ANÁLISIS DE DATOS DE RECEPTIVIDAD Centro de Estudios...
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Centro de Estudios de Postgrado UNIVERSIDAD DE JAÉN Centro de Estudios de Postgrado Trabajo Fin de Máster ANÁLISIS DE DATOS DE RECEPTIVIDAD ENDOMETRIAL MEDIANTE BIOLOGÍA DE SISTEMAS Alumno/a: Vargas Liébanas, Eva Tutor/a: Prof. D. Francisco José Esteban Ruiz Dpto: Biología Experimental Jaén y Julio, 2015
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UNIVERSIDAD DE JAÉN Centro de Estudios de Postgrado
Trabajo Fin de Máster
ANÁLISIS DE DATOS DE RECEPTIVIDAD ENDOMETRIAL
MEDIANTE BIOLOGÍA DE SISTEMAS
Alumno/a: Vargas Liébanas, Eva
Tutor/a: Prof. D. Francisco José Esteban Ruiz
Dpto: Biología Experimental
Jaén y Julio, 2015
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UNIVERSIDAD DE JAÉN Centro de Estudios de Postgrado
Trabajo Fin de Máster
ANÁLISIS DE DATOS DE RECEPTIVIDAD ENDOMETRIAL
MEDIANTE BIOLOGÍA DE SISTEMAS
Alumno/a: Vargas Liébanas, Eva
Tutor/a: Prof. D. Francisco José Esteban Ruiz
Dpto: Biología Experimental
Jaén y Julio, 2015
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ÍNDICE DE CONTENIDOS
ABSTRACT – KEYWORDS ..................................................................................................................... 5
RESUMEN – PALABRAS CLAVE ........................................................................................................... 5
1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................................ 7
1.1. Infertilidad y Biología de la Reproducción ............................................................................. 7
1.2. El endometrio y su complejidad. Receptividad endometrial ................................................ 7
1.2.1. Endometriosis .................................................................................................................. 9
1.3. Tecnologías –ómicas y su impacto en la ciencia .................................................................. 10
1.3.1. Genómica ....................................................................................................................... 11
1.3.2. Transcriptómica ............................................................................................................. 11
1.3.3. Proteómica .................................................................................................................... 12
1.3.4. Metabolómica ............................................................................................................... 13
1.3.5. microRNAs ..................................................................................................................... 14
1.3.6. Biología de Sistemas ...................................................................................................... 15
2. OBJETIVOS ................................................................................................................................... 17
3. MATERIAL Y MÉTODOS ............................................................................................................. 19
3.1. Obtención de datos .............................................................................................................. 19
3.1.1. Genómica – transcriptómica ......................................................................................... 19
3.1.2. Proteómica .................................................................................................................... 19
3.1.3. Metabolómica ............................................................................................................... 20
3.1.4. Perfil de microRNA ......................................................................................................... 20
3.2. Construcción y análisis de redes .......................................................................................... 20
3.3. Análisis funcional .................................................................................................................. 22
3.4. Búsqueda de genes diana para microRNAs ......................................................................... 22
3.5. Construcción de diagramas de Venn .................................................................................... 22
4
4. RESULTADOS ............................................................................................................................... 23
4.1. Patrón de expresión génica .................................................................................................. 24
4.1.1. Endometrio receptivo .................................................................................................... 24
4.1.2. Endometriosis ................................................................................................................ 27
4.1.3. Análisis funcional de la expresión génica diferencial .................................................... 28
4.2. Perfil proteómico .................................................................................................................. 31
4.2.1. Endometrio normal ....................................................................................................... 31
4.2.2. Endometriosis ................................................................................................................ 32
4.2.3. Análisis funcional de la expresión proteica diferencial .................................................. 34
4.3. Intersección entre transcriptoma y proteoma .................................................................... 34
4.4. Metabolómica ....................................................................................................................... 35
4.5. Perfil de miRNAs ................................................................................................................... 36
5. DISCUSIÓN ................................................................................................................................... 39
6. CONCLUSIONES ........................................................................................................................... 47
7. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................................. 49
ANEXO I. ASIGNATURAS DE MÁSTER CURSADAS ......................................................................... 57
ANEXO II. CURRICULUM VITAE ........................................................................................................ 61
ANEXO III. CD – MATERIAL SUPLEMENTARIO ............................................................................... 63
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ABSTRACT
Infertility is one of the main clinical factors affecting current demographic situation.
Endometrial receptivity alterations are related to certain diseases such as endometriosis and,
consequently, to infertility. Following a Systems Biology approach, and with the aim to
identify the molecular profiles underlying these conditions, we describe the transcriptomic,
proteomic and metabolomic signatures of the endometrium in a normal situation and in
endometriosis. The obtained results showed that the characteristic genes and proteins of the
normal endometrium were associated with biological processes such as proliferation and
cellular cycle, while those detected in endometriosis were mainly related to inflammatory and
proliferative processes. In addition, the metabolomic analysis highlighted that the only
common compound to both situations is naphareline, a synthetic drug. On the other hand,
the detected microRNA profiles point to the fact that these interesting molecules are mainly
involved in the regulation of cell cycle genes. In conclusion, we consider that Systems
Biology is a powerful tool to unravel the endometrial molecular complexity in health and
disease.
