BIOQUÍMICA, estudio de aminoácidos, cromatografía de aminoácidos y espectrofotometría,

UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA FACULTAD DE AGRONOMA

MANUAL DE PRACTICA PARA BIOQUMICA.REA DE CIENCIAS SUB REA DE CIENCIAS QUMICAS

GUATEMALA ENERO 2010

[Escr FACULTAD DE AGRONOMA

LABORATORIO DE BIOQUMICA

NDICECONTENIDO PAGINAS NDICE ..................................................................................................................................................................... 2 REUNIN DE INFORMACIN GENERAL DEL LABORATORIO DE BIOQUMICA ............................... 5 1. INTRODUCCIN ...................................................................................................................................................... 5 2. OBJETIVOS ................................................................................................................................................................ 5 3. MATERIALES ........................................................................................................................................................... 6 4. METODOLOGA ....................................................................................................................................................... 6 PRACTICA No. 1 SELECCIN DE LA MUESTRA VEGETAL A TRABAJAR EN EL LABORATORIO .. 7 1. INTRODUCCIN ...................................................................................................................................................... 7 2. OBJETIVOS ................................................................................................................................................................ 7 3. MATERIAL DE APOYO LAS BIOMOLCULA ................................................................................................. 8 4. CUESTIONARIO PRE LABORATORIO .......................................................................................................... 13 5. MATERIALES ........................................................................................................................................................ 15 6. METODOLOGA .................................................................................................................................................... 15 7. EVALUACIN DE LA PRCTICA .................................................................................................................... 16 PRCTICA 2. PREPARACIN DE MUESTRAS VEGETALES PARA ANLISIS QUMICO SECADO, MOLIDO Y TAMIZADO DE MUESTRAS VEGETALES ............................................................................... 17 1. INTRODUCCIN .................................................................................................................................................. 17 2. OBJETIVOS ............................................................................................................................................................. 17 3. MARCO TERICO ................................................................................................................................................ 18 4. CUESTIONARIO PRE LABORATORIO PRCTICA 2 .................................................................................. 21 5. MATERIALES ........................................................................................................................................................ 22 6. METODOLOGA .................................................................................................................................................... 23 7. EVALUACIN DE LA PRCTICA .................................................................................................................... 24 8. PARA INCLUIR EN EL REPORTE DE PRCTICA: ..................................................................................... 24 9. INVESTIGAR .......................................................................................................................................................... 24 PRCTICA No. 3 EXTRACCIN Y ESTUDIO CUALITATIVO DE PROTENAS EN MUESTRAS VEGETALES......................................................................................................................................................... 25 1. INTRODUCCIN ................................................................................................................................................... 25 2. OBJETIVOS ............................................................................................................................................................. 25

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3. MARCO TERICO. ............................................................................................................................................... 26 4. CUESTIONARIO PRE LABORATORIO PRCTICA 3 ................................................................................ 31 5. MATERIALES ........................................................................................................................................................ 32 6. METODOLOGA ................................................................................................................................................... 33 7. EVALUACIN DE LA PRCTICA .................................................................................................................... 37 8. PARA INCLUIR EN EL INFORME EN LA DISCUSIN.............................................................................. 38 PRCTICA 4 ESTUDIO DE AMINOCIDOS DE MUESTRA VEGETALES............................................. 39 1. INTRODUCCIN ................................................................................................................................................... 39 2. OBJETIVOS: ............................................................................................................................................................ 39 3. MARCO TERICO. ............................................................................................................................................... 40 4. CUESTIONARIO PRE LABORATORIO PRCTICA 4 ................................................................................ 46 5. MATERIALES ........................................................................................................................................................ 48 6. METODOLOGA. ................................................................................................................................................... 49 7. PARA INCLUIR EN EL INFORME DE PRCTICA: ..................................................................................... 54 8. EVALUACIN DE LA PRCTICA .................................................................................................................... 55 9. RESULTADOS Y ANLISIS DE RESULTADOS PARA EL REPORTE ................................................... 55 PRCTICA No. 5 ESTUDIO DE AMINOCIDOS, CROMATOGRAFA DE AMINOCIDOS Y ESPECTROFOTOMETRA. .............................................................................................................................. 57 1. INTRODUCCIN ................................................................................................................................................... 57 2. OBJETIVOS ............................................................................................................................................................. 57 3. MATERIAL DE APOYO CROMATOGRAFA (11)....................................................................................... 58 4. CUESTIONARIO PRE LABORATORIO PRCTICA 5 ................................................................................ 64 5. MATERIALES DE LA PRCTICA V ................................................................................................................. 66 6. METODOLOGA .................................................................................................................................................... 67 7. PARA INCLUIR EN EL INFORME DE PRCTICA: ..................................................................................... 73 Prctica No. 6 EXTRACCIN DE GLCIDOS DE MUESTRAS VEGETALES ........................................ 76 1. INTRODUCCIN ................................................................................................................................................... 76 2. OBJETIVOS ............................................................................................................................................................. 76 3. MATERIALES ........................................................................................................................................................ 77 4. METODOLOGA .................................................................................................................................................... 78 5. EVALUACIN DE LA PRCTICA .................................................................................................................... 79

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PRCTICA 7 ESTUDIO DE GLCIDOS DE MUESTRAS VEGETALES ................................................... 81 1. INTRODUCCIN ................................................................................................................................................... 81 2. OBJETIVOS ............................................................................................................................................................. 81 3. MATERIAL DE APOYO GLCIDOS (CARBOHIDRATOS) (3,7,15,20) ................................................ 82 4. CUESTIONARIO PRE LABORATORIO PRCTICA 7 ................................................................................ 89 5. MATERIALES ........................................................................................................................................................ 90 6. METODOLOGA .................................................................................................................................................... 91 7. PREPARACIN DE REACTIVOS ..................................................................................................................... 93 8. PARA INCLUIR EN EL INFORME DE PRCTICA: ..................................................................................... 94 9. EVALUACIN DE LA PRCTICA .................................................................................................................... 94 Prctica No. 8 EXTRACCIN DE LPIDOS DE MUESTRAS VEGETALES .......................................... 101 1. INTRODUCCIN ................................................................................................................................................. 101 2. OBJETIVOS ........................................................................................................................................................... 101 3. MATERIALES ...................................................................................................................................................... 102 4. METODOLOGA .................................................................................................................................................. 103 5. EVALUACIN DE LA PRCTICA: ................................................................................................................. 104 Prctica No. 9 ESTUDIO DE LPIDOS DE MUESTRAS VEGETALES .................................................. 105 1. INTRODUCCIN ................................................................................................................................................. 105 2. OBJETIVOS ........................................................................................................................................................... 105 3. MATERIAL DE APOYO ESTUDIO DE LPIDOS DE MUESTRAS VEGETALES ............................... 106 4. CUESTIONARIO PRE LABORATORIO PRCTICA 9 .............................................................................. 112 5. MATERIALES ...................................................................................................................................................... 113 6. METODOLOGA .................................................................................................................................................. 114 7. EVALUACIN DE LA PRCTICA .................................................................................................................. 117 8. PARA EL REPORTE DE PRCTICA .............................................................................................................. 117 BIBLIOGRAFA................................................................................................................................................. 119

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REUNIN DE INFORMACIN GENERAL DEL LABORATORIO DE BIOQUMICA

1. INTRODUCCIN Para iniciar el Laboratorio de Bioqumica, se plantea esta primera reunin, de carcter obligatorio, para enterar a los estudiantes de las disposiciones generales que aqu debern cumplirse. Esta es una parte del laboratorio que el estudiante suele obviar, pero que, por la trascendencia de la misma, se plantea como parle de la asistencia. Adems de lo antes dicho, puede aprovecharse la reunin para que el estudiante conozca a su instructor d laboratorio y viceversa, con la finalidad de que se cimienten las bases de una buena comunicacin sobre la cual pueda edificarse el conocimiento. A su vez, el instructor de laboratorio formar grupos de trabajo a quienes har responsables de un locker, con la finalidad de qu las actividades prcticas s realicen con el mayor orden posible.

2. OBJETIVOS 2.1. GENERAL Informar a los estudiantes de las disposiciones generales del laboratorio de Bioqumica. 2.2. ESPECFICOS: Revisar el contenido del programa de Laboratorio de Bioqumica. Revisar el reglamento de Laboratorio de Bioqumica. Revisar las normas de cuidado de materiales dentro del laboratorio. Dar lectura a los "aspectos a considerar para el buen uso del Manual de prcticas de bioqumica. Ampliar la informacin antes revisada, o bien aclarar aquellas dudas que el estudiante pudiese tener sobre algn tpico de la informacin general del Laboratorio. Formar los grupos de trabajo para el desarrollo ordenado del Laboratorio de Bioqumica.

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[Escr FACULTAD DE AGRONOMA 3. MATERIALES Programa de Laboratorio do Bioqumica.


Reglamento de Laboratorio de Bioqumica. Reglamento para Uso de Materiales de Laboratorio.

4. METODOLOGA El instructor de laboratorio habr d presentarse a los estudiantes y tomar asistencia a esta reunin. El instructor de laboratorio repartir los tres reglamentos mencionados en los listados de materiales" de esta sesin de laboratorio. Se proceder a dar lectura al Programa de laboratorio de Bioqumica. Se proceder a dar lectura al Reglamento d laboratorio de Bioqumica. Se proceder, a dar lectura al Reglament para uso de materiales de laboratorio. El instructor de laboratorio ampliar aquella informacin que fuese requerida por los estudiantes. Se formarn grupos de trabajo con un mximo de 4 integrantes, para favorecer la realizacin de las prcticas y el aprendizaje de los estudiantes.

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PRACTICA No. 1 SELECCIN DE LA MUESTRA VEGETAL A TRABAJAR EN EL LABORATORIO1. INTRODUCCIN Algunas veces se ha escuchado en la Subrea de Ciencias Qumicas, la inquietud de los estudiantes por encontrar, desde el inicio, un "sentido" a los laboratorios de la Subrea. No han quedado de lado aquellos estudiantes que ven al laboratorio simplemente como un requisito para la aprobacin del curso, y es qu mucho de lo que un estudiante puede aprovechar de un laboratorio, est ligado con la manera en cmo se lo presenten. Es por ello que ahora se inicia el Laboratorio de Bioqumica con los fundamentos que puedan crear un espritu de inters en el estudiante, esto es, algunas bases sobre las que pueda descansar el proceso de aprendizaje en el laboratorio, con la pretensin de que el estudiante se site en el contenido del Laboratorio de Bioqumica y logre contextualizar l mismo en el campo de la Agronoma. Procurando no caer en la profundizacin terica -lo cual corresponde a la teora de curso- se har una breve descripcin de lo que es una "Biomolcula", y junto a ello la identificacin de las molculas que se estudiarn posteriormente en el Laboratorio. As mismo, se aprovechar la reunin de esta semana para adelantar un poco de la Prctica 2 a fin de que no se sobrecargue de trabajo la semana asignada a dicha prctica.

