CALIBRACIÓN DE CROMATOGRAFÍA Y ESPECTOFOTOMETRÍA

Fundamentos Básicos

para la Calibración de

Espectrofotómetros

UV-VIS y

Cromatógrafos

JULIO, 2007MESSEN, C.A.LIC. KELIM VANO H.

Calibración de Espectrofotómetros UV-VIS y Cromatógrafos

Presentación participantes

• NOMBRE• Empresa

• Experiencia en CG o UV-Vis• ¿Algun problema en esas técnicas que

quisiera resolver?

ALFREDO AVILA DAVILA

Licenciado en Química , ULAM Sc Ingeniería Industrial , UC

26 años experiencia industrial

Ayudante Docente Análisis Instrumental , ULAJefe Análisis Especiales INDESCA

Jefe Análisis Instrumental, RESIMONJefe Calidad, BF GOODRICH

Jefe Operaciones, IQCQuímico Desarrollo, DUPONT


Calibración de Espectrofotómetros UV-VIS y CromatógrafosREGLAS DEL CURSO

Todas las ideas son importantesEscuchar con atención a los demásParticipar con energíaTodos enseñamos-todos

aprendemosNo quedarse con dudas¿Otra regla?

HORARIOS8:00 Inicio10:00 Refrigerio12:00 Almuerzo13:00 Sesiones de la tarde15:00 Refrigerio17:00 Salida

Adquirir los fundamentos básicos que permitan la ejecución de la calibración en los espectrofotómetros UV-VIS y los Cromatógrafos.

Objetivo general



OBJETIVOS ESPECIFICOS

Reconocer los sistemas de medición .

Seleccionar el material de referencia.

Reconocer el principio de calibración.

Identificar las fuentes de incertidumbre en la calibración.

EN UV-VISIBLE Y CROMATOGRAFIA



6

435

2

1

Identificar los elementos numerados

7

CONCEPTOS

LENGUAJE

TECNICAS

HERRAMIENTAS



Calibración

Verificación

Ajuste

CALIBRACIÓN

“Conjuntos de operaciones que

establecen, bajo condiciones

especificadas, la relación entre los valores

de magnitudes indicados por un

instrumento o sistema de medición, o

valores representados por una medida

materializada o un material de referencia y

los correspondiente valores realizados por

patrones”

Según VIM

“Confirmación mediante la

aportación de evidencia

objetiva de que se han

cumplido los requisitos

especificados ”

VerificaciónSegún Fund. y Vocb. SGC



“Operación destinada a

poner un instrumento de

medición en estado de

funcionamiento

adecuado para su uso”

AjusteSegún VIM



Fuente: Introduccion a la quimica analitica

CALIBRACIÓN

“Conjuntos de operaciones que

establecen, bajo condiciones

especificadas, la relación entre los valores

de magnitudes indicados por un

instrumento o sistema de medición, o

valores representados por una medida

materializada o un material de referencia y

los correspondiente valores realizados por

patrones”

Según VIM

Donde quiera que las decisiones se basen en resultados analiticos, es importante tener alguna indicación de la calidad de los resultados y saber cuanta confianza podemos tener en ellos para el proposito del analisis

Medidas de aseguramiento de la calidadUtilizar métodos de analisis validadosUso de procedimientos internos de control

de calidad definidosParticipar en esquemas de ensayos

interlaboratoriosAcreditacion basada en ISO 17025Establecer la trazabilidad de los

resultados de medición

Fuente:EURACHEM / CITAC Guide CG 4, http://www.eurachem.org

http://www.eurachem.org/



LOS COMPONENTES DE LA MUESTRA SON TRANSPORTADOS POR LA FASE MOVIL A TRAVES DE LA FASE ESTACIONARIA Y SE DETECTAN A LA SALIDA DE LA COLUMNA

PRINCIPIO DE CROMATOGRAFIA

PREGUNTA DE CROMATOGRAFIA DE GASES

¿EXISTE UNA RELACION ENTRE EL PUNTO DE EBULLICION Y EL TIEMPO DE RETENCION?


