Caracterización de los productos y estabilidad:

Cambios inducidos en las biomoléculas durante el almacenamiento prolongado

Teórica 7

Reacciones que son susceptibles de ocurrir en el almacenamiento a largo plazo

Actividad enzimática

Inactivación enzimática

Reacción amino-carbonilo (pardeo)

Oxidación de lípidos

Oxidación de polifenoles

Proteínas y aminoácidos

Az. reductores

Reacción de Maillard

Polifenoles lípidos insat.

Reacciones de caramelización reacciones oxidativas

Ácido ascórbico

Compuestos Amadori

deshidraciones, fragmentaciones

productos de bajo P.M.

CO2 + aldeh. + heterociclos

Deriv. de Strecker

isomerizaciones

Condensación

AGEs

Pigmentos pardos Fluorescencia

Principales reacciones en el almacenamiento de sistemas de biomoléculas

Causas de deterioro de proteínas.

•Desdoblamiento

•Agregación

•Oxidación

•Deamidación

deshidratación

congelación

almacenaje

Causas de deterioro de membranas.

•Fusión de las cabezas de fosfolípidos.

•Desnaturalización de proteínas de membrana.

•Oxidación lipídica.

deshidratación

congelación

almacenaje

Reacción de Maillard Reacción carbonilo-amina

Reactivos principales

R CH C

O

R2

Reactivos / Catalizadores

R NH2

Indicadores Reacción de Maillard Reactivos Intermediarios Hidroximetilfurfural Furfural Compuestos de Amadori Compuestos del reordenamiento de Strecker Compuestos fluorescentes Pentosidina Carboximetil-lisina CML Furosina

Productos finales Color

Semillas de quinoa pardeadas en el almacenamiento

Efecto de la aminoguanidina

Factores que intervienen en la cinética

aw y contenido acuoso

Temperatura Presencia de tampones pH

Reacción amino-carbonilo

Transiciones de estado y cambios de fase Presencia de inhibidores o catalizadores

Presión parcial de oxígeno

Temperatura

aw y contenido acuoso

Presencia de prooxidantes

Oxidación de lípidos

Transiciones de estado y cambios de fase

Tipo de sustrato

Indicadores Oxidación de lípidos Intermediarios: PRODUCTOS PRIMARIOS Peróxidos, hidroperóxidos

Productos finales: PRODUCTOS SECUNDARIOS Compuestos carbonílicos (Modifican fuertemente el sabor y el olor) Hidrocarburos (Derivados del furano, alcanos y alquenos) Alcoholes

Efecto de la actividad de agua en las reacciones amino-carbonilo (pardeo)

aw

Ve

loci

da

d d

e r

ea

cció

n

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8

sistemas líquidossistemas sólidos

PARDEAMIENTO NO ENZIMÁTICO

Efecto de la actividad de agua en las reacciones de oxidación de lípidos

a w

Vel

ocid

ad d

e re

acci

ón

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8

La estabilidad de biomoléculas depende de:

Transiciones a nivel supramolecular (movimientos cooperativos)

Movilidad molecular del agua y los solutos

Comparación del modelo de sorción D’Arcy y Watt con GAB

Etapa inicial Moléculas de agua

Sitios primarios activos de sorción

Formación de monocapa

Sitio bloqueado

Primera etapa

Segunda etapa

Sorción, estabilidad y movilidad de protones

2° pob. Hahn Inicio de CO-NH2

2° pob. Hahn Inicio de CO-NH2

2° pob. Hahn 1° pob. CPMG Máx. CO-NH2

2° pob. Hahn Inicio de CO-NH2

2° pob. Hahn 1° pob. CPMG Máx. CO-NH2

2° pob. CPMG I GAB Agua cong Disminuye CO-NH2

Matriz amorfa Matriz cristalina

Reactivos

Azúcar amorfo

Medio cristalino

0.00 0.25 0.50 0.75 1.000.0

0.1

0.2

0.3

0.4

Trehalosa

Trehalosa:maltodextrina

Cristalización

Almacenamiento: 4 semanas a 20°C

aw

Abso

rban

cia

(420

nm

)

Karmas, 1995

La cristalización de componentes de la matriz acelera daños en sistemas deshidratados

amorphous matrix

crystalline matrix.

amorphous sugar matrix.

crystalline matrix.

Posibles estrategias para evitar cristalización de solutos.

1 1 . Vitrificación

2. Retraso de la cristalización en medios sobreenfriados.

Combinación con biopolímeros.

otros azúcares. Combinación con

sales Combinación con

La cristalización de la fase sólida puede afectar significativamente los mecanismos por los que los azúcares amorfos manifiestan su efecto protector

Un segundo excipiente suele ser necesario

Proteins sugar crystallization

Sugars protein denaturation

Schebor et al., 2003

S + MgAc

S + KAc

S + KCit

S + KCl

S + MgCl2

S

W//g 0.5

°C -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100

^exo

Sacarosa R.H. 22%

a) Efecto de sales

0 20 40 60 80 100 120

0.5 W/g

T

T+βCD-A

T+A

T+βCD

RVP = 0.43

T+D

Temp. (°C)