2. OBJETIVOS Explicar la importancia del laboratorio de Bioqumica dentro de la Carrera de Ingeniero Agrnomo. Ubicar el trmino "Biomolcula" en la Jerarqua Organizativa de la Vida. Identificar las Biomolculas y Macromolculas que se van a trabajar en el laboratorio. Seleccionar el material vegetal que se trabajar en el laboratorio. Iniciar el proceso de preparacin del material vegetal seleccionado.

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[Escr FACULTAD DE AGRONOMA 3. MATERIAL DE APOYO LAS BIOMOLCULA


c) 3.1. La materia viva posee diversas caractersticas (15) Alguna vez estudiaste en Biologa General lo que distingue a los organismos vivos de los objetos inanimados; ahora mencionaremos uno de" estos atributos: "Un organismo vivo es estructuralmente complicado y altamente organizado. Poseen intrincadas estructuras internas (Fig. 1) y contienen muchos tipos de molculas. Ello contrasta con la materia inanimada del entorno -arcilla, arena, rocas, agua del mar que suele consistir en mezclas de compuestos qumicos relativamente simples. C4 C3

Fig. 1 corte transe versal de hoja. Observe como se aprecia la organizacin y complejidad microscpica

"Cada uno de los componentes de un organismo vivo tiene una funcin especfica. Esta afirmacin no es solamente cierta para estructuras macroscpicas como las hojas y los tallos, el corazn y los pulmones, sino tambin para estructuras intracelulares microscpicas como el ncleo y los cloroplastos". La bioqumica trata de explicar la vida en trminos qumicos (5) "Las molculas que componen los organismos vivos cumplen todas las leyes familiares de la qumica, pero tambin la interaccin entre ellas, de acuerdo con otra serie de principios a los que nos referiremos colectivamente como la lgica molecular de la vida. Estos principios son un conjunto de relaciones que caracterizan la naturaleza, la funcin, as como las interacciones de las Biomolcula. "Si los organismos vivos se componen de molculas intrnsecamente inanimadas, cmo pueden estas molculas dar lugar a la remarcable combinacin de caractersticas que llamamos vida? Cuales la razn de que un organismo vivo parece ser ms que la suma de sus partes inanimadas?

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El objetivo fundamental de la ciencia 'bioqumica es el de determinar de qu modo interactan los organismos vivos con otros los conjuntos de molculas inanimadas que constituyen los organismos vivos para mantener y perpetuar la vida. En otras palabras, la bioqumica tiene como objetivo explicar las estructuras y funciones biolgicas en trminos qumicos. Aunque la bioqumica proporciona conocimientos y aplicaciones prcticas que son importantes en medicina, agricultura, nutricin e industria, su preocupacin ltima es el prodigio de la vida misma. 3.2. Debajo de la diversidad biolgica subyace una informacin qumica (15) Por favor piense un poco en la diversidad de seres vivos que conoce. Piense en un conejo, en un caballo, en un insecto -de los que se miran en Entomologa General-, en un roble (Quercus sp), en el frijol (Phaseolus vulgaris), piense en una bacteria o un hongo (de los que se pueden apreciar al cursar Microbiologa General). Si compara cada una de las cosas en las que pens, en un principio, parece haber muy pocas cosas en comn. Sin embarg, despus de cien aos de investigacin bioqumica, resulta evidente que los organismos vivos son notablemente similares en los niveles qumico y microscpico. 3.3. Biomolculas Lehninger, Nelson y Cox (15) dicen que al comenzar el estudio de las biomolculas y sus interacciones, algunas cuestiones bsicas requieren atencin. Qu elementos, qumicos pueden encontrarse en las clulas? Qu tipos de molculas conforman la materia viva? En qu proporciones se hallan? Cmo llegaron a formar parteado ella? De qu manera las molculas presentes en las clulas vivas son especialmente adecuadas para cumplir su cometido? "Prcticamente todos los compuestos orgnicos a partir de los que se construyen los organismos vivos son productos de la actividad biolgica. Estas biomolculas fueron seleccionadas a lo largo del proceso de evolucin biolgica en razn de su idoneidad para llevar a cabo funciones bioqumicas y celulares especficas". 3.4. Composicin qumica (15) "A principios del siglo diecinueve resultaba claro para los qumicos que la composicin de la materia viva era sorprendentemente diferente de la del mundo inanimado. 3.5. La materia viva se compone principalmente en los elementos ms ligeros "Los cuatro elementos ms abundantes en loa organismos vivos, en trminos de porcentaje sobre el nmero total de tomos, son el hidrgeno, el oxgeno, el nitrgeno y el carbono, que en conjunto representan ms del 99% de la masa de la mayor parte de los clulas.

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3.6. Las biomolculas son compuestos de Carbono "La qumica de los organismos vivos se organiza alrededor del elemento carbono, que representa ms de la mitad del peso seco de las clulas. Recuerde un poco el contenido de curso de "Qumica Orgnica": "los tomos de carbono unidos covalentemente pueden formar cadenas lineales, cadenas ramificadas y estructuras cclicas y en forma de celda. A estos esqueletos carbonados se les unen otros grupos de tomos, denominados grupos funcionales, que confieren propiedades qumicas especficas a la molcula. Las molculas que contienen esqueletos carbonados unidos covalentemente se denominan compuestos orgnicos; el nmero de ellos y su variedad son casi ilimitados. La mayor parte de biomolculas son compuestos orgnicos; podemos por tanto deducir que la versatilidad de enlace del carbono constituy un factor decisivo en la seleccin de los compuestos de carbono para la maquinaria molecular de las clulas durante el origen y la evolucin de los organismos vivos"(15) 3.7. Los grupos funcionales determinan las propiedades qumicas: "Puede considerarse que la mayor parte de biomolculas son derivados de los hidrocarburos, compuestos que tienen un esqueleto de tomos de carbono unidos covalentemente a los que slo se unen tomos de hidrgeno. Los esqueletos de hidrocarburo son muy estables. Los tomos de hidrgeno pueden ser reemplazados por una amplia gama de grupos funcionales para dar lugar a las diferentes familias de compuestos orgnicos. "Muchas biomolculas son poli funcionales y contienen dos o ms tipos diferentes de grupos funcionales, cada uno de ellos con sus propias caractersticas qumicas y su reactividad propia: Los aminocidos, una importante familia de biomolculas que actan principalmente como subunidades monomricas de las protenas, contienen como mnimo dos tipos diferentes de grupos funcionales: un grupo amino y un grupo carboxlico. La capacidad de un aminocido para condensarse con otros aminocidos para formar las protenas depende de los propiedades qumicas de estos dos grupos funcionales''. 3.8. Reactividad qumica (15) . "Los hidrocarburos saturados -molculas con enlaces simples carbono-carbono y sin enlaces dobles o grupos sustituyentes- no son fcilmente atacados por la mayora de los reactivos qumicos; las biomolculas, quo pueden, poseer diversos tipos de grupos funcionales, son mucho ms reactivas qumicamente. Es posible analizar y predecir el comportamiento qumico y las reacciones de las biomolculas a partir de los grupos funcionales que contienen".

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3.9. Las macromolculas y sus subunidades monomricas (15) "Muchas de las molculas que se encuentran dentro de las clulas son macromolculas, polmeros de alta masa molecular construidos a partir de precursores relativamente simples. Las macromolculas pueden formar posteriormente estructuras supra macromoleculares, dando lugar a las unidades funcionales del tipo de los ribosomas, las membranas y los orgnulos (Ver Fig. 2) : "Las macromolculas son los constituyentes principales de los organismos. Prcticamente toda la materia slida de cualquier tipo de clulas es orgnica y se halla presente en cuatro formas: protenas, cidos nucleicos, polisacridos y lpidos. "Las protenas, largos polmeros de aminocidos, constituyen, el agua aparte, la fraccin celular mes importante; las protenas son quizs las ms verstiles de los biomolculas, en cuanto a sus mltiples funciones y propiedades. Los cidos nucleicos, DNA y RNA, son polmeros de nucletidos. Participan en el almacenaje, transmisin y traduccin de la informacin gentica. Los polisacridos, polmeros de azcares simples como la glucosa, tienen dos funciones principales: como almacn de combustibles energticos y cmo elementos estructurales extracelulares. Los lpidos, derivados hidrocarbonados grasos o aceitosos, sirven de componentes estructurales do las membranas y de reserva de combustible rico en energa, adems de cumplir otras funciones. "Las macromolculas se construyen a partir de subunidades monomricas. En las macromolculas protenas, cidos nucleicos y polisacridos el nmero de subunidades monomricas es muy grande. NOTA: Si esto ltimo le confunde un poco, no se preocupe, pues esto es lo que se ir estudiando en el laboratorio de Bioqumica. Antes de continuar, se recordar un poco de lo visto en el Curso de Biologa General, respecta a la jerarqua de organizacin de un organismo vivo. Esto servir para poder ubicar el contenido del laboratorio de Bioqumica en un contexto Agronmico, pues con esta Figura 2, es posible concatenar ideas, para ubicar el sitio de las "Biomolculas" en una planta (pilar fundamental de la Agronoma). 3.10. Existe una jerarqua en la estructura celular "Las subunidades monomricas (aminocidos, azcares simples como la glucosa, etc.), que se unen para formar las macromolculas, Son muy pequeas comparadas con las macromolculas biolgicas. Una molcula d un aminocido como la alanina tiene una longitud menor de 0.5 nm. Lo hemoglobina, la protena transportadora de oxgeno de los eritrocitos, est formada por aproximadamente 600 aminocidos unidos covalentemente en cuatro largas cadenas, que se

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pegan en forma globular y se asocian en una estructura tetramrica con un dimetro de 5,5 nm. Por su parte, las molculas de protena son pequeas en comparacin con los ribosomas (de aproximadamente 20 nm de dimetro), que contienen aproximadamente 70 protenas diferentes y diversas molculas de DNA. Los ribosomas, son a su vez, mucho ms pequeos que orgnulos cmo las mitocondrias, de dimetro aproximadamente igual a 1000 nm. Existe pues, un gran salto desde las biomolculas sencillas hasta las estructuras celulares que pueden observarse con el microscopio ptico. (Ver Fig. 2)

Fig. 2 Organizacin jerrquica en la estructura celular

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[Escr FACULTAD DE AGRONOMA 4. CUESTIONARIO PRE LABORATORIO


1. A qu se le llama la Lgica Molecular de la Vida?

2. Cul es el objetivo fundamental de la Ciencia Bioqumica?

3. Cules son los dos niveles en los cuales los organismos vivos (por ejemplo, un roble, un insecto o un hongo) son notablemente similares?

