CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA...

CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

FCEyN-INTI

Materia de Articulación CEBI_A4Química Biológica

Docente a cargo:Marta Blanca Mazzetti

CEBI_A4_3 : Enzimas

Enzimas

Un poco de historia…

Se reconocen catalizadores biológicos al estudiar la degradación de carnes por secreciones estomacales

Se observa conversión de almidón a azúcar

1700s

1800s Se observa conversión de almidón a azúcar por saliva y extractos vegetales

La fermentación de azúcar a alcohol por levaduras es catalizada por fermentos que son inseparables de las células vivas de levadura

1800s

1850s

Un poco de historia…

Buchner: extractos de levaduras pueden fermentar azúcar a alcohol

Sumner: aísla y cristaliza ureasa ⇒ todas las

1897

1926

ENZIMAS (Gk enzymos = levado)Kühne

Sumner: aísla y cristaliza ureasa ⇒ todas las enzimas son proteínas

Pepsina, tripsina y otras enzimas digestivas se aíslan y cristalizan y son proteínas

1926

1930s

1930s Haldane: interacciones débiles entre enzima y sustrato podrían usarse para catalizar reacción

Los Protagonistas…

¿ Qué sabemos hoy de las enzimas ?

� Exceptuando las ribozimas, son todas proteínas

� Actividad catalítica requiere proteína nativa

� Tamaño muy variable: PM entre 104 - 106

� Algunas requieren componente químico adicional para su actividad

COFACTOR o COENZIMA

Algunos cofactores son iones metálicos…

…Otros son moléculas orgánicas complejas

Coenzimas que transfieren Coenzimas que

COENZIMAS

Coenzimas que transfieren grupos de átomos

Coenzimas que transfieren electrones

Coenzimas que transfieren electrones

Coenzimas que transfieren grupos de átomos

Muchas coenzimas son metabolitos de las vitaminas

¿ Qué son las vitaminas ?

� Compuestos que son esenciales para la salud y que no pueden ser sintetizados por el

organismo

� Deben ser incorporados en la dieta� Deben ser incorporados en la dieta

� Su deficiencia genera enfermedades por carencia

� Se dividen en dos grupos de acuerdo con su solubilidad

Vitaminas Liposolubles

Vitaminas Hidrosolubles

Vitaminas HidrosolublesVitaminas Hidrosolubles

Volvamos a nuestras enzimas…Volvamos a nuestras enzimas…

Clasificación de enzimas…

E.C.w.x.y.z.

Un ejemplo…la hexoquinasa

ATP + D-glucosa → ADP + D-glucosa-6-fosfato

E.C.2.7.1.1.E.C.2.7.1.1.

transferasa

fosfotransferasa

P-transferasa con HO como aceptor

D-glucosa como aceptor del P

Las enzimas son catalizadores extraordinarios

� Condiciones de funcionamiento

� Especificidad

� Magnitud de la aceleración de la velocidad de reacción

¿ Cómo funcionan las enzimas ?¿ Cómo funcionan las enzimas ?

S

ST

Energía Libre (G)

En

erg

ía re

qu

erid

a S

P

Dirección de Reacción

En

erg

ía re

qu

erid

a

T = Estado de transición

Adapted from Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.166

E S+ P+SE E

¿Qué pasa en presencia de una enzima?

E S+ P+SE E

La enzima estabiliza el Estado de Transición

EST

ST

Cambio en Energía

En

erg

ía re

qu

erid

a (n

o ca

tálisis)

En

erg

ía d

ismin

uye

(catá

lisis)

S

P

ES

ES

EP

Dirección de Reacción

En

erg

ía re

qu

erid

a (n

o ca

tálisis)

En

erg

ía d

ismin

uye

(catá

lisis)

Adapted from Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.166

¿ Cómo lo logra ?

Sitio activo

El sitio activo…El sitio activo…

�� Proporciona una superficie catalíticaProporciona una superficie catalítica

�� EEstabiliza estado de transiciónstabiliza estado de transición

�� Transforma el estado de transición en productoTransforma el estado de transición en producto

B

BA Superficie catalítica

A

Juang RH (2004) BCbasics

¿ Cómo estabiliza el sitio activo el estado de transición ?