Keywords: Infertility – Endometrium – Endometriosis – Systems Biology
RESUMEN
La infertilidad constituye uno de los principales factores médicos que afectan a la situación
demográfica actual. Una de las causas que contribuyen a la infertilidad es la receptividad del
endometrio, que se ve afectada en ciertas patologías como la endometriosis. Tratamos de
establecer, siguiendo una estrategia de Biología de Sistemas, un patrón característico a
nivel de transcriptómica, proteómica y metabolómica del endometrio receptivo y lo
comparamos con el propio de la endometriosis con el objetivo de identificar las diferencias
existentes entre ambas situaciones. Los resultados obtenidos muestran cómo los genes y
proteínas propios del endometrio normal receptivo se encuentran relacionados con procesos
proliferativos y del ciclo celular, mientras que en la endometriosis cobran relevancia
procesos inflamatorios y proliferativos. Además, el estudio del metaboloma en ambas
situaciones puso de manifiesto que el único metabolito común a ambas es el fármaco
sintético nafarelina. Por otro lado, los perfiles de expresión de microRNAs indicaron su
participación principal en la regulación de genes del ciclo celular. Como principal conclusión,
podemos decir que la Biología de Sistemas se presenta como una herramienta muy útil para
el análisis de la complejidad molecular del endometrio en situaciones normales y
patológicas.
Palabras clave: Infertilidad – Endometrio – Endometriosis – Biología de Sistemas
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1. INTRODUCCIÓN
1.1. Infertilidad y Biología de la Reproducción
La infertilidad, entendida como la incapacidad de conseguir un embarazo tras un periodo de
un año manteniendo relaciones sexuales sin protección (Lindsay et al., 2015), constituye
uno de los principales factores médicos que influyen negativamente sobre la situación
demográfica actual. Clínicamente se trata de una patología altamente heterogénea con una
etiología que incluye tanto factores genéticos como ambientales (Zorrilla y Yatsenko, 2013) y
que puede deberse tanto a alteraciones masculinas como femeninas. Tratando de dar
respuesta a los problemas derivados de la infertilidad, la Biología de la Reproducción es una
de las disciplinas de la Biología y de la Biomedicina que más evolución ha experimentado en
los últimos años.
Alrededor del 50% de las alteraciones propias de la infertilidad están relacionadas con el
factor femenino y con enfermedades asociadas al tracto reproductivo femenino (Gupta et al.,
2014). Se estima que la infertilidad afecta a entre 50 y 80 millones de mujeres en todo el
mundo (Briceag et al., 2015). Puede deberse a diferentes causas, entre las que destacan
fundamentalmente: 1) patologías relacionadas con las trompas de Falopio, que afectan a
alrededor del 30% de las mujeres infértiles (Briceag et al., 2015); 2) patologías relacionadas
con el endometrio como la endometriosis, que afectan aproximadamente al 10% de mujeres
en edad reproductiva (Baranov et al., 2015) y que suele diagnosticarse en entre un 25 y un
40% de las mujeres infértiles (Xu et al., 2015); y 3) alteraciones a nivel ovárico, como el
síndrome del ovario poliquístico, un desorden reproductivo y endocrinológico presente en
entre el 6 y 10% de la población femenina (Barthelmess y Naz, 2014).
La infertilidad asociada a algunas de estas patologías se ha visto solventada gracias a la
aparición de las técnicas de reproducción asistida, si bien la tasa de éxito de las mismas
necesita ciertas mejoras que podrían lograrse por ejemplo con una correcta identificación del
endometrio receptivo para la implantación así como con la modulación del endometrio hacia
la fase receptiva (Von Grothusen et al., 2014).
1.2. El endometrio y su complejidad. Receptividad endometrial
El endometrio es uno de los tejidos más fascinantes del cuerpo humano (Revel, 2012). Se
encuentra rodeando el interior de la cavidad uterina (Ruíz-Alonso et al., 2012) y en su seno
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se produce la anidación del blastocisto (Pawar et al., 2014). Se trata de un tejido altamente
dinámico que sufre procesos de crecimiento, diferenciación, descamación y regeneración
cíclicos y controlados principalmente por las hormonas esteroideas ováricas estrógeno y
progesterona, así como por otras hormonas, además de citoquinas y quimiocinas (Altmäe et
al., 2014). El objetivo principal de estos importantes cambios, altamente dramáticos, es
preparar al endometrio para la llegada del blastocisto implantatorio (Bellver et al., 2012), al
que le proporcionará un ambiente adecuado para la implantación y el posterior desarrollo
(Altmäe et al., 2014).
La implantación es un proceso esencial durante el establecimiento del embarazo en
mamíferos (Pawar et al., 2014); que se produzca con éxito o no depende de tres factores: la
calidad del embrión, el estado de receptividad del endometrio y un diálogo sincronizado
entre el tejido materno y el blastocito. El fallo de implantación es una de las principales
razones de la infertilidad en mujeres, y la incapacidad de lograr la receptividad endometrial
es responsable de muchos de los fallos de las tecnologías de reproducción asistida
(Salamonsen et al., 2009).
Profundizar en los mecanismos que controlan los cambios del endometrio es necesario para
entender los factores que afectan los procesos biológicos implicados en reproducción y
muchos desórdenes ginecológicos (Bellver et al., 2012). Es decir, el conocimiento de estos
complejos mecanismos resulta crucial para entender no solo la implantación sino también
desórdenes ginecológicos como la endometriosis, los fibromas uterinos o el cáncer
endometrial, que pueden tener su impacto en la función del endometrio, llevando a la
infertilidad o a la pérdida del embarazo (Altmäe et al., 2014).
