BIOQUIMICA FARMASEUTICA

7/27/2019 BIOQUIMICA FARMASEUTICA

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ESCUELA SUPERIOR POLITCNICA DE CHIMBORAZO

FACULTAD DE CIENCIAS

ESCUELA DE BIOQUMICA Y FARMACIA

EVALUACIN IN VITRO DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS

ALCALOIDES DEL AGUA DE COCCION DEL PROCESO DE

DESAMARGADO DEL CHOCHO (Lupinus mutabilis Sweet)

TESIS DE GRADO

PREVIA LA OBTENCIN DEL TTULO DE

BIOQUMICO FARMACUTICO

PRESENTADO POR

ADRIANA ISABEL RODRGUEZ BASANTES.

RIOBAMBA ECUADOR2009


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DEDICATORIA

A dos seres extraordinarios, mis padres

quienes con su apoyo, dedicacin, y

paciencia incondicional me motivaron a

culminar mi carrera, siendo pilares

fundamentales en mi educacin espiritual

y profesional.

A mi esposo por su comprensin.

A mis hijos por ser la luz de mi vida.

A mi abuelito, por brindarme su apoyo, y

por siempre creer en m.


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AGRADECIMIENTO

A la Escuela Superior Politcnica de Chimborazo

Al Instituto Nacional Autnomo de Investigaciones

Agropecuarias INIAP, en especial al Departamento de

Nutricin y Calidad de la Estacin Experimental Santa

Catalina y a travs de ste a la Ing. Elena Villacrs, Directora

del Proyecto PIC-05-2006-2-003 Evaluacin yaprovechamiento de la Actividad antibacterina y antifngica

de los alcaloides del chocho (Lupinus mutabilis Sweet), sobre

cepas ATCC; por todas las facilidades brindadas.

A la Secretara Nacional de Ciencia y Tecnologa SENACYT,

por el financiamiento para la realizacin del presente estudio.

Mi eterna gratitud y sincero agradecimiento a la Dra. Janneth

Gallegos, por su valiosa direccin durante el desarrollo y

culminacin de la presente investigacin.

A la Dra. Lourdes Cuadrado Merino, por su valiosacolaboracin incondicional brindada en el desarrollo de la

investigacin.

A la Dra. Susana Abdo, por el gran aporte brindado en la

elaboracin del trabajo.

Y a todas las personas que colaboraron de cualquier manera

para la culminacin de este trabajo de investigacin


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ESCUELA SUPERIOR POLITCNICA DE CHIMBORAZO

FACULTAD DE CIENCIAS

ESCUELA DE BIOQUMICA Y FARMACIA

El Tribunal de Tesis certifica que: El trabajo de investigacin: EVALUACIN in

vitro DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS ALCALOIDES DEL

AGUA DE COCCION DEL PROCESO DESAMARGADO DEL CHOCHO

(Lupinus mutabilis Sweet), de responsabilidad de la seorita egresada Adriana

Isabel Rodrguez Basantes, ha sido prolijamente revisado por los Miembros del

Tribunal de Tesis, quedando autorizada su presentacin.

FIRMA FECHA

Dr. Edmundo Calua.DECANO FACULTAD CIENCIAS

Dr. Luis Guevara.DIRECTOR DE LA ESCUELA DEBIOQUMICA Y FARMACIA.

Dr(a)Janeth GallegosDIRECTORA DE TESIS

Dr(a).Susana AbdoMIEMBRO DE TRIBUNAL

Dr. Carlos Rodrguez.DIRECTOR DEL CENTRO DEDOCUMENTACION

NOTA DE TESIS ESCRITA ______________________


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Yo, Adriana Isabel Rodrguez Basantes, soyresponsable de las ideas, doctrinas y resultadosexpuestos en esta Tesis; y el patrimonio intelectual dela Tesis de Grado, pertenece a la ESCUELASUPERIOR POLITCNICA DE CHIMBORAZO

________________________________________

ADRIANA ISABEL RODRGUEZ BASANTES


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INTRODUCCIN

Es indudable que las plantas constituyen una fuente inagotable de una serie de

principios activos, muchos de los cuales han sido de gran utilidad en el tratamiento de

diversas patologas, las cuales son tan crticas como la falta de medicamentos, adems

de los altos precios de estos, en el mercado nacional e internacional que los hace

inalcanzable para aquellas personas de menores recursos econmicos, as como la gran

diversidad de manifestaciones adversas y el incremento de interacciones

medicamentosas. Igualmente, muchos de los usos de las plantas como parte de la

medicina tradicional, se encuentran a nivel de testimonios, por lo que se hace

indispensable el estudio sistematizado de las mismas por parte de las instituciones

cientficas con el objeto de validar los usos tradicionales.

El Lupinus mutabilis Sweet (chocho), es una leguminosa oriunda de los Andes

Sudamericanos, las semillas desamargadas y en cocimiento son utilizadas por el

poblador andino de nuestro pas como alimento y medicina.

Si bien es cierto que el gneroLupinus, ha sido muy estudiado desde el punto de vista

nutricional; sin embargo por su alto contenido de alcaloides no ha permitido el consumo

directo, debiendo previamente eliminarse estos. El producto lquido del desamargado ha

sido utilizado por pequeos agricultores para combatir a las garrapatas en el ganado

ovino y en camlidos, asimismo se utiliza como regulador del crecimiento o fertilizante

en los cultivos de maz, trigo, soja y papa.

En el proceso hdrico de desamargado se elimina el 99.92% de alcaloides, siendo su

contenido ms alto en el agua de coccin, por lo que al ser eliminadas estas sustancias

indiscriminadamente en los distintos cuerpos acuferos, contribuye al proceso de

contaminacin ambiental, volviendo muy complicado y costoso el proceso de

recuperacin de estas aguas. Ante esta problemtica se ha buscado alternativas para

reutilizar este residuo y elaborar productos benficos para el hombre, aprovechando las


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propiedades benficas que poseen los alcaloides quinolizidnicos presentes en el agua de

desamargado.

Adems no podemos dejar pasar por alto la gran incidencia que tienen en nuestro medio

las infecciones gastrointestinales, respiratorio-pulmonares, de mucosas y de la piel, por

lo que el control de los agentes implicados causales de estas enfermedades debe buscar

nuevas alternativas, y una de ellas es la investigacin de la actividad farmacolgica de

los metabolitos secundarios sintetizados por las plantas.

En este contexto, y en base a estudios preliminares que han demostrado las propiedades

que pueden ser explotadas a partir de los alcaloides quinolizidnicos, el objetivo de esta

investigacin fue evaluar in vitro la actividad antimicrobiana de los alcaloides del

chocho sobre cepas de microorganismos ATCC.


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CAPTULO I

1. MARCO TERICO

1.1. EL CHOCHO (Lupinus mutabilis Sweet)

El chocho o tarwi, es una leguminosa originaria de los Andes de Bolivia, Ecuador y

Per, tiene relevancia en la gastronoma de esos pases desde la poca prehispnica. Sualto contenido de protenas, mayor que el de la soja, lo hace una planta de inters para la

nutricin humana y animal. Segn los especialistas, su consumo en diversas

presentaciones (cremas, guisos, postres) ayuda a los nios en su crecimiento y

desarrollo cerebral, pues tiene calcio y aminocidos (21) (35).

FOTOGRAFA No. 1. EL CHOCHO (Lupinus mutabilis Sweet)

El gnero Lupinus consta de unas 200 especies distribuidas en Amrica, se cultiva entre

los 2500 a 3400 m.s.n.m., requiere entre 350-800 mm de precipitacin anual, siendo

cultivado exclusivamente en zonas secas, es susceptible al exceso de humedad, y

moderadamente susceptible a la sequa durante la floracin y envainado. No tolera las

heladas en la fase de formacin del racimo y madurez, aunque algunos ecotipos

cultivados a orillas del lago Titicaca, tienen una mayor resistencia al fro. Prefiere


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suelos francos y franco-arenosos, con balance adecuado de nutrientes, buen drenaje, y

pH que oscila entre 5 y 7. (41, 42).

1.1.1. TAXONOMIA deLupinus mutabilis Sweet.

Tronco : Cormofitas

Divisin : Embriofitas sifongamas

Sub Divisin : Angiosperma

Clase : Dicotiledneas

Sub Clase : Arquiclamideas

Orden : RosalesFamilia : Leguminosas

Sub Familia : Papilionceas

Gnero : Lupinus

Especie : mutabilis

Nombre Cientfico : Lupinus mutabilis Sweet

Nombre Comn : Tarwi, Chocho (52)

1.1.2. DESCRIPCIN BOTNICA DELupinus mutabilis Sweet.

1.1.2.1 Hojas

La hoja deLupinus es de forma digitada, generalmente compuesta por ocho fololos que

varan entre ovalados a lanceolados. En la base del pecolo existen pequeas hojas

estipulares, muchas veces rudimentarias (Fotografa No. 2). Se diferencia de otras

especies de Lupinus en que las hojas tienen menos vellosidades (31).


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FO

El color de las hojas pued

contenido de antocianina (1

1.1.2.2 Tallos y ramificac

La altura de la planta est

el tallo del chocho es gene

Su alto contenido de fib

combustin, sin embargotallo oscila entre verde os

oscuro (24, 31).

FO

El nmero de ramas vara

ramas fructferas tiene co

((24, 30, 31).

OGRAF A No. 2. HOJAS DEL CHOCHO

variar de amarillo verdoso a verde oscuro,

1, 12, 24, 31).

iones

eterminada por el eje principal que vara en

ralmente muy leoso y se puede utilizar co

ra y celulosa, hace que se lo emplee co

odra permitir un proceso de industrializacuro y castao. En las especies silvestres es

OGRAF A No. 3. TALLOS DEL CHOCHO

desde unas pocas hasta 52 ramas. El nmer

relacin positiva con una alta produccin

dependiendo del

tre 0,5 a 2,00 m,

o combustible.

mo material de

n. El color delrojizo a morado

de vainas y de

(Ticona, 1975),


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1.1.2.3 Flores e inflorescencia

El chocho pertenece a la subfamilia Papilionoideas por lo cual presenta una corola

grande de 1 a 2 cm, con cinco ptalos y compuesta por un estandarte, dos quillas y dos

alas (24, 31).

Segn el tipo de ramificacin que presente la planta, puede tener hasta tres floraciones

sucesivas. Blanco, (1980) menciona que en una sola planta pueden existir hasta 1000

flores (11, 12, 24, 39).

La coloracin de la flor vara entre el inicio de su formacin hasta la maduracin, de un

azul claro hasta uno muy intenso y de all se origina su nombre cientfico, mutabilis, es

decir que cambia. Los colores ms comunes son los diferentes tonos de azul e incluso

prpura; menos frecuentes son los colores blanco, crema, rosado y amarillo (Fotografa

No. 4) (11, 12, 24, 39).