4. En razn de qu surgieron las biomolculas a lo largo del proceso de evolucin biolgica?

5. Cules son los 4 elementos ms abundantes en los seres vivos?

6. A su juicio personal y fundamentado en lo que ha ledo, qu es lo que determina las propiedades qumicas y el comportamiento de las biomolculas?

7. Elabore una definicin propia de Biomolcula, indique qu es una macromolcula. Adems explique si a su juicio hay alguna diferencia entre ambos trminos.

8. Enumere las 4 macromolculas que se presentan en el material de apoyo a esta prctica. Adems indique cul de esas 4 es la que tiene mayor versatilidad de funciones y propiedades.

9. Seales las funciones generales de los cidos nucleicos, los polisacridos y los lpidos.

10. Esquematice lo que para usted significa la frase siguiente: las macromolculas se construyen a partir de subunidades monomricas.

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11. Para resolver este tpico piense, por ejemplo, en un conjunto formado por varios subconjuntos. Luego piense cmo la unin de estos lo hace a aqul. 12. Esquematice grficamente, de manera clara y sencilla, cada uno de los trminos sealados en la Fig. 2 del Material de apoyo de esta prctica, procurando que su esquema guarde una secuencia lgica. Por ejemplo: se le pudiera ocurrir esquematizar una hoja de Frijol como ejemplo de rgano.

13. Ordene ascendentemente (en funcin de su tamao), los trminos siguientes: rgano, subunidad monomrica, organismo vivo, complejos supra moleculares, orgnulos, tejido, macromolcula, sistema, clula.

14. Conteste con sinceridad si usted cree que ha podido ubicar el tema central de estudio de este laboratorio (biomolcula) como parte integradora de una Planta. Cree usted que al lograr esta ubicacin es posible enmarcar el Laboratorio de Bioqumica en un Contexto Agronmico? Explique. Recuerde que su Instructor de Laboratorio est para asesorarle y ayudarle a resolver sus dudas.

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[Escr FACULTAD DE AGRONOMA 5. MATERIALES A cargo de cada estudiante


Manual de prcticas de Laboratorio de Bioqumica Cuaderno de prcticas de laboratorio.

6. METODOLOGA Revisin del fundamento terico y explicacin del instructor de laboratorio: Resolver un examen corto del fundamento terico contenido en el "Material de Apoyo". Revisin del cuestionario pre-laboratorio y solucin a interrogantes de los estudiantes. Entrega del cuestionario pre-laboratorio. Identificacin de las biomolculas y macromolculas que se estudiarn en el Laboratorio de Bioqumica Revisar de forma general el documento de laboratorio de Bioqumica, procurando identificar las biomolculas y macromolculas que se tratarn en las prcticas respectivas. Realizar un listado de las biomolculas y macromolculas que se van a trabajar en las prcticas de laboratorio. En el listado anterior, procure colocar al menos, dos ejemplos de cada biomolcula macromolcula. Seleccin del material vegetal a trabajar en el laboratorio: Al observar los objetivos de su instructivo, se ve que durante el laboratorio de Bioqumica, se va a estudiar las macromolculas. En funcin de ello, la seleccin del material vegetal estar muy ligada al contenido (en porcentaje peso/peso) de dichas molculas. El material a trabajar debe, cumplir con las caractersticas siguientes: Que lo seleccionado sea un rgano vegetal (semilla, tallo, hoja, fruto, etc.) que no posea demasiados pigmentos (como podra ser el caso del caf o el laurel). Que sea factible preparar harina de ese rgano vegetal Para la seleccin de un material vegetal especfico seguir las recomendaciones siguientes: Que se tenga un porcentaje no menor que 10%, de al menos dos biomolculas y/o macromolculas (protenas, carbohidratos, lpidos). Conocer la planta seleccionada. Tener la facilidad de conseguir la planta. Toda vez seleccionada la planta que se va a trabajar, cada sub-grupo de laboratorio, se dirigir o. su instructor para pedir por la aprobacin de la planta a trabajar. 15



Para ello debe tener al menos dos opciones de plantas (que cumplan con lo sealado anteriormente) y presentar al instructor una pequea tabla con los datos siguientes: Nombre comn y nombre cientfico de la planta. Lugar (es) donde se le puede conseguir (nombre del almacn u otro lugar de suministro del material vegetal) Contenido, en porcentaje, de biomolculas y/o macromolculas Contenido de humedad Porcin no comestible de la planta. Inicio del proceso de preparacin de la muestra vegetal aprobada; Cuando el instructor apruebe la planta a trabajar, los estudiantes procedern a comprar el material suficiente para poder preparar una buena cantidad de harina de la muestra vegetal. De 700 gramos en adelante, de material vegetal. Cuando tengan la muestra vegetal, refirase al numeral 2.1 de la prctica 2 (en caso de semillas) y/o al numeral 2.4 de la prctica 2 (para el secado de la muestra vegetal). Luego los alumnos averiguarn el porcentaje de humedad de la muestra vegetal, utilizando el horno de conveccin (a una temperatura no mayor a 60oC). Refirase a la metodologa que se emplea en el laboratorio de la Subrea de Ciencias Biolgicas de la FAUSAC, para averiguar el contenido de humedad de la muestra vegetal. Para hacer esto puede serle de utilidad los numerales 2.1 y 2.2 del Instructivo de la Prctica 2 de este laboratorio. Anote los resultados de sus clculos en su cuaderno de laboratorio y entrguelos como parte de la Tarea No. 1. Recuerde que el material vegetal que se va a utilizar en la siguiente prctica debe llevarlo seco, para que su instructor autorice la realizacin de dicha prctica. 7. EVALUACIN DE LA PRCTICA Examen Corto con un nivel de dificultad similar al del CUESTIONARIO PRE LABORATORIO. Tarea No. 1: Usted deber entregar individualmente un trabajo corto, escrito. Para ello debe resolver y realizar aquello que est planteado, que aparecen en el Instructivo de Prctica 1. La parte prctica indicada en esos mismos ser evaluada al momento de que los estudiantes lleven su material debidamente seco, para la preparacin de la harina, en la Prctica 2.

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PRCTICA 2. PREPARACIN DE MUESTRAS VEGETALES PARA ANLISIS QUMICO SECADO, MOLIDO Y TAMIZADO DE MUESTRAS VEGETALES1. INTRODUCCIN En el laboratorio de Bioqumica, se plantea un estudio de protenas, carbohidratos y lpidos dentro de un contexto agronmico, y es por ello que el anlisis de estas biomolculas se har en muestras de vegetales. No obstante el aplicar pruebas analticas a muestras de vegetales a alguien le pudiese parecer insuficiente para crear un contexto agronmico en cada prctica. En funcin de esto, se realiz una planificacin de actividades, la semana anterior (Prctica 1), y en esa oportunidad se pudo seleccionar aquel vegetal, que por su contenido, de al menos dos de las tres molculas biolgicas en cuestin, es adecuada para el trabajo a lo largo de todo el laboratorio. Luego cada grupo de trabajo ha conseguido una muestra suficiente de la planta escogida. As se llega a la presente reunin de laboratorio, en donde la atencin se centrar en preparar dicho material vegetal, con lo, cual se pretende proveer al estudiante de herramientas de trabajo del campo agronmico.

2. OBJETIVOS Al finalizar la prctica, el alumno deber estar en capacidad de: Preparar muestras vegetales para el anlisis a realizar en el laboratorio de Bioqumica de la FAUSAC. Utilizar de manera correcta, el equipo de laboratorio utilizado en la presente prctica.

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[Escr FACULTAD DE AGRONOMA 3. MARCO TERICO


Cuando se hace referencia a "preparar" muestras vegetales para anlisis qumico, en el contexto del laboratorio de Bioqumica de la FAUSAC, se est hablando del proceso de colecta, secado, molido y tamizado de dichas muestras. Este proceso incluye la "extraccin" de los compuestos a analizar, sin embargo, esto se deja como un apartado puesto que se estar trabajando ms adelante (16) 3.1. Recopilacin botnica Es el estudio botnico de la familia o gnero de plantas a investigar con el objeto de no cometer errores en el momento de la recoleccin, pues en ocasiones hay varias plantas, miembros de familias o gneros, que por lo comn contienen las mismas sustancias de inters y debe decidirse cul planta escoger en el momento. (6) 3.2. Investigacin bibliogrfica de la planta de inters (6) Consiste en hacer un estudio exhaustivo sobre todo lo que se encuentra escrito sobre determinado gnero o familia del vegetal a investigar con el objeto de tener la mayor cantidad posible de informacin y conocer, por ejemplo, que parte de la planta es rica en ciertos constituyentes, qu tipo de constituyentes se conoce que contiene, qu parte de la planta recolectar, qu mtodo de extraccin utilizar, etc. La mayor cantidad de informacin sobre estudios qumicos en plantas y sustancias aisladas de ellas, son publicadas en revistas cientficas de muy diversa ndole, pertenecientes a las reas de Farmacia, Medicina, Agronoma, Botnica, Qumica, Zootecnia, etc.. Por lo tanto la localizacin de datos sobre un vegetal puede ser muy dificultosa. Sin embargo utilizando publicaciones de Chemical Abstrais u otros abstractos de la rama de vegetales, puede facilitarse esta bsqueda bibliogrfica. Adems, actualmente, el recurso Internet es de mucha ayuda. 3.3. Recoleccin de las muestras vegetales Segn Medinilla (lT), idealmente el anlisis qumico de muestras vegetales debera realizarse sobre tejidos vegetales frescos. Sin embargo, muchas veces la planta a estudiar proviene de lugares distantes, o quizs fue colectada en otro continente. En tales casos la planta debe ser secada antes de la extraccin de compuestos. Debe cuidarse que el material vegetal bajo estudio se encuentre libre de contaminacin con otra planta. Asimismo, es esencial emplear plantas sanas, que no estn infectadas por virus, bacterias u hongos. La razn de esto es que no solo podran detectarse productos de sntesis microbiana, sino que adems estas infecciones podran alterar seriamente el metabolismo de la planta y formarse productos inesperados, quizs en grandes cantidades (lT).