El término receptividad endometrial hace referencia a la capacidad del revestimiento uterino
de aceptar y acomodar un embrión incipiente, lo cual tiene como resultado un embarazo
exitoso (Lessey, 2011). Sin embargo, el endometrio humano es receptivo para la
implantación de un blastocisto solo durante 4-5 días en cada ciclo menstrual (Salamonsen et
al., 2009; Blesa et al., 2014), de forma que la receptividad queda restringida a un periodo
comprendido normalmente entre los días 19 y 21 del ciclo (Bellver et al., 2012), la llamada
“ventana de implantación” (Giudice, 1999). Se trata de un periodo hormonal limitado durante
el cual el tejido endometrial adquiere un estado funcional y transitorio dependiente de los
esteroides ováricos y que permite la implantación del blastocisto y la posterior iniciación del
embarazo (Miravet-Valenciano et al., 2015). La receptividad endometrial es un modelo útil
para estudiar las causas de la infertilidad sin explicación así como en las pérdidas de
embarazo (Lessey, 2011), ya que se ha comprobado cómo alteraciones en las interacciones
moleculares o celulares durante este periodo tienen un impacto negativo sobre el hecho de
conseguir un embarazo exitoso (Valdez-Morales et al., 2015). Es conocido el hecho de que
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existe un desplazamiento temporal de la ventana de implantación en una de cada cuatro
pacientes con fallos de implantación embrionaria, con los consecuentes efectos sobre el
éxito reproductivo (Gómez et al., 2015). Por ello, una correcta identificación de la ventana de
implantación en una paciente dada usando biomarcadores de receptividad endometrial
puede ayudar a prevenir fallos en la reproducción resultado de este desplazamiento de la
ventana de implantación (Garrido-Gómez et al., 2013).
Noyes y sus colaboradores dieron el primer paso en la definición de la ventana de
implantación al establecer una serie de criterios morfológicos para evaluar el desarrollo
endometrial y su receptividad (Noyes et al., 1995). A pesar de que los criterios de Noyes
constituyen el método de elección para el diagnóstico clínico de alteraciones endometriales,
la eficacia de este sistema ha sido ampliamente cuestionada ya que únicamente se tienen
en cuenta criterios histológicos. Concretamente, y a pesar de la información que se ha
podido obtener gracias a la aplicación de estos criterios, existen estudios recientes que han
invalidado el uso de la datación histológica en la evaluación rutinaria de la infertilidad (Blesa
et al., 2014). De hecho y por mostrar algún ejemplo, se sabe que existen diferencias en la
expresión génica y la traducción que sugieren que el endometrio de las mujeres con
endometriosis podría parecer histológicamente normal pero, de hecho, ser bioquímicamente
anormal durante la ventana de implantación (Wei et al., 2009). Así pues, es necesario
desarrollar nuevas tecnologías para la identificación objetiva de muestras endometriales
(Bellver et al., 2012). Todo ello iría encaminado a la mejora de la implantación embrionaria a
través de una visión sobre el útero, con el objetivo de aumentar las tasas de embarazo en
las técnicas de reproducción asistida (Revel, 2012).
1.2.1. Endometriosis
La endometriosis es un desorden común que afecta a aproximadamente el 10% de las
mujeres en edad reproductiva (Baranov et al., 2015). Consiste en el desplazamiento de
tejido endometrial hacia localizaciones extrauterinas y tiene como consecuencia la aparición
de dismenorrea, dolor pélvico crónico e infertilidad, de modo que la tasa de subfertilidad en
mujeres con endometriosis es de entre 2 y 3 veces la de la población general (Browne et al.,
2012; Upadhyay et al., 2013; Burney, 2014). Además, la endometriosis puede alterar la
ovulación, causar cicatrices que bloquean las trompas de Falopio y, por lo tanto, evitar la
fertilización, o crear un medio ambiente pélvico inflamatorio que puede dañar la
supervivencia del oocito (Wei et al., 2009).
10
El diagnóstico de la enfermedad en la actualidad se basa en la visualización directa de las
lesiones por laparoscopia, una técnica invasiva y cara (Wang et al., 2014). Este hecho,
unido a la inexistencia de un marcador definitivo específico de la enfermedad, complica el
diagnóstico (Cho et al., 2012) que, en la mayoría de los casos tiene lugar cuando la
enfermedad ya se encuentra en fases avanzadas (Fassbender et al., 2012), lo cual tiene
consecuencias negativas significativas en el pronóstico de la misma (Burney, 2014).
1.3. Tecnologías –ómicas y su impacto en la ciencia
El problema de la infertilidad se ha visto solventado para un elevado número de casos
gracias a la aparición y mejora, en los últimos años, de las técnicas de reproducción asistida
(Von Grothusen et al., 2014). Sin embargo, aún están lejos de ser 100% efectivas, entre
otros motivos por el conocimiento aún parcial de la fisiología de las células germinales, el
embrión y el endometrio, los tres principales componentes que condicionan los resultados
reproductivos. Los análisis actuales se basan principalmente en el estudio de las
características morfológicas de estos elementos, pero aún se necesitan nuevas
herramientas diagnósticas y terapéuticas que ayuden a mejorar los resultados (Egea et al.,
2014). Además, hay que tener en cuenta el componente multifactorial de la infertilidad.