Calibración de Espectrofotómetros UV-VIS y CromatógrafosSOLVENTES INDUSTRIALES

SOLVENTEPUNTO

EBULLICION, C1 METANOL 64,53 ETANOL 784 ACETONA 565 ISO-PROPANOL 826 CLORURO METILENO 427 N-PROPANOL 978 METIL-ETIL-CETONA 809 2-BUTANOL 108

10 ACETATO DE ETILO 7712 ACETATO DE ISOPROPILO 8815 TOLUENO 11018 M-XILENO 13917 DIACETONA ALCOHOL 16619 CICLOHEXANONA 156



LOS COMPUESTOS INDIVIDUALES SON RETARDADOS POR LA FASE ESTACIONARIA

BASADOS EN

ADSORCION SUPERFICIAL

SOLUBILIDAD RELATIVA

CARGA IONICA



TIEMPO RETENCION ALCOHOL

PUNTO EBULLICION

2,15 METANOL 64,52,68 ETANOL 784,44 1-PROPYL 977,9 1-BUTANOL 118

13,81 1-HEXANOL 15616,13 1-HEPTANOL 17618,21 1-OCTANOL 19420,11 1-NONANOL 214

Principio de espectrofotometriaAlgunos compuestos absorben radiación de una fuente y esta señal se puede medir

La señal puede relacionarse con la concentración del compuesto



Fuente de Energia

Sistema En estudio

InformaciónAnalitica

Io I

Tramitancia = I / Io

Absorbancia = - log T

A = ε b C

Pregunta de espectrofotometría

¿Existe una relación de Absorbancia y concentración que sea util para determinar un analito en un rango de interés?



CONCENTRACION ABSORBANCIA0 0

0,25 0,270,57 0,510,68 0,84

Fuente: Hach, Linear regresion



Fuente: Fundamentals of spectrophotometry



35

3 MINUTOS



Fuente: skoog, West, Chapter 1

1 Concentración

2 Respuesta instrumental

3 Cm: Limite de detección

4 LOQ: Limite de Cuantificacion

5 Rango dinamico

6 LOL: Limite de linealidad

7 Curva de calibracion

8

1

62

45

3

ERRORESAL AZAR

Variaciones no predeciblesSISTEMATICOS

Variaciones predeciblesGROSEROS ( Espurios)

Fallas humanas o del instrumento, que invalidan las medidas

estudiante

A 10,08

10,11

10,09

10,10

10,12

Preciso, Sesgado

B 9,88 10,14

10,02

9,80 10,21

Impreciso, insesgado

C 10,19

9,79

9,69 10,05

9,78 Impreciso, sesgado

D 10,04

9,98

10,02

9,97 10,04

Preciso, insesgado

promedio d.s. d.s.r10,10 0,02 0,1610,01 0,17 1,729,90 0,21 2,13

10,01 0,03 0,33

Valoracion de 10,0 mL de NaOH 0,1 M con HCl 0,1 M

Fuente: Estadistica y Quimiometria para Quimica Analitica

RAZONES PARA RESULTADOS ANALITICOS ERRONEOS

IncompetenciaErrores de transcripción o

cálculoMétodo no adecuadoContaminaciónInterferenciasErrores de calibraciónErrores de muestreoPerdidas o degradaciónFuente: Quality assurance in Analytical chemistry

COMO MEJORAR como calibrador?COMPRENSION DE TÉRMINOSInformaciónTécnicasLlevar al dia a dia , con las limitacionesProcedimientos especificosActitud y disposiciónFamiliarizarseInterpretar estadisticamente los resultadosDudas de los jefes

¿Como evaluar el desempeño como evaluador?