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Es necesario reconocer de antemano al vegetal a recolectar entre grupos similares de plantas, as como saber que parte o partes se van n colectar de acuerdo al inters del investigador. Es imperativo llevar a cabo una recoleccin de acuerdo a las normas establecidas para ello. (6) De la tcnica do colecta de plantas en el campo, puede obtenerse una buena referencia consultando el documento "Algunas indicaciones para la preservacin de plantas", del Herbario de la FAUSAC (13), razn por la cual no se detalla aqu. 3.4. Secado de las muestras vegetales Medinilla (17), dice: "es esencial que la operacin de secado se efecte bajo condiciones controladas para evitar que ocurran cambios qumicos en los constituyentes. Toda muestra vegetal debe secarse lo ms pronto posible, evitando usar altas temperaturas, y preferiblemente con una adecuada circulacin de aire". Segn el documento "Mtodos de Investigacin Fitoqumica" (6), el secado de muestras vegetales puede realizarse de 2 maneras: 3.4.1. Tcnica de secado al sol: Esta tcnica es la ms utilizada, debido a que no hay descomposicin de constituyentes, por lo cual es la tcnica ms recomendable. Secando sobre papel peridico cambiable cada 24 horas hasta unas 4 a 5 veces hasta la eliminacin total del agua 3.4.2. Tcnica de secado artificial: Utilizando mtodos elctricos o de cualquier otro tipo. Es necesario no calentar a temperaturas mayores de 60C que podran descomponer ciertos compuestos. En el documento del Herbario de la FAUSAC (13), dice que en el proceso de colecta de muestras vegetales, muchos buenos especmenes se pierden por pudricin. Por ello el secado de esas muestras es imperativo. En ese documento se citan tcnicas de colocacin de muestras vegetales en una "prensa", con el objeto de preservar de mejor forma la morfologa de la planta, y proveer una tcnica fcil de secado -que es lo particularmente nos interesa -. Una vez hecho el paquete en la "prensa", puede dejarse secando lejos de la intemperie y haciendo cambios constantes de papel peridico, o bien utilizando una cmara desecadora, comnmente utilizada en el herbario. 3.5. Molienda y tamizado del material vegetal Moler es reducir un cuerpo a partes menudas, o aplastarlo mucho (de aqu en adelante procuraremos no confundir este trmino con "macerar", por las razones que habrn de explicarse posteriormente). Para el caso del anlisis de las plantas en el laboratorio de Bioqumica, se realiza la molienda con el fin de homogeneizar el material a analizar, pues muchas veces, los compuestos qumicos de inters se encuentran distribuidos heterogneamente en un rgano vegetal 19



"La molienda debe efectuarse con el material ya seco; con el objeto de reducir a lo mnimo posible el tamao de la partcula del material a utilizar. Con races o material leoso debe usarse un molino, teniendo cuidado de que la friccin producida no eleve la temperatura del sistema para evitar descomposiciones de principios activos o compuestos qumicos de inters. Cuando el material es ligero (hojas, tallos, flores, etc.) puede utilizarse un mortero manual" (1). Para el tamizado se utiliza un tamiz de 20 mallas, con el objeto de dejar pasar nicamente aquellas partculas ms pequeas y separarla de grumos que no suelen ser de inters. 3.6. Procesamiento de las semillas En el laboratorio de Bioqumica de la FAUSAC suelen utilizarse semillas para el anlisis de las biomolculas de inters. Por ello debe hacerse una breve referencia de aquellas razones en las que se fundamentan algunos hechos de la metodologa del instructivo de prctica. Para principiar, se recomienda eliminar la testa de las semillas a usar, para evitar que exista una interferencia de pigmentos (13). Sin embargo, esto se hace en funcin de que con el anlisis a realizar en este laboratorio, se pretende acercar al estudiante al estudio cuali-cuantitativo de biomolculas, y no se pretende hacer un anlisis detallado de todas las molculas para cada parte de la planta a utilizar. Es bueno hacer referencia a la definicin de testa. Testa es la capa exterior de la semilla, y suele conocerse vulgarmente como la "cascara" de la semilla. Algunas veces es difcil de eliminar (por ejemplo en el frijol negro, Phaseolus vulgaris) y por ello se recomienda hacer un remojo de no ms de 25 minutos para esa eliminacin. Lo que sucede es que la testa no es impermeable y permite el paso de agua hacia su interior, provocando que los tejidos internos de la semilla (endospermo y embrin) absorban agua y se hinchen, facilitando de tal manera la eliminacin de la testa.

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4. CUESTIONARIO PRE LABORATORIO PRCTICA 2 1. A qu se refiere la "preparacin de muestras vegetales" para anlisis qumico, dentro del contexto de laboratorio de Bioqumica de la FAUSAC?

2. Cul es la importancia de hacer un recopilado botnico y una investigacin bibliogrfica de la planta de inters?

3. Por qu debe cuidarse que el material vegetal bajo estudio debe estar sano?

4. Qu documento se le recomienda aqu para la colecta y secado de material vegetal?

5. Por qu razn la operacin de secado debe hacerse bajo condiciones controladas?

6. En qu consiste la tcnica de secado artificial de muestras vegetales

7. Explique por qu cree que se hace la molienda del material vegetal.

8. Qu es la testa de una semilla?

NOTA Cada grupo de trabajo debe traer, para la realizacin de esta prctica, lo siguiente: La muestra vegetal que se puso a secar das antes de la presente prctica, segn lo estipulado por el Instructivo de\ Prctica I. Esta muestra debe estar debidamente seca para no: daar el equipo de laboratorio, por ello su instructor revisar esto al inicio de la prctica.

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[Escr FACULTAD DE AGRONOMA 5. MATERIALES Preparar el rea de trabajo del rea de trabajo: 01 Mortero y 01 pistilo (1 marceador) 02 esptulas 01 Becker de 600 ml 01 balanza mono plato Papel peridico 01 tamiz de 20 mallas A cargo del da de laboratorio: 01 horno de conveccin Papel encerado Etiquetas auto adhesivo Tijeras Masking tape


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[Escr FACULTAD DE AGRONOMA 6. METODOLOGA


6.1. Preparado de la semilla a secar (si tuviera testa) Remojar las semillas en agua durante un perodo mximo de 30 minutos. Iniciar la eliminacin de la cscara de forma manual o con el auxilio de alguna otra tcnica. Investigue las tcnicas utilizadas en el secado de semillas.

6.2. Secado de la semilla. Pesar aproximadamente 900 gramos de semilla ejemplo garvanzo. Colocar las semillas en las bolsas de papel y colocarlos en hornos de conveccion a una To menor a 60 OC durante 48 h Elaborar bolsal de papel periodico y perforarlos para que tenga ventilacion. Pregunte a su instructor de laboratorio sobre la manera adecuada de manejar el horno de conveccin.

6.3. Molienda de la muestra vegetal. Con la ayuda de un mortero y un pistilo se procede a moler aproximadamente 600gramos. de la muestra vegetal. Debe de tener especial cuidado en daar el mortero, por lo que debe de hacerse sin despegar demasiado el pistilo. Anote en su cuaderno de laboratorio la cantidad exacta que peso con su grupo de trabajo.

Auxiliandose del molino tipo Wiley, muele el material previamente macerado, para obtener una muestra fina. NOTA: si el material utilizado para obtener la harina, es demasiado dura, como la semilla de soya, inicie de una sola vez con molturacin del material en los molinos disponibles, sin una previa molturacin en el mortero y pistilo.

6.4. Tamizado de la muestra vegetal molida Tamizar la muestra vegetal, molida previamente, con un tamiz de 20 mallas, Coloque el tamiz sobre el recipiente donde colectara la muestra tamizada Agregue pequeas muestras de material vegetal molido y mueva constatemente el tamiz, evite utilizar la mano o algun material para forzar el paso de la muestra vegetal por el tamiz

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6.5. Almacenamiento de la muestra vegetal preparada para analisis quimico.

Determinar la cantidad de harina obtenida. Fabrique uno o varios paquetes de papel encerado, utilizando tijeras y masking tape. Guardar la harina obtenida, en el(los) paquete(s) de papel encerado. Identificar claramente la harina preparada por su grupo de trabajo. Almacene esta harina en un lugar limpio y seco. Nota: Debido a que la mayora de grupos de trabajo utilizarn "semillas" de la planta de inters, la metodologa que se describirn ser para ese rgano vegetal. En caso de utilizar otra parte de la planta, consultar con su instructor de laboratorio. 7. EVALUACIN DE LA PRCTICA Examen Corto con un nivel de dificultad similar al del CUESTIONARIO PRE LABORATORIO. Tarea No. 2: Usted deber entregar individualmente un trabajo corto, escrito. Para ello debe resolver y realizar aquello que est planteado para el reporte. 8. PARA INCLUIR EN EL REPORTE DE PRCTICA: Reporte la cantidad de semilla utilizada para preparar harina. Reporte la cantidad de harina obtenida Reporte el porcentaje de prdida en el proceso de preparacin de harina. Trate de indicar las razones de prdida de harina. Indique qu cuidados especiales debern aplicarse a la harina en su almacenamiento. 9. INVESTIGAR Por qu debe eliminarse la testa de las semillas que se utilizaren como muestras vegetales para el anlisis en este laboratorio? Refirase a documentos de Tecnologa de Semillas" o dirjase al rea Tecnolgica (Subrea de Manejo y Mejoramiento de Plantas) y pregunto sobre quien puede asesorarle en este tpico. Por qu se utiliza ms la "tcnica de secado al sol" que la de "secado artificial", en la preparacin de muestras vegetales para anlisis qumico? Por qu es necesario calentar las muestras vegetales a temperaturas menores de 60 0C en la tcnica de secado artificial? Cul es la razn de efectuar la "molienda" con material vegetal seco?

