Cinética Microbiana

Crecimiento microbiano

Para los microorganismos, el crecimiento es la respuesta más inmediata al medio fisicoquímico. El

crecimiento es el resultado de la replicación y cambio en el tamaño de la célula. Los

microorganismos pueden crecer bajo una gran variedad de condiciones físicas, químicas y

nutricionales. En un medio ideal, los microorganismos extraen nutrientes del medio y los convierten

en compuestos biológicos. Los nutrientes, entonces, se emplean para la producción de energía y

para la biosíntesis y formación de productos. Como resultado la masa microbiana aumenta con el

tiempo y puede ser descrita como:

Sustrato + células → productos + células nuevas

El crecimiento microbiano es un excelente ejemplo de una reacción auto catalítica. La tasa de

crecimiento está directamente relacionada a la concentración celular, y la reproducción celular es un

resultado de dicha reacción.

La tasa de crecimiento microbiano se caracteriza por una tasa específica de crecimiento (µ) definida

como:

Donde X es la concentración másica celular (g/L), t es el tiempo (h) y µ es la tasa especifica de

crecimiento (h-1).

El crecimiento se puede ilustrar a través de una curva que representa la relación entre el número de

microorganismos y el tiempo, como se observa en la figura 1. La curva de crecimiento microbiano

tiene seis etapas claramente diferenciables.

Figura 1. Curva de crecimiento microbiano y sus distintas fases

I. Fase Lag: Durante esta etapa la razón de crecimiento es nula. La fase lag ocurre

inmediatamente después de la inoculación y es un periodo de adaptación de las células

a su nuevo ambiente. En esta etapa, la célula puede llegar a crecer un poco, sin

incrementar en lo absoluto el número de células. Cuando el inoculo es pequeño y tiene

una fracción numérica celular viable baja, puede existir una fase pseudo-lag, la cual no

se debe a la adaptación sino al mal estado del inoculo. Bajas concentraciones de

algunos nutrientes y la falta de factores de crecimiento pueden prolongar la fase lag. Así

mismo, la edad del inoculo tiene una gran repercusión en la duración de la fase lag:

generalmente, a mayor edad del inoculo, mayor será el tiempo de la fase lag. La fase lag

no ocurre cuando el inoculo se encuentra en un estado metabólico de crecimiento

exponencial durante su transferencia.

II. Fase de crecimiento acelerado: En esta etapa, la tasa de crecimiento aumenta

gradualmente, alcanzando un máximo nivel al final de la etapa. Los factores que afectan

esta etapa, son comúnmente, los mismos que afectan a la fase lag.

III. Fase de crecimiento exponencial: Durante esta etapa, las células se han adaptado al

nuevo entorno. Después del periodo de adaptación, las células pueden multiplicarse

rápidamente y la masa y la densidad celular aumentan exponencialmente con el tiempo,

es un periodo de crecimiento balanceado en el que todos los componentes celulares

crecen a la misma velocidad. Durante este crecimiento balanceado, la tasa específica de

crecimiento determinada por el número de células o masa celular será igual. Como la

concentración de nutrientes es elevada en esta, la tasa de crecimiento es independiente

de la concentración de nutrientes, el crecimiento exponencial se vuelve de primer orden:

IV. Fase de crecimiento retardado: Esta fase empieza cuando uno de los sustratos

esenciales se vuelve limitante o se acumulan subproductos tóxicos generados durante la

etapa de crecimiento. Durante esta etapa, la tasa de crecimiento específico depende de

la concentración del sustrato limitante. En esta etapa de desaceleramiento se produce

un crecimiento desbalanceado.