FOTOGRAFA No. 4. FLORES E INFLORESCENCIAS DEL CHOCHO

1.1.2.4 Semilla.

Las semillas del chocho estn incluidas en nmero variable en una vaina de 5 a 12 cm y

varan de forma (redonda, ovalada a casi cuadrangular), miden entre 0,5 a 1,5 cm. Un


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kilogramo tiene 3500 a 5000 semillas. La variacin en tamao depende tanto de las

condiciones de crecimiento como del ecotipo o variedad (24, 29, 31).

La semilla est recubierta por un tegumento endurecido que puede constituir hasta el

10% del peso total. Los colores del grano incluyen blanco, amarillo, gris, ocre, pardo,

castao, marrn y colores combinados como marmoleado, media luna, ceja y salpicado

(Fotografa No.5) (Gross, 1982) (24, 29, 31).

FOTOGRAFA No. 5. SEMILLAS DE CHOCHO DE DIFERENTES ECOTIPOS

La gentica en la herencia del color de la semilla es bastante compleja y existen genes

tanto para el color principal, como para cada una de las combinaciones (Blanco, 1980)

(24, 29, 31).

1.1.2.5 Races y ndulos

Como leguminosa, el chocho tiene una raz pivotante vigorosa y profunda que puede

extenderse hasta 3 m de profundidad.

En la raz se desarrolla un proceso de simbiosis con bacterias nitrificantes que forman

ndulos de variados tamaos (1 a 3 cm). En suelos con presencia de bacterias, la

formacin de ndulos se inicia a partir del quinto da despus de la germinacin (Meza

1974), los ndulos pueden alcanzar un dimetro hasta de 3 cm; se localizan

principalmente en la raz primaria, por encima de la ramificacin radicular, e incluso en

las races secundarias (Fotografa No.6), (Lange y Parker, 1960) (24, 34, 31).


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FOTOGRAFA No. 6. RACES Y NDULOS DEL CHOCHO

Bernal, (1982) encontr cepas de Rhizobium lupini con gran efectividad y su presencia

en el eje central de la raz estuvo altamente correlacionada con plantas ms vigorosas y

productivas. Estas bacterias tienen la propiedad de fijar nitrgeno de la atmsfera en el

suelo, las plantas pueden utilizar este nitrgeno como abono natural (29,31).

1.1.3 COMPOSICIN QUMICA

1.1.3.1 Composicin qumica y valor nutricional

En los ensayos sobre los componentes qumicos del grano de Lupinus mutabilis Sweeta

veces se encuentran ambigedades, incoherencias y hasta contradicciones, mismas que

dificultan una evolucin de los datos (Tabla No. 1). Diferencias que pueden deberse a

la variabilidad gentica y a la influencia ambiental. La semilla cruda de chocho tiene un

promedio del 19 % en aceite, lo que constituye un atractivo econmico (14).


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TABLA No. 1 COMPOSICIN POR 100 g DE PORCIN COMESTIBLE DEL CHOCHO

Composicin chocho cocidocon cscara

chochocrudo

sin cscara

chochoharina

Energa Kcal. 151 277 458Agua g 69.7 46.3 37.0

Protena g 11.6 17.3 49.6Grasa g 8.6 17.5 27.9

Carbohidratos g 9.6 17.3 12.9Fibra g 5.3 3.8 7.9

Ceniza g 0.6 1.6 2.6Calcio mg 30 54 93

Fsforo mg 123 262 440Hierro mg 1.4 2.3 1.38Tiamina mg 0.01 0.60 .

Riboflavina mg 0.34 0.4 -Niacina mg 0.95 2.10 .

cido ascrbico 0.00 4.6 .FUENTE: CAICEDO C. (2000)

1.1.3.2 Protenas solubles en agua.

El contenido de protenas en el chocho es tan alto como en los granos de soja. Las

globulinas corresponden a la mayor fraccin proteica, siendo la albmina la restante.

Las globulinas presentan un amplio punto isoelctrico entre pH 4 6 con solubilidad

mnima de nitrgeno entre 10 20 % (14,24).

El comportamiento de las protenas en cuanto a la solubilidad es muy diverso y depende

del nmero de grupos polares y apolares y de su ordenacin en la molcula.

En general, las protenas slo son solubles en disolventes fuertemente polares, como

por ejemplo agua, glicerol, formamida, dimetil-formamida, cido frmico, en

disolventes menos polares, como por ejemplo el etanol, solo en caso excepcionales hay

una notable solubilidad. La solubilidad en agua depende del pH y la presencia de sal

(25, 27).


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Las sales neutras tienen en general una doble influencia sobre la solubilidad de las

protenas a concentraciones bajas (0,5-1 mol/L), actan como consecuencia de la

disminucin de las interacciones electrostticas protena-protena, aumentando la

solubilidad (12,13,24)

La capacidad de imbibicin es para las protenas insolubles lo que la hidratacin para

las protenas solubles. Por penetracin de agua en la estructura, se produce un aumento

de volumen y otras modificaciones de las propiedades fsicas (29).

1.1.3.3 Lpidos.

El Lupinus mutabilis Sweet tiene un elevado contenido de grasa (18 - 25 %), lo que

hace factible para la extraccin de aceite a nivel industrial (17, 24, 29).

Los lpidos constan de cidos grasos insaturados y su composicin es semejante a la del

man, aproximadamente la mitad de estos constan de cido oleico (36.154.6%),

existiendo un 22.3 - 43.9% de cido linoleico y el 2.1 - 2.7 % le corresponde al cido

linolnico. El aceite delLupinus albus contiene pequeas cantidades de cido ercico,

mientras que la semilla delLupinus mutabilis Sweetno lo contiene. (17, 24, 29).

1.1.3.3.1 cidos Grasos.

El cido graso que predomina en el chocho, man y soja es el cido oleico, siendo as

que su concentracin en la semilla de chocho se aproxima al 40.40% (Tabla No. 2).

La concentracin de cido linolnico en la semilla del Lupinus mutabilis es baja,

caracterstica que favorece la conservacin del aceite ya que este se oxida rpidamente y

podra originar cambios indeseables en el sabor del aceite (17, 24, 29).

La composicin de cidos grasos, a diferencia de los aminocidos, depende fuertemente

de las influencias ambientales, de manera que puedan presentarse considerables

variaciones segn las localizaciones y los aos (17, 24, 29).

TABLA No. 2 COMPOSICIN DEL CONTENIDO DE CIDOS GRASOS EN CHOCHO, MAN YSOJA


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cidos GrasosLupinus mutabilis Sweet

Man SojaAmargo Semidulce

Mirstico

Palmtico

Palmitoleco

Esterico

Oleico

Linoleico

Linolnico

Araqudico

Behmico

Cuociente P/S a

0.60

13.40

0.20

5.70

40.40

37.10

2.90

0.20

0.20

2.00

0.30

9.80

0.40

7.80

53.90

25.90

2.60

0.60

0.50

1.5

0.10

11.00

-----

3.0

55.00

28.00

1.00

1.50

3.50

----

----

11.00

-----

4.00

22.00

55.00

8.00

0.40

0.30

------a P/S: Poliinsaturados/saturadosFUENTE: VILLACRS, E; CAICEDO, C; PERALTA, E. 1998. DISFRUTE COCINANDO CON CHOCHO.

RECETARIO. PRONALEG. EESC-INIAP-FUNDACYT. P-BID-206. JUNIO. QUITO, ECUADOR. 48 P.

1.1.3.4 Fibra.

El contenido de fibra representa ms del 6%, se debe principalmente a la cubierta

seminal que comprende el 10% del peso de la semilla (17, 24, 29).

1.1.3.5 Aminocidos

La distribucin de los aminocidos es relativamente estable, presenta mayor contenido

de triptfano y tirosina frente a la soja y el frjol (Tabla No. 3), los aminocidos

azufrados como la metionina son los primeros limitantes, pero se puede equilibrar este

dficit combinando el chocho especialmente con cereales ya que estos en cambio sondeficientes en lisina (17, 24, 29).


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TABLA No. 3 CONTENIDO DE AMINOCIDOS EN CHOCHO, SOJA, FRJOL Y MAN

Aminocidos Chocho Soja Frjol Man

Isoleucina

LeucinaLisinaMetioninaCistinaFenilalaninaTirosinaTreoninaTriptfanoValinaArgininaHistidinaAlaninaAcido AsprticoAcido GlutmicoGlicinaProlinaSerina

274

4493314787231221228110252594163221685

1372259257317

284

4863997983

30919624180

300452158266731

1169261343320

262

4764506653

326158248----287355177262748924237223347

211

4002217278

31124416365

261697148243712

1141349272299

Total aminocidos 6051 6157 5662 5887Total aminocidos Esenciales 2183 2457 2389 2026

FUENTE: VILLACRS, E; CAICEDO, C; PERALTA, E. 1998. DISFRUTE COCINANDO CON CHOCHO. RECETARIO. PRONALEG. EESC-INIAP-FUNDACYT. P-BID-206. JUNIO. QUITO, ECUADOR. 48 P.

1.1.3.6 Minerales solubles en agua

El contenido de sustancias minerales en el chocho se asemeja al de otras semillas de

leguminosas (Tabla No. 4). nicamente el contenido de fsforo y magnesio es un poco

ms elevado. La semilla de lupino representa, en total, una valiosa fuente de magnesio,

fsforo y potasio para el hombre.

Dado que el calcio se encuentra principalmente en la cscara, mientras que el fsforo se

halla en el ncleo. Hay que tener presente que la relacin calcio-fsforo se altera tras el

descascarado del grano (17, 24, 29).


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TABLA No. 5 CONTENIDO DE VITAMINAS EN LA SEMILLA CRUDA DE CHOCHO

Vitaminas mg/100g

-caroteno 0.09

Tiamina 0.51Riboflavina 0.42

Niacina 4.1

FUENTE: GROSS, (1982)

1.1.3.9 Sustancias Antinutricionales.

Como en todas las semillas leguminosas, tambin en el grano de chocho se hallaalgunas sustancias antinutritivas, que limitan el uso directo de grano crudo en

alimentacin humana y animal (14, 17, 24, 28,32).

Entre las sustancias antinutritivas del chocho se citan:

Inhibidores de proteasas, que tienen la propiedad de inhibir la actividad

proteoltica de ciertas enzimas.

Hemaglutininas, que son protenas que coagulan o aglutinan los glbulos rojos y

reaccionan como una especie de anticuerpo.

Glucsidos cianogenticos, que liberan cido cianhdrico por accin enzimtica,

sin embargo su concentracin en el chocho no tiene importancia desde el punto

de vista toxicolgico.

Alcaloides que constituye el principal obstculo para la utilizacin directa, ya

que su alto contenido determina que los granos sean txicos y amargos (14, 17,

24)

1.1.4 PROPIEDADES Y USOS DE LAS SEMILLAS DEL LUPINO

El grano desamargado tiene una infinidad de usos:


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Consumo humano: En fresco se puede utilizar en ceviche, sopas (crema de

chocho); guisos, postres y refrescos (jugo de papaya con harina de chocho).