Posee grupos reactivos+Evita influencia del agua

-


Optimiza interacción con S

La enzima no es perfectamente complementaria al sustrato sino al

estado de transición(Linus Pauling, 1946)

X

Ajuste inducido

(Koshland, 1958)

Adapted from Nelson & Cox (2000) Lehninger Principles of Biochemistry (3e) p.252

Hexoquinasa

D-glucosa

El sitio activo…El sitio activo…

�� Proporciona una superficie catalítica

�� Estabiliza estado de transición

�� Transforma el estado de transición en producto

B

BA Superficie catalítica

A


Cinética EnzimáticaCinética Enzimática

Orden 0VoV

[S]

Orden 1

ES

Otra vez un poco de historia…

Victor Henri: reacción E + S → ES etapa necesaria en catálisis enzimática

Michaelis y Menten: Teoría General de la Catálisis Enzimática

1903

1913

Las condiciones de M-M

E + S ESk1

k2

E + Pk3

k4

rápida lenta*

ESTADO ESTACIONARIO: producción y consumo del complejo ES proceden a la misma velocidad ⇒

se mantiene constante la concentración de ES

S P

Co

nce

ntra

ción

E

ES

Tiempo de reacción

Co

nce

ntra

ción


ET

EE

Vo

VmVo = Vm

Vo = Vm [S]

[S]

½ Vm

Km

Vo = Vm [S]Km

Vo = Vm [S]Km + [S]

Y siguiendo con la hexoquinasa…

Glucosa + ATP → Glc-6-P + ADPGlucosa Alosa Manosa

CHO

H-C-OH

HO-C-H

CHO

H-C-OH

H-C-OH

CHO

HO-C-H

HO-C-H

Km = 8 8.000 5 mM

HO-C-H

H-C-OH

H-C-OH

H2-C-OH

H-C-OH

H-C-OH

H-C-OH

H2-C-OH

HO-C-H

H-C-OH

H-C-OH

H2-C-OH


Cinética MichaelianaCinética Michaeliana

Vo

VmVo = Vm

Vo = Vm [S]

[S]

½ Vm

Km

Vo = Vm [S]Km

Vo = Vm [S]Km + [S]

¿ Qué pasa con MM cuando la reacción catalizada tiene más de un sustrato ?

ATP + D-glucosa → ADP + D-glucosa-6-fosfato

Distintos mecanismos posibles…

¿Cómo hacemos en la práctica para obtener práctica para obtener

Vm y Km?

Recopilando…

1)1) Usar una cantidad definida de Enzima → E

2)2) Agregar sustrato en varias concentraciones → S

3)3) Determinar Producto a Tiempo Fijo (P/t) → vo

4)4) Estimar Vmax yKm

Vmax

Km S

vo

1/S

1vo

Doble recíproca

Gráfico Directo1

Vmax

- 1 Km

1/2

Jua

ng

RH

(2

00

4)

BC

ba

sics

¿Cómo medimos la cantidad de enzima?

UNIDAD ENZIMÁTICA

UNIDAD ENZIMÁTICA (UE)

Cantidad de enzima que cataliza formación de determinada cantidad de producto en la unidad de tiempo, en

condiciones de velocidad máxima

UEActividad

Específica =Proteína (mg)Específica =

¿Cómo puedo comparar la eficiencia de distintas eficiencia de distintas

enzimas?

E + S ES E + Pk2

k1 k

3

En condiciones saturantes Vm = k3 ETEn condiciones saturantes Vm = k3 ET

k catalíticaNúmero de recambio

Algunos ejemplos…

kcat / kmConstante de especificidad

Inhibición de la actividad enzimática

Algunos inhibidores son irreversibles…

Se unen covalentemente (o no) o destruyen grupo funcional clave para

catálisis

Inhibidores suicidas

Diseño racional de fármacos

Un ejemplo real…la Enfermedad del Sueño

Trypanosoma brucei

Inhibidor suicida de la Ornitín decarboxilasaprimera enzima en biosíntesis poliaminas

Difluorometilornitina

¡¡¡Y otros inhibidores son evidentemente reversibles!!!!!

Existen distintos tipos de inhibición reversible…

I

I

S

S

S IIII

IIII

IIII II

S

Competitiva No-competitiva Incompetitiva

E

E

Compite por

Sustrato

Dib

ujo

Gu

ía

E

I

S

ISSitio diferente

Compite por Sitio activoInhibidorD

ibu

jo G

uía

Ecuación y Descripción

[II] se une a [E] libre solo,y compite con [S];aumento de [S] eliminala Inhibición por [II].

[II] se une a [E] libre o [ES] complejo; aumento de [S] noelimina [II] inhibición.

[II] se une al [ES] complejo Solo; aumento [S] favorecela inhibición por [II].