V. Fase estacionaria: En esta etapa el crecimiento neto es cero o igual a la tasa de muerte.

A pesar de que el crecimiento sea cero, durante ésta las células continúan

metabolizando activamente y produciendo metabolitos secundarios en etapas de no

crecimiento. La producción de metabolitos secundarios, en procesos biotecnológicos

específicos, se estimula voluntariamente durante esta etapa. Durante la fase

estacionaria, las células catabolizan reservas celulares para la construcción de nuevos

bloques y generación de energía (metabolismo endógeno). La razón para la culminación

del crecimiento es por abatimiento de nutrientes y/o acumulación de sustancias toxicas;

si productos inhibidores se acumulan a cierto nivel, el crecimiento cesará por inhibición.

VI. Fase de declinación o muerte: Inicialmente después de la fase estacionaria, ocurre la

fase de muerte; debido a que ya en la etapa estacionaria existe muerte celular, las

distinción precisa del momento en el que sucede la fase de declinación no es clara. La

tasa de muerte usualmente ocurre como una cinética de primer orden:

Durante la fase de muerte, las células pueden o no efectuar lisis, y el restablecimiento

del cultivo puede ser desarrollado durante una etapa temprana de la fase de decline, si

las células son transferidas a un medio rico en nutrientes.

Metabolitos primarios y secundarios

El metabolismo es el conjunto de procesos y reacciones químicas anabólicas (requieren energía) y catabólicas (liberan energía); por los cuales un microorganismo obtiene la energía y los nutrientes que necesita para vivir y reproducirse. Los microorganismos utilizan numerosos tipos de estrategias metabólicas distintas y las especies pueden a menudo distinguirse en base a estas estrategias. Las características metabólicas específicas de un microorganismo constituyen el principal criterio para determinar su papel ecológico, su responsabilidad en los ciclos biogeoquímicos y su utilidad en los procesos industriales. Metabolitos primarios. Se producen en el curso de las reacciones metabólicas anabólicas o catabólicas que tiene lugar durante las fases decrecimiento y que contribuyen a la producción de biomasa o energía por las células. Se producen principalmente en la tropofase o fase de crecimiento.

Son necesarios para el crecimiento del m.o que los produce

Se producen como productos únicos

Son producidos por todos los microorganismos (son universales)

La producción no puede perderse fácilmente por mutación espontanea

Los más importantes desde el punto de vista industrial son 1- Componentes esenciales y productos formados por los microorganismos: proteínas, ácidos nucleicos, polisacáridos (dextranos, alginatos, gelanos, xantanos) y poliésteres (PHB y plásticos), ácidos grasos (saturados e insaturados), esteroles (ergosterol) 2- Derivados del metabolismo intermedio: azucares (fructosa, ribosa, sorbosa), ácidos orgánicos (gluconico, ácido láctico, cítrico, acético, propionico, succínico, fumarico), alcoholes (xilitol, etanol, glicerol, sorbitol, butanol), aminoácidos (Lys, Thr, Glu, Trp, Phe), vitaminas (carotenos, B2, B12), nucleótidos saborizantes (ácidos inocinico y guanilico), polisacáridos y poliésteres de reserva.

Metabolitos secundarios. Se producen por rutas anabólicas especializadas cuando no hay crecimiento. Significado evolutivo controvertido por ser imprescindibles. Pueden ser una estrategia para mantener en funcionamiento los sistemas metabólicos cuando no hay crecimiento; también sirven como indicativos de diferenciación y se producen durante la idiofase de los cultivos. Entre sus características comunes; tienden a producirse cuando el crecimiento está limitado (cultivo continuo); se forman por enzimas específicos a partir del metabolismo central; no son esenciales para el crecimiento o para el metabolismo central y son específicos para cada especie, y a veces, de cada cepa.

