - - - -

Aspergillus niger - - - - - -

Microsporum

gypseum - - - - - -

Trichophyton rubrum - - - - - -

T. mentagrophytes - - - - - - (-) sin actividad 1mg/mL


A los extractos acuosos se les determinó su actividad antifúngica, encontrándose que

ninguno presenta actividad a una concentración de 1mg/mL (Tabla 7).

48

Tabla 7. Actividad antifúngica de extractos acuosos de hongos comestibles

HONGOS

PATÓGENOS

HONGOS COMESTIBLES

A.

polymyces

B.

edulis

C.

lateritius

N.

ponderosus

L.

deliciosus

A.

garabitoana

Aspergillus flavus - - - - - -

Aspergillus fumigatus - - - - - -

Aspergillus niger - - - - - -

Microsporum gypseum - - - - - -

Trichophyton rubrum - - - - - -

T. mentagrophytes - - - - - - (-) sin actividad 1mg/mL


III.6.4 Actividad antimicrobiana

A los extractos etanólicos al 95% se les determinó su actividad antimicrobiana,

encontrándose que ninguno presenta actividad a una concentración de 1mg/mL (Tabla 8).

Tabla 8. Actividad antimicrobiana de extractos etanólicos al 95% de hongos comestibles

MICROORGANISMOS

HONGOS COMESTIBLES

A.

polymyces

B.

edulis

C.

lateritius

N.

ponderosus

L.

deliciosus

A.

garabitoana

Staphylococcus aureus - - - - - -

Escherichia coli - - - - - -

Salmonella typhi - - - - - -

Mycobacterium smegmatis - - - - - -

Bacillus subtilis - - - - - -

Pseudomonas aeruginosa - - - - - -

Candida albicans - - - - - -

Cryptococcus neoformans - - - - - - (-) sin actividad 1mg/mL


A los extractos acuosos se les determinó su actividad antimicrobiana, encontrándose que

ninguno presenta actividad a una concentración de 1mg/mL, excepto A. garabitoana

(Tabla 9).

Tabla 9. Actividad antimicrobiana de extractos acuosos de hongos comestibles

MICROORGANISMOS

HONGOS COMESTIBLES

A.

polymyces

B.

edulis

C.

lateritius

N.

ponderosus

L.

deliciosus

A.

garabitoana

Staphylococcus aureus - - - - - 0.5 mg/dL

Escherichia coli - - - - - 0.5mg/dL

Salmonella typhi - - - - - -

Mycobacterium smegmatis - - - - - -

Bacillus subtilis - - - - - -

Pseudomonas aeruginosa - - - - - -

Candida albicans - - - - - -

Cryptococcus neoformans - - - - - - (-) sin actividad 1mg/mL Fuente: FODECYT 30-2007

49

III.6.5 Actividad inmunomoduladora

En las siguientes tablas se muestran los resultados obtenidos para el ensayo

linfoproliferativo de los extractos etanólicos y acuosos de los basidiomicetos analizados

en el estudio (tablas No. 10 y 11):

Tabla 10. Actividad inmunomoduladora para el ensayo linfoproliferativo


UTILIZADO

Actividad

1 mg/mL

Armillariella polymyces Etanol 95% Estimulatoria (33.82 %)

Agua Estimulatoria (53.64%)

Boletus edulis Etanol 95% Inhibitoria (29.76 %)

Agua Estimulatoria (70.26 %)

Cantharellus lateritius Etanol 95% Estimulatoria (17.77 %)

Agua Estimulatoria (59.85%)

Neolentinus ponderosus Etanol 95% Estimulatoria (30.75%)

Agua Inhibitoria (44.47 % )

Lactarius deliciosus Etanol 95% Estimulatoria (13.80%)

Agua Inhibitoria (30.21 %)

Amanita garabitoana Etanol 95% Estimulatoria (25.25%)

Agua Estimulatoria (17.18%) (porcentaje de actividad respecto a la lectina utilizada, en este caso PHA-M)


Los extractos que presentaron una actividad mayor al 55 % se les determinó la

Concentración Efectiva Mínima (CEM) encontrando que para el extracto de B. edulis es

de 125 μg/mL y en el caso de C. lateritius los porcentajes fueron muy similares en las

diferentes diluciones realizadas y que se muestran en la tabla a continuación:

Tabla 11. Determinación de Concentración Efectiva Mínima (CEM) de extractos

acuosos de B. edulis y C. lateritius para el ensayo linfoproliferativo

HONGO

COMESTIBLE

500

μg/mL

250

μg/mL

125

μg/mL

62.50

μg/mL

31.25

μg/mL

15.62

μg/mL

7.81

μg/mL

Boletus edulis 18.97% 10.50% 3.46% - - - -

Cantharellus lateritius 3.85 % 12.5 % 9.42% 5.38 % 8.72% 4.36 % 7.88 % (porcentaje de actividad respecto a la lectina utilizada, en este caso PHA-M)


III.6.6 Actividad sobre el Sistema de Complemento

El segundo ensayo in vitro realizado fue el análisis del Sistema de complemento,

evaluándose la actividad tanto de la vía clásica como la vía alterna (Tabla 12 y 13).

50

Tabla 12. Actividad inmunomoduladora de los extractos etanólicos al 95% y acuosos de

hongos comestibles sobre el Sistema de Complemento.

HONGO

COMESTIBLE

SOLVENTE

UTILIZADO

Vía clásica

(1 mg/mL)

Vía alterna

(1 mg/mL)

Armillariella polymyces Etanol 95% Inhibitoria (87.60%) Estimulatoria (103.03%)

Agua Inhibitoria (100.14%) Inhibitoria (54.20%)

Boletus edulis Etanol 95% Inhibitoria (73.70%) Estimulatoria (120.95%)

Agua Inhibitoria (99.60%) Estimulatoria (83.10%)

Cantharellus lateritius Etanol 95% Inhibitoria (109.00%) Estimulatoria (96.95%)


Neolentinus ponderosus Etanol 95% Inhibitoria (86.40%) Estimulatoria (123.25%)


Lactarius deliciosus Etanol 95% Inhibitoria (81.70%) Estimulatoria (87.90%)


Amanita garabitoana Etanol 95% Inhibitoria (65.60%) Estimulatoria (62.30%)

Agua Inhibitoria (71.60%) Estimulatoria (57.60%) Actividad estimulatoria: % de hemolisis producida. Actividad inhibitoria: % de inhibición de hemolisis


Tabla 13. Determinación de CI50 del ensayo hemolítico para la valoración de la Vía

Clásica del Sistema de Complemento para los extractos etanólicos al 95% y acuosos de

hongos comestibles.

HONGO

COMESTIBLE

SOLVENTE

UTILIZADO

333.33

μg/mL

111.11

μg/mL

37.04

μg/mL

12.34

μg/mL

4.11

μg/mL

1.37

μg/mL

Armillariella polymyces Etanol 95% 88.70% 82.10% 81.00% 81.90% 84.70% 86.10%

Agua 94.80% 90.20% 78.90% 67.20% 66.10% 58.50%

Boletus edulis Etanol 95% 73.10% 70.60% 70.70% 69.50% 69.80% 67.00%

Agua 95.00% 86.10% 71.00% 73.00% 63.00% 60.60%

Cantharellus lateritius Etanol 95% 103.00% 102.00% 102.00% 87.20% 83.00% 85.30%

Agua 85.20% 91.80% 88.70% 82.10% 77.00% 75.40%

Neolentinus ponderosus Etanol 95% 83.00% 82.10% 81.00% 82.90% 81.60% 77.60%

Agua 53.00% 48.20% 43.80% 42.10% 46.20% 40.60%

Lactarius deliciosus Etanol 95% 72.10% 71.30% 73.40% 76.00% 71.70% 80.60%

Agua 91.50% 81.00% 80.9% 68.00% 63.40% 60.90%

Amanita garabitoana Etanol 95% 61.70% 64.30% 61.80% 59.20% 61.40% 59.40%

Agua 68.70% 63.20% 65.10% 63.80% 67.30% 61.40% Los datos de la tabla se utilizan para determinar la CI50 por medio de una regresión lineal, que debe ser igual o

menor a 15 μg/mL .