E + S→ES →E + P+II

↓

EII

←

↑

E + S→ES →E + P+ +II II

↓ ↓

EII+S→EIIS

←

↑ ↑

E + S→ES →E + P+II

↓

EIIS

←

↑

I

Inhibición Reversible

IIII IICompetitiva No-competitiva Incompetitiva

Grá

fico

Dir

ect

o Vmax Vmax

vo

vo

II II

Vmax

IIVmax’Vmax’

Km

Grá

fico

Dir

ect

oD

ob

le R

ecí

pro

ca

Km Km’ [S], mM [S], mM Km [S], mMKm’

Vmax no cambiaKm aumenta

Vmax disminuyeKm no cambia Vmax & Km disminuyen

II

1/[S]1/Km

1/vo

1/Vmax

IIII1/v

o

1/Vmax

1/[S]1/Km 1/[S]1/Km

1/Vmax

1/vo

= Km’

Una aplicación clínica y curiosa de la inhibición competitiva…

¡ Emborrachar a los individuos intoxicados con metanol !

�

Alcoholdeshidrogenasa

metanol Formaldehído �deshidrogenasa

etanol es inhibidor competitivo

Infusión lenta y continuada de etanol ☺

Otra aplicación clínica importante de la inhibición competitva: las sulfamidas

-COOHH2N-

PrecursorAcidofólico

Acido p-aminobenzoico (PABA)

Bacterias necesitan

PABA para

-SONH2H2N-

Precursor fólico

Sulfanilamida

biosíntesis de ácido

fólico

Estructura similar al PABA, inhibe el crecimiento bacteriano.

Adapted from Bohinski (1987) Modern Concepts in Biochemistry (5e) p.197

Cinética Michaeliana: Resumen

vo= Vmax [S]

Km+ [S]

&

1er orden

Orden cero

Directo

kcat

Número de

recambio

kcat/K

m

Significa:

Km

Vmax &

Competitiva

No-competitiva

Incompetitiva

Doble recíprocaAfinidad consubstrato

VelocidadMáxima In

hib

ición

k3[Et]

UE

1 µmolmin


Grupos específicos en el sitio activo contribuyen a la catálisis a través de distintos mecanismos

� Catálisis covalente

� Catálisis con ión metálico� Catálisis con ión metálico

� Catálisis ácido-base

Catálisis ácido-base

Asp102

His57

Ser195

Tríada CatalíticaTríada Catalítica

HH

Mecanismo Catalítico de Quimotripsina A1

NC[HOOC] C C [NH ]

O

N

C

C

N

[HOOC]H

O

C

C

N

C

C

[NH2]

Chequear especificidad de sustrato

Asp102

His57

Ser195HH


O

Primer Estado de Transición

HH


O

Intermediario Acil-Enzima

H

Mecanismo Catalítico de Quimotripsina D1

O

Intermediario Acil-Enzima Agua

H

Mecanismo Catalítico de Quimotripsina D2

O

O

Segundo Estado de Transición

OH

H

Mecanismo de Catálisis de Quimotripsina D3

O

OOH

Des-acilación

Carga en el Sitio A

ctivo

Ser195

His 57

Asp 102

H–O–CH2

OC–O -=

H–N N

C C

C

H

H

CH2

Ad

ap

ted

fro

m A

lbe

rts

et

al (

20

02

) M

ole

cula

r B

iolo

gy o

f th

e C

ell

(4e

) p

.15

8

Ser Activa

Ser195

His 57

Asp 102

-O–CH2

OC–O–H

=

N N–H

C C

C

H

H

CH2

Ad

ap

ted

fro

m A

lbe

rts

et

al (

20

02

) M

ole

cula

r B

iolo

gy o

f th

e C

ell

(4e

) p

.15

8

Catálisis Acido-Base

(20

00

) L

eh

nin

ger

Prin

cip

les

of

Bio

che

mis

try

(3e

) p

.25

2

Induce el estado de transición

ONH

+

CatálisisAcido-base Catálisis

Acida

Ad

ap

ted

fro

m A

lbe

rts

et

al (

20

02

) M

ole

cula

r B

iolo

gy o

f th

e C

ell

(4e

) p

.16

7

NH

+

Especificidad

HO

H

Ad

ap

ted

fro

m N

els

on

& C

ox

(20

00

) L

eh

nin

ger

Prin

cip

les

of

Bio

che

mis

try

(3e

) p

.25

2

CO

=

NH

HCH

NH

C- OOH

OH

-δ

+δ

HO

H

CO

=

NH

HCH

CO

=

NH

HCH

CO

=

NH

HCH

Lenta Rápida Rápida Muy rápida

Catálisis

Básica

Ambas

Ad

ap

ted

fro

m A

lbe

rts

et

al (

20

02

) M

ole

cula

r B

iolo

gy o

f th

e C

ell

(4e

) p

.16

7

NH

C- OO

HO

H

Mecanismo Concertado de Catálisis

3 4

O-

H

+ H

COO-

(270)Glu

(248)Tyr

O-

H

Carboxipeptidasa A

SITIO

ACTIVO

SITIO

ACTIVO

Sitio para

especificidad

Bolsillodel SitioActivo

NC

1

2

5

O

His(196)

His (69)

Glu(72)