¿CUAL ES EL OBJETIVO DE LA VALIDACION?

http://images.google.co.ve/imgres?imgurl=http://weblogs.clarin.com/management-y-negocios/archives/pregunta.jpg&imgrefurl=http://weblogs.clarin.com/management-y-negocios/archives/2007/05/quien_es_lipovetsky.html&usg=__mT6T5JP-bzLYMYWw7CbAzm6MieQ=&h=630&w=945&sz=75&hl=es&start=4&tbnid=TWQ7poF_BQDzvM:&tbnh=99&tbnw=148&prev=/images?q=PREGUNTA&gbv=2&hl=es

DE ACUERDO A ICH

El objetivo de la validación de un procedimiento analítico es demostrar que el mismo es adecuado para el propósito previsto

46

Fuente; ICH, Q2, 2005



Fuente: Quality assurance in Analytical chemistry

DEFINIR EL REQUERIMIENTO

ANALITICO

DESARROLLAR / IDENTIFICAR

METODO CANDIDATO

PLANEAR EXPERIMENTO DE VALIDACIÓN

DEFINICION DE VALIDACION

REALIZAR EXPERIMENTO

USAR LOS DATOS PARA DEFINIR

AJUSTE AL PROPOSITO

¿CUBRE

REQUISITOS

ANALITICOS?

NO

SI

Proceso de validación de un método de ensayo



PREPARACION

EXTRACCION Y LIMPIEZA

PREPARAR ESTANDARES

DE CALIBRACION

CALIBRACIONDETERMINACI

ON

RESULTADOS

FUENTE: The Estimation of Uncertainty by the Utilization of Validation and Quality Control Data

CARACTERISTICAS A VALIDAR

49

• ____________________ ______________________ ___________________

• ____________________ ______________________ ___________________

• ____________________ ______________________ ___________________

ESPECIFICIDAD EXACTITUD

LIMITE DECUANTIFICACION

RANGO

LINEALIDAD

PRECISION

ROBUSTEZ

LIMITE DEDETECCION

Fuente; ICH, Q2, 2005Traduccion libre: Alfredo Avila Dávila

ESPECIFICIDADCAPACIDAD DE EVALUAR SIN

EQUIVOCACION EL ANALITO EN PRESENCIA DE COMPONENTES QUE SE ESPERA ESTEN PRESENTES EN LA MUESTRAIDENTIFICACIONPRUEBA DE PUREZACONTENIDO

50

EXACTITUDCERCANIA ENTRE EL

VALOR ACEPTADO Y EL VALOR OBTENIDO

51

• 9 determinaciones tres niveles de concentración

• Cubriendo el rango• 98-102 % recuperación

PRECISIONCERCANIA ENTRE LOS VALORES

OBTENIDOS DE UNA SERIE DE MEDICIONES OBTENIDAS DE MULTIPLES MUESTRAS DE LA MISMA MUESTRA HOMOGENEAREPETIBILIDADPRECISION INTERMEDIAREPRODUCIBILIDAD

52

REPETIBILIDADPrecisión, misma condiciones, corto plazoTres determinaciones ,tres nivelesIntra-ensayo

PRECISION INTERMEDIADiferentes dias, analistas, equiposIntra-laboratorio

REPRODUCIBILIDADEntre-laboratorios

53

Reportar DS, DSR, IC

LIMITE DE DETECCIONCantidad mas pequeña de analito , en una

muestra, que puede ser detectada

No necesariamente cuantificada con un valor exactoPuede evaluarse mediante

Relación señal – ruido 2:1 ó 3:1 Curva de calibración

54

PLD

3

LIMITE DE CUANTIFICACIONCantidad más pequeña de analito en una

muestra que puede ser determinada cuantitativamente con precisión y exactitud adecuadas

Particularmente impurezas

55



56

Fuente: Huber, Validation and Analytical Methods review, www.labcompliance.com

•Definir precisión esperada en LC•Preparar muestras, diluir. 6

concentraciones decrecientes•Inyectar 6 veces cada muestra

•Calcular %DSR•Graficar precisión vs

concentración•Concentración a la precisión

definida = limite de detección

LINEALIDADCapacidad para obtener resultados que sean

directamente proporcionales a la concentración del analito en la muestraDentro de un rangoMin. 5 concentracionesr2 mayor que 0,997Reportar:Coeficiente correlacion,Pendiente, intercepto,Suma cuadrados residuales

