Factores que influyen en la

actividad enzimtica

Las enzimas estn presentes en cantidades muy bajas

Generalmente en los laboratorios de determina actividad enzimtica y no concentracin

La unidad de actividad se expresa por unidades internacionales (UI)

UI se define como la cantidad de enzima que produce 1 umol de producto por minuto a 25C en condiciones estndar

Concentracin del sustrato

Concentracin de la enzima

Temperatura

pH

Activadores

Inhibidores

Factores relacionados con la velocidad

De las reacciones catalizadas

Concentracin de la Enzima

La velocidad de la reaccin aumenta cuando la

concentracin de la enzima es mayor

La velocidad se reduce cuando la

concentracin es menor

El valor de Km es independiente de la

concentracin enzimtica

Temperatura

Las reacciones catalizadas por enzimas se aceleran cuando la temperatura aumenta

Debido al incremento del movimiento de las molculas que provocan colisiones mas frecuentes del sustrato con la enzima

Cuando se alcanza el valor optimo, la velocidad de reaccin se reduce, ya que el incremento de temperatura provoca desnaturalizacin de la enzima y perdida de la actividad catalitica

LA mayora de las enzimas tienen un rango de temperatura optimo que en general es similar al del medio fisiolgico en el que funcionan

La desnaturalizacion comienza entre los 40 a 50C

Cada incremento de 1C da como resultado un aumento de un 10% de la actividad enzimtica

La mayora de los anlisis de enzimas con significado diagnstico se efecta a temperaturas de 25, 30 o 37C.

Mximo de

Actividad

Zona de

activacin

Zona de

Inactivacin

Temperatura

pH

La mayora de las enzimas tienen un rango de pH bastante restringido en el cual su actividad es optima

Los cambios de ionizacin de la enzima o el sustrato explican los efectos del pH

Si se produce una ionizacin de los grupos aminados del sitio activo o cerca de el, ocurre cierto grado de desnaturalizacin de la enzima

Aunque casi todas las enzimas con significado clnico tienen actividad optima a pH neutro, algunas exhiben actividad optima a pH inferior o superior

Para evitar que el pH vare en forma

considerable durante la reaccin enzimtica,

se incorporan soluciones amortiguadoras a

la mezcla de reaccin al determinar la

actividad enzimtica

pH

100

50

0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Pepsina

Tripsina

Fosfatasa

Alcalina

Activadores Incrementan la velocidad de una reaccion enzimatica

Son moleculas o iones pequeos

Zn, Mg, Fe, Mn

Proporcionan un sitio activo electropositivo que atrae a los grupos con carga negativa del sustrato

Otros tienen funcin estructural y ayudan a estabilizar la estructura terciaria y cuaternaria de la enzima

Las coenzimas son similares a los activadores ya que algunas enzimas requieren que estas molculas orgnicas estn presentes para que su actividad enzimtica sea completa.

Las coenzimas como el NAD y NADP+ actan como aceptores de electrones o donadores en reacciones de deshidrogenasas y funcionan mas como un segundo sustrato que como activadores

Al igual que el sustrato, se requiere que la

coenzima este presente en concentracin

suficiente para que la reaccin se lleve a

cabo a la velocidad correcta

Inhibidores

Son sustancias que inhiben selectivamente

la accin de determinadas enzimas

Se enlazan con diferentes sitios de la

molcula enzimtica y producen efectos

como la variacin de la velocidad de

reaccin.

Los hay competitivos y no competitivos

Inhibidores competitivos

Son similares a las molculas de sustrato normal y

compiten con ella para enlazarse al sitio activo de

una enzima especfica

La inhibicin competitiva se invierte aumentando

la concentracin del sustrato

Algunos ejemplos son las sulfonamidas y otras

sustancias que actan como anlogos de sustrato e

inhiben reacciones enzimticas en los

mircoorganismos

Inhibicin no competitiva Se produce cuando una sustancia se enlaza con la enzima en un sitio distinto al sitio activo.

Este enlace provoca cambio de la configuracin en la estructura enzimtica alterando el sitio activo que deja de ser receptivo para el sustrato

Es reversible o irreversible segn sea el tipo de enlace que se forme

El enlace covalente hace que la unin sea irreversible

Algunos ejemplos son los iones de metales pesados como plomo y mercurio

Otros se encuentran en el laboratorio y en ocasiones interfieren con los anlisis enzimticos (Detergentes que contaminan el material de vidrio)

I. Acompetitiva: Es cuando el inhibidor se enlaza con el complejo E-S para formar un complejo E-S-I que no da lugar a producto

CONCENTRACIN DE

SUSTRATO

Para que una enzima ejerza su actividad cataltica debe combinarse con el sustrato y existir temporalmente como complejo ES.