+Arg (145)C-terminal

Chequear porC-terminal

Cadenapeptidica del

Sustrato

RNCN C

COO-

O-

C

2+Zn

Jua

ng

RH

(2

00

4)

BC

ba

sics

O ON–C–C–N–C–C N–C–C–N–C–C

R H R’

Quimotripsina Tiene Un Sitio de Especificidad

O -

CCSer

Sitio ActivoSitio Activo

Sitio de

Especificidad

Sitio de

Especificidad Sitio Catalítico


Especificidad de la Familia de Ser-Proteasas

Tripsina Quimotripsina Elastasacorta en Lys, Arg corta en Trp, Phe, Tyr corta en Ala, Gly

Bo

lsill

o P

rofu

nd

o y

Ca

rga

do

O O–C–N–C–C–N–

C

C


C


CH3

COO-

C

Asp

COO-

C

Asp

Sitio Activo

Bolsillo No-polar

Bo

lsill

o P

rofu

nd

o y

Ca

rga

do

Ne

ga

tiva

me

nte

Bolsillo Poco Profundoy

no-polar

C

C

C

NH3+

CH3

Jua

ng

RH

(2

00

4)

BC

ba

sics

Especificidad Espacial

D

A

sp3

BC

DB

C

DBC

Estos dos triángulos no son idénticos

La estructura tetrahédricade los orbitales del carbonotiene una tensión estéricaque conforma la unidadbase de la conformaciónproteica


Superficie Enzima

Enzimas Regulatorias

Retroalimentación negativa

Enzimas Alostéricas

Gk: allos = otros

steros = forma

Enzimas Alostéricas

�Proteínas multiméricas y complejas

�Modulador y S se unen a distintas subunidades

�Unión modulador produce cambio conformacional que altera

�Modulador puede ser positivo o negativo

�Un sitio específico para cada modulador

actividad enzimática

�Modulador puede ser el mismo S (homotrópico) o no (heterotrópico)

Un ejemplo real: aspartato transcarbamilasa

12 cadenas polipeptídicas2 clusters catalíticos con 3 cadenas

3 clusters regulatorios con 2 cadenas

Enzima Alostérica Aspártico transcarbamilasa

+

Forma Activa relajada

ATCasa

COO-

CH2

HN-C-COO-

H H-

---

O

H2N-C-O-PO32-

=

O

H2N-C-

=

COO-

CH2

N-C-COO-

H H

---

-

AspartatoCarbamilfosfato

Carbamil aspartato

Forma tensa Inactiva

ATCasaH H H H

ATP

CTP

MetabolismoNucleicos

Feedback

inhibiciónCTP

CTP

CTP

CTP

CTP

CTP


Cinética alostérica

Cooperatividad

Dos modelos para explicar este comportamiento…

Concertado(Monod)

Ajuste inducido(Koshland)

2 formas R y T en equilibrio que se desplaza a un lado u otro según presencia modulador

1 forma única que va ajustando su actividad de acuerdo con entrada

modulador

S y modulador + sólo se unen a R

Modulador – sólo se une a T

El modulador puede afectar K0.5…

El modulador puede afectar Vm…

Volvamos a la ATC…

Efe

cto C

urva

Sig

moid

ea

Efector positivo (ATP)lleva curva sigmoidea a hiperbólica

Efector Negativo (CTP) mantiene

CTPATP

v

vo

Si exageramos la curva sigmoideaVemos el puntoOn/Off claramente

Una enzima alostérica puede “detectar” la concentración en el ambiente y ajustar suactividad

vo

[Sustrato]Off On


Enzimas reguladas por clivaje proteolítico

�Proteólisis expone sitio activo

�Regulación irreversible

�Se necesita otro mecanismo para inactivar

Inhibidor que se une fuertemente a sitio activo

Enzimas reguladas por modificación covalente

Grupos de átomos unidos o removidos generalmente por otras enzimas

Fosforilaciones catalizadas por proteín quinasas específicas

Fosforilación tiene que ser reversible

Fosfo proteín fosfatasas

Un ejemplo: la glucógeno fosforilasa

(glucosa)n + Pi → (glucosa)n-1 + glucosa-1-P

A veces una misma enzima tiene varios sitios de fosforilación

(glucosa)n + Pi (glucosa)n-1 + glucosa-1-P

GP

(glucosa)n + Pi (glucosa)n-1 + glucosa-1-P

GS

Rápida Respuesta a Concentración Azúcar en Sangre

Glucógeno fosforilasa Glucógeno sintasaA

ctiv

ida

d E

nzi

má

tica

Act

ivid

ad

En

zim

átic

a

0 2 4 6 8Tiempo (min)

Glucosa

Adapted from Stryer (1995) Biochemistry (4e) p.597

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