57Fuente: Agilent, Documento 5989-7459en



58

Ferguson, QUANTITATIVE HPLC ANALYSIS ANALGESIC CAFFEINE FORMULATION



59

Datos simulados a partir de KUME,

The regression equation isespesor = - 8,261 + 1,282 presion

S = 0,154413 R-Sq = 97,5% R-Sq(adj) = 97,3%

Analysis of Variance

Source DF SS MS F PRegression 1 16,4352 16,4352 689,30

0,000Error 18 0,4292 0,0238

Total 19 16,8644

RANGOIntervalo en el cual se ha demostrado que el

procedimiento tiene un nivel adecuado de precisión, exactitud y linealidad

60

ROBUSTEZCapacidad para no ser afectado por variaciones

pequeñas, deliberadas en los parámetros del método

Por ejemploEstabilidad solucionesFiltraciónTiempo extracciónTemperaturaflujo

61



62

ESTABILIDAD ESTANDAR Y MUESTRA

DIA % MUESTRA

INICIAL ESTANDAR1 100,2 99,82 100 99,83 99,9 100,24 99,5

Fuente: CHUNG CHOW CHAN (et al), Analytical Method validation and instrument performance verification


Calibración de Espectrofotómetros UV-VIS y CromatógrafosMETODO

¿VALIDADO?

¿INFORMACION COMPLETA?

INFORMACION

SATISFACTORIA

REEVALUAR INFORMACION

REVALIDAR

USAR EL METODO CON CONFIANZA

MEDICION CRITICA

COMPILAR INFORMACION

¿Cuánta validación es necesaria?

Fuente: Quality assurance in Analytical chemistry

SI

NO

SI

SI

SI

SI

NO

NO

NO

NO



ESPECTROFOTOMETRÍA UV-VIS

TEORÍA BÁSICA.1.-1.-

2.-2.-

3.-3.-

INSTRUMENTACIÓN.

ESQUEMA

CALIBRACIÓN, EQUIPOS Y MATERIALES.

4.-4.-

5.-5.-

ESTIMACIÓN DE LA INCERTIDUMBRE.

BUENAS PRÁCTICAS.

1.- 1.- TEORÍA BÁSICA DE LA

ESPECTROFOTOMETRÍA UV-VISIBLE


Calibración de Espectrofotómetros UV-VIS y CromatógrafosENERGIA

MATERIA

CAMBIO DE NIVEL DE ENERGIA

RETORNO AL NIVEL

INICIAL

Interactúa con

produciendo

Al desactivarse



ENERGIA MATERIA

CAMBIO DE NIVEL

DE ENERGIA

RETORNO AL

NIVEL INICIAL

Térmica∆ E

Luminosahν

hν

Interacción de radiación con la materia

ATOMOSMOLECULAS

Estado base

Estado excitado



ESPECTROSCOPIA

ATOMICAMOLECULA

R

TRANSICIONES ENTRE NIVELES

ELECTRONICOS

TRANSICIONES ENTRE NIVELES

ROTACIONALES,

VIBRACIONALES, SPIN



ESPECTROSCOPIA ATOMICA

TECNICA EXCITACIÓN

RELAJACION

EMISION CALOR UV-VIS

ASBORCION UV-VIS CALOR

FLUORESCENCIA UV-VIS UV-VIS

RAYOS X RAYOS X RAYOS X



ESPECTROSCOPIA MOLECULAR

TECNICA RADIACION ELECTROMAGNETICA

RMN RADIOFRECUENCIA

MICROONDAS MICROONDAS

INFRARROJO INFRARROJO

UV-VIS UV-VIS


Calibración de Espectrofotómetros UV-VIS y CromatógrafosESPECTROFOTOMETRÍA DE

ABSORCIÓN MOLECULAR UV-VIS

LA ABSORCIÓN DE RADIACIÓN ULTRAVIOLETA Y VISIBLE (200–800 nm)

SE RESTRINGE A UN NÚMERO LIMITADO DE GRUPOS FUNCIONALES, LLAMADOS CROMÓFOROS,

QUE CONTIENEN ELECTRONES DE VALENCIA CON ENERGÍAS DE EXCITACIÓN RELATIVAMENTE BAJOS.