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PRCTICA No. 3 EXTRACCIN Y ESTUDIO CUALITATIVO DE PROTENAS EN MUESTRAS VEGETALES1. INTRODUCCIN El contenido proteico es un componente de los anlisis bromatolgicos que se realizan en cultivos para evaluar su calidad nutricional o para evaluar el efecto, en este aspecto, de algn tratamiento practicado (16). Para el estudio de las macromolculas, en este laboratorio, han de realizarse pruebas analticas (cuantitativas y cualitativas). Dichas pruebas estn diseadas para llevarse a cabo en medio acuoso. Es por ello que en esta prctica de laboratorio se prepararn soluciones salinas y acuosas de protenas a travs del proceso de "Extraccin de Protenas" indicado ms adelante. Con la finalidad de no confundir al estudiante en su proceso de aprendizaje, en esta prctica se pretende dar a conocer cmo caracterizar a la macromolcula "Protena", sin profundizar, todava, en las subunidades monomricas que le componen. As que se detendr, por el momento, en el estudio a travs de dos pruebas de caracterizacin de protenas, que son: La Prueba de Biuret y la Prueba de Metales Pesados. Es necesario mencionar, que el estudio cuantitativo de protenas se realizar en una prctica posterior, a fin de evitar que se sobresature el contenido de prcticas de laboratorio siguientes.

2. OBJETIVOS Al finalizar la prctica el estudiante deber estar en capacidad de: Efectuar extraccin salina y extraccin acuosa de las protenas de una muestra Vegetal. Efectuar la prueba de Biuret para la deteccin de protenas y/o pptidos (de al menos dos enlaces peptdicos), en los extractos. Efectuar la prueba de "Precipitacin Proteica por Metales Pesados" para la deteccin de protenas en los extractos. Utilizar adecuadamente el equipo y cristalera de laboratorio empleado en la presente prctica.

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[Escr FACULTAD DE AGRONOMA 3. MARCO TERICO.


3.1. Protenas La importancia de las protenas fue reconocida a comienzos del S. XIX por Mulder (1838): En las plantas y animales hay presente una sustancia que sin duda es la ms importante entre las sustancias conocidas de los seres vivos, y sin ella, la vida sera imposible en el planeta. Esta sustancia se llama protena. El nombre protena atestigua la importancia que sematribuye a esta clase de biomolculas". (19) Bohinski (2) dice lo siguiente: "Cada protena es nica en trminos de estructura y funcin. No obstante, tambin existen numerosas semejanzas entre las protenas. Su caracterstica ms comn es que todas son polmeros formados por aminocidos, que son loa monmeros que se unen en forma covalente unos a otros en secuencia mediante lo que se llama un enlace peptdico. La estructura resultante, que tiene forma de cadena, recibe el nombre de polipptido, o simplemente pptido. Cuando un polipptido consta de 50 o ms residuos (unidades) de aminocidos (un mnimo arbitrario) ya se considera una protena". Como dicen Lehninger, Nelson y Cox (15), casi todo lo que sucede en la clula requiere la intervencin de una o ms protenas. Las protenas proporcionan estructura, catalizan reacciones celulares y llevan a cabo una multitud de tareas. Su papel central en la clula queda reflejado en el hecho que la informacin gentica se expresa en ltimo trmino en forma de protenas. En una clula tpica existen miles de protenas diferentes, cada una codificada por un gen y encargada de realizar una tarea especfica. Las protenas se encuentran entre las macromolculas biolgicas ms abundantes y son tambin extremadamente verstiles en sus funciones. Las protenas son las molculas orgnicas ms abundantes en el interior de las clulas, pues constituyen el 50% o ms de su peso seco. Las protenas ocupan una posicin central en la composicin y en funcionalismo de la materia viva. Las actividades fsicas y qumicas que constituyen la vida de la clula estn catalizadas por enzimas, las cuales son todas de naturaleza proteica (19). 3.2. Extraccin proteica La visin bioqumica general sobre la estructura y funcin de las protenas proviene del estudio de muchas protenas individuales. Los mtodos de separacin de protenas aprovechan las propiedades tales como la carga, tamao y solubilidad, que varan en una y otra protena (15). La Extraccin de Protenas tiene que ver mucho con su solubilidad en diversos compuestos. Dado que muchas protenas se unen a otras biomolculas, las protenas tambin se pueden separar en base a sus propiedades ligantes. La fuente de una protena es

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generalmente un tejido o clulas microbianas. Las clulas deben romperse liberando la protena en una solucin denominada extracto crudo. Protena: del griego protos, primero. Mulder en 1838 introdujo esta palabra con el sentido de "de primer orden, o sea, la sustancia ms importante de la materia viva, Para el caso particular de los laboratorios de Bioqumica de la FAUSAC, interesa la extraccin acuosa y la extraccin salina. Se suelen preparar soluciones de protena a razn de 5 g. de protena por litro de solvente. La casena se disuelve en un poco de NaOH (6N), la albmina, gelatina y peptona se disuelven en solucin salina (NaCl 0.2N) (19) 3.3. Composicin de las protenas En la prctica siguiente, se ver cmo las protenas se conforman a partir de aminocidos. El objeto de colocar aqu, un poco sobre "composicin de Protenas", es para tocar un poco lo de la solubilidad de las protenas y con ello comprender un poco mejor el tema de la "Extraccin de Protenas". Segn Lelninger (15), del aislamiento de muchas protenas en forma pura y cristalina, se ha aprendido que todas contienen carbono, hidrgeno, nitrgeno y oxgeno, y casi todas tambin azufre. Asimismo, hay protenas que contiene elementos adicionales, como fsforo, hierro, zinc y cobre. Lehninger(15) y Bohin.ski(2) coinciden en que las protenas se dividen en dos clases principales basndose en su composicin: Protenas simples y Protenas conjugadas. 1. LAS PROTENAS SIMPLES: son aquellas que por hidrlisis producen solamente aminocidos, sin ningn otro producto principal, orgnico o inorgnico. Comprenden los siguientes grupos: Albminas: Solubles en agua, coagulan por el calor y precipitan con las soluciones salinas saturadas. Globulinas: Solubles en soluciones diluidas de sales de cidos y bases fuertes (NaCl por ejemplo); insolubles en agua pura o en soluciones salinas de mediana concentracin; coagulan por el calor. Glutelinas: Solubles en cidos y lcalis diluidos; insolubles en los solventes neutros; coagulan por el calor. Ejemplo: glutelina del trigo. Prolaminas: Solubles en alcohol de 70 a 80%; insoluble en alcohol absoluto, en agua y en otros solventes neutros. Ejemplos: la zena del maz y la gliadina del trigo. Albuminoides: Solubles en todo solvente neutro y en cidos y lcalis diluidos. En este grupo entran las protenas de sostn. Ejemplo: queratina, colgeno. Histidias: Solubles en agua y en cidos muy diluidos; coagulables por el calor. Predominan los aminocidos bsicos.

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Protaminas: Poli pptidos bsicos, solubles en agua predominan aminocidos bsicos en su estructura; precipitan a otras protenas. Se encuentran principalmente en las clulas huevo.

2. Las PROTENAS CONJUGADAS son aquellas que por hidrlisis producen no solamente aminocidos, sino tambin otros componentes orgnicos o inorgnicos (esta porcin no aminocido, de una protena conjugada se denomina grupo prosttico). Las protenas conjugadas pueden subdividirse de acuerdo con la naturaleza qumica de sus grupos prostticos, y pueden identificarse as: Nucleoprotenas: Compuestos formados por una o varias molculas de protena unidas al cido nucleico. Glucoproteas: Compuestos que tienen carbohidratos como grupos prostticos. Ejemplo: la mucina. Fofoprotenas: Compuestos con un radical que contiene fsforo que no sea ni un fosfolpidos ni cido nucleicos. Ejemplo: la casena. Cromoprotenas: Compuestos conjugados con un grupo cromforo. Ejemplos: hemoglobina, citocroruo y flavoproienas. Lipoprotenas: Poseen grasas neutras (triglicridos) u otros lpidos tales como fosfolpidos y colesterol. Metaloprotenas: Resultan de la unin con un metal. Flavoprotenas: Tienen una flavina como grupo prosttico. De vez en cuando pueden estar presentes dos o ms grupos prostticos idnticos o diferentes. 3.4. Configuracin (forma) de las protenas Segn la forma o estructura tridimensional de las protenas, estas pueden ser: fibrosas y globulares. Las protenas fibrosas tienen formas moleculares muy alargadas. Como dicen Sniith y Woocl(19), son insolubles en medio acuoso. Dentro de ellas encontramos: Cartlagos, tendones, cabello, seda, exoesqueleto de los insectos, etc... Las protenas globulares son ms compactas que las fibrosas; en general son ms solubles que las protenas fibrosas. Incluyen la mayora de enzimas, muchas hormonas y otros como los anticuerpos (2,19). 3.5. Extraccin salina de las protenas Segn White, et.aL (20), las sales pueden disminuir o aumentar la solubilidad de una protena. El efecto salino haciendo mayor la cantidad de protena disuelta se conoce como salling-in, o solubilidad por salado.

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Como usted recordar, del contenido terico de la Qumica General II, la solubilidad de cualquier sustancia depende de la afinidad relativa entre la correspondiente a las molculas del soluto entre s y la existente con las molculas del solvente. Como dicen White et.al. (20): "Cualquier factor que disminuya las interacciones entre las molculas del soluto tender a aumentar la solubilidad. En el efecto salling-in, los pequeos iones de las sales neutras interaccionarn con los grupos inicos de las molculas proteicas, disminuyendo la interaccin proteica y, por tanto, favoreciendo la solubilidad". 3.6. Reacciones de color de protenas (20) An cuando todas las protenas son. Compuestos formados por aminocidos unidos por enlaces peptdicos, estas sustancias presentan variaciones considerables en sus propiedades qumicas y biolgicas. Las protenas reflejan las propiedades qumicas do los aminocidos que estas contienen en su estructura. Muchas de las reacciones de color de las protenas dependen de la presencia de un aminocido en su molcula. 3.7. Prueba de precipitacin proteica con metales pesados

Esta prueba permite detectar la presencia de protenas. La precipitacin de las protenas se llama "desnaturalizacin". En ella hay prdida de la actividad biolgica de la molcula. La desnaturalizacin puede ser causada por: a) agentes fsicos o b) por agentes qumicos. La prueba se basa en que no todas las protenas son igualmente sensibles a los agentes desnaturalizantes y esta propiedad puede usarse para remover ciertas protenas de una mezcla. A pH 7 o por encima de l, las protenas estn usualmente cargadas negativamente, as que la adicin de metales cargados positivamente neutraliza la carga y la protena precipita. La precipitacin por metales pesados es, por lo tanto, ms efectiva a valores de pH neutros o ligeramente alcalinos, pero la solucin no puede ser muy alcalina porque se corre el riesgo de que se precipiten hidrxidos de los metales. El precipitado es frecuentemente soluble en exceso de iones de metal pesado, ya que tal exceso confiere a las partculas, cargas positivas estables.