Hace unos años era complicado estudiar las enfermedades multifactoriales, pero gracias a
la emergencia de las tecnologías –ómicas (genómica, epigenómica, transcriptómica,
proteómica y metabolómica) se ha permitido la mejora del conocimiento en este campo,
obteniéndose una visión más amplia de los sistemas biológicos complejos (Silvestri et al.,
2011). Una de las principales ventajas que presentan estas tecnologías es la gran cantidad
de información que proporcionan, y que además se puede obtener con relativamente poco
coste y esfuerzo (Egea et al., 2014). Sin embargo, dicha ventaja en ocasiones constituye un
impedimento, puesto que se necesitan herramientas potentes que permitan extraer
conclusiones con significación biológica a partir de la gran cantidad de información
generada.
Las tecnologías –ómicas son disciplinas que incluyen el estudio de eventos e interacciones
desde las estructuras y los procesos celulares del genoma a la función biológica de una
forma compleja y global. Gracias a su uso se pueden analizar en un solo experimento
multitud de compuestos biológicos, marcadores epigenéticos, genes, ARNm, proteínas y
metabolitos (Egea et al., 2014). A continuación haremos un breve comentario acerca de
algunas de estas tecnologías y los principales avances que han tenido lugar en el campo de
la Biología reproductiva gracias a su aplicación.
11
1.3.1. Genómica
La genómica estudia el conjunto total de genes y su expresión en las diferentes poblaciones
celulares o tejidos (Egea et al., 2014). En definitiva, la genómica comprende el estudio de
los genomas y de la colección completa de genes que éstos contienen (Bellver et al., 2012).
Los recientes avances en la tecnología de genotipado, junto con la información de variantes
génicas comunes como los polimorfismos de nucleótidos simples (single nucleotide
polymorphisms o SNPs) han llevado al rápido desarrollo de estudios de asociación génica
(genome-wide association studies o GWAS), que constituyen la estrategia más utilizada
para la búsqueda de SNPs o loci asociados con patologías como la endometriosis (Altmäe
et al., 2014). La genómica constituye una de las –ómicas con más aplicaciones en el campo
de la reproducción, ya que el ADN puede analizarse prácticamente en cada peldaño de la
escalera reproductiva (Bellver et al., 2012).
1.3.2. Transcriptómica
El estudio y análisis de la expresión génica supuso una verdadera revolución en el campo
de la ciencia a finales del siglo XX y comienzos del XXI, debido fundamentalmente a la
aparición de investigaciones como el proyecto Genoma Humano (años 90) o el proyecto
NCODE hace una década (Ding et al., 2014). De hecho, la finalización del Proyecto Genoma
Humano supuso el rápido desarrollo de nuevos campos en Biología Molecular, dentro de la
cual la transcriptómica constituye un elemento esencial para el conocimiento del endometrio
y la receptividad endometrial (Gómez et al., 2015). Entendemos por transcriptómica el
estudio del transcriptoma o conjunto de ARNm generado en la célula en un momento
determinado bajo unas condiciones específicas (Bellver et al., 2012).
Como se ha comentado anteriormente, la evaluación histológica del endometrio basada en
la morfología se ha considerado una técnica estándar para el diagnóstico durante los últimos
años, pero su eficacia ha sido puesta en entredicho en muchos estudios. Todo ello se debe
a que el tejido endometrial es altamente dinámico y puede sufrir cambios morfológicos y
funcionales como consecuencia de las distintas fases del ciclo menstrual (Egea et al., 2014).
La tecnología de microarrays, que permite la monitorización simultánea de la expresión de
miles de genes, es la plataforma más usada para el análisis transcriptómico (Altmäe et al.,
2014). Su desarrollo, junto con la capacidad de monitorizar la expresión génica de miles de
genes al mismo tiempo, abrió nuevas posibilidades y ha permitido dirigir el estudio
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transcriptómico del endometrio hacia el análisis de los cambios que ocurren durante ciclos
de estimulación ovárica controlada, endometriosis, cáncer endometrial y otros muchos
aspectos, aunque sin duda los avances más relevantes son los que se centran en el estudio
del endometrio humano durante la ventana de implantación para definir el patrón de
expresión génica de la receptividad endometrial (Bellver et al., 2012). Gracias a la aplicación
de esta tecnología, durante la última década los análisis transcriptómicos del endometrio
han demostrado que se pueden usar firmas genómicas específicas para fenotipar distintas
fases del ciclo menstrual incluyendo la fase receptiva, independientemente de la apariencia
histológica del tejido endometrial (Díaz-Gimeno et al., 2014). En base a esto incluso se
desarrolló un array de receptividad endometrial (endometrial receptivity array o ERA), capaz
de identificar la signatura genómica de la receptividad (Díaz-Gimeno et al., 2011). Este array
es más preciso que la datación histológica y es un método completamente reproducible para
la diagnosis del estado de receptividad endometrial (Díaz-Gimeno et al., 2013); tiene el
objetivo de identificar y diagnosticar el estado de receptividad endometrial durante la
ventana de implantación, tratando de evitar fallos de implantación y mejorando por tanto los
resultados de las técnicas de reproducción asistida (Egea et al., 2014). Todo ello nos
permite introducir el concepto de transferencia embrionaria personalizada en el día óptimo
para que se produzca la implantación (Gómez et al., 2015).
1.3.3. Proteómica
Se entiende por proteómica al estudio de las proteínas para determinar cómo, dónde y
cuándo se expresan; dicho de otro modo, consiste en el estudio a gran escala de la
presencia proteica, prestando especial atención a sus niveles de organización y funciones
(Bellver et al., 2012). Este emergente campo de la Biología Molecular permite el análisis
masivo de las proteínas de un sistema, fundamentalmente a nivel de estructura y función.