Los datos de la tabla anterior muestran que en su mayoría el valor de la CI50 es menor a

1.37 μg/mL. La concentración exacta no es posible determinarla por ser muy pequeña.

51

Tabla 14. Determinación de CI50 del ensayo hemolítico para la valoración de la Vía

Alterna del Sistema de Complemento para los extractos etanólicos al 95% y acuosos de

hongos comestibles.

HONGO

COMESTIBLE

SOLVENTE

UTILIZADO

333.33

μg/mL

111.11

μg/mL

37.04

μg/mL

12.34

μg/mL

4.11

μg/mL

1.37

μg/mL

Armillariella polymyces Etanol 95% 122.72% 121.19% 123.21% 122.04% 134.19% 102.18%

Agua 47.60% 36.00% 33.00% 34.50% 32.10% 37.30%

Boletus edulis Etanol 95% 122.25% 120.61% 122.66% 120.82% 130.02% 137.45%

Agua 88.90% 91.70% 97.20% 93.40% 85.10% 92.50%

Cantharellus lateritius Etanol 95% 135.68% 121.22% 121.49% 130.47% 100.54% 128.04%

Agua 113.00% 107.00% 111.00% 102.00% 109.00% 117.00%

Neolentinus ponderosus Etanol 95% 118.13% 123.04% 117.45% 108.18% 105.85% 129.91%

Agua 86.40% 82.70% 87.00% 80.80% 87.10% 91.80%

Lactarius deliciosus Etanol 95% 178.00% 177.00% 122.00% 132.00% 131.00% 128.00%

Agua 62.40% 77.60% 71.70% 88.80% 84.30% 88.50%

Amanita garabitoana Etanol 95% 87.80% 88.10% 84.90% 80.30% 76.80% 75.70%

Agua 70.40% 92.80% 91.70% 95.60% 91.20% 82.70% Los datos de la tabla se utilizan para determinar la CI50 por medio de una regresión lineal, que debe ser igual o

menor a 15 μg/mL .


III.7 OBJETIVO 7.

Caracterizar la composición química y el análisis proximal de los hongos y

extractos.

III.7.1 Sólidos extraíbles

La determinación del porcentaje de sólidos extraíbles con diferentes concentraciones de

solvente determina la concentración más adecuada que extrae el mayor porcentaje de

sólidos. En la tabla 13 se puede observar que con la concentración de etanol al 50% se

obtuvo el mayor porcentaje de rendimiento en la mayoría de los hongos, excepto N.

ponderosus (Tabla 15).

Tabla 15. Cantidad de sólidos extraíbles con diferentes concentraciones de solvente

Especie

Etanol

Porcentaje de Sólidos Extraíbles

50% 70% 95%

Armillariella polymyces 14.56 14.15 3.07

Boletus edulis 24.31 18.39 5.71

Cantharellus lateritius 14.70 11.52 2.08

Neolentinus ponderosus 13.78 16.49 5.27

Lactarius deliciosus 14.76 14.62 2.62

Amanita garabitoana 23.82 23.23 7.00 Fuente: FODECYT 30-2007

52

III.7.2 Tamizaje fitoquímico

Resultados de pruebas macro y semimicro

Se realizó el tamizaje fitoquímico mediante ensayos macro y semimicro, utilizando

diversas pruebas preliminares de coloración y precipitación para la identificación de los

metabolitos secundarios, los cuales posteriormente fueron confirmados mediante

cromatografía en capa fina (Tabla 16-27).

Tabla 16. Prueba de alcaloides

Muestra Reactivo de

Mayer’s

Reactivo de

Dragendorff

Reactivo de

Wagner Resultado

A. garabitoana (+) (+) (+) Positivo

A. polymyces (+) (+) (+) Positivo

B. edulis (-) (+) (-) Positivo

C. lateritius (-) (+) (-) Positivo

L. deliciosus (-) (+) (-) Positivo

N. ponderosus (+) (+) (+) Positivo Fuente: FODECYT 30-2007

Tabla 17. Prueba de Flavonoides y Antocianinas


Tabla 18. Prueba de Antraquinonas

Muestra Bornträger Bornträger

Modificado Resultado

A. garabitoana (-) (-) Negativo

A. polymyces (-) (-) Negativo

B. edulis (-) (-) Negativo

C. lateritius (-) (-) Negativo

L. deliciosus (-) (-) Negativo

N. ponderosus (-) (-) Negativo


Muestra

Reactivo H2SO4 FeCl3 HCl + Δ Mg + HCl Álcali Resultado

A. garabitoana (-) (-) (-) (-) (+) Positivo

A. polymyces (+) (-) (+) (-) (+) Positivo

B. edulis (-) (+) (+) (-) (+) Positivo

C. lateritius (+) (-) (-) (-) (+) Positivo

L. deliciosus (+) (-) (-) (-) (+) Positivo

N. ponderosus (-) (-) (-) (-) (+) Positivo

53

Tabla 19. Prueba de Cardenólidos y Bufadienólidos

Muestra Lactonas

Insaturadas

Azúcares 2-

desoxigenadas Resultado

A. garabitoana (-) (+) Positivo

A. polymyces (-) (+) Positivo

B. edulis (-) (+) Positivo

C. lateritius (-) (+) Positivo

L. deliciosus (-) (+) Positivo

N. ponderosus (-) (+) Positivo


Tabla 20. Prueba de Esteroides y Triterpenoides

Muestra Lieberman-

Burchard

Ácido

Tricloroacético Carr-Price Resultado

A. garabitoana (-) (-) (-) Negativo

A. polymyces (-) (-) (-) Negativo

B. edulis (-) (-) (-) Negativo

C. lateritius (-) (-) (-) Negativo

L. deliciosus (-) (-) (-) Negativo

N. ponderosus (-) (-) (-) Negativo


Tabla 21. Prueba de Saponinas

Muestra Prueba de

Espuma Resultado

A. garabitoana (+) Positivo

A. polymyces (+) Positivo

B. edulis (-) Negativo

C. lateritius (+) Positivo

L. deliciosus (-) Negativo

N. ponderosus (+) Positivo


Tabla 22.: Prueba de Taninos

Muestra Gelatina 1% Gelatina-Sal FeCl3 10% Resultado

A. garabitoana (-) (-) (-) Negativo

A. polymyces (-) (-) (-) Negativo

B. edulis (-) (-) (-) Negativo

C. lateritius (-) (-) (-) Negativo

L. deliciosus (-) (-) (-) Negativo

N. ponderosus (-) (-) (-) Negativo


54

Tabla 23. Prueba de Glicósidos Cianogénicos


Tabla 24. Prueba de Esteroles Insaturados

Muestra Liebermann-

Burchard H2SO4 [ ] Resultado

A. garabitoana (-) (-) Negativo

A. polymyces (-) (-) Negativo

B. edulis (-) (+) Positivo

C. lateritius (-) (+) Positivo

L. deliciosus (-) (+) Positivo

N. ponderosus (-) (+) Positivo Fuente: FODECYT 30-2007

Tabla 25. Prueba de Cumarinas


Tabla 26. Prueba de Azúcares Reductores

Muestra Reactivo de

Benedict Resultado

A. garabitoana (+) Positivo

A. polymyces (+) Positivo

B. edulis (+) Positivo

C. lateritius (+) Positivo

L. deliciosus (+) Positivo

N. ponderosus (+) Positivo


Muestra Prueba de

Guignard Resultado

A. garabitoana (-) Negativo

A. polymyces (-) Negativo


C. lateritius (-) Negativo


N. ponderosus (-) Negativo

Muestra Fluorescencia con

KOH 0.5 N Resultado







55

Tabla 27. Prueba de Polisacáridos

Muestra H2SO4 [ ] +Timol Resultado








III.7.3 Resultados de la Cromatografía en capa fina

Para confirmar la presencia de los metabolitos secundarios se realizó la cromatografía en

capa fina para cada una de las especies en estudio (Tabla 28-32).