(Anexo No.1)

Industrialmente: La harina de chocho puede ser usada en panificacin, tiene la

ventaja de mejorar considerablemente el valor proteico y calrico el producto;

asimismo permite una ms larga conservacin del pan debido a la retrogradacin

del almidn, obtenindose un mayor volumen por las propiedades emulgentes

que tiene la lecitina del chocho dulce (37,45)

Uso Medicinal: Los alcaloides (espartena, lupinina, lupanidina, etc) se emplean

para controlar ectoparsitos y parsitos intestinales de los animales.

Ocasionalmente los agricultores utilizan el agua de coccin del tarwi como

laxante y para el control de plagas en plantas (24)

Uso Agronmico: En el estado de floracin la planta se incorpora a la tierra

como abono verde, con buenos resultados mejorando la cantidad de materia

orgnica, estructura y retencin de humedad del suelo (24, 44)

Por su contenido de alcaloides se siembra a menudo como cerco vivo o para

separar parcelas de diferentes cultivos, evitando el dao que pudieran causar los

animales.

Como combustible: Los residuos de la cosecha (tallos secos) se usan como

combustible por su gran cantidad de celulosa que proporciona un buen poder

calorfico. (24, 49)

El cultivo tiene potencial productivo y perspectivas de uso como oleaginosa, fuente de

protena, fijador de nitrgeno y productor de alcaloides con uso en sanidad animal y

vegetal. (24, 49)


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1.2 ALCALOIDES.

1.2.1 GENERALIDADES.

En el siglo XIX se lograron verdaderos adelantos en la farmacologa, con el sucesivo

aporte de remedios procedentes de plantas, este avance haba sido precedido por los

trabajos del sueco Carl Scheele, quien logr aislar los cidos orgnicos de las plantas, y

del joven boticario Friedrich Wilhelm Sertrner (1783-1841) que con sus audaces y

llamativos experimentos descubri en 1816 el principio activo ms importante del opio

de la amapola, la morfina cuyos cristales dieron lugar al principium somnferum(que

Gay-Lussac llamara luego morfina, por el dios griego Morfeo) que Osler llam Lamedicina de Dios, porque revolucion la lucha contra el dolor; al igual que otros

compuestos orgnicos obtenidos de las plantas, fue llamada alcaloide, trmino

acuado en 1818 por Wilhelm Meissner y se aplic a los compuestos de origen vegetal

con propiedades alcalinas, y que recuerdan la reaccin de los minerales con carcter

bsico (45, 49)

No existe una definicin sencilla de alcaloides, si se consideran las distintas diferenciasen cuanto a estructura y propiedades de los 6000 compuestos descritos en este grupo. La

dificultad principal radica en establecer el lmite de separacin de los alcaloides de otros

compuestos orgnicos nitrogenados de origen natural. Se considera como alcaloide Un

compuesto orgnico de origen natural (generalmente vegetal), nitrogenado (el nitrgeno

se encuentra generalmente intracclico), derivados generalmente de aminocidos, de

carcter ms o menos bsico, de distribucin restringida, con propiedades

farmacolgicas importantes a dosis bajas y que responden a reacciones comunes de

precipitacin. De acuerdo a las caractersticas de esta definicin, algunos autores han

dividido a los alcaloides en cuatro clases (Figura No.1) (6, 17)

Alcaloides verdaderos

Protoalcaloides

Pseudoalcaloides

Alcaloides imperfectos


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Alcaloides Verdaderos c

de alcaloide: son formad

intracclico, son de carcte

sal.

Protoalcaloides son amina

productos del metabolismo

Pseudoalcaloides presenta

pero no son derivados de a

Alcaloides imperfectos so

especficos para alcaloides

FIGURA No. 1 ASPECTOS BI

En cuanto a su estado natu

todos los rganos de la pla

nicotina, pilocarpina), en fl

peletiarina, coniina), en se

en la raz (emetina y cefali

mplen estrictamente con las caractersticas

os a partir de aminocidos, tienen siemp

r bsico y existen en la naturaleza normalme

s simples con nitrgeno extracclico, de car

de los aminocidos.

n algunas de las caractersticas de la definic

inocidos.

n derivados de bases pricas, no precipitan

(6, 17, 32)

GENTICOS PARA LA CLASIFICACI N DE LOS

ral, los alcaloides son esencialmente sustan

nta, pueden encontrarse mayoritariamente e

ores (escopolamina, atropina), en frutos (alc

illa (piperina, arecolina), en corteza (quinin

a) (6, 17).

de la definicin

re un nitrgeno

nte en estado de

ter bsico y son

in de alcaloide,

on los reactivos

LCALOIDES

ias presentes en

hojas (cocana,

aloides del opio,

a, tubocurarina),


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1.2.2. FUNCIN DE LOS ALCALOIDES EN LAS PLANTAS

La funcin de los alcaloides en las plantas no es aun clara, existen algunas sugerencias

sobre el rol que juegan estas sustancias en los vegetales como:

Sirven como productos de desecho o almacenamiento del nitrgeno sobrante,

esta funcin es equivalente a la del cido rico o de la urea en los animales.

Debido a que en su mayora, los alcaloides son asociados con cidos orgnicos

que le facilita el transporte en la planta, pueden servir como productos de

almacenamiento del nitrgeno no metabolizado o para transporte del mismo; en

el caso de las Solanaceas midriticas, los steres del tropano se forman en las

races y son transportados a las partes areas donde pueden ser hidrolizados.

La microqumica ha permitido mostrar en forma general, que los alcaloides son

localizados en los tejidos perifricos de los diferentes rganos de la planta, es

decir en el recubrimiento de las semillas, corteza del tallo, raz o fruto y en la

epidermis de la hoja; esto nos permite pensar que los alcaloides cumplen una

importante funcin como es la de proteger a la planta, por su sabor amargo de

estos, del ataque de insectos (6, 17, 32, 45).

Los alcaloides pueden servir de reguladores del crecimiento, se ha demostrado

que los alcaloides derivados de la putrescina se incrementan notablemente

durante la germinacin de algunas plantas como la cebada, cuando se encuentran

en suelos deficientes de potasio (6, 17, 32, 45).

Mediante tcnicas biotecnolgicas, las plantas que normalmente acumulan

alcaloides en las partes areas, como es el caso de laNicotiana yDaturas, se han

producido sin alcaloides, la prdida de alcaloides en el vstago, no impide el

desarrollo de la planta, lo cual sugiere que los alcaloides no son esenciales para

los vegetales Si bien, la presencia de alcaloides no es vital para la planta, estos

deben de participar en secuencias metablicas y no son solamente productos de

desecho del metabolismo (6, 17, 32, 45).


25/83

1.2.3. PROPIEDADES FSICO-QUMICAS DE LOS ALCALOIDES.

Algunas bases no oxigenadas son lquidas a temperatura ambiente, los alcaloides bases

son normalmente slidos cristalizables, raramente coloreados. Casi siempre estn

dotados de poder rotatorio especfico y las bases cristalizadas tienen puntos de fusin

netos, sin descomposicin por debajo de 200 C (2, 15, 56)

Por regla general, los alcaloides bases son muy poco solubles en agua, solubles en

disolventes orgnicos apolares o poco polares y solubles en alcoholes de ms elevada

graduacin (2, 15, 56).

El carcter bsico de los alcaloides es muy variable, dependiendo esta propiedad de la

disponibilidad del doblete libre del nitrgeno.

Los agrupamientos electroflicos adyacentes al tomo de nitrgeno, disminuyen la

basicidad y los de carcter contrario la aumentan. El sistema heterocclico puede

permitir una basicidad muy variable. En el caso del pirrol o del indol, el doblete del

nitrgeno participa en la aromaticidad, por lo que no son bsicos (2, 15, 56).

Por su carcter bsico, los alcaloides forman sales con cidos minerales u orgnicos,

stas son hidrosolubles, insolubles en disolventes orgnicos apolares y solubles en

alcoholes. La formacin de sales, estabiliza la molcula, por lo que comercialmente los

alcaloides se encuentran al estado de sales (2, 15, 56).

Los alcaloides son sustancias interesantes, por sus actividades farmacolgicas que se

ejercen sobre los ms variados terrenos: SNC, SNV (simptico y parasimptico),cardiovascular, anestesia, tumores, enfermedades parasitarias, etc. (2, 15, 56).

1.2.4. ALCALOIDES QUINOLIZIDNICOS

En el gneroLupinus los alcaloides quinolizidnicos se sintetizan en los cloroplastos de

las hojas y son transportados va floema a otros rganos de la planta para su

almacenamiento en tejido epidrmico y subepidrmico de hojas tallos y principalmentesemillas (75). Las semillas de lupinus de la variedad dulce tienen bajos contenidos de


26/83

alcaloides (59), son una buena fuente de nutrientes, debido al contenido de protenas,

lpidos, fibra diettica, minerales y vitaminas (38).

Los alcaloides quinolizidnicos poseen un heterociclo nitrogenado bicclico,

quinolizidina y se encuentra tanto en los alcaloides indlicos como en los que derivan

del metabolismo de la tirosina (32).

Las quinolizidinas autnticas son aquellas que se derivan de la lisina, y se pueden

dividir en bicclicas como la lupanina, tricclicas como la cisticina o tetracclicas como

la espartena (49).

Ms de 150 especies de lupinus son conocidos en la naturaleza. Los alcaloides

quinolizidnicos estn ampliamente distribuidos entre las leguminosasLotoideas, siendo

los lupinos los ms ricos en este tipo de alcaloides (49).

Cho y Martn, (1971), citado por Gross, (1982), aislaron casi 60 diferentes alcaloides en

mas de 180 especies de leguminosas. En Lupinus mutabilis se han encontrado 25

alcaloides quinolizidnicos de los cuales 19 se han identificado hasta la presente (Tabla

6) (3, 49).


27/83

TABLA No. 6 COMPOSICIN RELATIVA DE ALCALOIDES EN LA SEMILLA DE Lupinusmutabilis.

AlcaloidesComposicin Relativa

de Alcaloides (%)

Espartena 7,39

K2 ( no identificada) 0,07

Ammodendrina 0,23

K5 (no identificada) 0,16

N-Metilangustifolia 3,46

Angustifolia + 17 oxoespartena 0,60

Isolupanina 0,29


4- hidroxilupanina 8,65

Multiflorita 0,14

17- Oxolupanina 0,09

Anagirina 0,03

13-Hidroxilupanina 14,9

4,13- dehidroxilupanina 2,12

K17- K19 (no identificada) 0,09

13- tigloiloxilupanina 0,28

Monoangeloil + ester de la monogloil 0,45

de la 4,13 dehidroxilupanina 0,08


13 Benzoiloxilupanina 1,15

13-cis-cinnammoiloxilupanina 0,39

13-trans-cinnammoilxilupanina 99,39

13-angeloiloxilupanina 1,57

Contenido total de alcaloides en la semilla 3,10

FUENTE: GROSS (1982)

Estudios realizados por Pealoza, (1988) indican que las principales fracciones de

alcaloides del chocho son:


28/83

TABLA No. 7 PRINCIPALES FRACCIONES DE ALCALOIDES DEL CHOCHO

Alcaloides Porcentaje %

Lupanina 60

13-Hidroxylupanina 15

Espartena 7,5

4-Hidroxylupanina 9

Isolupanina 3

FUENTE: JARRIN P. (2003)

1.2.5. BIOSNTESIS DE LOS ALCALOIDES

La biosntesis se basa casi siempre en los aminocidos: ornitina, lisina, fenilalanina,

tirosina, triptfano, histidina y cido antranlico, los que pueden reaccionar con otros

productos elementales del metabolismo general: acetato o mevalonato. La formacin del

heterocclico, es decir el establecimiento de una unin carbono-nitrgeno, se realiza por

un proceso Inter o intramolecular simple que implica la formacin de una base de Schiff

o por una reaccin de Mannich (9).