En los últimos años, las técnicas proteómicas han experimentado un desarrollo creciente,
convirtiéndose en herramientas útiles para el descubrimiento de biomarcadores de
enfermedad gracias a su destacada sensibilidad y especificidad (Wang et al., 2014). Por
todo ello, la proteómica se considera un “punto caliente” y cada vez se está aplicando más
frecuentemente al estudio del endometrio humano (Altmäe et al., 2014).
En la actualidad, los investigadores están centrando sus trabajos en la identificación de
proteínas implicadas en estados específicos de enfermedad con el objetivo de desarrollar
nuevas herramientas diagnósticas (Bellver et al., 2012). Además, la aplicación de la
proteómica es muy útil en la búsqueda de biomarcadores y la generación de perfiles
13
proteicos que permitan predecir, diagnosticar y monitorizar alteraciones como la infertilidad,
incluidas estrategias moleculares encaminadas a la selección de los mejores gametos y
embriones y detección del endometrio más receptivo (Egea et al., 2014). Se conoce que el
endometrio tiene funciones importantes en la consecución del embarazo, pero aún queda
mucho por saber acerca de la identidad de las proteínas secretadas por él. El estudio del
endometrio usando un enfoque proteómico podría ayudar a clarificar los cambios en las
proteínas secretadas durante la fase receptiva y no receptiva, proporcionando una visión
más eficaz de su fisiología y permitiendo el desarrollo de nuevas herramientas terapéuticas
de diagnóstico (Bellver et al., 2012).
Muchos estudios se han centrado en la identificación del proteoma en distintas fases del
ciclo menstrual y, gracias a la aplicación de técnicas de proteómica como la electroforesis
bidimensional y la espectrometría de masas, se ha descubierto, por ejemplo, que el fallo de
implantación recurrente está asociado a un perfil proteico característico diferente al de las
mujeres fértiles (Brosens et al., 2010). En otros casos más recientes, incluso se han
conseguido identificar numerosas proteínas con expresión diferencial en pacientes con
endometriosis con respecto a controles sanos (Cho et al., 2012; Hwang et al., 2013; Hwang
et al., 2014; Wang et al., 2014) y que se cree podrían ser marcadores candidatos para el
diagnóstico de esta enfermedad. El principal problema para el diagnóstico de la
endometriosis, como se ha comentado previamente, es el carácter invasivo de las técnicas
aplicadas. En este sentido, la proteómica nos abre nuevos horizontes: se sabe que la orina
puede ser usada para diagnosticar la enfermedad vía espectrometría de masas, ya que
puede reflejar las proteínas más abundantes del plasma, en particular los péptidos de bajo
peso molecular (El-Kasti et al., 2011). De hecho, ya se ha podido analizar con éxito el
proteoma urinario de pacientes con endometriosis, obteniéndose prometedores resultados
que podrían aplicarse en la práctica clínica y reducir la invasividad actual (Cho et al., 2012;
Wang et al., 2014). Mientras la genómica permitía la evaluación de toda la información
potencial, la proteómica nos permite evaluar los programas que se están ejecutando
actualmente y la metabolómica mostrará principalmente los resultados de dichas
ejecuciones (Silvestri et al., 2011).
1.3.4. Metabolómica
La metabolómica estudia simultáneamente la concentración de los metabolitos y sus
fluctuaciones en un medio ambiente definido (Egea et al., 2014). Un metabolito es cualquier
molécula obtenida en una ruta metabólica. Con esta descripción podrían incluirse gran
14
cantidad de moléculas en este grupo. Los metabolitos se definen como el producto final de
procesos celulares reguladores. Se usan para estudiar la respuesta de sistemas biológicos a
ciertos cambios genéticos, nutricionales y medioambientales. El metaboloma se define como
el conjunto de pequeñas moléculas de metabolitos encontrados en una muestra biológica,
que son por sí mismos un buen indicador de actividad celular. En el campo de la
reproducción, la metabolómica ‒al igual que la proteómica‒ adquiere una especial
relevancia debido a que permite conocer qué procesos biológicos están ocurriendo en cada
paso del desarrollo embrionario a partir de una célula de forma no invasiva (Bellver et al.,
2012).
La metabolómica refleja eventos subyacentes a la expresión génica y se considera más
próxima al fenotipo que la genómica, transcriptómica o proteómica. La concentración de un
metabolito específico es el efecto acumulativo de la actividad de todas las enzimas
implicadas en la síntesis y catabolismo de un compuesto dado y por lo tanto tiene el
potencial para proporcionar información integrativa acerca de la función del tejido en el
contexto del organismo completo (Altmäe et al., 2014). Al ser una tecnología de origen
relativamente reciente, existe poca información al respecto. Unos de los pocos trabajos
existentes acerca del análisis metabolómico del endometrio se ha centrado en el análisis
lipidómico de la receptividad endometrial, entendiendo por lipidómica el estudio masivo de
especies de lípidos existentes en una célula o sistema biológico y rutas metabólicas y redes
relacionadas. Se trata de una estrategia no invasiva –pues utiliza fluido endometrial para los
análisis–, y hasta la fecha solo está disponible en modelos animales (Egea et al., 2014). A
pesar de las limitaciones de este tipo de estudios, se ha demostrado que muchos
compuestos de origen lipídico como los triglicéridos, prostaglandinas o tromboxanos, entre
otros, juegan un importante papel durante las primeras fases del embarazo, incluyendo la
formación y el desarrollo preimplantacional, la propia implantación y el crecimiento posterior
a ésta (Wang et al., 2005).