Tabla 28. Cromatografía en capa fina de Alcaloides

MUESTRA NO. DE

BANDAS VALOR RF

COLORACIÓN DE LA

BANDA

Estándar de Atropina 1 0.30 Naranja

Estándar de Ajmalina 1 0.40 Amarilla

Estándar de Papaverina 1 0.55 Naranja

Estándar de Reserpina 1 0.49 Amarilla

A. garabitoana

No se observó ninguna banda

A. polymyces

B. edulis

C. lateritius

L. deliciosus

N. ponderosus Fuente: FODECYT 30-2007

Fase móvil: Tolueno - Acetato de etilo - Dietilamina (70:20:10)

Detección: Reactivo de Dragendorff.

Tabla 29. Cromatografía en capa fina de Flavonoides y Antocianinas

MUESTRA NO. DE

BANDAS VALOR RF

COLORACIÓN UV DE LA

BANDA RESULTADO

Estándar de Quercetina 1 0.94 Amarilla – naranja ----------

Estándar de Rutina 2 0.56, 0.68 Amarilla, naranja ---------

A. garabitoana 2 0.5, 0.62 Amarilla, amarilla Positivo

A. polymyces No se observó ninguna banda Negativo

B. edulis 3 0.50, 0.63, 0.78 Amarilla, amarilla, amarilla Positivo

C. lateritius No se observó ninguna banda Negativo

L. deliciosus 3 0.37, 0.43, 0.63 Azul, amarilla, amarilla Positivo

N. ponderosus 2 0.29, 0.54 Verde, amarilla Positivo Fuente: FODECYT 30-2007

Fase móvil: acetato de etilo, ácido fórmico, ácido acético glacial-agua (100:11:11:27)

Detección: reactivo de Productos Naturales (NP/PEG).

56

Tabla 30. Cromatografía en capa fina de Saponinas

MUESTRA NO. DE

BANDAS VALOR RF

COLORACIÓN DE LA

BANDA RESULTADO

Estándar

Saponinas 0.1% 1 0.29 Café ---------------

A. garabitoana 5 0.29, 0.38, 0.51, 0.76 Verde, verde, verde,

verde, verde Positivo

A. polymyces 1 0.77 Verde Positivo

B. edulis 7 0.29, 0.34, 0.39, 0.51,

0.57, 0.61, 0.77

Verde, amarilla,

verde, amarilla,

verde, verde, verde

Positivo

C. lateritius 4 0.29, 0.39, 0.5, 0.6 Vede, azul, azul,

verde Positivo

L. deliciosus 5 0.29, 0.34, 0.53,

0.61,0.77

Verde, verde, verde,


N. ponderosus 4 0.29, 0.34, 0.51, 0.61 Verde, verde, verde,



Fase móvil: n-butanol-ácido acético-agua (50:10:40)

Detección: vainillina-ácido sulfúrico.

Tabla 31. Cromatografía en capa fina de Principios Amargos

MUESTRA NO. DE

BANDAS VALOR RF

COLORACIÓN DE LA

BANDA RESULTADO

Estándar Neurolaena

lobata 2 0.19, 0.84 Café, violeta -----------

A. garabitoana 2 0.63, 0.77 Violeta, violeta Positivo

A. polymyces No se observó ninguna banda Negativo

B. edulis 5 0.29, 0.5, 0.59,

0.65, 0.81

Violeta, amarilla,

violeta, amarilla, roja Positivo

C. lateritius 2 0.46, 0.59 Violeta, violeta Positivo

L. deliciosus 3 0.26, 0.59, 0.76 Violeta, violeta,

violeta Positivo

N. ponderosus 5 0.26, 0.47, 0.56,

0.59, 0.84

Violeta, violeta,

violeta, violeta, violeta Positivo


Fase móvil: Acetato de etilo – Metanol – Agua (39:8:4)

Detección: Vainillina - ácido sulfúrico

57

Tabla 32. Cromatografía en capa fina de Aceites Volátiles

MUESTRA VALOR RF COLORACIÓN UV RESULTADO

Estándar de citral 0.49 Café-azul ------------

Estándar de limoneno 0.59 Azul -----------

A. garabitoana 0.15, 0.82 Café, café Negativo

A. polymyces 0.15 Café Negativo

B. edulis 0.17, 0.79 Café, Café Negativo

C. lateritius No se observó ninguna banda Negativo

L. deliciosus 0.76 Café Negativo

N. ponderosus No se observó ninguna banda Negativo


Fase móvil: Tolueno:Acetato de Etilo (93:7)

Detección: Vainillina - ácido sulfúrico.

58

Resultados obtenidos en las diferentes pruebas cualitativas realizadas para la investigación de los metabolitos secundarios presentes en

las diferentes especies en estudio.

Tabla 33. Alcaloides, antraquinonas, cumarinas, cardenolidos y bufadenolidos y estreroides y triterpenoides

Alcaloides Antraquinonas Cumarinas Cardenólidos/Bufadienólidos

Esteroides/

Triterpenoides

M CCF M CCF M CCF

Lactonas

Insaturadas

Azúcares

2-desoxigenadas M

Armillariella polymyces + - - - - - - + -

Boletus edulis + - - - - - - + -

Cantharellus lateritius + - - - - - - + -

Neolentinus ponderosus + - - - - - - + -

Lactarius deliciosus + - - - - - - + -

Amanita garabitoana + - - - - - - + - Fuente: FODECYT 30-2007 M: macrométodo. CCF: cromatografía en capa fina

Tabla 34. Principios amargos, taninos, flavonoides y antocianinas, glicocidos cianogénicos, aceites volátiles, saponinas y

esteroides insaturados

Principios

amargos Taninos

Flavonoides/

Antocianinas

Glicósidos

cianogénicos

Aceites

volátiles Saponinas

Esteroles

insaturados

CCF M M CCF M CCF M CCF M

Armillariella polymyces - - - - - + + + -

Boletus edulis + - + + - + - + +

Cantharellus lateritius + - - - - - + + +

Neolentinus ponderosus + - + + - - + + +

Lactarius deliciosus + - + + - + - + +

Amanita garabitoana + - - + - + + + - Fuente: FODECYT 30-2007 M: macrométodo. CCF: cromatografía en capa fina

59

Tabla 35. Azúcares reductores y poliscáridos

Azúcares Reductores Polisacáridos

M M

Armillariella polymyces + -

Boletus edulis + -

Cantharellus lateritius + -

Neolentinus ponderosus + -

Lactarius deliciosus + -

Amanita garabitoana + - M: macrométodo.


III.7.4 Análisis de composición mineral

Concentraciones de Potasio(K), Hierro(Fe), Níquel(Ni), Cobre (Cu), Zinc (Zn), Manganeso (Mn), y Rubidio (Rb) de las muestras de

basidiomicetos analizadas (mg/kg de peso seco)

Tabla 36. Concentración de potasio (K), hierro (Fe), Niquel (Ni), cobre (Cu), cinc (Zn), manganeso (Mn) y plomo (Pb)

Concentración de Elementos

K Fe Ni Cu Zn Mn Rb

Armillariella polymyces 3289.11 41.11 31.04 13.87 27.61 5.12 14.57

Boletus edulis 965.89 51.99 ND 60.18 30.40 ND 23.81

Cantharellus lateritius 4318.79 184.43 22.37 127.37 85.26 ND ND

Neolentinus ponderosus 1913.74 43.55 37.52 ND 29.09 ND ND

Lactarius deliciosus 1020.87 53.32 19.03 9.56 25.14 ND 22.04

Amanita garabitoana 1826.53 61.02 19.66 14.69 23.22 ND 36.43 Fuente: FODECYT 30-2007. ND: No Detectado

60

III.8 OBJETIVO 8.

Preparar una Ficha Técnica de cada hongo colectado que incluya los resultados

obtenidos.

Fueron elaboradas fichas técnicas de los hongos estudiados. Cada ficha técnica contiene

una fotografía del basidiomiceto en su estado natural sin deshidratación y las datos que lo

describen según características macro y microscópicas. Son incluidos también datos

ambientales y referenciales. (Ver Anexos).

III.9 OBJETIVO 9.

Difundir los resultados a nivel nacional e internacional.