El heterocclico nitrogenado, quinolizidina se encuentra tanto en alcaloides indlicos

como en los que derivan del metabolismo de la tirosina (2, 15, 56)

Las quinolizidinas autnticas (derivadas de la lisina), se localizan en las leguminosas

lotoideas y se pueden subdividir en bicclicas como la lupanina, tricclicas como la

citosina o tetracclicas como la espartena. La biosntesis de estos alcaloides es compleja

(Figura No.2). (2, 15, 29, 56)


29/83

FIGURA No. 2

1.2.6. PROPIEDADESALCALOIDES Q

Los principales alcaloides

espartena (14%), 4-hidr

(3%), 13-hidroxilupanina (

Estos compuestos poseen

bsico formando por loinsolubles en agua, poco s

poseen oxgeno en su est

contienen oxgeno como l

17, 29, 48).

BIOSNTESIS DE ALCALOIDES QUINOLIZIDNIC

F SICO QU MICAS GENERALEINOLIZID NICOS.

presentes en el chocho son los siguientes:

xilupanina (10%), isolupanina (3%), n-

1%) (2, 17, 29, 48).

propiedades alcalinas debido a la presen

general ncleos heterocclicos. Estos enlubles en alcohol y solubles en ter y clorof

uctura y son slidos no voltiles, sin emb

espartena, siendo esta lquida a temperat

S

DE LOS

upanina (46%),

etilangustifolina

ia de nitrgeno

orma libre sonrmo, la mayora

argo algunos no

ra ambiente (2,


30/83

1.2.6.1. PROPIEDADESQUINOLIZID NI

1.2.6.1.1. LUPANINA

La lupanina es el alcaloid

frmula estructural C15H2

g/mol, es soluble en agua,

17, 29, 56)

FIGURA No.

Se puede encontrar la d y

pueden ser identificadas p

forma racmica es encontr

La d-lupanina es un lquid

entre 40 a 44 C, con punto

1.5444, soluble en agua,

puede ser determinada por

C, dehidrocloruro pf. 162

etc (36).

La l-lupanina es un aceite

formar compuestos como

otras sales que podran tend- lupanina (33).

F SICO QU MICAS DE LOSOS.

que se encuentra en mayor concentracin

N2O (Figura No. 3), tiene un peso mole

cloroformo, ter y alcohol e insoluble en te

3. ESTRUCTURA MOLECULAR DE LA LUPANINA

l-lupanina as como tambin sus mezclas,

r la presencia de una de las formas ptica

da en los lupinos blancos.

espeso cristalino con agujas higroscpicas,

de ebullicin entre 190 a 193 C, ndice de r

loroformo, ter y alcohol e insoluble en

el gran nmero de derivados: monohidroclo

-167 C, monohidrobromuro pf: 127 C, pi

viscoso, con un punto de ebullicin entre 18

monohidroyoduro pf. 183-185 C, perclora

er similares puntos de fusin a sus derivado

ALCALOIDES

n el chocho, su

ular de 248.36

r de petrleo (2,

las mismas que

ente activas. La

punto de fusin

efraccin igual a

ter de petrleo;

ruro pf. 217-269

rato pf. 211 C,

6-188 C, puede

o pf. 213 C, y

s anlogos de la


31/83

La lupanina tiene actividad

contra lepidpteros y co

moduladoras, inhibe la s

tRNA, adems posee activ

(14, 52).

1.2.6.1.2. ESPARTE NA

Su frmula estructural es

unidos en forma terciaria, t

lquido oleoso, espeso, in

Tiene un peso especfico

insoluble en agua, alcohol,

FIGURA No.

La espartena es un gangli

la despolarizacin de la

excitacin ganglionar, asdisminuye la excitabilidad

de las contracciones. Sus

digestivos, hipotensin ort

La espartena tiene sus ef

sntesis y formacin del

actividad, oxitotcica, uter

respiratorio (51).

antibacteriana, nematicida, puede utilizarse

epteros, tambin produce inhibicin de

tesis de protenas, inhibe la fase de elon

idad antiarrtmica, hipotensora, y actividad

15H26N2, los dos tomos de nitrgeno de la

ienen un peso molecular de 234 g/mol, (Figu

oloro con olor dbil a anilina y sabor sum

e 1.02 a 20 C y hierve a 311 C en corri

ter, y cloroformo, con reaccin alcalina (19

ESTRUCTURA MOLECULAR DE LA ESPARTEN

pljico poco potente, bloqueando la transmi

embrana postsinptica: despus de una fa

la el miocardio de la influencia neuro-veel tejido nodal, la conductibilidad y la frecu

efectos secundarios son poco importantes

sttica (36).

ctos txicos al inhibir los canales de K+,

NAt, es un depresor del sistema nervios

tnica, antiarrtmica, diurtica, hipoglicemi

omo insecticida

las actividades

acin de Phe

hipoglicemiante

espartena estn

ra No. 4). Es un

amente amargo.

nte alcalina. Es

, 26).

sin por impedir

se transitoria de

getativa central,encia y amplitud

como trastornos

dems inhibe la

o central, posee

nte, estimulante


32/83

1.2.6.1.3. HIDROXILUPANINA

La hidroxilupanina tiene la siguiente frmula estructural C15H24N2O2, con un peso

molecular igual a 264 g/mol. Los compuestos salinos ms representativos de la

hidroxilupanina son: Hidrocloruro pf. 275 C, cloruro arico pf. 210 C, picrobromato

pf. 174-175C, hidroyoduro monohidratado pf. 91-93 C, tiocianato monohidratado pf.

125 C. (51)

Se han identificado dos formas ismeras de la hidroxilupanina como unidades qumicas

representativas, dependiendo de la localizacin del grupo hidroxilo (OH)- en la

estructura bsica de la molcula, estas son: 4-hidroxilupanina (Figura No. 5) y la 13-hidroxilupanina (Figura No. 6) (29, 42).

FIGURA No. 5 4-HIDROXILUPANINA FIGURA No. 6 13-HIDROXILUPANINA

1.2.6.1.4. ANGUSTIFOLINA.

La angustifolina inhibe el crecimiento bacteriano de Bacilo subtillis, Bacilo

thuringiensis yE. coli, participa en la inhibicin de las actividades moduladoras y en la

biosntesis de las protenas. La angustifolina posee actividades similares a las de la

espartena, Lupanina, Angustifolina, 13-hidroxilupanina, Lupinina, 17-oxoespartena,

13-tigloiloxilupanina. La anagirina produce mal formaciones congnitas en terneros

(54).

1.3. APLICACIONES POTENCIALES DE LOS ALCALOIDES DEL LUPINO

El principal propsito de los alcaloides del chocho es la defensa de la planta contra

insectos, herbvoros y patgenos microbianos.


33/83

Ocasionalmente los agricultores utilizan esta propiedad para el control de plagas,

ectoparsitos y parsitos intestinales de los animales, tienen efectos txicos y

mutagnicos en conejos, nemtodos, abejas, caracoles, langostas, gusanos y escarabajos

(54).

Los alcaloides del lupino tienen una significante actividad biolgica que puede ser

explotada en el campo de la farmacia, agricultura, e industria (52, 54).

La Lupanina, Espartena, 13-Hidroxilupanina, Angustifolina, inhiben el crecimiento de

Staphylococcus aureus, Bacilo subtilis, E. coli. Los dos primeros alcaloides poseen

actividad antifngica mientras que la lupinina, lupanina, 13-oxoespartena y espartena,

tienen actividad insecticida, reprimiendo en los insectos el deseo de alimentacin, desta manera eliminan su supervivencia (52).

La Espartena tiene utilidad prctica comercial, gracias a sus aplicaciones en medicina y

en el campo industrial. En el campo mdico, la espartena tiene accin cardiovascular,

es agente dilatador de las coronarias y analgsico, cardiotnico, oxitotcico (32).

En el rea industrial, tiene utilidad en la elaboracin de polmeros pticamente activos,

como catalizador de la polimerizacin del etileno y en la telomerizacin (obtencin depolmeros de bajo peso molecular) del etileno con otras olefinas (26, 28).

Desde el punto de vista farmacolgico, el lupino tambin tiene inters pues algunos de

sus componentes, principalmente los alcaloides, presentan efecto secretagogo de

insulina. En medicina tradicional se les ha atribuido actividad hipoglucemiante que

clsicamente se ha considerado debida a la presencia de los alcaloides, tambin con

actividad hipocolesterolemiante. Igualmente se le atribuyen propiedades

antiinflamatorias y preventivas del cncer por los flavonoides y hepatoprotectoras por

sus saponinas (26, 28).

El efecto hipoglucmico se ha comprobado para algunas especies de lupino

administrados por va oral en animales con diabetes inducida experimentalmente

(conejo, rata, ratn). Igualmente en conejos diabticos y con niveles de colesterol

elevados, se comprob como la adicin de semillas de lupino a su alimentacin produjo

una disminucin de la hiperglucemia postprandial y del colesterol (26, 28, 48).


34/83

Los principios activos responsables de la actividad hipoglucemiante podran ser adems

de los alcaloides, los compuestos de naturaleza saponnica presentes en el extracto de

lupinus, pues muchos de ellos han demostrado ser capaces de inhibir la gluconeognesis

heptica y la glucogenlisis y adems son capaces de activar la produccin de insulina o

inducir un incremento en el metabolismo perifrico de la glucosa (26, 28).

Por otra parte se ha comprobado que este extracto es capaz de normalizar los sistemas

de destoxificacin del organismo, anormalmente alterados en animales diabticos (26,

28, 48).

La actividad de la espartena se ha estudiado tambin en humanos sanos y en pacientes

diabticos insulino-dependientes y con diabetes tipo 2. La administracin intravenosadel sulfato de espartena en personas sanas incrementa la secrecin de insulina basal o

inducida por glucosa y, en pacientes con diabetes tipo 1 aumenta la secrecin de

glucagn. En diabticos tipo 2, la espartena estimula la secrecin de las clulas beta,

produciendo una cada en los niveles plasmticos de glucosa (26, 28).

Recientemente (2004) se ha estudiado el efecto sobre la secrecin de insulina de tres

alcaloides aislados de lupinos: lupanina, 13-alfa-OH lupanina y 17-oxo-lupanina as

como un compuesto derivado sinttico: 2-tionospartena, comprobndose in vitro, un

incremento en la liberacin de insulina inducida por glucosa. La intensidad del efecto

depende de la concentracin de glucosa en el medio y se debe, al menos en parte, al

bloqueo de canales de Ksensibles a ATP en clulas beta (2, 11, 27, 29).