Figura 3: Resultados de prueba de nitrato de plata, as como la reaccin.

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Figura 4: Resultados de la prueba de (CH3COO)2Pb Fuente: Marvin Pec.

3.8. Biuret El ion cobre formar un complejo con las protenas de una manera similar al que forma con el amonio. El complejo en el caso de las protenas es rojo o violeta, y azul en el caso del amonio. La prueba es positiva cuando la muestra analizada posee, al menos, dos enlaces peptdicos (tripptidos, polipptidos y protenas); esto quiere decir que los aminocidos y los dipptidos dan una prueba negativa de Biuret. La sustancia ms simple que tiene dos uniones peptdicos es el Biuret (NH2CONHCONH2) y esta es la razn por la cual esta reaccin lleve el nombre de Biuret.

O

C HN

C NH HC Cu2+ C

O

R O

CH C

R O

HN R CH

NH HC R

Figura 5: Resultados de prueba de Biuret y figura que muestra la interaccin entre cobre y aminocidos

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4. CUESTIONARIO PRE LABORATORIO PRCTICA 3 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. Elabore una definicin propia de: protena. Cules son los cinco elementos que se encuentran ms comnmente en las protenas? Cmo pueden clasificarse las protenas segn su "composicin"? Cul es la diferencia entre una protena simple y una protena conjugada? Mencione tres protenas simples que sean solubles en agua. De una definicin de grupo prosttico. Mencione al menos tres compuestos que pueden, existir corno grupos prostticos, en las protenas. Qu tipo de protena -segn su configuracin- es ms "soluble"? Las fibrosas o las globulares? A qu se refiere la "solubilidad por salado" o salting-in? A qu se le llama "desnaturalizacin" de protenas? A pH 7 o por encima de l, las protenas precipitan cuando se les adicionan metales pesados. Por qu? Adems, por qu en esta reaccin la solucin no debe estar demasiado alcalina?

11. Qu caracterstica debe tener un compuesto para dar positiva la prueba de Biuret? 12. Indique el cambio que evidencia un resultado positivo para la prueba de "Metales Pesados" y para la prueba de "Biuret".

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[Escr FACULTAD DE AGRONOMA 5. MATERIALES A cada del grupo de trabajo: Balanza mono plat 2 Becker de 150 ml. 2 erlenmeyer de 50 ml. 1 anillo de hierro 1 esptula 12 tubos de ensayo


A cargo del da de laboratorio: Centrfuga manual 2 varillas de agitacin Probeta de 25 ml 1 plancha agitadora 1 embudo plstico 1 soporte universal Agua destilada Solucin de Biuret [0.2M 1 estufa elctrica Papel parafilm No. 42 Papel encerado 2 probetas de 10 ml. 1 piceta 4 tubos de ensayo c/tapn de rosca-1 pinza p/tubo de Solucin NaCl 10.2N] Solucin Acetato de Pb Refrigeradora Papel filtro Whatman Centrifugadora Solucin de HCl (6N) 1 beacker de 500 mL Solucin de Sulfato Cu [0.2M] 1 gradilla de metal 2 tubos p/centrfuga Etiquetas autoadhesivas Solucin Nitrato de Hg 10.2M Centrifugadora

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[Escr FACULTAD DE AGRONOMA 6. METODOLOGA


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6.1. EXTRACCION ACUOSA DE PROTEINAS a. Mida dos (2) gramos de harina de la muestra a estudiar, en el beacker de 150 mL b. Aada 25 mL de agua destilada. c. Mezcle, durante 5 minutos, utilizando un agitador magntico, o bien agitando manualmente. d. Reposar la mezcla por tres minutos y Agite, nuevamente, durante cinco minutos.Centrifugacion. e. Centrifuge la suspensin durante diez minutos, utilizando una centrifugadora manual, que encontrar en un locker de grupo, o bien la centrifugadora elctrica de la Subrea de Ciencias Qumicas.

f. Decante y filtre el sobrenadante, utilizando papel Whatman No. 42. Colecte el lquido filtrado en un erlenmeyer de 50 ml Identifique el erlenmeyer de 50 mL con su nmero de grupo, da y jornada de laboratorio g. Devuelva al beacker de 150 ml el sedimento resultante del proceso de centrifugacin. h.Repita una vez mas la metodologia descrita del 6.1. a al 6.1. f para obtener una mayor cantidad del extracto. y lo obtenido colocarlo en el erlenmeyer anterior, y este constituira el Extracto acuoso

Mida en con una probeta de 25 ml la cantidad de Extracto obtenida.i. Selle el erlenmeyer que contiene el extracto, utilizando papel parafinado y/o papel parafilm. j. Almacene este extracto en una refrigeradora de la Subrea de Ciencias Qumicas. k. Indique la cantidad obtenida de Extracto Acuoso

6.2. EXTRACCION SALINA DE PROTEINASa. Coloque el residuo de la extraccin acuosa en un beacker de 100 ml. b. Agregue 25 mL de solucin de NaC1 0.2N, al residuo de la extraccin acuosa c. Repita la metodologia del 6.1 b al 6.1 g

d. Agregue otros 25 mL de la solucin de NaCl 0.2 N al residuo anteriormente tratado y repita la metodologia del 6.1. b al 6.1 f Repita los pasos de los incisosos 6.1 i al 6.1. k Indique la cantidad de obtenda de extracto salino

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[Escr FACULTAD DE AGRONOMA PRUEBAS DE CARACTERIZACIN DE PROTENAS


El siguiente cuadro, es una gua para el estudiante para que sepa qu muestras se van a analizar con cada prueba, en esta prctica. CUADRO 1. Resumen de pruebas cualitativas, protenas.PRUEBA

a realizar a soluciones patrones y extractos de

METALES PESADOSMUESTRA A ANALIZAR

BIURET

Extracto Acuoso Extracto Salino Peptona Albumina Casena Gelatina NOTA: Las soluciones patrn (peptona, albmina, casena y gelatina) son protenas. Estas soluciones se utilizan para que el estudiante tenga cuatro "testigos" de resultados positivos en cada prueba. En otras palabras, estas soluciones sirven para poder observar como es el resultado positivo para cada una de estas pruebas.

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6.3. PRUEBA DE PRECIPITACION PROTEICA.a. Tome 6 tubos de ensayo limpios y secos. b. En cada tubo de ensayo, por separado, coloque 2 mL de muestra a analizar. Ver el Cuadro 1, presentado anteriormente, para ver cules son las 6 muestras a utilizar. c. dentifique los tubos de ensayo para evitar confusiones en el manejo de los mismos.

d. A cada muestra aada 6 gotas del metal pesado que se le ha indicado. e. Agite cada uno de los tubos de ensayo. (como metal pesado puedeutilizarse "sulfato de cobre", "acetato .de plomo" o "nitrato de plata" con una concentracin 0.2M c/u)

f. observe los resultados y anote en su cuadernode laboratorio

6.4. PRUEBA DE BIURET. a. Tome 6 tubos de ensayo limpios y secos. b. En cada tubo de ensayo, por separado, coloque 1 mL de muestra a analizar. (Vea el Cuadro 1, presentado anteriormente, para ver cules son las 6 muestras a utilizar.) c. Identifique loa tubos de ensayo para evitar confusiones en el manejo de los mismos. d. A cada muestra aada de 20 a 35 gotas del reactivo de Biuret.

Si usted quisiera saber preparar el reactivo de Biuret, dirjase a su instructor de laboratorio, a la Coordinacin de la Subrea o a la "Bodega de Cristalera y Reactivos". As puede obtener una copia dla metodologa necesaria para dicha preparacin.

e. Agite cada uno de los tubos de ensayo. f. Si no se observa un color violeta o rojo, djelos reposar durante 10 o 15 minutos. La coloracion es positiva si es como la del tubo de ensayo No. 1 Al terminar de utilizar los extractos gardarlos en refrigeradora.

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7. EVALUACIN DE LA PRCTICA Examen Corto con un nivel de dificultad similar al del CUESTIONARIO PRE LABORATORIO. La metodologa de evaluacin tambin incluye un Informe de prctica. Este informe puede hacerse en parejos o individualmente, y debe incluir: Cartula RESULTADOS Y ANLISIS DE RESULTADOS Resultados de prctica. Estos se presentan segn las siguientes indicaciones: Para los resultados de los numerales 6.1 y 6.2 de la metodologa, solamente resuelva lo que se le indica en los "cuadritos negros" que all aparecen. Para los numerales 6.3 y 6.4, primeramente debe presentar un cuadro de resultados pura cada prueba: Siga el modelo indicado en el Cuadro 2. CUADRO 2. Resultados de la prueba de BIURET con las cuatro soluciones patrn y los dos extractos de protenas. MUESTRA ANALIZADA Extracto Acuoso Extracto Salino Peptona Albmina Casena Gelatina REFERENCIA: Coloracin = color observado como resultado de la prueba Dictamen = prueba positiva (+) o negativa (-). Adems del cuadro anterior, para los numerales 6.3 y 6.4, debe incluir el anlisis y explicacin de los dos cuadros de resultados, a fin de establecer la presencia o ausencia de protenas en cada muestra problema. (Para el caso de la explicacin que se le pide, haga nfasis sobre si hay concordancia de los resultados prcticos con el fundamento terico. Si no hubiese tal concordancia, plantee una justificacin valida). COLORACIN OBTENIDA DICTAMEN

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Resuelva los "cuadros" que aparezcan en su metodologa (6.3 y 6.4); debe presentarlos tambin, intercalados con los resultados, y anlisis de resultados. Esto puede servirle tambin como una gua para ou anlisis de resultados. 8. PARA INCLUIR EN EL INFORME EN LA DISCUSIN Qu es una solucin patrn? Qu utilidad encontrada con el uso de este tipo de soluciones en la presente prctica? De la extraccin de protenas: Cul cree que es (son) la(s) razn(es) para realizar dos tipos de extraccin de protenas? Cuntos tipos de "extraccin de protenas" existen y cules son? En qu se diferencian estos tipos de extraccin? Qu tipo de protena -segn su configuracin- es ms "soluble"? Las fibrosas o los globulares? En funcin de ello qu tipo de protena -segn su configuracin- habr en mayor cantidad en sus "Extractos de protenas"? Esquematice (utilice dibujos sencillos: No se complique) el procedimiento general para extraer protenas de una muestra vegetal. Sugiera usted el solvente para extraccin (agua o solucin salina) En qu se basa la prueba de Precipitacin proteica por metales pesados? Qu resultado indica una prueba positiva en esta prueba? Qu se logra identificar con esta prueba? En qu se basa la prueba de Biuret? Qu resultado indica una prueba positiva en esta prueba? Qu se logra identificar con esta prueba? Haga un listado de los tipos de protenas que se pueden extraer con Agua. (Vea la parte Composicin de las Protenas" de su material de Apoyo a la prctica) Haga un listado de los tipos de protenas que se pueden extraer con Solucin salina. (Vea la parte "Composicin de las Protenas" de su material de Apoyo a la prctica) A qu se refiere la solubilidad por salado o "salting in"? Qu tiene que ver con esta prueba de la prctica?