Los resultados obtenidos en la presente investigación deben ser dados a conocer tanto a

nivel nacional como internacional. En la Jornada Científica de la Facultad de CCQQ y

Farmacia en septiembre 2008 se realizó una comunicación en la modalidad de afiche,

para difundir el proyecto que estaba en curso, así como un Seminario de Graduación

realizado por estudiantes de la carrera de Químico Biólogo. (Ver Anexos).

61

III.10 DISCUSIÓN DE RESULTADOS

En el proceso de colecta de los macromicetos, así como la preparación y obtención de

extractos tanto etanólicos como acuosos de las seis especies de hongos, se evidenció la

dificultad de obtener cantidades adecuadas de materia prima, ya que su disponibilidad es

dependiente de múltiples condiciones ambientales imposibles de controlar. El material

fúngico depende principalmente de los ciclos de lluvia que en la actualidad no son

posibles de predecir. Una vez obtenida una cantidad adecuada, se encontró que el

rendimiento de estas especies es muy bajo. De las seis especies en estudio, la que mayor

rendimiento mostró fue Lactarius deliciosus con 28.2% y 23.4% en extracción etanólica

y acuosa, respectivamente. Las especies Armillariela polymyces y Cantharellus lateritius

mostraron el más bajo rendimiento en extracción etanólica y acuosa de 7.4 y 8.2 por

ciento la primera y 1.09 y 2.5 la segunda. A pesar de ello, se obtuvo la cantidad

suficiente para realizar los ensayos propuestos, aunque no es un buen índice para un

posible desarrollo como un producto farmacéutico futuro.

El ensayo de actividad citotóxica contra nauplios de Artemia salina así como el ensayo de

actividad larvicida contra los cuatro estadíos de Aedes aegypti y Anopheles albimanus

mostraron ausencia de actividad en todos los extractos evaluados, habiendo establecido

como punto de corte una concentración de 1 mg/mL (Tablas 2 y 3).

La actividad antimicrobiana y antilevadura fue realizada utilizando la metodología

descrita por Mitcher y colaboradores y la actividad antifúngica miceliar con la

metodología descrita por Brancato & Holding modificada por McRae. De los extractos

etanólicos y acuosos evaluados ninguno presentó actividad a una concentración de 1

mg/mL contra las cepas de bacterias gram positivo (B. subtilis, S. aureus), gram negativo

(S. typhi, , P. aeruginosa, E. coli), micobacterias (M. smegmatis), levaduras (C. albicans,

C. neoformans), hongos filamentosos (A.flavus, A.fumigatus, A.niger) ni hongos

dermatofitos (T. ruburum, T. mentagrophytes, M. gypseum). El único extracto que

presentó alguna actividad antimicrobiana fue el extracto acuoso de Amanita garabitoana,

el cual presentó una actividad inhibitoria contra S. aureus y E. coli a una concentración

inhibitoria mínima (CIM) de 0.5 mg/mL (Tablas 4-7). A pesar de que este basidiomiceto

presentó actividad biológica, dicha concentración no se considera significativa para un

uso farmacéutico, si se toma en cuenta además su limitado rendimiento.

La actividad inmunomoduladora evaluada con respecto a su efecto sobre la proliferación

de linfocitos mostró una actividad significativa de estimulación, en el extracto acuoso de

Boletus edulis, con una actividad estimuladora de la linfoproliferación a una

concentración efectiva mínima (CEM) de 125 μg/mL. Cantharelus lateritius mostró

también actividad estimuladora de la linfoproliferación, pero los resultados obtenidos no

siguen un efecto dosis-respuesta.

Al evaluar los resultados del ensayo linfoproliferativo en las otras especies, se observa

que la mayor parte de los extractos analizados presentan una actividad inespecífica de

estimulación. Dicho hallazgo puede sugerir estudios más exhaustivos de estas especies o

de otras nativas del país; en los que se midan las citocinas que dichos linfocitos puedan

62

estar produciendo y que causen la potenciación de la actividad del mitógeno empleado lo

que apoyaría su uso posterior como nutricéutico inmunoestimulante o

inmunopotenciador.

En cuanto al efecto de los extractos fúngicos sobre el sistema de complemento, tanto por

su vía clásica como la alterna, el extracto acuoso de A. polymyces fue el único que mostró

una actividad inhibitoria estadísticamente significativa, con una CI50 de 1.37 µg/mL.

Como parte del tamizaje fitoquímico se realizaron ensayos macro y semimicro donde se

evaluó la formación de precipitados y complejos coloreados; además en algunos casos se

realizó cromatografía en capa fina (CCF), para caracterizar y confirmar presencia o

ausencia de los metabolitos secundarios, ya que esta es una prueba más específica para la

identificación de determinados compuestos, para ello se cuenta con estándares y

reveladores que permiten diferenciar mediante la comparación de colores y bandas del

cromatograma la presencia o ausencia del metabolito en investigación. Se realizaron

ensayos para determinación de: alcaloides, flavonoides y antocianinas, saponinas,

cumarinas, taninos, esteroides y triterpenoides, glicósidos cianogénicos, antraquinonas,

cardenólidos y bufadienólidos, principios amargos, aceites volátiles, esteroles

insaturados, azúcares reductores y polisacáridos.

El Rf (factor de retención: medida de la migración de una sustancia determinada en un

disolvente dado) obtenido en la cromatografía en capa fina, de algunas muestras no

siempre coincidirá con los Rf’s de los estándares utilizados, ya que no siempre las

muestras poseen los compuestos contenidos en los estándares más comunes, y en el

laboratorio no se cuenta con mucha diversidad de estándares.

Como se puede observar en las tablas 31-33 tras la realización de las diferentes pruebas

para la investigación de los diferentes tipos de metabolitos secundarios, se encontraron

resultados negativos para los siguientes metabolitos secundarios: esteroides o

triterpenoides, taninos, glicósidos cianogénicos, lactonas insaturadas y polisacáridos, ya

que en las pruebas macrométricas no se observaron cambios de coloración o precipitación

característicos.

Se observaron los resultados de los ensayos macro y CCF para determinación de

cumarinas y antraquinonas respectivamente, ninguna de las especies en estudio reportó

resultados positivos al agregar los reactivos, ya que no se observaron cambios de

coloración o formación de precipitados característicos, en ensayo macrométrico, y en la

CCF no se detectaron bandas coloreadas en las muestras tras la aplicación de la solución

reveladora.

En la investigación de alcaloides, en el ensayo macro se obtuvo un resultado positivo en

todas las muestras; sin embargo, tras la realización de la cromatografía en capa fina las

muestras no desarrollaron bandas coloreadas, comparadas con las obtenidas con cada uno

de los estándares utilizados. Los resultados positivos obtenidos en el ensayo

macrométrico pudieron haber sido resultado de posibles interferentes, como proteínas o

63

sustancias que reaccionan con las sales, ya que estos reactivos no son específicos para

alcaloides, son un tipo de prueba presuntiva.

Se puede establecer la presencia de azúcares tanto reductores como azúcares 2-

desoxigenadas en las seis especies en estudio ya que los resultados obtenidos fueron

positivos en cada prueba.

Según los resultados que se muestran en la tabla 31 para el ensayo macrométrico de

flavonoides, se puede sospechar la presencia de flavonas, flavonoles e isoflavonas en A.

polymyces, B. edulis, C. lateritius, L. deliciosus ya que presentaron una coloración

amarilla la cual identifica la presencia de este tipo de compuestos en solución. En la

cromatografía en capa fina sin embargo A. polymyces y C. lateritius no presentaron

bandas por lo que se descarta que sean compuestos de ese tipo y por lo tanto el resultado

es un falso positivo en la prueba macrométrica. Se puede sospechar la presencia de

compuestos del tipo flavonoide en A. garabitoana, B. edulis, L. deliciosus y N.

ponderosus ya que presentaron una intensa fluorescencia en UV de 365 nm, además de

que estas especies desarrollaron una banda amarilla de Rf similar al del estándar de

Rutina.

Se determinó en el ensayo macro que A. garabitoana, A. polymyces, C. lateritius y N.

ponderosus presentaron un poco de formación de espuma característica de saponinas en

la prueba de espuma. En las especies B. edulis y L. deliciosus no se observó ninguna

formación de espuma. La formación de espuma que se observó fue mayor en A.

polymyces y N. ponderosus que el observado en A. garabitoana y C. lateritius. Las

saponinas se caracterizan por su capacidad para producir espuma cuando se agita una

solución acuosa.