Los autores del trabajo sugieren que la administracin de los alcaloides de lupino puede

disminuir el riesgo de hipoglucemia que se produce con algunos hipoglucemiantes

orales que, estimulan la secrecin de insulina en presencia de bajas concentraciones deglucosa. (26, 28).

1.4. TOXICIDAD DE LOS ALCALOIDES DEL CHOCHO

La toxicidad de estos compuestos ha sido demostrada a dosis muy altas tanto en

animales como en seres humanos. Han ocurrido casos aislados de envenenamiento con

semillas de lupino. Dosis comprendidas entre 11 a 25 mg/Kg de peso corporal en nios


35/83

y dosis de 25 a 46 mg/Kg de peso corporal en adultos producen graves intoxicaciones

(11, 29).

Los sntomas de envenenamiento son: midriasis, calambres, cianosis, parlisis

respiratoria, violentos dolores estomacales, vmitos e incluso coma (11, 29).

La reaccin toxicolgica frente a los alcaloides quinolizidnicos vara entre las

diferentes especies animales; Eichekbaum, (1927), citado por Gross, (1982), seala que

los peces en general y en especial las truchas Salmo gairdnerii muestran una elevada

sensibilidad a un exceso de estos compuestos (11, 29).

Entre las propiedades toxicolgicas de los alcaloides del chocho Lupinus mutabilis

Sweet, tambin se menciona su capacidad para inhibir la germinacin de varias semillas

(2, 11, 29).

1.5. ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA.

Un agente antimicrobiano, es un compuesto qumico que inhibe el crecimiento o mata a

los microorganismos. La contribucin de nuevos estudios acerca de sustancias que

posean actividad antimicrobiana es muy importante dado que en la actualidad se ha

creado resistencia a muchos compuestos y productos qumicos conocidos como

antibacterianos, adems stos agentes teraputicos son en su mayora responsables de

efectos colaterales indeseables para el ser humano (47, 48)

Se conoce que la presencia de metabolitos en las plantas est en relacin directa a su

bioactividad, por lo que es necesario para la seleccin de las mismas conocer sobre los

tipos de compuestos de un determinado taxn vegetal (37, 31).

Investigaciones en la bsqueda de metabolitos secundarios, a los que se les atribuye

actividades antibacterianas en vegetales superiores, demuestran que en la mayora de los

casos esta actividad farmacolgica es debida a la presencia de alcaloides bis-bencil-

isoquinolnicos, isoquinolnicos, complejos de indol, entre otros (24).


36/83

El abuso de antimicrobianos en los hospitales como medida de profilaxis en las

operaciones quirrgicas est incrementando la resistencia antimicrobiana sin realmente

beneficiar en muchos casos al paciente (32, 53).

1.5.1. CONCENTRACIN MNIMA INHBITORIA (CMI)

La concentracin mnima inhibitoria se define como la mnima concentracin de

antimicrobiano (en g/mL 0 mg/mL) que inhibe el crecimiento visible de un

microorganismo despus de 24 horas de incubacin a 37oC. La CMI se ha establecido

como "gold Standard" frente a otros mtodos que evalan susceptibilidad

antimicrobiana; adems de confirmar resistencias inusuales, da respuestas definitivas

cuando el resultado obtenido por otros mtodos es indeterminado (3, 48, 53).

1.5.2. DESCRIPCIN DE LAS CEPAS MICROBIANAS

1.5.2.1. Staphylococcus aureus ATCC 13709

CLASIFICACIN.

Orden: Eubacteriales

Familia: Micrococaceae

Gnero: Staphylococcus

Especie: aureus

MORFOLOGA.

Los Staphylococcus son esferas facultativamente anaerobias, grampositivas, de 0.8 a 1.0

m de dimetro. En el pus se observan aisladas, apareadas, y en cmulos irregulares;

ocasionalmente forman cadenas cortas, rara vez de ms de cuatro cocos de longitud. El

agrupamiento caracterstico en racimos es notorio en grmenes que crecen en medios

slidos. (23, 53)

La pared de la clula estafiloccica contiene una columna vertebral de peptidoglucano,

y cidos teicoicos especficos de cada especie. Adems, S. aureus posee un componente


37/83

antifagocitico de superficie, denominado protena A, que est unido a la capa de

peptidoglucano, pero tambin puede ser liberado parcialmente en forma extracelular.

(27, 53)

S.aureus es un coco Gram positivo, inmvil, que se presenta aislado, en pares, en

cadenas cortas o en racimos irregulares. Esta ltima disposicin es quiz la ms

caracterstica. (53)

S. aureus puede desarrollar resistencia a los antibiticos con sorprendente facilidad.

Por lo menos el 90% de las cepas de estafilococos hospitalarias son resistentes a la

penicilina, la cual es medida por una beta-lactamasa o penicilinasa. (53)

INFECCIONES EN HUMANOS

Los estafilococos estn entre los grmenes ms fciles de cultivar. El estado de portador

intermitente de S. aureus se considera que existe en el 30-50% de los individuos, y las

fosas nasales suelen ser el habitad de bacterias en portadores. El hecho de que los

individuos puedan transportar y diseminar S. aureus patgeno durante largo tiempo

indica que ellos, y la mayor parte de sus contactos tiene un grado importante de

inmunidad para el organismo. Solamente cuando las defensas normales del hospedero

faltan o estn comprometidas, el microorganismo tiene probabilidad de ser invasor. As

es como la enfermedad puede presentarse e lugares de lesin local, como quemaduras,

abrasin u otras heridas. Las anormalidades que originan inmunodepresin sistemtica y

predispone a enfermedades estafiloccicas incluyen diabetes, leucemia, insuficiencia

renal, teraputica. (55, 53)

Los estafilococos se han reconocido como causa de enfermedades pigenas desde los

primeros tiempos de la microbiologa; principalmente en infecciones postquirrgicas y

obsttricas graves, con frecuencia mortales. (55, 53)


38/83

1.5.2.2.Escherichia coli ATCC 9637

CLASIFICACIN.

Familia: EnterobacteriaceaeGnero: Escherichia

Especie: coli

MORFOLOGA

Escherichia coli son bacilos de 1 a 3 m por 0.5 um, sus formas varan desde cocos a

pequeos bastoncillos, que se presentan solos, en pares, en cortas cadenas, agrupados:

en general mviles por flagelos peritricos, aunque existen variantes mviles no

flageladas. No forman esporas; y son Gram negativos. (55, 53)

En cultivos jvenes la forma cocobacilar es bastante frecuente y en los cultivos viejos se

presentan formas de un tamao mayor. Son aerbicos y anaerbicos facultativos,

produce dos tipos de fibras o cilos que rigen su capacidad patgena.

E. coli Produce un tipo de encima denominada bacteriocina que se sabe regula la flora

normal segn el principio de la antibiosis. (55, 53)

INFECCIONES EN HUMANOS.

E. coli Es un husped permanente del tracto intestinal del hombre y los animales y no es

considerado como un patgeno primario, por su abundancia en el tracto intestinal y sufacilidad de cultivo, se lo usa como ndice de potabilidad del agua para el consumo

humano; su presencia en el agua o los alimentos constituyen un indicador de

contaminacin fecal (55, 53)

Las infecciones causadas por E. coli, pueden ser divididas en extraintestinales e

intestinales (55, 53)


39/83

Extraintestinales: resultado de un contacto de persona a persona, provocando

infecciones urinarias como: cistitis, pielitis, pielonefritis, esto ocurre probablemente por

la ntima asociacin entre el habitad normal de los microorganismos y el tracto urinario,

estas infecciones estn alrededor del 20% de todas las infecciones urinarias: en

pacientes tratados con drogas inmunosupresoras y antibiticos; E. coli puede producir

infecciones graves (55, 53)

E. coli es una bacteria que habita normalmente en el intestino del hombre y animales de

sangre caliente, y desempea un importante papel en la fisiologa del intestino. La

distribucin en el ambiente est determinada por su presencia en el intestino. Por ser un

habitante regular y normal del intestino se usa desde hace un siglo como "el mejor"indicador de contaminacin de los alimentos con materia fecal (55, 53)

1.5.2.3.Salmonella gallinarum ATCC 9184

CLASIFICACIN.

Familia: Enterobacteriaceae

Gnero: Salmonella

Especie: gallinarum

MORFOLOGA.

Algunos serotipos son siempre inmviles. S. gallinarum es serotipo de S. enteriditis.

Habitualmente son mviles. Forma bacilar de 1 a 3 um por 0.6 um, mviles por flagelos

pertricos; se presenta solo o en pares, no forma esporas ni cpsulas. Son agentes gran

negativos. (48).

INFECCIONES EN HUMANOS

S. gallinarum puede ser transportada por cualquier animal o pjaro domstico y por

algunos vertebrados de sangre caliente y sangre fra. Brotes de salmonelosis en el

hombre provienen de reservorios de tortugas caseras, polluelos, patitos, gallinas, ganado

y otros diversos animales domsticos. (48, 55).


40/83

1.5.2.4.Klebsiella pneumoniae ATCC 10031

CLASIFICACIN.

Orden : Eubacteriales.

Familia : Enterobacteriaceae.

Gnero : Klebsiella.

Especie :pneumoniae.

MORFOLOGA.

K. pneumoniae son bacilos Gram negativos, no esporulados. Miden de 0.3 - 1 m de

dimetro y de 0.6 - 6.0 m de longitud, dispuestas en pares, solos, o en cadenas cortas.

(48, 55).


Klebsiella pneumoniae es el agente etiolgico de un 3 por 100 de las neumonas deorigen bacteriano. Es causa comn de la neumona lobar adquirida en la comunidad,

particularmente frecuente en individuos alcohlicos, diabticos y en pacientes con

enfermedad obstructiva crnica; tambin se asocia a cuadros respiratorios severos como

bronconeumona y bronquitis. El gnero Klebsiella se asla de las infecciones del tracto

urinario y de las bacteriemias de origen nosocomial. Esta bacteria es resistente a muchos

antibiticos entre ellos la ampicilina (48, 55).

1.5.2.5.Mycobacterium smegmatis ATCC607

CLASIFICACIN.

Orden : Mycobacteriaceae.

Familia : Mycobacterium.

Gnero :Mycobacterium.Especie : smegmatis.


41/83

MORFOLOGA.

Esta bacteria est clasificada dentro de las micobacterias de crecimiento rpido , con

pigmento irregular. M. smegmatis es un bacilo delgado de forma recta o ligeramente

curvada, su tamao suele ser de 1.0-10 m de largo por 0.2-0.7 m de ancho, no

forman esporas y no poseen flagelos ni cpsula. Cuando se tien de Gram, las

micobacterias lo hacen escasamente, comportndose como Gram positivas dbiles. Son

bacilos cido-alcohol resistente. (BAAR) (48, 55).


Son bacterias saprfitas, se conoce muy poco acerca de sus factores de patogenicidad.