La actividad enzimtica es una medida de la conversin S P

Si la enzima no se enlaza con el sustrato no ejerce actividad enzimtica y por tanto se obtiene un valor bajo falso al efectuar el anlisis

As la concentracin del sustrato es un factor muy importante que influye en la velocidad de las reacciones enzimticas

La velocidad de una reaccin enzimtica aumenta conforme la concentracin de sustrato se incrementa

A medida que hay molculas de S disponibles, hay mas probabilidad que se enlacen con los sitios activos de la enzima, lo que permite que esta ltima ejerza su actividad al mximo de la velocidad (Vmax)

Sin embargo, en determinado momento se alcanza la Vmax, y el incremento de la concentracin del sustrato mas alla de este punto no aumenta la velocidad

A la Vmax, la concentracin de sustrato es

suficientemente alta para que todas las

molculas enzimticas tengan los sitios activos

ocupados.

Tan pronto como una molcula de producto

sale del sitio activo, entra otra a l.

Velo

cidad

de la R

eaccin

Concentracin del Sustrato

Vmax

Vmax

Km

Grfica de Michaelis-Menten

Reaccin 1er orden Reaccin orden cero

Cintica Enzimtica

Grfica de Michaelis-Menten

Durante la fase inicial de la reaccin la velocidad es casi lineal con respecto a la concentracin de sustrato [S].

En esta fase de la curva la reaccin sigue una cintica de primer orden, de manera que la velocidad es directamente proporcional al [S].

En la segunda fase se alcanza una meseta y la reaccin adquiere una cintica de orden cero, es decir, la velocidad de reaccin es independiente de la [S].

En la fase II se alcanza la Vmax y cualquier incremento adicional de sustrato ya no modifica la velocidad

En la cintica de orden cero todas las mlculas enzimticas estn saturadas de sustrato y slo existen en forma de complejo ES.

En contraste en la cintica de primer orden, la concentracin de sustrato [S] limita la velocidad, ya que no esta presente en suficiente cantidad para saturar todos los sitios activos de la enzima.

Es posible determinar con precisin Vmax y Km ya que es fcil medir la pendiente y la interseccin en la grfica

Km es una constante cuyo valor permanece sin cambio para cada par enzima-sustrato dado.

El valor de Km es en la mayora de los casos, independiente de la cantidad de enzima o sustrato que se emplea para determinarlo

Sin embargo cuando una enzima de baja especificidad cataliza mas de una reaccin, el valor de Km para cada enzima sustrato indica qu sustrato tiene mayor afinidad con la enzima

Un valor de Km bajo indica mayor afinidad hacia el sustrato. Adems cualquier modificacin en las condiciones de reaccin que afecte al enlace de la enzima con el sustrato altera el valor que se observe para Km.

Las enzimas no saturadas no pueden ejercer su actividad enzimtica real y por lo tanto es imposible medirlas

Al efectuar el anlisis enzimtico en el laboratorio, es fundamental que [S] sea suficientemente elevada para favorecer la saturacin de la enzima.

Todas las reacciones deben tener cintica de orden cero para permitir una determinacin enzimtica mas precisa.

Con el fin de asegurar que una reaccin enzimtica tenga cintica de orden cero durante un anlisis, es necesario proporcionar la concentracin ptima de sustrato para la reaccin

La constante de Michaelis-Menten que se conoce como valor Km es til para determinar una [S] que no limite la velocidad de reaccin

Km representa la concentracin de sustrato en moles/litro cuando la V inicial es un de la Vmax.

El valor de Km se determina a partir de la grfica de Michaelis-Menten

Cuando se conoce Km es posible establecer de manera aproximada el orden de reaccin a determinada concentracin de sustrato

Cuando la [S] > Km por un factor de 100, la reaccin tiene cintica de orden cero

Cuando la [S] < Km por un factor de 100, la reaccin tiene cintica de primer orden

Grfica del doble recproco

Por ser la grfica de Michaelis-Menten una hiprbole, puede expresarse mediante la ecuacin:

V = Vmax[S]

Km + [S]

En esta ecuacin, es en cierto punto difcil calcular el valor de Km puesto que la determinacin de la Vmax se vuelve mas bien apreciativa al tratarse de una acntota.

Por tal motivo, surgi La ecuacin de Lineweaver-Burk que toma la forma recproca de la ecuacin de M-M para producir una ecuacin de lnea recta

1 = Km 1 + 1 y = mx + b

V Vmax [S] Vmax

Donde y = 1/V, x = 1/[S] y m = Km/Vmax

Grfica Lineweaver-Burk

Inver

so d

e la

Velo

cidad

de la

Rea

cci

n

Inverso de la Concentracin del Sustrato

1/Vmax

-1/Km

1/V

1/[S]

Pendiente= Km/Vmax