La presencia de saponinas se confirmó mediante la cromatografía en capa fina, ya que la

prueba de espuma es un ensayo preliminar para determinar saponinas. Al realizar la

respectiva CCF, se observó que muchas de las bandas obtenidas son características de

saponinas (bandas color violeta, amarillo, verde, azul fluorescente bajo luz UV). La

mayoría de las bandas observadas no coincidieron con el estándar de saponinas, esto

demuestra que posiblemente si hay presencia de saponinas dentro de la composición de

las muestras, pero son de otro tipo de saponina.

Se determinó la presencia de principios amargos positiva para B. edullis, C. lateritius, N.

ponderosus, L. deliciosus y A. garabitoana ya que en la cromatografía en capa fina se

obtuvieron coloraciones similares a la del estándar de Neurolaena lobata, y las especies

B. edullis y N. ponderosus presentaron un Rf similar al estándar. Las demás bandas que

no coinciden con el estándar indican que las muestras poseen principios amargos de otro

tipo dentro de su composición. Se obtuvo resultado negativo para A. polymyces ya que no

se observó ninguna banda.

En la investigación de esteroles se obtuvo resultado positivo en la prueba de anillo en las

especies: B. edulis, C. lateritius, L. deliciosus y N. ponderosus ya que se observó la

64

formación del anillo color rojo en la interfase el cual es positivo para estos compuestos

sin embargo con el reactivo de Liebermann-Burchard las muestras resultaron negativas.

La investigación de aceites volátiles por medio de cromatografía en capa fina evidenció

la posible presencia de estos compuestos en A. garabitoana, A. polymyces, B. edulis y L.

deliciosus por lo que para corroborar los resultados se realizó el proceso de extracción de

aceites volátiles por hidrodestilación en Neoclevenger el cual es un proceso que se basa

en la destilación de agua para arrastrar los compuestos volátiles de la materia vegetal; sin

embargo tras la realización de este proceso no se obtuvo ninguna cantidad de aceite por

lo que se descarta la presencia de aceites volátiles en las especies estudiadas.

El análisis de composición mineral se llevó a cabo por medio de espectrometría de

Fluorescencia de Rayos X por reflexión Total (TXRF); las muestras fueron sometidas a

un proceso de digestión ácida previo para luego ser sometidas al análisis. Para cada

muestra se realizaron tres lecturas, de las cuales los resultados fueron promediados y se

calculó la cantidad, en miligramos, del elemento por cada kilogramo de peso seco de la

muestra. Fueron encontrados 7 elementos, de los cuales como se puede observar, el mas

abundante es el potasio, encontrándose el nivel más alto en C. lateritius y el más bajo en

B. edulis. El hierro se encontró en más alta concentración en C. lateritius y A. polymyces

presentó la concentración más baja para este elemento. El níquel se encontró en mayor

cantidad en N. ponderosus y la menor cantidad en L. deliciosus. C. lateritius presentó la

concentración más alta de cobre y L. deliciosus la más baja, este elemento no fue

encontrado en N. ponderosus. El zinc se encontró en mayor concentración en C. lateritius

y en menor proporcion en A. garabitoana. El manganeso se detectó únicamente en A.

polymyces. A. garabitoana presentó la mayor concentración de rubidio y la más baja la

presentó A. polymyces; en las muestras de C. lateritius y N. ponderosus no se detectó la

presencia de este elemento.

La técnica de Fluorescencia de Rayos X por reflexión Total (TXRF) se basa, en líneas

generales, en el estudio de las emisiones de fluorescencia de rayos X generados después

de la excitación de una muestra mediante una fuente de rayos X. Los átomos presentes

en la muestra analizada son excitados de modo que los electrones de las capas internas

son arrancados o promocionados a niveles de energía superiores. Los electrones de otras

capas minimizan su energía ocupando los huecos electrónicos que quedan libres, de

modo que la energía asociada a dichas transiciones se re-emiten en forma de fotones. A

estas emisiones se las conoce como emisiones de fluorescencia o radiación secundaria y

presentan unas energías características del átomo que las genera y una intensidad que

depende directamente de la concentración de dicho átomo en la muestra. El resultado es

un espectro de dispersión de energía, donde aparecen simultáneamente todas las líneas

asociadas a los elementos químicos presentes. Analizando la posición de los máximos de

intensidad, se identifican los elementos presentes (Análisis Cualitativo), integrando cada uno

de los perfiles elementales se obtienen sus proporciones másicas y añadiendo un elemento

patrón de concentración conocida se obtiene la cuantificación de dichos elementos (Análisis

Cuantitativo).

65

PARTE IV

IV.1 CONCLUSIONES

IV.1.1 Se obtuvieron muestras de seis especímenes de basidiomicetos comestibles de

Guatemala: Armillariella polymyces, Boletus edulis, Cantharellus lateritius, Neolentinus

ponderosus, Lactarius deliciosu y Amanita garabitoana.

IV.1.2 Se procesaron en condiciones apropiadas los especímenes colectados y se

depositaron en la Micoteca “Lic. Rubén Mayorga Peralta” de la Facultad de CCQQ y

Farmacia, USAC.

IV.1.3 Los bioensayos inmunomoduladores y biocidas fueron estandarizados para la

evaluación de extractos de hongos macroscópicos.

IV.1.4 Fueron obtenidos un extracto polares y uno apolar de cada una de las seis especies

de basidiomicetos colectados.

IV.1.5 Las características microscópicas de los basidiomicetos del estudio fueron

registradas e incluidas en la ficha técnica elaborada para cada una de las especies.

IV.1.6 Fueron aplicados los bioensayos para la determinación de la actividad

inmunomoduladora y biocida de los extractos de hongo.

IV.1.7 Se obtuvo la caracterización de la composición química de los hongos estudiados.

IV.1.8 Se obtuvo el mayor rendimiento en los extractos utilizando etanol a una

concentración del 50% como solvente extractor.

IV.1.9 El extracto etanólico al 95% con mayor porcentaje de rendimiento fue el extracto

de Lactarius deliciosus

IV.1.10 El extracto acuoso con mayor porcentaje de rendimiento fue el extracto de

Boletus edulis.

IV.1.11 Ninguno de los extractos etanólicos ni acuosos evaluados presentó actividad

citotóxica contra nauplios de A. salina ni actividad citotóxica contra larvas de A. aegypti

ni A. albimanus.

IV.1.12 El extracto acuoso de A. garabitoana fue el único que presentó una actividad

antimicrobiana contra S. aureus y E. coli a una concentración mínima inhibitoria de 0.5

mg/dL.

IV.1.13 Ninguno de los extractos etanólicos y acuosos evaluados presentó actividad

antifúngica contra hongos filamentosos (A.flavus, A.fumigatus, A.niger) ni hongos

dermatofitos (T. ruburum, T. mentagrophytes, M. gypseum).

66

IV.1.14 El extracto acuoso de Boletus edulis, fue el único que mostró una actividad

estimuladora de la linfoproliferación a una concentración efectiva mínima (CEM) de 125

μg/mL.

IV.1.15 El extracto acuoso de Armillariela polymyces fue el único que mostró una

actividad inhibitoria sobre el sistema de complemento, con una CI50 de 1.37 µg/mL.

IV.1.16 El tamizaje de metabolitos secundarios fue negativo para alcaloides, esteroides o

triterpenoides, taninos, glicósidos cianogénicos, cumarinas, antraquinonas, lactonas

insaturadas y polisacáridos en las seis especies analizadas.

IV.1.17 Los metabolitos secundarios encontrados en las especies estudiadas fueron

saponinas, principios amargos, flavonoides, azúcares reductores y azúcares 2-

desoxigenadas.

IV.1.18 A. garabitoana presentó dentro de su composición mineral la mayor cantidad de

elementos químicos Potasio (K), Hierro (Fe), Níquel (Ni), Cobre (Cu), Zinc (Zn),

Manganeso (Mn), y Rubidio (Rb).

IV.1.19 C. lateritius presentó los niveles de concentración más altos de los elementos:

Potasio (K), Hierro (Fe), Cobre (Cu), Zinc (Zn).