Por lo general, las micobacterias no tuberculosas son mucho menos txicas que M.

tuberculosis, aunque se encuentren en una concentracin elevada en el tejido infectado.

Este tipo de micobacterias producen la infeccin llamada micobacteriosis que

generalmente afectan a individuos que tienen sus mecanismos de defensa locales o

generales deteriorados. La puerta de entrada de los microorganismos es tanto area

como digestiva. (48, 55).

1.5.2.6.Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

CLASIFICACIN.

Orden : Eubacteriales.

Familia : Pseudomonodaceae.

Gnero : Pseudomonas.

Especie : aeruginosa.

MORFOLOGA.


42/83

Son bacilos Gram negativos, miden de 1-3 m de longitud y 0.5-1 m de grosor. Son

mviles, presentan de 1-3 flagelos polares, y pueden estar rodeados de una

pseudocpsula, son aerobios no fermentadores de la glucosa, oxidasa negativa. (48, 55).


P. aeruginosa es un patgeno oportunista como tal infecta a pacientes con sus defensas

generales disminuidas.

A esta bacteria se le ha agente de infecciones: respiratorias, urinarias, oculares y

ticas, cutneas, bacteriemia, endocarditis, enfermedades menngeas, infecciones

gastrointestinales (48, 55).


43/83

CAPTULO II

2. PARTE EXPERIMENTAL

2.1.LUGAR DE LA INVESTIGACIN.

La presente investigacin se llev a cabo en el Laboratorio de Microbiologa, de la

Facultad de Ciencias, Escuela de Bioqumica y Farmacia de la Escuela SuperiorPolitcnica de Chimborazo.

2.2.EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS.

2.2.1. EQUIPOS.

Autoclave

Balanza tcnica

Bao Mara.

Cmara de flujo laminar.

Centrfuga

Refrigeradora.

Reverbero

Rotavapor

Ultrasonido

2.2.2. MATERIALES.

Asa de platino.

Baln de500mL

Caja de guantes estriles

Calculadora.


44/83

Embudos de separacin con tapa de 500 mL

Gradilla.

Mangueras.

Mechero

Papel filtro

Placas de silica gel

Probetas de 25, 100 y 1000 mL

Puntas estriles

Regla

Rollos de algodn

Trpode

Tubos de ensayo

Varillas de vidrio

Vasos de Precipitacin de 100, 500 y 1000 mL

2.2.3. REACTIVOS

Acetato de etilo

Acido clorhdrico 0,01N

cido Sulfrico 0,01N

Agar Muller Hinton

Agar sabourad 4%

Agua destilada

Amonaco

Dietilamina

Etanol 960 ter etlico

Reactivo de Dragendorff

Reactivo de Mayer

Reactivo de Wagner

Sulfato de sodio

2.2.4. MATERIAL BIOLGICO

Se utilizaron los siguientes microorganismos tipificados por la ATCC


45/83

2.3. METODOLOGA

2.3.1. EXTRACTOS

Para el desarrollo de esta investigacin se utilizaron los siguientes productos, los

mismos que fueron suministrados por el Instituto Nacional Autnomo de

Investigaciones Agropecuarias (INIAP)

a) Liofilizado del agua de coccin

b) Liofilizado del agua de hidratacin

c) Aceite de lupanina 2%

d) Extracto crudo de alcaloides (lupanina 7,6%)

Adems se utiliz hojas y grano de chocho de la lnea INIAP 450 Andino, eco tipo de

origen ecuatoriano, el cual fue tratado a nivel de laboratorio para la obtencin de los

siguientes extractos:

e) Extracto etreo crudo de alcaloides totales a partir del agua de coccin

del grano deLupinus mutabilis Sweet( 300g /L por 1H)

f) Extracto alcohlico crudo de las hojas deLupinus mutabilis Sweet

N BACTERIA CDIGO

1 Staphylococcus aureus ATCC 13709

2 Escherichia coli ATCC 96373 Salmonella gallinarum ATCC 9184

4 Klebsiella pneumoniae ATCC 10031

5 Mycobacterium smegmatis ATCC 607

6 Pseudomona aeruginosa ATCC 27853


46/83

2.3.2. PREPARACIN DE EXTRACTOS ALCALOIDALES

2.3.2.1.PROCEDIMIENTO

Extracto etreo crudo de alcaloides totales del grano de Lupinus mutabilis

Sweet : Granos enteros seleccionados se cocierondurante una hora, ( 300 g 1 L de

agua destilada),se filtro, el filtrado se alcaliniz con amonaco hasta pH 11, se dej

en reposo una hora, se extrajeron los alcaloides con ter etlico (1:1) y se recuper la

fase orgnica. (Anexo 2 ) (55, 60)

Extracto alcohlico crudo de las hojas de Lupinus mutabilis Sweet: Las hojasfrescas se secaron a 35 oC en una estufa, se macer en etanol de 96o se aplic en el

ultrasonido, se filtr, se adicion sulfato de sodio, se dej en eposo 24 horas luego

se filtr, y evaporo a sequedad. (Anexo 3)

2.3.3. IDENTIFICACIN DE ALCALODES.

En el material vegetal (liofilizado) del agua de coccin e hidratacin del proceso dedesamargado preparadas en el laboratorio, filtradas y no filtradas, extracto etreo crudo

de alcaloides totales del grano deLupinus mutabilis Sweet, yextracto alcohlico crudo

de las hojas de Lupinus mutabilis Sweet se realizaron pruebas cuantitativas de

Dragendorff, Mayer y Wagner para identificacin de los alcaloides. (37,58)

2.3.3.1.ANLISIS COMATOGRAFICO.

Soluciones de los liofilizados de las aguas de coccin e hidratacin del proceso de

desamargado de Lupinus mutabilis Sweet, y el material de control se analizaron por

cromatografa en capa fina empleando de 10 a 20 L de muestra, como adsorbente:

Silica gel 60 F254 (Merck); solventes: Acetato de etilo, hexano, Dietil amina (77,5: 17,5:

5,5) y revelador reactivo de Dragendorff.


47/83

2.3.4. DETERMINACIN CUANTITATIVA DE ALCALOIDES

Se tom una alcuota de 0.2 mL de agua de desamargado de chocho, se agreg 0.6 g de

xido de aluminio, se mezcl bien y se aadi 0.2 mL de KOH al 15% y se agit hastaformar una pasta homognea, luego se transfiri a tubos de centrfuga y se agreg 6 mL

de cloroformo. Se agit hasta homogenizacin y se centrifug por 2 minutos (entre

1.500 y 3.000 rpm)

Se recibi la fase clorofrmica, se repitieron las extracciones por lo menos 10 veces,

hasta que 1 mL del ltimo extracto fue evaporado a sequedad, suspendido en 4 o 5 gotas

de cido sulfrico 0.01N, dando reaccin negativa con 3 o 4 gotas del reactivo de

Dragendorff.

Se recogi los lavados de todos los extractos, se evapor con calor suave sin llegar a

sequedad, dejando en la etapa final 1 mL, que desaparecer rpidamente al dejarlos en

un recipiente con agua fra. Se agreg 5 mL de cido sulfrico 0.01N, dos gotas de rojo

de metilo y se titul el exceso de cido con NaOH 0.01N. El contenido de alcaloides

sereport como lupanina considerando que: 1 mL de H2SO4 0.01N equivale a 2.48 mg

de Lupanina.

2.3.5. ENSAYO DE ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DE LOSEXTRACTOS ALCALOIDALES DEL Lupinus mutabilis Sweet(MTODO DE MITSCHER) (16)

2.3.5.1.PREPARACIN DE LAS MUESTRA PARA EL ENSAYO

a. Extractos Crudos y Totales

En un vial limpio, seco y estril, se codific el nombre del extracto de la planta. Con

precisin se pes 50 mg del extracto crudo o total y se disolvi en 500 L de DMSO. La

concentracin final de esta disolucin fue 100000 g/mL.


48/83

Se realiz diluciones al dcimo, utilizando tubos de ensayo, secos, limpios y estriles a

los que se aadi 900 L de DMSO y 100 L del extracto de la concentracin anterior,

las concentracin finales fueron de de 10000g/mL, 1000g/mL, 100g/mL.

Se codificaron cajas Petri estriles, con el nombre del extracto y la concentracin final

(una caja para la concentracin 1000 g/mL, una caja para la concentracin 100 g/mL,

y una caja para la concentracin 10 g/mL), se pipete separadamente 100 L de las

disoluciones con los extractos a los tubos de ensayo que contenan 10 mL de TSA a 45oC.

Se mezcl con la ayuda de un vrtex e inmediatamente se pas a las cajas Petri

previamente codificadas con el nombre de los extractos y de cada una de las

concentraciones preparadas. Una vez que se solidific el medio de cultivo con los

extractos, se invirtieron las cajas Petri y se dejaron a temperatura ambiente por 18-24

horas.

b. Fracciones del Extracto Crudo

Se pes exactamente la cantidad de fraccin del extracto crudo a ensayarse y se disolvi

con agua, en tubos 100 X 13 limpios, secos y estriles, de tal manera que tenga una

concentracin inicial y un volumen, posible de realizar diluciones adicionales.

Utilizando tubos de ensayo 100 X 13 limpios y secos se realiz diluciones sucesivas

(Ejemplo: 100 L de extracto + 100 L de DMSO. Se codific las cajas Petri necesarias

con la identificacin de la fraccin y las concentraciones finales respectivas.

Se pipete separadamente 100 L de las disoluciones de la fraccin del extracto y se

pas a los tubos de ensayo con 10 mL de TSA a 45 oC. Se mezcl con la ayuda de un

vrtex e inmediatamente se pas a las cajas Petri previamente codificadas.

Las cajas Petri una vez solidificadas el medio de cultivo con las diluciones de los

extractos, se invirtieron y se dejaron a temperatura ambiente por 18-24 horas, se

realizaron blancos respectivos de reactivos y de DMSO.


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d. Preparacin de las suspensiones de los microorganismos

En tubos de 150 X 15 con 10 mL de solucin salina estril se llevaron a temperatura

ambiente y se codificaron con el nombre respectivo del microorganismo.

Los cultivos de los microorganismos para el ensayo deben estar visiblemente turbios, y

a partir de estos se prepararon las siguientes suspensiones en los tubos con solucin

salina estril (Anexo 6).

e. Estriado de los Microorganismos

A partir de las suspensiones bacterianas en la solucin salina, se tom una asada de cada

microorganismo en su turno y se estri en cada suspensin, desde el lmite hacia cerca

del centro de la caja Petri, los cultivos se incubaron a 37 oC por 24-48 horas.

d. Lectura de Resultados

La actividad antibitica se manifiesta por falta de crecimiento e la lnea de estriado.

Hay actividad antibitica cuando no hay crecimiento visible. La concentracin minina

inhibitoria (CMI) es la menor concentracin de las diluciones en la cual no hay

crecimiento del microorganismo. Las lecturas de los resultados se interpretaron de la

siguiente manera: A = Activo, P = Parcialmente activo, I = Inactivo.