Generalmente se producen como mezclas de productos muy relacionados químicamente entre si

La producción puede perderse fácilmente por mutación espontanea

Cada uno de estos productos es producido por un grupo muy reducido de organismos Clasificación de los productos que se pueden obtener de los microorganismos (según que función cumplan dentro del metabolismo) I. Productos finales del metabolismo energético. Son ejemplos de este grupo el etanol, ácido

láctico, acético, butírico, butanol, y otros compuestos asociados a procesos anaerobios. Su formación es consecuencia directa de la degradación de la fuente de carbono para obtener energía

II. Productos intermedios de metabolismo primario. Pertenecen a este grupo los aminoácidos, los nucleótidos, las vitaminas, los ácidos orgánicos, y pueden incluirse también biopolímeros como enzimas. Los procesos de obtención son aerobios y la formación de estos productos ocurre principalmente en organismos que han sido sometidos a mutaciones o que se los hace crecer en medios deficientes. En cualquier caso lo que se pretende es lograr una regulación anormal del metabolismo tal que la fuente de carbono y energía se derive hacia la formación del producto deseado. En general, y a diferencia de los productos pertenecientes al primer grupo, no existe una relación directa entre la generación de energía y la síntesis de los productos de este grupo.

III. Productos de metabolismo secundario. Pertenecen a este grupo los antibióticos, las toxinas, los alcaloides y las giberelinas. Históricamente se ha considerado a los metabolitos secundarios como aquellos que no son indispensables para las funciones vitales del microorganismo, a diferencia de los metabolitos primarios, aunque tal afirmación se encuentre actualmente en revisión. Cualquiera sea el caso, existen algunas características que diferencian a este grupo del anterior. Frecuentemente los precursores específicos para la biosíntesis de estos productos son obtenidos por modificación de metabolitos primarios. Por otra parte estos precursores suelen ser limitantes de la biosíntesis. El cultivo continuo y el batch alimentado son sistemas de cultivo que permiten regular la velocidad de crecimiento, y por tanto muy apropiados para obtener este tipo de productos. Los productos de este grupo comparten con el anterior la necesidad de un adecuado suministro de oxígeno para su formación. Cuando este requisito no es satisfecho los rendimientos disminuyen

Medidas del crecimiento celular

El crecimiento de una población se mide a través de:

Métodos directos:

Numero de células

Peso de la biomasa

Métodos indirectos:

Consumo de nutrientes

Formación de productos

Calorimetría

ATP

La selección del método para cuantificar el crecimiento microbiano, depende de:

Propiedades de la biomasa (bacterias, hongos)

Propiedades del medio de cultivo

Sensibilidad requerida

Confianza del método

Velocidad necesaria

Métodos directos

Medida del numero de células:

o Cuenta directa (microscopio): conteo total de células → cámaras especiales

o Cuenta en placa: conteo solo de células viables

Medida de la masa celular

o Peso seco: Filtración (<0.2 µm) de la suspensión de biomasa → peso del filtro +

biomasa. Centrifugación

o Turbidez: cuantificación de la densidad óptica de una suspensión de células →

curva patrón con numero conocido de células

o Volumen celular empacado: para células empacadas

Cinética Microbiana

El crecimiento microbiano es un fenómeno totalmente complejo debido al número y tipo de

reacciones llevadas a cabo a lo largo de su desarrollo, así como su dependencia a factores externos

que pueden ejercer influencia sobre el mismo. Por ello, el entendimiento de la dinámica de

crecimiento microbiano se clarifica en términos de una descripción cinética.

Definiciones

Crecimiento: incremento ordenado de los constituyentes químicos de los microorganismos. Aumento

en el número de células o en la masa celular.

Tasa de crecimiento: cambio en el número de células o masa celular por unidad de tiempo

Tiempo de duplicación (td): tiempo necesario para que a partir de una célula se formen dos (para

que se duplique)

Numero de generaciones (n): numero de divisiones celulares en un determinado tiempo.