IV.1.20 N. ponderosus presentó una menor presencia de elementos químicos,

encontrándose Potasio (K), Hierro (Fe), Níquel (Ni) y Zinc (Zn).

67

IV.2 RECOMENDACIONES

IV.2.1 Continuar con la búsqueda de actividad inmunomoduladora de los hongos sobre

otros mecanismos inmunes, estandarizando nuevos bioensayos que midan la respuesta

inmune humoral, la actividad de macrófagos y fagocitosis, entre otros.

IV.2.2 Aplicar los mismos bioensayos de inmunomodulación a fracciones y compuestos

aislados de las especies fúngicas.

IV.2.3 Efectuar la búsqueda de actividad inmunomoduladora y biocida en especies

fúngicas susceptibles de cultivo y domesticación, para garantizar la disponibilidad de

materia prima.

68

IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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74

IV.4 ANEXOS

IV.4.1 Extracción fitoquímica

Figura 9. Obtención de extractos para ensayos


IV.4.2 Citotoxicidad

Figura 10. Actividad citotóxica de extractos de N. ponderosus y A. polymyces (a) y (b),

así como nauplios vivos en un pozo de la placa del ensayo (c).

(a) (b) (c)


75

IV.4.3 Actividad larvicida

Figura 11. Actividad larvicida de extractos de los hongos a investigar contra larvas del

primer estadío de A. aegypti y A. albimanus (a) y del cuarto estadío (b), (c) y (d).

(a) (b) (c)

(d)


IV.4.4 Actividad antifúngica

Figura 12. Actividad antifúngica contra A. niger de los extractos etanólicos de A.

polymyces (a)(d)(g), B. edulis (b)(f), C. lateritius/N. ponderosus (c)(e)(h); así como los

extractos acuosos y etanólicos de L. deliciosus (i) y A. garabitoana (j).

(a) (b) (c)

(d) (e) (f)

76

(g) (h) (i)

(j)


Figura 13. Actividad antifúngica contra M. gypseum de extractos etanólicos de A.

polymyces (a), C. lateritius/N. ponderosus (b) y B. edulis (c), así como de sus extractos

acuosos: A. polymyces (d), B. edulis/C. lateritius (e) y N. ponderosus (f).

(a) (b) (c)

(d) (e) (f)


77

Figura 14. Actividad antifúngica contra T. rubrum de los extractos etanólicos de

Control/A. polymyces (a), Control/B. edulis (b) y Control/C. lateritius (c), así como los

extractos acuosos de A. polymyces (d), A. polymyces/B. edulis (e), C. lateritius/N.

ponderosus (f) y Control/N. ponderosus (g).

(a) (b) (c)

(d) (e) (f)

(g)


Figura 15. Actividad antifúngica contra T. mentagrophytes de los extractos acuosos de

Control/A. polymyces (a), B. edulis/C. lateritius (b), N. ponderosus (c).

(a) (b) (c)


78

Figura 16. Actividad antifúngica contra A. fumigatus de los extractos etanólicos de A.

polymyces/Control/B. edulis (a) y C. lateritius/N. ponderosus (b). Así como los extractos

acuosos de Control/A. polymyces (c), B. edulis/C. lateritius (d)(g), N. ponderosus (e)(f).

Actividad de los extractos etanólicos y acuosos de A. garabitoana (h) y L. deliciosus (i).

(a) (b) (c)

(d) (e) (f)

(g) (h) (i)


79

Figura 17. Actividad antifúngica contra A. flavus de los extractos etanólicos de

A.polymyces/Control (a), C. lateritius/N. ponderosus (b) y C. lateritius/B. edulis.

Actividad de los extractos acuosos de Control/C. lateritius (d), Control/A. polymyces (e),

Control/N. ponderosus. Actividad de los extractos etanólicos y acuosos de A.

garabitoana (g) y L. deliciosus (h).

(a) (b) (c)

(d) (e) (f)

(g) (h)

Fuente: FODECYT 30-2007 IV.4.5 Actividad antimicrobiana

Figura 18. Actividad antimicrobiana de los extractos acuosos de N. ponderosus (a), B.

edulis (b), C. lateritius (c), A. garabitoana (d), L. deliciosus (e); CIM de extracto acuoso

de A. garabitoana contra M. smegmatis/B. subtilis (f), S. typhi/P. aeruginosa (g), E. coli

(h)(i), S. aureus (h)(j); CIM de extracto acuoso de A. polymyces contra C. neoformans/S.

aureus (k). Actividad de los extractos etanólicos de N. ponderosus (l), A. polymyces (m),

A. garabitoana (n).

80

(a) (b) (c)

(d) (e) (f)

(g) (h) (i)

(j) (k) (l)

(m) (n)


81

IV.4.6 Actividad inmunomoduladora sobre la proliferación de linfocitos

Figura 19. Fases de separación de linfocitos hasta obtener la capa de mononucleares


Cuantificación de linfoproliferación, ensayo con XTT

Figura 20. Placa lista para lectura por espectofotometría, revelada con XTT.


82

IV.4.8 Sólidos extraíbles

Figura 21. Proceso de Precolación para la determinación del Porcentaje de Sólidos

Extraíbles


Figura 22. Evaporación a sequedad en cápsulas previamente taradas para determinar

sólidos extraíbles


83

Figura 23. Cantidad de sólidos extraídos después de evaporación a sequedad: (1)

Neolentinus ponderosus, (2) Amanita garabitoana, (3) Lactarius deliciosus


IV.4.9 Tamizaje fitoquímico

Figura 24. Preparación de soluciones metanólicas para realización de Tamizaje

Fitoquimico por medio de cromatografia en capa fina (CCF): (1) Amanita garabitoana,

(2) Armillariella polymyces, (3) Boletus edulis, (4) Cantharellus lateritius, (5) Lactarius

deliciosus, (6) Neolentinus ponderosus.


1 2 3 4 5 6

1

2

3

Etanol 50% Etanol 70% Etanol 95%

84

Figura 25. Preparación de la cromatoplaca para la realización de CCF para la

investigación de alcaloides

.


Figura 26. Placa para investigación de alcaloides colocada en la cámara cromatográfica

previamente saturada con la fase móvil

. Fuente: FODECYT 30-2007

85

Figura 27 .Placa cromatográfica vista bajo luz UV 365 nm. Resultado Negativo para

la presencia de Alcaloides: (1) Amanita garabitoana, (2) Armillariella polymyces, (3)

Boletus edulis, (4) Cantharellus lateritius, (5) Lactarius deliciosus, (6) Neolentinus

ponderosus. Estándar 1 (Std 1): Atropina; Estándar 2 (std 2): Papaverina


1 2 3 4 5 6 Std 1 Std 2

86

IV.4.10 Afiche presentado en la Jornada Científica de la Facultad de CCQQ y

Farmacia Septiembre de 2008

EVALUACIÓN INMUNOMODULADORA DE

BASIDIOMICETOS COMESTIBLES

Paz AM., Cáceres A., Álvarez E., Cáceres R., Guerrero K., Ramírez K.,

Oliva S., González N., Rodríguez CM., Sánchez S.Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología. Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología.

Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia, Universidad de San Carlos de Guatemala

Email: [email protected]

ANTECEDENTES

La medicina natural en Guatemala se enfocaprincipalmente a las plantas. A los hongosmuchas veces se les considera solamente unafuente alimenticia.Sin embargo, la medicina tradicional chinaatribuye propiedades medicinales a varioshongos comestibles los cuales se han utilizadocomo agentes inmunomoduladores,terapéuticos y profilácticos.

La actividad linfoproliferativa se determinamediante un bioensayo cuyo principioconsiste en la cuantificación de un productocromógeno derivado de la actividad delinfocitos sobre este compuesto, la cual esdirectamente proporcional al número delinfocitos viables. La actividad de losextractos se compara con una lectina(activadora de la linfoproliferación) y con unblanco de suspensión de linfocitos (sinlinfoproliferación).

La activación de las vías clásica y alternadel sistema del complemento se evalúa conlos ensayos hemolíticos descritos por Klerx.