Si el microorganismo fue morfolgicamente alterado, por ejemplo, si P. aeruginosa no

muestra su pigmento verde caracterstico, o si no crece bien, la caja puede ser registrada

como P. (actividad parcial).

N0 TIPO DE BACTERIA

CDIGO

ATCC MODO DE PREPARACIN

1 Staphylococcus aureus 13709 100 L de susp.bact. en 10 mL sln salina

2 Escherichia coli 9637 100 L de susp.bact. en 10 mL sln salina

3 Salmonella gallinarum 9184 100 L de susp.bact. en 10 mL sln salina

4 Klebsiella pneumoniae 10031 100 L de susp.bact. en 10 mL sln salina

5 Mycobacterium smegmatis 607 Sin diluir

6 Pseudomona aeruginosa 27853 1 L de susp.bact. en 10 mL sln salina


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Las cajas Petri de control deben tener la apariencia esperada (crecimiento en todas las

lneas en las cajas de control negativo y la potencia apropiada en las cajas de control

positivo de sulfato de estreptomicina), de no ser as, el experimento ha fallado y debi

ser repetido.


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CAPTULO III

3. RESULTADOS Y DISCUSIN

3.1 ANLISIS FITOQUMICO PRELIMINAR DEL EXTRACTOALCOHLICO DE LAS HOJAS Y DEL AGUA DE COCCIN DEL GRANODE CHOCHO (Lupinus mutabilis Sweet), OBTENIDO A NIVEL DE

LABORATORIO.

El anlisis fitoqumico preliminar que se realiz: a) extracto alcohlico de las hojas, b)

aguas de coccin del grano de chocho, determinndose que los alcaloides, triterpenos y

esteroides se encuentran cualitativamente en mayor proporcin en el grano de chocho

que en las hojas en relacin al resto de metabolitos secundarios. Algunos autores

sealan que la distribucin de los alcaloides es bastante selectiva, hallndose en mayor

concentracin en las primeras etapas de desarrollo de la planta en capas externas de

hojas, tallos y flores, y cuando la planta ha llegado a su madurez los alcaloides se

localizan principalmente en los tegumentos de las semillas. (Cuadro No.1). (11, 14, 31).


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CUADRO No. 1. ANLISIS FITOQUMICO DEL EXTRACTO ALCOHLICO DE LAS HOJAS Y DELAGUA DE COCCIN DEL GRANO DE Lupinus mutabilis Sweet. FACULTAD DECIENCIAS. ESPOCH. RIOBAMBA. AGOSTO 2008.

RESULTADOS

TIPO DECOMPUESTO

REACCIONESPRUEBAS

EXTRACTOALCOHOLICO DE LAS

HOJAS DE Lupinusmutabilis Sweet

AGUA DE COCCIN DELGRANO DE Lupinus

mutabilis Sweet

AlcaloidesWagnerMayerDragendorff (++) (+++)

Triterpenos y

Esteroides

Lieberman-

Burchard (++) (+++)

Azcares Reductores Fehling(++) (++)

Fenoles y Taninos FeCl3 (++) (++)

FlavonoidesShinodaEnsayo deAntocianidinas (+) (++)

Saponinas Ensayo de laespuma (+) (++)

Aminocidos Libres Ninhidrina(+) (++)

+++ cuando la presencia del metabolito secundario es abundante+ ++ cuando la presencia del metabolito es poco o escaso y cuando las reacciones han sido negativas, lo que indica ausencia del compuesto

Los alcaloides presentes en el gnero Lupinus son de tipo quinolizidnicos. Estos

metabolitos secundarios constituyen un mecanismo de defensa contra microorganismos

fitopatgenos, herbvoros y contra otras especies de plantas que causan competencia

(Wink, 1998) (11, 14, 31, 46).

Desde el punto de vista farmacolgico los alcaloides, las saponinas, flavonoides,

triterpenos y esteroides han mostrado diversas actividades biolgicas: antimicrobiana,

citotxica, antitumoral, ictiotxica, molusquecida, insecticida, antihelmntica,


54/83

expectorante, diurtica, cardiovascular, antiinflamatoria, gastroprotectora, analgsica,

antipirtica, sedante, antihepatotxica, etc (6, 46).

De ah el inters de comprobar si los alcaloides de las aguas del proceso de coccin del

chocho poseen actividad antibacteriana.

3.2. ANLISIS CROMATOGRFICO DE LOS ALCALOIDES DE Lupinusmutabilis Sweet

El anlisis cromatogrfico se desarroll en:

a) Aguas del proceso de coccin del grano de Lupinus

b) Extracto etreo crudo obtenido de la extraccin bsica lquido- lquido de lasaguas de coccin del grano de Lupinus

c) Extracto crudo alcohlico de las hojas deL. mutabilis Sweet (Anexo 4)

Los productos proporcionados por el INIAP: a) Liofilizado del agua de coccin, b)

Liofilizado del agua de hidratacin, c) Aceite de Lupanina 2%, d) Extracto crudo de

alcaloides (Lupanina 7,6%); dieron positivos los ensayos de Mayer, Wagner,

Dragendorf, verificndose cualitativamente el contenido de alcaloides.

La cromatografa en capa fina para la determinacin de alcaloides revel la presencia de

Lupanina en los dos liofilizados, donde el valor terico referencial fue Rf 0,43 el cual

coincidi con el valor prctico Rf prctico (5).

La identificacin y cuantificacin de los alcaloides del chocho, es de gran importancia,

ya que la toxicidad y amargor del grano dependen del tipo y proporcin de estoscomponentes. Estudios realizados en el Laboratory of Food Chemistry and Mass

Spectrometry de la University of Milan, Italia verificaron que de los alcaloides

identificados, la lupanina es el mayor constituyente, pues alcanz el 2,5 % en el grano

crudo y el 11,5 % en el extracto. El segundo en importancia fue la espartena y

corresponde al 0,32 % en el grano crudo y 2,5 % en el extracto. Otros compuestos como

la 3--hidroxilupanina y 13-hidroxilupanina y tetrahidrorombifolina, se encontraron en

menor cantidad. Este ltimo alcaloide desaparece durante la purificacin y

concentracin del extracto (Anexo 5)


55/83

De igual manera en el extracto etreo crudo del grano y en el extracto alcohlico crudo

de las hojas de Lupinus se identific la presencia de lupanina.

La cuantificacin de lupanina en el agua de coccin del grano de Lupinus revel una

concentracin de 36% (p/p), y en el agua de hidratacin 35% (p/p), adicionalmente el

extracto etreo crudo de alcaloides present 137 mg/g de lupanina.

3.3. ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA

La actividad antimicrobiana se ensay frente a los siguientes microorganismos:

Staphylococcus aureus ATCC 13709; Escherichia coli ATCC 9637; Salmonella

gallinarum ATCC 9184; Klebsiella pneumoniae ATCC 10031 Mycobacteriumsmegmatis ATCC 607; Pseudomona aeruginosa ATCC 27853

3.3.1. ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LIOFILIZADO DEL AGUA DECOCCION; LIOFILIZADO DEL AGUA DE HIDRATACIN; ACEITEDE LUPANINA 2%; EXTRACTO CRUDO DE ALCALOIDES(LUPANINA 7,6%) DE Lupinus mutabilis Sweet FRENTE A LOSMICROORGANISMOS UTILIZADOS

Los liofilizados del agua de coccin e hidratacin, el aceite de Lupanina 2% y el

extracto crudo de alcaloides (Lupanina 7,6%) en concentraciones de 1.000g/mL; 100

g/mL y 10 g/mL as como tambin concentraciones intermedias de estos ensayos, no

mostraron actividad frente a las cepas estndar utilizada. (Cuadro No.2).


56/83

CUADRO No. 2. ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LIOFILIZADO DEL AGUA DE COCCION;LIOFILIZADO DEL AGUA DE HIDRATACIN; ACEITE DE LUPANINA 2%;EXTRACTO CRUDO DE ALCALOIDES (LUPANINA 7,6%) DE Lupinus mutabilisSweetFRENTE A LOS MICROORGANISMOS UTILIZADOS. SEPTIEMBRE 2008.

A = Activo, PA = Parcialmente activo, I = Inactivo

1. Staphylococcus aureus ATCC 13709

2. Escherichia coli ATCC 9637

3. Salmonella gallinarum ATCC 9184

4. Klebsiella pneumoniae ATCC 10031

5. Mycobacterium smegmatis ATCC 607

6. Pseudomona aeruginosa ATCC 27853

Se sugiere que las concentraciones ensayadas son demasiado bajas para activar

mecanismos inhibitorios de estos microorganismos, vale mencionar que pruebas

clsicas de identificacin de Dragendorff, Mayer, Wagner y cromatografas en capa fina

determinaron presencia de este principio activo en todas las soluciones testadas.

La eficacia antimicrobiana tambin pudo ser interferida por materia orgnica propias de

las semillas del alimento coincidiendo con los hallazgos de Tomlinson, S y Palombo, E.

PRODUCTOS DE ENSAYO CONCENTRACION

g/mL

MICROORGANISMOS

1 2 3 4 5 6

a) Liofilizado del agua de

coccin

b) Liofilizado del agua de

hidratacinc) Aceite de Lupanina 2%

d) Extracto crudo de

alcaloides (lupanina

7,6%)

1000 I

I I I I I

100 I I I I I I

10 I I I I I I

BLANCO -------- I I I I I I

DMSO 10000 I I I I I I


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CUADRO No. 4. ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DEL EXTRACTO ETREO CRUDO DE LOSALCALOIDES TOTALES DEL GRANO DE Lupinus mutabilis SweetFRENTE ALOS MICROORGANISMOS UTILIZADOS. SEPTIEMBRE 2008.








El extracto etreo crudo de alcaloides totales, a las dosis de desafo inhibi a los

microorganismos en estudio excepto a Pseudomona aeruginosa ATCC 27853 que fue

parcialmente inhibida a (5.000g/mL), siendo inhibida a las concentraciones ms altas,

lo cual hace pensar que la metodologa de extraccin y/o purificacin degrada a los

compuestos activos.

Al encontrarse actividad antibacteriana a la dosis de 5.000 g/mL del extracto etreo

crudo de los alcaloides totales del grano, coincidiendo con el estudio de Fuertes, R. et

al; se prob actividad con diluciones consecutivas 1:2 de (2.500 g/mL; 1.250 g/mL;

PRODUCTO DE

ENSAYO

CONCENTRACIONmg/mL

MICROORGANISMOS1 2 3 4 5 6

Extracto etreo

crudo del agua de

coccin del granode Lupinus

200 A A A A A A

100 A A A A A A

50 A A A A A PA

25 A A A A A I

12.5 A A A A A I

6.25 A A A A A I3.125 PA PA PA PA PA I

1.56 PA PA PA PA PA I




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625 g/mL; 312,5 g/mL y 156,25 g/mL), encontrndose actividad frente a los

microorganismos en estudio. Se determin que la concentracin mnima inhibitoria

(MIC) fue de 625 g/mL para Staphylococcus aureus ATCC 13709; Escherichia coli

ATCC 9637; Salmonella gallinarum ATCC 9184; Klebsiella pneumoniae ATCC

10031 Mycobacterium smegmatis ATCC 607; y de 10.000 g/mL para Pseudomona

aeruginosa ATCC 27853. (Cuadro No.4) ( Anexo 9)

Sin embargo, estos extractos son inhibidores dbiles de acuerdo con Aligiannis et al,

quien propuso una clasificacin de materiales de planta basado en los resultados de MIC

(Inhibidores fuertes: MIC hasta 500 g / mL; inhibidores regulares: MIC entre 600 y

1.500 g/mL; inhibidores dbiles: MIC anterior 1.600 g / mL) (40,31,46).