1.3.5. microRNAs
Los microRNAs (miRNAs) son unas pequeñas moléculas de ARN cortas (de
aproximadamente 22 nucleótidos) no codificantes, altamente conservadas y de
descubrimiento reciente, que regulan la expresión génica a nivel postranscripcional. Los
miRNAs suprimen la síntesis proteica a través de la inhibición de la traducción de proteínas
a partir de ARNm o a través de la promoción de la degradación de ARNm, silenciando por
tanto la expresión génica (Laudanski et al., 2013). Desde su descubrimiento se han
15
considerado importantes reguladores de la estabilidad de la expresión génica (Siristatidis et
al., 2015).
En el endometrio, los miRNAs están implicados en los cambios dinámicos asociados con el
ciclo menstrual, en la implantación y en desórdenes reproductivos. Ya que parecen tener un
papel importante en el curso de la reproducción, son unos candidatos excelentes en la
investigación con el potencial de permitir una mejor comprensión acerca de las actividades
moleculares subyacentes que impiden la implantación y posterior progresión del embrión
(Siristatidis et al., 2015). Además, distintos estudios han demostrado su implicación en el
desarrollo de patologías asociadas al endometrio. Así, se cree que podrían tener un papel
significativo en la patogénesis del cáncer endometrial (Sianou et al., 2015) y en la
endometriosis, pues su detección en plasma y otros fluidos corporales y su relativa
estabilidad hace posible que puedan ser utilizados como biomarcadores no invasivos para el
diagnóstico de esta patología (Marí-Alexandre et al., 2015).
Todas estas tecnologías –ómicas descritas pueden ponerse en práctica en el campo de la
reproducción asistida con el objetivo de definir las características moleculares óptimas no
solo del endometrio, sino también de las células implicadas en la reproducción, como los
espermatozoides, los oocitos y las células de la granulosa, así como de sus productos
metabólicos en el plasma seminal, fluido folicular y medio de cultivo (Egea et al., 2014).
1.3.6. Biología de Sistemas
La gran cantidad de datos generados a partir de estas tecnologías –ómicas de alta
resolución representa un gran reto para los investigadores biomédicos (Bellver et al., 2012),
ya que aunque incluyen multitud de ventajas desde el punto de vista experimental y de la
aplicación biomédica, se trata de un sistema de análisis que genera un gran volumen de
información que debe ser procesada y analizada cuidadosamente mediante potentes
aplicaciones bioinformáticas, lo cual dificulta la obtención e interpretación de los resultados
(Vargas, 2014).
La integración de las tecnologías –ómicas se denomina “Biología de sistemas”. Recopila
información de la genómica, epigenómica, transcriptómica, proteómica y metabolómica,
principalmente, y la analiza con modelos computacionales que infieren el comportamiento de
una célula, tejido u organismo (Altmäe et al., 2014). La Biología de Sistemas ha permitido
hacer frente a la complejidad de la investigación en reproducción (Bellver et al., 2012). El
análisis global del genoma y la caracterización morfofuncional de las proteínas y metabolitos
16
proporciona una gran cantidad de información con un alto potencial para desvelar la
interacción de las redes moleculares subyacentes a la función de cualquier organismo en
salud y enfermedad. Por lo tanto, la Biología de Sistemas proporciona un enfoque integrativo
para comprender la Biología, permitiendo el análisis funcional de la estructura y dinámica de
las células y se centra en las interacciones complejas, más que en las características de los
componentes aislados de los sistemas biológicos (Altmäe et al., 2014).
Desde un punto de vista patofisiológico, el análisis de –ómicas bajo una estrategia de
Biología de Sistemas podría ser usado en búsqueda de genes, identificación de
biomarcadores, fisiología endometrial normal, clasificación de la enfermedad de
endometriosis, recurrencia de la enfermedad, descubrimiento de fármacos y estrategias
terapéuticas y, en última instancia, medicina predictiva y preventiva (Altmäe et al., 2014). La
Biología de Sistemas es, por lo tanto, una herramienta clave para el análisis de situaciones
complejas como las que tienen lugar en la infertilidad.
Una forma elegante de representar resultados frecuente en Biología de Sistemas es la
construcción de redes. Además, es un modo muy útil de mostrar ciertos tipos de datos
biológicos, incluidas las interacciones proteína-proteína, las regulaciones de genes, las rutas
celulares y la transducción de señales, ya que podemos extraer información cuantitativa de
los elementos de la red (nodos) con el objetivo de inferir su importancia en el sistema que
representan (Chin et al., 2014).
Dos de las medidas clásicas de centralidad de redes que se usarán en este Trabajo Fin de
Máster son la centralidad de grado o degree y la intermediación o betweenness. La
centralidad de los nodos, ha sido una cuestión clave en el análisis de redes (Freeman, 1978)
y está atrayendo una atención creciente durante la última década (Chin et al., 2014). Se
define como el número de nodos a los cuales un nodo dado está conectado, y mide la
implicación del nodo en la red. Su simplicidad es una ventaja, ya que solo debe conocerse la
estructura local alrededor de un nodo para poder calcularlo. Sin embargo, existen
limitaciones, pues esta medida no tiene en consideración la estructura global de la red. Por
ejemplo, aunque un nodo pueda estar conectado a muchos otros, podría no estar en una
posición que le permita alcanzar rápidamente recursos como la información o el
conocimiento (Opsahl et al., 2010). Por otro lado, la intermediación o betweenness evalúa el
grado en el cual un nodo conecta por el camino más corto otros dos nodos, y es capaz de
canalizar el flujo en la red. Esta medida tiene en cuenta la estructura de la red global
(Freeman, 1978).