RESUMEN: La ejecución del proyecto consiste en colectar 7 especies silvestres y 2cultivadas de hongos comestibles. Se prepararon extractos etanólicos y acuosos de lasespecies: Amanita garabitoana, Armillariella polymyces, Bolletus edulis, Cantharelluslateritius, Laccaria amethystina, Lactarius deliciosus, Neolentinus ponderosus y Pleurotusostreatus y se realizará la evaluación de su efecto inmunomodulador, buscando actividadsobre el proceso de linfoproliferación y sobre el sistema de complemento. Posteriormente serealizará el tamizaje químico de los mismos.

o

Neolentinusponderosus

j

k

l

m

n

Adicionalmente se evaluará la citotoxicidad y laactividad biocida (antibacteriana y angifúngica)de los extractos y se realizará un tamizajefitoquímico así como un análisis químico sobre lacomposición mineral y bromatológica de losbasidiomicetos.

AGRADECIMIENTOS

Al Depto. de Microbiología de la Facultad de CC. QQ. yFarmacia por su apoyo en la identificación y desecación delos hongos, especialmente al Lic. Osberth Morales.A la Licda. Isabel Gaitán del Depto. de Citohistología unreconocimiento especial.A SENACYT se agradece especialmente por el financiamientootorgado al Proyecto FODECYT 30-2007.

MATERIALES Y METODOS

Los especímenes fueron recolectados endiferentes regiones de la República deGuatemala:

Cantharellus lateritius (Berk.) Singerj,

Armillariella polymyces (Pers.:Letell) Sing. & Clem.k,

Laccaria amethystina (Huds.) Cookel,

Lactarius deliciosus (L.ex Fr.) S.F. Gray l,

Bolletus edulis Bull ex Fr. m,

Neolentinus ponderosus (O.K. Miller) Redh. & Ginnsk

Amanita garabitoana Tullos, Halling & G.M. Muell ln

Pleurotus ostreatus (Fr.) Rickl Se obtuvo en una

cooperativa de cultivo artesanal.

Se confirmó la identidad de cada hongorecolectado para luego desecarlos.

Se realizaron los extractos duros en etanol al95% y los extractos acuosos por sonicación yliofilización.

Cantharellus lateritiusLactarius deliciosus

Extractos etanólicos

Foto: Roberto Cáceres

Foto: Fred Stevens

Cantharelluslateritius

Bolletus edulis

Pleurotusostreatus

Localización geográfica de la colecta de los basidiomicetos.

87

IV.4.11 FICHAS TÉCNICAS DE LAS ESPECIES DE ESTUDIO

Armillariella polymyces Pers. ex Let.) Sing. & Clem.

Píleo: de 10 a 85 mm de diámetro, convexo a plano, centro deprimido, margen estriado,

borde ondulado, superficie viscosa, finamente escamosa principalmente en el centro

atenuándose hacia el borde, de color café naranja o rosáceo en jóvenes a café rojizo en

adultos y café negruzco en ejemplares viejos o dañados. Contexto carnoso, de color

blanquecino, de hasta 2 mm de ancho.

Himenio: láminas, adheridas a subdecurrentes, delgadas, juntas, borde liso, de color

rosado en jóvenes a café rojizo en ejemplares adultos o dañados.

Anillo: colgante como un aro, membranoso, de color blanco, blanco rosáceo o café claro.

Estípite: 30 a 163 mm de longitud, cilíndricos, superficie fibrilosa, finamente escamosa,

de color blanquecino a café naranja o café rojizo y café negruzco hacia la base. Contexto:

lleno, carnoso de color blanco.

Olor y sabor: a hongo.

Microscopia: esporas elipsoides, lisas de pared gruesa, inamiloides, de 7.0-8.0 x 5.0-6.5

µm.

Hábito: gregario.

Hábitat: sobre troncos de árboles frutales.

Lugar de procedencia: San Pedro Carcha, Alta Verapaz.

Observaciones: este hongo es consumido en el Departamento de Alta Verapaz, se conoce

tradicionalmente con el nombre de “Silip”. Su valor puede oscilar entre los Q20.00 y

Q25.00 la medida (canasto pequeño).

88

Boletus edulis Bull.

Píleo: de 64 a 216 mm de diámetro, convexo, margen recto, borde entero de color blanco,

superficie húmeda, de color café a café naranja; cutícula desprendible con contexto

blanco. Contexto lleno carnoso de color blanco, de hasta 22 mm de ancho.

Himenio: poros circulares a hexagonales, de 2 a 3 por mm, de color blanco cuando

jóvenes a amarillo oliva en adultos, al maltrato se tornan cafés a café naranja. Al corte

transversal se observan tubos en forma de flauta, adheridos a subadheridos, fácilmente

desprendibles de hasta 20mm de longitud, de color amarillo oliva en jóvenes a café

naranja en adultos o áreas lastimadas.

Estípite: de hasta 242 mm de longitud, de 23 a 40 mm diámetro ápice y de 60 a 80 mm

diámetro base, superficie reticulosa hacia el ápice de color blanco, café claro a café de

fondo y blanquecino en la base. Contexto lleno, carnoso, fibriloso, de color blanco.

Olor y sabor: a hongo, ligeramente a ajo.

Microscopia: esporas cilíndricas a baciliformes, lisas pared gruesa, dextrinoides, de 10.0-

16.0 x 3.0-5.0 m.

Hábito: solitario o en pequeños grupos espaciados (2 o 3).

Hábitat: sobre el suelo en bosques de Pinus.

Lugar de procedencia: Ixchiguan, San Marcos (cooperativa).

Propiedades medicinales: posee ocho aminoácidos esenciales y promueve una buena

saludad si se consume regularmente.

Farmacología: los extractos de los cuerpos fructíferos han demostrado poseer,

propiedades antitumorales en ratones (una tasa de inhibición del 100% contra el sarcoma

180 y una tasa de inhibición del 90% contra el carcinoma Ehrlich), que podría atribuirse

algún péptido o proteína. El micelio de B. edulis no parece poseer propiedades

antitumorales. Los polisacáridos de B. edulis tuvieron una acción antagónica y

neutralizante sobre los mediadores de inflamación.

Uso tradicional en Medicina: se ha utilizado para tendones y tiene un efecto positivo

sobre el lumbago, dolor de piernas, entumecimiento de las extremidades, incomodidad en

los huesos y tendones, tétanos y leucorrea. Dosis: 9 gramos, 3 veces al día.

Observaciones: este hongo es consumido en las regiones de Huehuetenango y San

Marcos, se conoce tradicionalmente como Panbuk en idioma Chuj. Su valor puede

oscilar entre los Q95 a Q120 la libra.

89

Neolentinus ponderosus (Miller) Redhead & Ginns

Píleo de 47 a 78 mm de diámetro, convexo a plano, margen incurvado a recto, borde

entero, superficie seca, escamosa radialmente acentuándose hacia el borde, color beige a

café naranja, escamas de color café oscuro a café claro. Cutícula desprendible. Contexto

de hasta 15 mm de grosor, color blanco, consistencia carnosa esponjosa que se mancha de

naranja pálido al corte.

Himenio con láminas subdecurrentes, juntas, anchas, denticuladas, las láminas se

continúan con una línea hacia el estípite, color blanco a amarillento a veces tiñéndose de

café naranja. Lamélulas subtruncadas.

Estípite de 55 mm de longitud, 15 mm de diámetro en el ápice y 12 mm de diámetro

hacia la base, cilíndrico, superficie escamosa principalmente en la parte media la base,

color blanco con escamas color café oscuro, se mancha de café naranja pálido.

Olor y sabor: a hongo, suave.

Microscopia: esporas cilíndricas, de pared delgada, inamiloides, de 7.0-10.0 x 3.0-4.0

m.

Hábito: Gregario.

Hábitat: Crece sobre troncos de Pinus spp.

Observaciones: se conoce como comestible en San Mateo Ixtatán, Huehuetenango.

90

Cantharellus lateritius (Berk.) Singer

Píleo: de 15 a 112 mm de diámetro, plano convexo a infundibuliforme, margen

incurvado lobulado, borde entero, superficie lisa, finamente escamosa de color café

naranja en el centro, sobre un fondo de color amarillo a amarillo naranja pálido o café

naranja en adultos. Contexto: carnoso, de color blanco que se torna naranja pálido al

corte, de hasta 9 mm de ancho.