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PRCTICA 4 ESTUDIO DE AMINOCIDOS DE MUESTRA VEGETALES1. INTRODUCCIN En la prctica anterior se ha efectuado el estudio cualitativo de protenas de una muestra vegetal. Esta vez el estudio recae en las unidades que componen a las protenas; usted recordar que en la prctica 1 se mencion que las protenas se construyen a partir de aminocidos, los cuales son las subunidades monomricas que se unen para formar esas macromolculas. Tal como se ver ms adelante, pueden obtenerse aminocidos libres a partir de la hidrlisis de protenas. Esto es, entonces, la primera parte de esta prctica, la hidrlisis de protenas; luego, mediante el anlisis de los hidrolizados, se habr de comprobar si la hidrlisis de las protenas fue o no fue completa. El desarrollo de esta prctica contina con un estudio cualitativo de los hidrolizados obtenidos; es este el momento en que el estudiante de laboratorio centrar su atencin en los aminocidos y podr detectar su presencia/ausencia. Esta prctica es una de las ms que necesita ms tiempo para su realizacin. A s que deben emplearse al mximo las dos horas de laboratorio y en caso de no poder terminar con la metodologa de prctica, se tendr que trabajar en otro momento, acordado por el instructor y los estudiantes, dentro de la semana asignada para esta prctica. 2. OBJETIVOS: Al finalizar la prctica, el estudiante deber estar en la capacidad de: Efectuar la hidrlisis cida e hidrlisis alcalina de protenas extradas de la muestra vegetal. Determinar la presencia o ausencia de aminocidos en hidrolizados de protenas. Determinar la presencia o ausencia de aminocidos con ncleo aromtico, en hidrolizados de protenas. Determinar la presencio o ausencia de aminocidos fenlicos, en hidrolizados de protena. Determinar la presencia o ausencia de thioaminocidos, en hidrolizados de protena. Determinar la presencia o ausencia de aminocidos con grupo imidazol, en hidrolizados de protenas. Utilizar soluciones patrn, para obtener resultados positivos que acten como testigos en cada prueba de esta prctica. Utilizar adecuadamente el equipo y cristalera de laboratorio empleado en la presente prctica.

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[Escr FACULTAD DE AGRONOMA 3. MARCO TERICO.


La hidrlisis proteica es el proceso de rompimiento del enlace peptdico con lo que se producen ppticos y/o aminocidos libres. La hidrlisis proteica puede ser de tres tipos: cida, alcalina o por enzimas (10,15) La hidrlisis con cido o base no es especfica y existen algunos aminocidos que sufren modificaciones o pueden ser destruidos. Mediante la hidrlisis enzimtica es posible romper los enlaces peptdico entre residuos de aminocidos especficos. La hidrlisis es un proceso fundamental para llegar a determinar la secuencia de aminocidos que conforman la estructura primaria de la protena. (15). Hidrlisis de las protenas mediante cido: (De Harper (10) y Lehninger (15)): la mayora de las protenas son completamente hidrolizadas hasta sus aminocidos constituyentes calentando a 110oC durante 20 a 70 horas en HCL 6N. La hidrlisis se realiza en un tubo cerrado. El hidrolizado resultante contiene los aminocidos en forma de clorhidratos. Sin embargo, no todos los aminocidos de un pptido o de una protena determinada se recuperarn cuantitativamente. Esto quiere decir lo siguiente: Todo el triptfano y cantidades variables se serina y treonina son destruidos. Los grupos amida de la glutamina y la asparagina resultan hidrolizados, con produccin de los cidos glutmico y asprtico y de iones amonio. Hidrlisis de las protenas por lcali: esta se usa para recuperar el triptfano y la tirosina, los cuales no se destruyen por hidrlisis alcalina. Sin embargo, la hidrlisis alcalina provoca la destruccin de la arginina, la cistina, la serina y la treonina; todos los aminocidos son racemizados. Por ello el mtodo se emplea para la determinacin por separado del triptfano, que es estable a la calefaccin con bases. (10,15) 3.1. Aminocidos Anteriormente se cit a Bohinski (2) para conocer que la caracterstica ms comn de las protenas es que todas son polmeros formados por aminocidos. Este autor dice que los aminocidos son monmeros que se unen en forma covalente unos a otros en secuencia mediante lo que se llama un enlace peptdico, y dan por resultado una estructura que tiene forma de cadena; esa estructura recibe el nombre de polipptido, o simplemente pptido. Cuando un polipptido consta de 50 o ms residuos (unidades) de aminocidos (un mnimo arbitrario) ya se consideran una protena. El primer aminocidos que se aisl de una protena fue la glicina (del griego glykis, dulce, pues la sustancia tiene cierto sabor dulce); la obtuvo Braconnot, en 1820, al hidrolizar la gelatina con

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cido sulfrico diluido, en un intento de averiguar si la gelatina, como la celulosa, producira un azcar por hidrlisis. Durante un perodo de 50 aos, el aislamiento de aminocidos a partir de hidrolizados de protena era una cuestin de azar, ms que un problema de investigacin sistemtica (10). A partir de estos bloques unitarios, los aminocidos, los diferentes organismos pueden fabricar productos tan diversos como enzimas, hormonas, anticuerpos, la protena del cristalino del ojo, antibiticos, venenos de hongos y muchas sustancias con actividades biolgicas distintas (15) 3.2. Estructura de los aminocidos caractersticas generales Se sabe que existe alrededor de 300 aminocidos diferentes de origen natural. Muchos de ellos solo se observan en determinadas formas de vida, y algunos solo aparecen en una especie. Sin embargo, todos los organismos usan solo 20 de ellos para la biosntesis de protenas, lo que constituye un notable ejemplo de la unidad bioqumica en la biosfera (2). Como seala Lehinger, Nelson y Cox (15), debido a que cada uno de esos aminocidos tiene una cadena lateral propia que determina sus propiedades qumicas, se puede considerar a este grupo de 20 molculas precursoras como el alfabeto en el que est escrito el lenguaje de la estructura proteica . Las clulas pueden producir protenas con propiedades y actividades claramente diferentes uniendo los mismos 20 aminocidos en multitud de combinaciones y secuencias distintas. Como dice Bohinski (2) y White & Handler (18), casi todos los aminocidos (salvo la Prolina y la hidroxiprolina) son alfa-aminocidos pues tienen un grupo amino (-NH2) y Un grupo carboxilo (COOH) unidos al mismo tomo de carbono, llamado alfa.

Cada aminocido posee propiedades nicas debido a la variacin en la estructura de los Grupos R (el grupo R se refiere a la cadena lateral del aminocido). Lehninger, Nelson y Cox (15) dicen que algunos aminocidos son mucho menos frecuentes q otros. Por ejemplo, muchas protenas poseen relativamente pocos restos de Histidina y de triptfano. 3.3. Reacciones qumicas de los aminocidos Alfa-amino ms caracterstica y ms ampliamente utilizada es la reaccin de la Las reacciones qumicas de los aminocidos son las de sus grupos funcionales, es decir, las de los grupos alfacarboxilo y alfa-amino, as como las de los grupos funcionales presentes de las cadenas laterales.

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Una de las reacciones del grupo ninhidrina, que puede utilizarse para valorar los aminocidos cuantitativamente en cantidades muy pequeas (15) 3.4. Solubilidad de los aminocidos La naturaleza del radical R de los aminocidos, puede ser, por un lado, hidroflico o Hidrofbico y, por otro, acida, bsica o neutra. Fieser y Fieser (10) sealan que como los aminocidos contienen simultneamente grupos carboxilo y amino, se comportan como sustancias anfteras que se ionizan como cidos y como bases. En el laboratorio de Bioqumica de la FAUSAC, se acostumbra preparar soluciones patrn de aminocidos a razn de 1g de aminocidos por litro de agua destilada. Para disolver los aminocidos hay que considerar si estos son cidos, bsicos o neutros. As: los aminocidos se disuelven en agua y agregando unas gotas de HCl 1N; por otro lado los aminocidos bsicos se disuelven agregando, al agua, unas gotas de NaOH6N. Los aminocidos neutros se disuelven simplemente en agua (5, 16). Esto de aminocidos cidos, neutros o bsicos depende del grupo R de los aminocidos. Para profundizar en ello se recomienda referirse al captulo 5 de Lehninger, Nelson y Cox (15) 3.5. Protenas vegetales y nutricin humana (18) Salisbury y Ross (18) sealan lo siguiente: seres humanos y otros animales dependen de los vegetales para obtener muchos de sus aminocidos, por lo que la composicin protenica de semilla, hoja y tallo es importante para la dieta. Nosotros y otros animales, utilizamos estos aminocidos para formar nuestras propias protenas y como fuente alimenticia ( de energa ). Aunque los humanos adultos podemos sintetizar la mayor parte de los aminocidos que necesitamos, a partir de carbohidratos y diversos compuestos orgnicos nitrogenados, hay ocho aminocidos que debemos obtener del alimento. Estos son: leucina, isoleucina, valina, lisina, metionina, triptfano, fenilalanina y treonina. Adems parece que slo se pueden formar cantidades adecuadas del aminocido azufrado Cistenas cuando se dispone de suficiente metionina (otro aminocido azufrado ), y Utilizamos la fenilalanina para sintetizar tirosina, que de lo contrario tambin seria Esencial en la dieta. La mayor parte de las protenas en la dieta humana provienen de semillas, en especial granos de cereales como maz, trigo y arroz. Una contribucin menor, pero an importante, la hacen semillas de leguminosas como frjol, chcharo y soya.