17
2. OBJETIVOS
El objetivo general de este Trabajo Fin de Máster es estudiar, mediante un enfoque de
Biología de Sistemas, las diferencias existentes, a nivel de transcriptómica, proteómica y
metabolómica, entre el endometrio sano receptivo y la endometriosis, con el fin de detectar
cómo la endometriosis –que afecta a la capacidad reproductiva femenina– puede modificar
los patrones moleculares característicos de la receptividad endometrial, y los procesos
biológicos que subyacen a esta patología.
18
19
3. MATERIAL Y MÉTODOS
3.1. Obtención de datos
La obtención de datos constituye una parte fundamental de este Trabajo Fin de Máster y
para llevarla a cabo se emplearon como fuentes las bases de datos que se detallan a
continuación.
3.1.1. Genómica – transcriptómica
Para obtener el perfil de expresión génica, se accedió a las bases de datos que a
continuación se indican; a partir de las mismas se extrajeron los símbolos de los genes
implicados en las situaciones de interés. Concretamente, para el estudio del perfil de
expresión génica del endometrio en condiciones normales, los genes de interés se
obtuvieron de la base de datos del Instituto Europeo de Bioinformática – que forma parte del
Laboratorio Europeo de Biología Molecular (EMBL – The European Molecular Biology
Laboratory) – denominada Expression Atlas (Petryszak et al., 2014;
https://www.ebi.ac.uk/gxa/home).
En el caso de la endometriosis, además de utilizar Expression Atlas se recopilaron datos
procedentes de la base de datos Phenopedia (Yu et al., 2010;
http://64.29.163.162:8080/HuGENavigator/startPagePhenoPedia.do), que realiza una
búsqueda exhaustiva multinivel a partir de diferentes bases de datos para tratar de aunar
toda la información relativa a una enfermedad concreta.
3.1.2. Proteómica
The Human Protein Atlas (Uhlén et al., 2015; http://www.proteinatlas.org/) es una potente
base de datos que recoge extensos perfiles del proteoma de diferentes tejidos y órganos.
Esta fue nuestra herramienta utilizada para la búsqueda del perfil proteico del endometrio en
condiciones normales. Adicionalmente, tratamos de detectar si existían resultados para el
perfil proteómico del endometrio en la endometriosis y esta base de datos nos devolvió
únicamente 2 proteínas relacionadas; como este número de resultados parecía insuficiente
para establecer una estrategia de análisis satisfactoria, se llevó a cabo una búsqueda
20
adicional de bibliografía relacionada en la base de datos de artículos científicos Pubmed,
perteneciente al Centro Nacional de Información Biotecnológica Americano (NCBI – National
Center for Biological Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed).
3.1.3. Metabolómica
La base de datos del proyecto Metaboloma Humano, HMDB (Human Metabolome Database,
Wishart et al., 2013; http://www.hmdb.ca/) contiene información acerca de qué metabolitos
concretos se encuentran en una determinada situación, ya sea fisiológica o patológica. En
este trabajo, la información acerca de los metabolitos que de forma habitual se encuentran
en una situación basal en el endometrio, así como aquellos que pueden detectarse en la
endometriosis, se obtuvo a partir de esta base de datos.
3.1.4. Perfil de microRNA
Para el estudio de los perfiles de microRNA se realizó una revisión bibliográfica completa de
los últimos trabajos publicados en receptividad endometrial y endometriosis en la base de
datos de artículos científicos del Centro Nacional de Información Biotecnológica Americano
(NCBI – National Center for Biological Information) Pubmed
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed). Se escogieron, por un lado, aquellos miRNA que
habían sido descritos como alterados en la situación patológica y por otro aquellos que
mostraban algún tipo de implicación directa en la correcta implantación embrionaria.
3.2. Construcción y análisis de redes
Para construir las redes de interacción molecular utilizamos el software STRING (Search
Tool for Retrieval of Interacting Genes/Proteins) versión 9.1 (Franceschini et al., 2013;
http://string-db.org/), que permite la obtención y representación de interacciones tanto para
genes como para proteínas en base a diferentes parámetros que se indican a continuación.
Para la obteción de las interacciones reprodujimos la metodología empleada por Wall y sus
colaboradores (2009), basándonos en una red de tipo “evidencia” con 5 métodos de
predicción (Franceschini et al., 2013): vecindad (neighborhoods), co-ocurrencia (co-
occurrence), co-expresión (co-expression), bases de datos (databases) y minería de texto
21
(text-mining). La red representa el tipo de asociación de forma esquemática por colores y se
basa en la construcción de la misma en base a una serie de elementos como son: 1)
búsqueda de sintenia a partir de las bases de datos Swiss Prot y Ensembl; 2) perfiles
filogenéticos derivados de la base de datos COG; 3) corregulación de genes medida
mediante microarrays importada desde ArrayProspector; 4) interacciones validadas a
pequeña escala, complejos proteicos y rutas destacadas en las bases de datos BIND,
KEGG y MIPS y 5) co-mención de los nombres de los genes a partir de abstracts de
Pubmed. El resto de parámetros por defecto se mantuvieron, y se aplicó un score de
confidencia mínimo de 0’4 (Wall et al., 2009).
Para la construcción de las redes se utilizó el software Cytoscape en su versión 3.2.1
(Shannon et al., 2003; http://www.cytoscape.org/), un software libre que integra redes de
interacción molecular con datos de expresión de alta resolución y otro tipo de datos
moleculares. Utilizando esta herramienta se analizaron dos medidas clásicas de centralidad
de redes (Boccaletti et al., 2006): la centralidad de grado (degree) (1) y la intermediación
(betweenness) (2).