Himenio: liso o ligeramente arrugado, amarillento.

Estípite: 20 a 88 mm de longitud, atenuado hacia la base, superficie lisa o finamente

fibrilosa, de color amarillo pálido hacia el ápice, amarillo naranja pálido en el medio y

café naranja hacia la base. Contexto: lleno, carnoso de color blanco que al corte se torna

naranja pálido.

Olor y sabor: afrutado, ligeramente amargo.

Microscopia: esporas elipsoides, hialinas de 7.0 a 9.0 x 5.0 a 7.0 µm.

Hábito: solitario o en pequeños grupos (2 o 4).

Hábitat: sobre el suelo en bosques de Encino o mixtos Pino-Encino.

Lugar de procedencia: San Raymundo, Guatemala.

Observaciones: este hongo es consumido en casi todo el país, se conoce

tradicionalmente con el nombre de Anacate. Su valor puede oscilar entre los Q20.00 y

Q40.00 la libra.

91

Lactarius deliciosus (L.: Fr.) Gray

Píleo: 30 a 95 mm de diámetro, plano convexo, centro deprimido, margen recto, borde

entero a crenado, superficie de color naranja, con áreas blanquecinas y verdosas,

levemente zonado, cutícula desprendible con contexto naranja. Contexto carnoso,

poroso, de color blanquecino a naranja, de hasta 9 mm de ancho.

Himenio: láminas juntas, subdecurrentes, anchas, con lamélulas subtruncadas, ambas con

bordes lisos y de color naranja, que con el maltrato o paso del tiempo se tornan verdosas.

Estípite: de hasta 66 mm de longitud, cilíndrico, superficie tomentosa, de color naranja a

verdoso en ejemplares dañados o viejos, con algunas áreas blanquecinas, presentan un

anillo tomentoso blanco en la unión con las láminas y escrobículos en la base y en

algunos ejemplares desde el ápice a la base. Contexto canoso, poroso, hueco en el centro,

de color blanco y naranja hacia la cutícula.

Olor y Sabor: a hongo.

Microscopia: esporas subglobosas a ampliamente elipsoides de pared gruesa,

espiculadas, con papila apical reducida, amiloides, de 5 a 8.5 x 7.5 a 8.0 µm.

Hábito: solitario o en pequeños grupos espaciados (2 a 7).

Hábitat: sobre el suelo en bosques de Pinus.

Lugar de procedencia: San Juan Comalapa, Chimaltenango.

Observaciones: es uno de los hongos más consumidos en casi todo el país, es conocido

tradicionalmente como Xara. Su valor puede oscilar entre los Q5 a Q15 la medida.

92

Amanita garabitoana Tulloss, Halling & G. M. Muell. nom. prov. 24.2007

Píleo: de 55 a 186 mm de diámetro, convexo en jóvenes a planoconvexo en adultos,

centro umbonado, superficie seca, margen estriado, borde entero, de color café en el

centro que se decolora a tonos café amarillentos o café naranjas hasta amarillos en el

margen, cutícula poco desprendible con contexto amarillo claro. Contexto lleno, carnoso,

blanco y amarillo naranja en la unión con la cutícula, de hasta 10mm de ancho.

Himenio: láminas, libres, anchas, juntas, con lamélulas subtruncadas de diferentes

longitudes, ambas con bordes aserrulados, de color amarillo pálido.

Anillo: colgante, cara externa finamente estriada, algodonosa, de color amarillo naranja;

cara interna, lisa, algodonosa, de color blanco.

Estípite: de hasta 182 mm de longitud, cilíndrico, con escamas de color café naranja o

amarillo naranja, sobre un fondo blanquecino. Contexto de hasta 3mm de grosor, hueco

en el centro, de color blanco y amarillo naranja hacia la cutícula.

Volva: sacciforme, bilobulada, cara externa con superficie rugosa de color blanco y cara

interna con superficie lisa de color blanco.

Olor y sabor: a hongo.

Hábito: solitario o en pequeños grupos espaciados (2 o 4).

Hábitat: sobre el suelo en bosques de Quercus.

Lugar de procedencia: Tecpán, Chimaltenango.

Observaciones: este hongo es consumido en las regiones de Chimaltenango con bosques

de encinos, se conoce tradicionalmente con el nombre de Q’atzu en idioma Kaqchikel.

Su valor puede oscilar entre los Q15 y Q30 la medida y si el ejemplar es muy grande se

vende individualmente entre Q10 y Q15 la unidad.

93

PARTE V

V.1 INFORME FINANCIERO

AD-R-0013

Nombre del Proyecto:

Numero del Proyecto: 030-2007

Investigador Principal: Licda. Ana Margarita Paz

Monto Autorizado: Q361,735.00

Fecha de Inicio y Finalización: 01/08/2007 AL 31/01/2009 18 MESES

Menos (-) Mas (+)

1 Servicios no personales

181

Estudios, investigaciones y proyectos de

factibilidad 135,750.00Q 128,000.00Q 7,750.00Q

181

Estudios, investigaciones y proyectos de

factibilidad (Evaluación externa de

impacto) 8,000.00Q 8,000.00Q

122 Impresión, encuadernación y reproducción 3,000.00Q 3,000.00Q

133 Viáticos en el interior 3,000.00Q 3,000.00Q

163

Mantenimiento y reparación de equipo

médico-sanitario y de laboratorio 6,000.00Q 6,000.00Q

2 MATERIALES Y SUMINISTROS

213 Productos animales 2,500.00Q 2,500.00Q

214

Productos agroforestales, madera, corcho

y sus manufacturas 1,000.00Q 1,000.00Q

241 Papel de escritorio 600.00Q 600.00Q

243 Productos de papel o cartón 1,000.00Q 1,000.00Q

245 Libros, revistas y periódicos 4,000.00Q 4,000.00Q

249

Otros productos de papel, cartón e

impresos 517.44Q -517.44 Q

261 Elementos y compuestos químicos 53,000.00Q 22,974.53Q 30,025.47Q

262 Combustibles y lubricantes 2,000.00Q 2,000.00Q

267 Tintes, pinturas y colorantes 1,000.00Q Q1,500.00 2,500.00Q

268 Productos plásticos, nylon, vinil y pvc 22,000.00Q Q8,002.00 9,415.64Q 4,582.36Q

269 Otros productos químicos y conexos 2,000.00Q 2,000.00Q

272 Productos de vidrio 4,000.00Q 2,451.81Q 1,548.19Q

283 Productos de metal 4,000.00Q 4,000.00Q

291 Útiles de oficina 1,000.00Q 1,000.00Q

292 Útiles de limpieza y productos sanitarios 1,500.00Q 1,500.00Q

295

Útiles menores, médico-quirúrgicos y de

laboratorio 2,500.00Q Q8,002.00 10,501.43Q 0.57Q

299 Otros materiales y suministros 3,000.00Q Q1,500.00 1,500.00Q

PROPIEDAD, PLANTA, EQUIPO E

INTANGIBLES

323 Equipo médico-quirúrgico y de laboratorio 65,000.00Q Q6,470.00 12,849.18Q 45,680.82Q

324 Equipo educacional, cultural y recreativo 3,000.00Q Q6,470.00 9,470.00Q

GASTOS DE ADMÓN. (10%) 32,885.00Q 32,885.00Q -Q

361,735.00Q Q15,972.00 Q15,972.00 219,595.03Q Q142,139.97

MONTO AUTORIZADO 361,735.00Q Disponibilidad 142,139.97Q

(-) EJECUTADO 219,595.03Q

SUBTOTAL 142,139.97Q

(-) CAJA CHICA

TOTAL POR EJECUTAR 142,139.97Q

CATORCEAVA CON VOCATORIA

LINEA FODECYT

En Ejecuciòn

Grupo

TRANSFERENCIA

Nombre del Gasto Asignacion

Presupuestaria Ejecutado

Composición química y actividad inmunomoduladora y biocida de Basidiomicetos

comestibles de Guatemala.

Renglon Pendiente de

Ejecutar

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