Compuestos con electrones π, σ y η

LOS TIPOS DE TRANSICIONES ELECTRÓNICAS QUE PERMITEN EXPLICAR PORQUÉ ALGUNAS ESPECIES PUEDEN ABSORBER ENERGÍA RADIANTE:

cromóforos, que contienen electrones de valencia con energías de excitación relativamente bajos.

ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN MOLECULAR UV-VIS

Compuestos con Transferencia de

Carga

Compuestos con electrones d y f

complejos inorgánicos,

Los iones y complejos de los 18 elementos de las dos primeras series de Transición

75



76



77


Calibración de Espectrofotómetros UV-VIS y CromatógrafosFundamento teórico

La ley fundamental en la que se basan los métodos espectrofotométricos es la de Lambert y Beer.

La relación entre la intensidad de la luz transmitida o energía radiante I y la energía radiante incidente I0 es una función del espesor de la celda b a través del medio absorbente, de acuerdo a donde:

A = ε b C

Donde:

A = absorbancia

ε = absortividad

b = espesor de la celda

C = concentración

78



• ACTUALMENTE ES UNA DE LAS TÉCNICAS ANALÍTICAS MÁS USADAS EN LA INDUSTRIA, LABORATORIOS CLÍNICOS Y DE INVESTIGACIÓN.

• TIENE UNA GRAN APLICABILIDAD EN LA IDENTIFICACIÓN Y DETERMINACIÓN DE UNA ENORME CANTIDAD DE COMPUESTOS ORGÁNICOS E INORGÁNICOS.

79

EJEMPLOSVer internet

80



2.- 2.- INSTRUMENTACIÓN EN

ESPECTROFOTOMETRÍA UV-VIS



Instrumento de haz sencillo



Instrumento de doble haz



Fuente: Modern Instrumental analysis



3.- 3.- CALIBRACIÓN, EQUIPOS Y MATERIALES

EN MEDICIONES

ESPECTROFOTOMÉTRICAS

EVALUACION DE ESPECTROFOTOMETROSCalibración trazableCAPACIDAD para analisis de rutina

TrazabilidadUso de materiales de referencia certificados

Métodos específicos acordados por las partes

Requerimientos de calibraciónCalibración de Longitud de Onda

Calibración de AbsorbanciaAbsorción de las celdasRadiación dispersa

Calibración de Longitud de OndaSoluciones de Holmio en acido perclórico

Filtros de Holmio o didimioLámparas de descarga de Mercurio, Cadmio o Zinc.


Calibración de Espectrofotómetros UV-VIS y Cromatógrafos Filtro de óxido de Holmio o de Didimio (en vidrio o solución)Filtro de óxido de Holmio o de Didimio (en vidrio o solución)

Calibración de AbsorbanciaVisible

Filtros neutrosSoluciones de CuSO4

UltravioletaSolucion de K2Cr2O7Filtros metalizados



Filtro de Densidad Óptica Neutra.

Absorción de las celdasCeldas con agua

Vidrio a 356 y 650 nmCuarzo a 220 y 240 nm

Radiación DispersaFiltros de corteSoluciones NaI, KCl, NaNO2, Acetona



Incertidumbres asociadas a varios métodos

Metodo Incertidumbre (Abs)

Dicromato acido de potasio 1 ±0.004 (min)Filtros NIST 930D 2 ±0.0022Filtros NIST 2031 metal – cuarzo 3 ±0.004

Fuente: Varian, Measuring Photometric accuracy using double aperuture method



Espectrofotómetro UV-VIS.

Balanza analítica, con una resolución de 0,1 mg (sólo si los materiales de referencia del analito deben ser pesados).

Solución de Material de Referencia Certificado (MRC) conteniendo una concentración conocida del analito en un medio apropiado. Distintas soluciones (siempre un número superior a 3 y más conveniente ≥5) de una concentración conocida del analito a determinar. Dicha concentración abarcarán lo más extensamente posible el rango lineal de determinación del analito.

Equipos y Materiales en la Calibración de Espectrofotómetos UV-VIS

CALIBRACIÓN DE CROMATOGRAFÍA Y ESPECTOFOTOMETRÍA

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