Antecedentes y experimentoAntecedentes y experimento

Para el aislamiento de un gen de un organismo para introducirlo en otro

¿Para que nos sirve la Tecnología de DNA recombinante?

¿Cómo hacerlo ?

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Producción del vector recombinante. (Vector y DNA cortado con enzimas de restricción y su posterior ligación)

Transfomación de células de E. coli

Células de E. coli transformantes creciendo en el medio IPTGInducción de proteína recombinante

Esquema para la producción de proteína recombinante

Hasta donde vamos con la Hasta donde vamos con la producción de células producción de células

transformantes?transformantes?

1. Comprobamos fenotípicamente que las células tengan el vector recombinante. Crecimiento en medio de selección para kanamicina.

2. Comprobamos que contenga el inserto, mediante la restricción del plásmido y nos FALTA

3. Comprobar que se produzca la proteína para la cual codifica el gen de interés.

• Conocer el fundamento de la inducción de la síntesis de proteínas recombinantes en E. coli.

• Realizar la inducción de una proteína recombinante (-lactamasa).

• Obtener la curva temporal de inducción de una proteína recombinante.

• Interpretar el patrón electroforético de producción de una proteína recombinante.

• Conocer las aplicaciones biotecnológicas de las proteínas recombinantes.

Objetivos de la inducción de proteína recombinante

¿Qué proteínas se pueden ¿Qué proteínas se pueden producir con la tecnología del producir con la tecnología del

RNA recombinante?RNA recombinante?

• De todo tipo, proteínas membranales, proteínas solubles, proteínas de bajo o de alto peso molecular

• Pero, dependiendo de la proteína a expresar necesitamos un tipo particular de vector en el que se introduce el gen de interés.

Vectores de expresión para producción Vectores de expresión para producción de proteínas recombinantesde proteínas recombinantes

• La función de un vector de expresión es llevar a la formación del producto del gene, usualmente más del producto mejor.

• Por lo tanto los vectores de expresión tienen promotores muy fuertes,

• Esto quiere decir que entre más RNAm producido más proteína se obtendrá.

VECTORES DE EXPRESIÓN VECTORES DE EXPRESIÓN INDUCIBLEINDUCIBLE

• Generalmente es ventajoso mantener al gene recombinante o transgen reprimido hasta que se este listo para expresar en la célula huésped.

• Esto es porque las proteínas eucarióticas producidas en gran escala pueden ser tóxicas para las bacterias e interferir con el crecimiento bacteriano.

• Entonces la solución es mantener el gene clonado en la bacteria APAGADO.

• ¿Cómo apagamos el gen?

• Colocándolo debajo de un promotor inducible que puede mantenerlo apagado. Un ejemplo es el del operón lac

• Tenemos al inserto en negro

• Con un cuadro la región (secuencia) del operador (O)

• Lac I la secuencia que codifica para la proteína represora (parte del sistema de regulación del operón lac)

o

El operón lac consta de tres genes estructurales (lacZ, lacY, y lacA), que codifican enzimas metabólicas implicados en la utilización de la lactosa como fuente de carbono. Lac I codifica para una proteína represoraOperador es una secuencia a la que de manera específica se puede unir la proteína represora.En presencia de una molécula que se une a la proteína represora se reprime la expresión de los genes

• El inductor del operón lac que utilizaremos será el isopropiltiogalactósido (IPTG).

• El IPTG suele utilizarse como inductor artificial del operón lac, ya que es capaz de unirse al represor LacI (es decir a la proteína represora), pero no es un sustrato para la β-galactosidasa y no puede ser metabolizado por la bacteria.

• En presencia de una molécula como lactosa o un análogo se forma un complejo con la proteína represora y entonces el complejo no se une al operador y entonces la RNA polimerasa transcribe el gene.

No transcripción del TRANSGENE:

• Cuando al sintetizarse la proteína represora (lac repressor) va y se une a la región del operador.

• Entonces no hay transcripción transgene porque se impide la unión de la RNA polimerasa.

INDUCCIÓN• Cuando hay inductor como el

IPTG, se forma el complejo IPTG-represor y entonces la RNA polimerasa transcribe al transgene.

Entonces, como se lleva a cabo la inducción de la proteína recombinante?

Como funciona la lactosa o Como funciona la lactosa o el IPTGel IPTG

A) células que expresan el promotor de lactosa completo producen la -galactosidasa

B) vector recombinante en donde se usa parte del promotor de lactosa para producir proteína recombinante.

1. Medio saturado2. Inocular una alícuota en

medio fresco.3. Alcanzar la absorbancia en

donde las células se encuentren en la fase log

4. Añadir el inductor5. Tomar alícuotas (curso

temporal de inducción de proteína recombinante

6. Separación y visualización en un gel de poliacrilamida-SDS

7. Determinación del tiempo óptimo de inducción

¿Qué esperamos?¿Qué esperamos?

Teñido con la solución de Coomasie0.12% azul de coomasie R25050% Metanol10% ácido acéticoDesteñido con:45% Metanol10% ácido acético

Tiempo de inducción 0 0.5 1.0 1.5 Std

Proteína recombinante