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Comparados con casi cualquier protena animal, las protenas de los granos de cereal tienen bajo contenido de lisina, mientras que las semillas de las leguminosas tienen bajo contenido de metionina. Los agricultores estn logrando algunos avances con la introduccin de especies nuevas o hibridas con mayor contenido protenico y mayores porcentajes de aminocidos esenciales.Cuadro 3. Contenido proteico y composicin de aminocidos de algunos cereales y Leguminosas.

3.6.

PRUEBAS DE CARACTERIZACIN CUALITATIVA DE AMINOCIDOS: (5,16)

a) Prueba de la ninhidrina: Esta prueba se utilizar en este laboratorio para la deteccin de aminocidos. Al reaccionar la Ninhidrina, un agente oxidante poderoso, con cualquier alfa aminocido a un pH entre 4 y 8 se forma un compuesto azulado o violeta. Con la prolina o Hidroxiprolina, que poseen un grupo amino libre, el color producido es amarillo.

Fig. 6. Reaccin de Ninhidrina

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[Escr FACULTAD DE AGRONOMA b) Prueba de sanger:


En solucin dbilmente alcalina, el 1-fluor-2,4-dinitrobenceno (FDNB) convierte cualquier aminocido en su derivado 2,4 dinitrofenicado, por sustitucin de un hidrogeno del grupo-amino en un grupo 2,3-dinitrofenilo. En esta prueba, el desarrollo de un precipitado amarillo denota la presencia de aminocidos.

Fig. 7. Reaccin de Sanger

c) Prueba xantoproteica: Los aminocidos que poseen un ncleo aromtico forman nitro derivados de color amarillo cuando se calientan con acido ntrico concentrado. Las sales de estos derivados son de color naranja. Por lo tanto, el aparecimiento de color naranja, en esta prueba, denota la presencia de aminocidos aromticos. Las protenas que contienen triptfano, tirosina, y fenilalanina, dan prueba positiva. Esta prueba la realizan inadvertidamente los estudiantes cuando derraman cido ntrico sobre su piel.

Figura No. 8 coloracion de los extractos tanto acido como basico despues de la aplicacin de acido nitrico. Ademas de la coloracion de los patrones

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[Escr FACULTAD DE AGRONOMA d) Prueba de millon:


Los compuestos que contienen el radical hidroxibenceno reaccionan con el reactivo de Millon formando compuestos rojos. Los nicos aminocidos fenlicos son la tirosina y sus derivados y solamente ellos dan una reaccin positiva.

Fig. 9 Reaccin positiva de millon

e) Prueba del sulfuro: Los thioaminocidos reaccionan en medio alcalino con el acetato de plomo, precipitando sulfuro de plomo (de color negro) como uno de los productos.

Fig. 10 Reaccin de Sulfuro

f) Prueba del bromo: El bromo acta en medio alcalino con aminocidos que poseen el grupo imidazol (como la Histidina), provocando una reaccin de adicin al eliminar un doble enlace. El compuesto as formado posee una cloracin azul- violeta. Esto quiere decir, que cuando en esta prueba se produce un color azul-violeta, se denota la presencia de Histidina.

Figura No. 11 Reaccin del bromo.

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4. CUESTIONARIO PRE LABORATORIO PRCTICA 4 1. Qu Es la hidrlisis proteica?

2.

Qu tipo de hidrlisis se utiliza para la determinacin por separado del triptfano? Explique.

3.

Elabore una definicin propia de: Aminocido.

4.

A qu se refiere el trmino alfa-aminocido?

5.

A qu se refiere el grupo R que poseen los aminocidos?

6.

Mencione al menos 5 productos que se pueden formar a partir de las distintas combinaciones de aminocidos:

7.

Qu grupos funcionales son los que propician las reacciones qumicas de los aminocidos?

8.

Cmo disolvera usted 3 gramos de un aminocido cuyo grupo R es de naturaleza alcalina?

9.

En la reaccin de Nihidrina Qu reaccin provoca una coloracin azulada o violeta? Cul reaccin provoca un color amarillo?

10. Explique en qu consiste la prueba de Sanger, la prueba Xantoprotica, la prueba de Millon, la prueba de Sulfuro y la prueba del Bromo.

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11. Investigue a que se refieren los trminos: aminocido fenolico, thioaminoacido, y aminocido con grupo imidazol. Consulte a su instructor de laboratorio, a su catedrtico de curso o en alguno de los libros que se le sugieren como bibliografa del curso.

12. Cules son los 8 aminocidos que los adultos debemos obtener del alimento?

13. Refirase al cuadro 1 del material de apoyo de esta prctica. Observe los aminocidos que all se le presentan. Diga cules de ellos se trabajarn en esta prctica (vea cuadro 2 que est en el instructivo de practica).

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[Escr FACULTAD DE AGRONOMA 5. MATERIALES A cargo del grupo de laboratorio: Extracto acuoso Extracto salino Muestra desconocida 4 beackers de 50 Ml 2 varillas de agitacin 1 pizeta 4 tubos grandes con tapn de rosca 1 gradilla de metal grande 4 frascos con gotero para cada una de las siguientes soluciones: NaOH (1N), NaOH(GN), HCl(6N), Y HCl(1N). 30 tubos de ensayo 2 gradillas de metal 2 pinzas p/tubo de ensayo 1 estufa elctrica 2 probetas de 10 mL 1 beacker de 500 mL 1 beacker de 100 ml Frasco gotero identificado para cada una de las siguientes soluciones: Nihidrina, FDNB, Millon, NaNO2 1 % y acetato de plomo 2%


A cargo del auxiliar de laboratorio 1 estufa elctrica colocada en una campana de gases 1 beacker de 500 mL Recipiente de polietileno con solucin NaOH (6N) Agua destilada Etiquetas autoadhesivas Gotero de pico de gallo con acido ntrico (ubicado en campana de gases) Gotero pico de gallo con acido sulfrico (ubicado en lavadero de laboratorio) Gotero pico de gallo con solucin de bromo (ubicado en campana de gases) Gotero pico de gallo con carbonato de Amonio (ubicado en campana de gases) Solucin de HCl (6N) Solucin HCl Autoclave Mechero de Meckler Manguera de hule Trpode para autoclave Rollos de papel pH Potencimetros (medir pH).

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[Escr FACULTAD DE AGRONOMA 6. METODOLOGA.


6.1. HIDRLISIS CIDA DE PROTENAS: a. Coloque 8 mL de extracto acuoso en tubo de ensayo con tapn de rosca. b. Agregue 12 mL de HCl (6N) c. Coloque el tapn en el tubo de ensayo y cierre (tal como le indica el instructor) d. Identifique este tubo con tapn de rosca, con la letra A e. Repita los pasos del 6.1a al 6.1c, utilizando extracto salino en lugar de extracto acuoso. f. Identifique este tubo con la letra B 6.2. HIDROLISIS ALCALINA a. Coloque 8 mL de extracto acuoso en un tubo de ensayo con tapn de rosca. b. Agregue 12 mL de NaOH(1N) c. Coloque el tapn en el tubo de ensayo (tal como le indica el instructor) d. Identifique este tubo con la letra C. e. Repita los pasos 6.2a al 6.2c, utilizando extracto salino en lugar de extracto acuoso. f. Identifique este tubo con la letra D. 6.3. UTILIZACION DEL AUTO CLAVE a. Toda vez que tenga identificados los tubos con las letras A, B, C y D (adems de una sea que identifique que pertenece a su grupo de trabajo) proceda de la siguiente manera: b. Agregue agua de chorro hasta la marca lmite del autoclave. c. Coloque los 4 tubos en la gradilla que est en el autoclave. d. Cuando su instructor le autorice, cierre el autoclave hermticamente. e. Coloque el autoclave sobre un trpode metlico, cuidando que no exista peligro de caerse. f. Encienda el mechero Meckler y aplique calor al autoclave. g. Procure mantener la temperatura del autoclave en un rango de 212 F a 228 F.h. Para mantener la temperatura regule el flujo de calor y utilice la vlvula para liberar presin del autoclave. Al usar la vlvula tenga cuidado porque esta estar caliente. i. Mantenga el autoclave a esa temperatura por un periodo no menor a 15 minutos, ni mayor a 20 minutos. j. Libere la presin del autoclave con la vlvula, esperando hasta que no observe mas salida de vapor de agua. k. Asegrese que la presin marca 0 y abra la tapa del autoclave. l. Saque los tubos con tapn de rosca que sean de su grupo.

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NEUTRALIZACION DE LOS HIDRILIZADOS Las pruebas de caracterizacin deben realizarse a un pH neutro o no mayor a 8. Por ello ahora se pretende neutralizar los hidrolizados. Importante es mencionar que aunque aqu se han de neutralizar los hidrolizados, aqu se les seguir llamando hidrolizado acuoso acido (A), hidrolizado salino acido (B), hidrolizado acuoso bsico (C) e hidrolizado salino bsico (D). Proceda as: Tome los cuatro tubos (A, B, C y D) que saco del autoclave y coloque su contenido en cuatro erlenmeyers de 50 ml identificados con la letra respectiva (A, B, C y D). Aqu tenga cuidado de no confundir o revolver los hidrolizados que efectu en los nmeros 6.1 y 6.2 de este instructivo

6.4. NEUTRALIZACION DE LOS HIDROLIZADOS ACIDOS a. A los hidrolizados de los erlenmeyers A y B agregue 11.8 ml de solucin de NaOH 6n. b. Corte en varias tiritas, una tira de papal pH con una tijera c. Proceda a medir el pH de los hidrolizados de los erlenmeyers A y B d. Si el pH es 7 o al menos no es mayor que 8 pase al numeral 6.7 Si no sucede esto siga como se le indica: e. Agregar gota a gota solucin de NaOH 1N, hasta obtener un pH neutro f. Siga conforme el numero 6.7 NOTA: para agilizar el procedimiento, en vez de utilizar papel pH, se deben de utilizar los potencimetros, teniendo el cuidado debido con los bulbos y el aparato completo.

6.5. NEUTRALIZACION DE LOS HIDROLIZADOS BASICOS a. A los hidolizados de los erlenmeyers C y D agregar 11.8 ml de solucin de HCL1n. b. Corte en varias tiritas, una tira de papal pH con una tijera c. Proceda a medir el pH de los hidrolizados de los erlenmeyers C y D d. Si el pH es 7 o al menos no es mayor que 8 pase al numeral 6.7 Si no sucede esto siga como se le indica: e. Agregar gota a gota s

BIOQUÍMICA, estudio de aminoácidos, cromatografía de aminoácidos y espectrofotometría,

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