El extracto alcohlico de las hojas de Lupinus mutabilis Sweet a las concentraciones

desafo no presentaron actividad frente a los microorganismos ensayados, exepto con

Staphylococcus aureus ATCC 13709, que a 5.000 g/mL y 10.000 g/mL se manifest

una actividad parcial pero a la concentracin de 20.000 g/mL se present una total

inhibicin frente a este microorganismo. (Cuadro No. 5) (Anexo 8)


61/83

CUADRO No. 5. ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DEL EXTRACTO CRUDO ALCOHLICO DELAS HOJAS DE Lupinus mutabilis Sweet FRENTE A LOSMICROORGANISMOS UTILIZADOS. SEPTIEMBRE 2008.








Segn Gross R. Von Baer E., en la determinacin de los contenidos de protena,

compuestos fenlicos, cido fenlico libre y taninos; se estableci que la inhibicin dela prueba del crecimiento de bacterias depende principalmente del contenido total de

compuestos fenlicos, lo cual descarta la posibilidad de la influencia de alcaloides en

los resultados (11, 31, 40, 46).

Otras investigaciones realizadas por Reinhard, H., et,al indican que los compuestos

fenlicos y en especial los isoflavonoides aislados del Lupinus argenteus podran

potenciar la actividad antibacteriana de los alcaloides y del cido linolnico (11, 31,46).

PRODUCTO DE ENSAYO

CONCENTRACION

mg/mL

MICROORGANISMOS

1 2 3 4 5 6

Extracto alcohlico

crudo de las hojas de

Lupinus

200 A I I I I I

100 PA I I I I I

50 PA I I I I I

25 PA I I I I I

12.5 PA I I I I I

6.25 PA I I I I I

3.125 I I I I I I

1.56 I I I I I I




62/83

La mayora de antibiticos de uso clnico se han obtenido de microorganismos

(bacterias, hongos, actinomicetos), pero debido a la gran diversidad de manifestaciones

adversas y el incremento de interacciones medicamentosas, en los ltimos 20 aos ha

surgido mayor inters por antimicrobianos obtenidos a partir de plantas.

CUADRO No. 6. ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DEL SULFATO DE ESTREPTOMICINA FRENTE

A LOS MICROORGANISMOS UTILIZADOS. SEPTIEMBRE 2008.








PRODUCTO DE ENSAYO

Sulfato de Estreptomicina

CONC

g/mL

MICROORGANISMOS

1 2 3 4 5 6

100 A A A A A A

50 A A A A A A

25 A A A A A A

12.5 A A A A A PA

6.25 A A A A A PA






63/83

CAPTULO IV

4. CONCLUSIONES

1. La cuantificacin de los alcaloides expresados como lupanina en el agua de

coccin del grano de Lupinus revel una concentracin de 36% (p/p), y en el

agua de hidratacin 35% (p/p), la coccin facilita una mayor liberacin de este

compuesto de inters farmacolgico. Pruebas cualitativas de Mayer, Wagner,Dragendorf, dieron positivos los ensayos verificndose cualitativamente el

contenido de alcaloides en el liofilizado del agua de coccin, liofilizado del agua

de hidratacin, aceite de Lupanina 2%, extracto crudo de alcaloides (Lupanina

7,6%)

2. Los alcaloides presentes en las agua de coccin e hidratacin, el aceite de

Lupanina 2%, el extracto crudo de alcaloides (Lupanina 7,6%) y los extractosobtenidos a nivel de laboratorio, a concentraciones de 10 g/mL; 100 g/mL y

1.000 g/mL as como tambin concentraciones intermedias de estos ensayos,

no mostraron actividad frente a Staphylococcus aureus ATCC 13709;

Escherichia coli ATCC 9637; Salmonella gallinarum ATCC 9184; Klebsiella

pneumoniae ATCC 10031 Mycobacterium smegmatis ATCC 607; Pseudomona

aeruginosa ATCC 27853, en las condiciones del presente ensayo, sugirindose

que las concentraciones ensayadas son demasiado bajas para activar mecanismos

inhibitorios de estos microorganismos.

3. El extracto etreo crudo de los alcaloides totales del grano de Lupinus mutabilis

Sweet empleado a una concentracin de desafo de 20.000 g/mL y diluciones

consecutivas hasta 156,25 g/mL, mostr actividad frente a los

microorganismos en estudio.


64/83

4. Para el extracto etreo crudo de los alcaloides totales del grano de Lupinus

mutabilis Sweetse determin que la concentracin mnima inhibitoria (MIC) fue

de 625 g/mL para Staphylococcus aureus ATCC 13709; Escherichia coli

ATCC 9637; Salmonella gallinarum ATCC 9184; Klebsiella pneumoniae

ATCC 10031 Mycobacterium smegmatis ATCC 607; y de 10.000 g/mL para

Pseudomona aeruginosa ATCC 27853, deduciendo que os alcaloides del chocho

muestran actividad antimicrobiana a concentraciones muy atas en las

condiciones utilizadas en el presente ensayo, en relacin a 100 g/mL que es la

asociada a un buen nivel de potencial para aplicaciones de utilidad clnica. Por

todo lo expuesto anteriormente, los alcaloides de Lupinus mutabilis Sweet

pueden ser aprovechados para otro tipo de aplicaciones, y as evitar el eliminar

indiscriminadamente el residuo de los lavados del procesamiento del chocho.

5. El extracto alcohlico crudo de las hojas de Lupinus mutabilis Sweet present

actividad nicamente contra Staphylococcus aureus ATCC 13709 a 5.000

g/mL; y 10.000 g/mL manifest una parcial actividad, y a la concentracin

ms alta (20.000 g/mL) mostr una total inhibicin frente a este

microorganismo.


65/83

CAPTULO V

5. RECOMENDACIONES

1. Se recomienda utilizar nuevas tcnicas de extraccin y purificacin para la

obtencin de los alcaloides del chocho con la finalidad que se garantice la mayor

concentracin de compuestos activos responsables de la accin antimicrobianadel Lupinus mutabilis Sweet.

2. Se debera realizar nuevas investigaciones con los alcaloides de Lupinus

mutabilis Sweet, ampliando el nmero de microorganismos causantes de

patologas comunes en nuestro medio.

3. Es necesario ampliar este estudio para evaluar otras posibles actividades que se

le atribuye a nivel popular, as como realizar estudios de toxicidad subcrnica y

crnica para obtener una mayor seguridad en el uso de los alcaloides de Lupinus

mutabilis Sweet.

4. A pesar que los alcaloides de Lupinus mutabilis Sweet muestran actividad

antimicrobiana a concentraciones muy altas en referencia a 100 g/mL que es la

relacionada a un alto nivel de potencia para usos farmacolgicos, y ante la

problemtica ambiental que representa la eliminacin indiscriminada del agua

del proceso de coccin y desamargado del chocho en los distintos cuerpos

acuferos, se debera utilizar estos alcaloides para elaborar productos benficos

para el hombre, aprovechando las propiedades farmacolgicas que poseen los

alcaloides quinolizidnicos frente a microorganismos patgenos de gran

incidencia en nuestro medio.


66/83

CAPTULO VI

6. RESUMEN

En el laboratorio de Microbiologa de alimentos de la facultad de Ciencias de la Escuela

Superior Politcnica de Chimborazo se determin "in vito" la actividad antimicrobiana

de los liofilizados de las aguas de coccin e hidratacin del proceso de desamargado de

Lupinus mutabilis Sweet (chocho), frente a Staphylococcus aureus ATCC 13709;

Escherichia coli ATCC 9637; Salmonella gallinarum ATCC 9184; Klebsiella

pneumoniae ATCC 10031 Mycobacterium smegmatis ATCC 607; Pseudomona

aeruginosa ATCC 27853, la investigacin est enfocada a reducir la contaminacin

ambiental, utilizando los alcaloides presentes en las aguas causantes de la muerte de

especies vegetales en el lugar donde son vertidas por la gran toxicidad que presentan.

Cont con el financiamiento del INIAP, SENACYT, al realizar el anlisis de los

liofilizados se determin la actividad antimicrobiana utilizando como metodologa de

ensayo tcnicas de Mitscher et, al.

Las aguas a las concentraciones de 10 g/mL; 100 g/mL y 1000 g/mL no mostraron

actividad frente a Staphylococcus aureus ATCC 13709; Escherichia coli ATCC 9637;

Salmonella gallinarum ATCC 9184; Klebsiella pneumoniae ATCC 10031;

Mycobacterium smegmatis ATCC 607; Pseudomona aeruginosa ATCC 27853. Al no

obtener respuesta positiva en la evaluacin, se ensayaron dosis desafo de 5000 g/mL;

10000 g/mL y 20000 g/mL; las cuales manifestaron actividad antimicrobiana frentea Staphylococcus aureus ATCC 13709; Escherichia coli ATCC 9637; Salmonella

gallinarum ATCC 9184; Klebsiella pneumoniae ATCC 10031; Mycobacterium

smegmatis ATCC 607; Pseudomona aeruginosa ATCC 27853.

Luego del estudio realizado se concluy que los alcaloides del proceso de desamargado

no mostraron actividad a concentraciones segn el test de Mitscher et,al. las cuales son

consideradas de uso clnico. Por lo que se recomienda investigar nuevas tcnicas de

extraccin de alcaloides.


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SUMARY

At the Food Microbiology Lab of the Science Faculty of the Escuela SuperiorPolitcnica de Chimborazo, the anti-microbial activity in vitro of the leofilized of

cooking water and hydration of the-bittering process of Lupinus mutabilis Sweet

(chocho), in front of Staphylococcus aureus ATCC 13709; Escherichia coli ATCC

9637; Salmonella gallinarum ATCC 9184; Klebsiella pneumoniae ATCC 10031

Mycobacterium smegmatis ATCC 607;and Pseudomona aeruginosa ATCC 27853,was

determined. This investigation was focused on reducing the environmental pollution

using alkaloids present in water causing the death of vegetal species in the place whereit is poured because of its high toxity. It had the funding from INIAP and SENACYT.

Upon carrying out the liofilized analysis the microbial activity determined using as a

trial methodology Mitscher et al. techniques. Water at concentrations of 10 g/mL; 100

g/mL and 1000 g/mL did not show any activity against Staphylococcus aureus

ATCC 13709; Escherichia coli ATCC 9637; Salmonella gallinarum

BIOQUIMICA FARMASEUTICA

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