Exo

>b) Efecto de polímeros

Sacáridos de alta masa molar. • Bajo grado de interacción con proteínas (-) • Buena estabilidad física (alta Tg), (+) • Baja densidad de empaque molecular. (-)

Disacáridos no-reductores • Tg relativamente baja (-) • Alta tendencia a cristalizar (-) •Alta densidad de empaque molecular (+) • Capacidad de formar puentes de H (+)

Sacáridos reductores • La actividad enzimática puede afectarse seriamente por la interacctión entre grupos carbonilos y amino (-)

Pueden mejorarse por formulación adecuada

Modelos para describir el comportamiento de propiedades dinámicas en las cercanías de Tg

34

ARRHENIUS MODEL

−=

RTEkk a

oexp. TR

Ekk a

o .lnln −=linealizando

-0.5 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1 -0.0 0.1 0.2 0.3-2

-1

0

1

2

3Experimental

linear regression

1/T (K-1)

ln(k

)

Ea/R

35

-0.5 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1 -0.0 0.1 0.2 0.3-2

-1

0

1

2

3

Tg

T

ln(k

)

Gomoso= Ea= 41.16 kcal/mol

vitreo= Ea= 20.8 kcal/mol

36

ln η

15

10

5

0

Tm/Tg Tm

Tg

ARRHENIUS

Willams, Landel y Ferry (WLF)

WILLAMS, LANDEL Y FERRY (WLF)

( ) ( )g2

g1

TTC)TT(C

Log−+−

−=αt

( )g

g

gTTTT

Log−+−−

−=

66.51

)(44.17ηη

( )g2

g1

g TTC)TT(C

Log−+−

−=

ηη

Coeficientes Universales (polímeros)

WLF: Define movilidad o dependencia con la T de cualquier reacción química limitada por difusión respecto a la de Tg.

a> T- Tg. > movilidad > cambios < tiempos de relajación (θ) > velocidad de reacción

VOGEL-TAUMMAN –FULCHER (VTF)

−

=∞

oTT

Bexp.ηη

η∞ η a T = ∞

To es la temperatura a la cual el tiempo de relajación es infinito Donde:

To = 184 K que fue estimado a partir de η de solución de azúcares

oTT

B−

+=∞

ηη lnlnLinealizando

Pendiente B

Ordenada η∞ Vs (T-To) Grafico ηln

(1)

(2)

Dependencia de la velocidad de cristalización con la temperatura

VTF

B: 2632

B: 4315

Matriz “0”% R.H.

Sacarosa

S/R (90:10)

Arrhenius Ea (KJ/mol)

161.5

272

WLF

C1: 5.55

C1: 8.48

0 20 40 60 80 100-7

-5

-3

-1

1

WLF

VTF

Arrhenius

Exp

L/T (80:20)

LACTOSA

(T-Tg), K

Ln (1

/ τ1/

2)Arrhenius, WLF y VTF resultaron adecuados empleando los coeficientes calculados

VTF

B: 1465

B: 2105

Matriz 33%R.H.

Lactosa

L/T (80:20)

Arrhenius Ea (KJ/mol)

61

74

WLF

C1: 3.09

C1: 5.78

-Tg vs. contenido de agua ó de aw

-Descenso crioscópico -Curva de solubilidad de los sólidos solubles. (p. ej., para frutas sacarosa o la mezcla de azúcares, para lácteos lactosa, para amiláceos la curva de Tm -gelatinización- del almidón)

Resumen.

Curvas necesarias para obtener los diagramas de estado suplementados.

Datos para las predicciones de estabilidad • Variables tradicionales : Temperatura, contenido de agua y composición

(Generación de los diagramas suplementados)

GAB

- Descripción matemática de las isotermas de sorción

Gordon y Taylor

- Descripción de la dependencia de Tg con el contenido de agua

Herramientas matemáticas para el estudio de las consecuencias de las transiciones de fase

GDW

Ecuación de Arrhenius

Ecuación de Williams-Landel-Ferry (WLF)

Ecuación de Vogel-Tamman-Fulcher (VTF)

Predicción de la cinética de cambios en las cercanías de Tg

- Ecuación de Avrami ( ó JMAK)

Descripción de la cinética de cristalización o retrogradación

Información compementaria:

•Valores de humedad de monocapa (mo) •H.R. donde el agua comienza a tener características de diluyente (I): agua congelable, movilidad del agua •Inhomogeneidades en la distribución de agua (aspectos microscópicos). •Movilidad molecular (RMN, ESR, IR)

-DSC

-RMN -Microscopías

-IR y otros

Resumen.

Métodos de análisis.

Resumen.

Condiciones para la formulación de medios

Interacciones Moleculares Azúcaares no reductores - proteina

Reactividad Química Azúcaares reductores ⇒ Maillard

Cristalización

Temperatura

ESTABILIDAD DE BIOMOLECULAS EN SISTEMAS DESHIDRATADOS

Tg

Hidratación del Cristal

w

A partir de los conceptos abordados,

se pueden obtener datos para determinar:

Estabilidad estructural.

Formación de eutéctico o vidrio?

Definición de las temperaturas máximas del proceso y del almacenamiento.

Estabilidad química.