Crecimiento exponencial

Durante la fase exponencial → incremento de la población en el que el número de células se duplica

cada cierto tiempo

Representando lo anterior en forma grafica

Obtener información sobre la tasa de crecimiento a partir de curvas aritméticas es difícil → escala

logarítmica (línea recta)

Tiempo de duplicación

El numero de veces que se duplica la biomasa en un cierto tiempo esta dado por:

Donde n= numero de generaciones; t= tiempo del cultivo; td= tiempo de duplicación

La concentración de biomasa después de cierto tiempo de crecimiento exponencial puede

cuantificarse, en función de la biomasa inicial, a través de:

⁄

Donde x= numero final de células; x0= numero inicial de células

Con base en las ecuaciones anteriores, si conocemos las poblaciones inicial y final, podemos

calcular el número de generaciones (n) y el tiempo de duplicación

⁄ ⁄ ⁄ ⁄ ⁄

Velocidad especifica

de crecimiento (µ)

Tasa especifica de crecimiento (µ)

Velocidad a la cual una población microbiana se duplica en un tiempo determinado (fase

exponencial)

Velocidad especifica de crecimiento

A pesar de que el crecimiento de las células es un fenómeno complejo, a menudo se puede obtener

una descripción global buena del mismo a través de ecuaciones relativamente sencillas. Entre ellas

la más usada es la ecuación de Monod, esta ecuación describe el crecimiento celular en función de

la disponibilidad de un sustrato limitante y se puede expresar de la siguiente manera:

Sustrato (S) + Células (X) → mas células (X) + Producto (P)

Donde rx es la velocidad de crecimiento de células, µmax es la velocidad específica máxima de

crecimiento y KS es la constante de Monod (constante de afinidad por el sustrato).

KS es el valor de la concentración del nutriente limitante a la que la velocidad específica de crecimiento es la mitad de la máxima. Para valores de S inferiores a Ks, la velocidad de crecimiento depende de una forma lineal de S, mientras que para valores superiores, el valor de µ se hace independiente de S.

Figura 2. Dependencia de la velocidad específica de crecimiento respecto a la concentración de

sustrato limitante según la ecuación de Monod.

Rendimientos Los rendimientos se definen como la relación entre el producto obtenido y el sustrato consumido, usualmente referidos a la fuente de carbono y energía. El rendimiento celular se define a través del concepto de nutriente limitante. Un nutriente limitante es aquel sustrato cuyo consumo controla la velocidad de producción de biomasa, es decir, que la velocidad de crecimiento celular es función de tal nutriente. En muchos casos existen más de un nutrientes u otros factores que intervienen en dicha velocidad, pero para simplificar se considera siempre que uno es esencial y el más importante.

⁄

El sustrato normalmente es la fuente de carbono. El consumo de sustrato no está dedicado sólo a la producción de biomasa, este tiene tres usos: asimilación de los microorganismos como material celular, provisión de energía para la síntesis celular y energía para el mantenimiento celular

⁄

El rendimiento teórico se define como ⁄ que es el sustrato empleado en la asimilación de los microorganismos como material celular, también se llama el rendimiento del crecimiento, este rendimiento permanece constante si la composición celular se mantiene constante. Sin embargo el rendimiento global dependerá de la fracción de sustrato consumido en cada una de las actividades celulares. Existen otros rendimientos referidos a otros parámetros del proceso o en función de otras variables. Estos pueden ser como los que siguen a continuación:

Con todo esto se puede escribir la siguiente ecuación:

Donde rs es la velocidad de desaparición de sustrato, rx es la velocidad de aparición de biomasa, rp es la velocidad de aparición de producto y rc es la velocidad de aparición de CO2. Cinética del consumo de sustrato

El sustrato es consumido por el microorganismo tiene como finalidad el crecimiento celular, mantenimiento de las actividades vitales y la generación de producto, para el caso donde la formación de producto no esté asociada de forma directa al metabolismo energético. Para modelar la variación de la concentración de sustrato con el tiempo se proponen diversas ecuaciones.

⁄

⁄

⁄

⁄

⁄

La ecuación cinética global será:

⁄

⁄

Cinética de formación de producto De manera análoga al modelo cinético de consumo de sustrato se plantean diferentes ecuaciones para modelar la formación de producto.

⁄

⁄

Y mediante el uso de las dos condiciones anteriores se obtiene el modelo de Luediking-Piret, parcialmente asociado al crecimiento