La centralidad de grado o degree ki de un nodo i es el número de vértices incidentes con el
nodo y se define en términos de la matriz de adyacencia A como
𝑘𝑘𝑖𝑖 = ∑ 𝑎𝑎𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖∈𝑁𝑁 , (1)
La intermediación o betweenness bi de un nodo i se define como
𝑏𝑏𝑖𝑖 = ∑𝑛𝑛𝑗𝑗𝑗𝑗(𝑖𝑖)𝑛𝑛𝑗𝑗𝑗𝑗𝑖𝑖,𝑘𝑘 ∈𝑁𝑁,𝑖𝑖≠𝑘𝑘 , (2)
donde njk es el número de las rutas más cortas que conectan i y j, y njk(i) es el número de
las rutas más cortas que conectan i y j y pasan a través de i .
En nuestro caso, para los datos de expresión génica y proteómica, tanto del endometrio
sano receptivo como de la endometriosis, dentro de cada grupo se seleccionaron los nodos
con un degree superior a la media de todos los degrees más dos veces la desviación
estándar o con un betweenness igual a 1.
22
3.3. Análisis funcional
Con el objetivo de identificar los procesos biológicos en los que se encontraban implicados
los distintos genes y proteínas en cada una de las situaciones experimentales, se llevó a
cabo un análisis funcional siguiendo dos estrategias diferentes: 1) uso de la base de datos
DAVID (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery) versión 6.7 (Huang
et al., 2009) y 2) uso de una novedosa aplicación web para el análisis de conjuntos de datos
a nivel de multi –ómicas denominada RAMONA (Remotely Accessible Multilevel ONtology
Analysis; Sass et al., 2015).
Mediante DAVID se pueden analizar, entre otros, los procesos biológicos en los que se
encuentran implicados unos genes o proteínas concretos, mientras que RAMONA permite
comparar dos situaciones experimentales, especificando qué rutas biológicas cobran
relevancia cuando se valora una situación experimental frente a otra.
3.4. Búsqueda de genes diana para microRNAs
Es importante conocer los genes sobre los que actúan los microRNAs para así poder
comprender correctamente su función. Por ello, una vez elaborado el listado de microRNAs
propios del endometrio normal y de los implicados en la endometriosis, se procedió a la
selección de los genes regulados por éstos. Se empleó el software gratuito DIANA-TarBase
versión 7.0 (Vlachos et al., 2015; http://www.microrna.gr/tarbase), que realiza una búsqueda
acerca de la bibliografía publicada más actualizada referente a microRNAs y además
devuelve un listado completo acerca de los genes dianas validados para un microRNA
concreto. Gracias a esta útil herramienta, pudimos identificar genes diana para
prácticamente todos los microRNAs que habíamos clasificado como característicos de
ambas situaciones experimentales.
3.5. Construcción de diagramas de Venn
Con el objetivo de identificar las intersecciones entre los conjuntos de datos de diferentes
situaciones experimentales (por ejemplo, genes o proteínas que se expresen en ambas
situaciones), utilizamos el software de acceso libre Venny en su versión 2.0 (Oliveros et al.,
2015; http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/).
23
4. RESULTADOS
Tras la aplicación de la metodología previamente descrita se obtuvieron una serie de
resultados que a continuación se detallan.
Una vez analizadas las bases de datos, actualizadas hasta enero de 2015, los datos fueron
almacenados y clasificados para su posterior análisis. En la Tabla 1 se encuentran
recopilados, a modo de resumen, el conjunto de datos obtenidos para cada situación.
Bases de datos
consultadas Número de ítems
relacionados
Transcriptómica del endometrio
normal Expression Atlas 540 genes
Transcriptómica de la
endometriosis
Expression Atlas
Phenopedia 751 genes
Proteómica del endometrio normal Human Protein Atlas 203 proteínas
Proteómica de la endometriosis Human Protein Atlas
Pubmed 65 proteínas
Metabolómica
Human Metabolome
Database
25 metabolitos para el
endometrio normal
5 metabolitos para la
endometriosis
Perfil de micro-RNAs del
endometrio normal Pubmed
4 miRNA característicos
del endometrio receptivo
Perfil de micro-RNAs en
endometriosis Pubmed
111 miRNA implicados en
endometriosis
Tabla 1. Conjunto de datos de partida obtenidos a partir de distintas bases de datos. Los
listados originales completos pueden consultarse en el material suplementario (Tabla
suplementaria 1).
24
4.1. Patrón de expresión génica
4.1.1. Endometrio receptivo
Hemos detectado 540 genes asociados al perfil de expresión normal del endometrio
receptivo.
A partir de los datos de interacción obtenidos con STRING, se construyó con Cytoscape la
red de expresión para el endometrio sano receptivo. Esta red contenía 326 genes (Figura 1.
En el material suplementario – Figura suplementaria 1 – puede consultarse la imagen a
mayor resolución).
El análisis de la red de interacción refleja la existencia de genes con un alto grado de
centralidad (entendiendo por alto grado de centralidad aquellos genes que posean una
centralidad de grado o degree superior a la media de todos los degrees más dos veces la
desviación estándar de los mismos o bien aquellos con un valor de betweenness igual a 1).
En el primer grupo, los principales son el gen de la vinculina (VCL) (k = 13), la quinasa
ligada a integrinas (ILK) (k = 10), el receptor endotelial de tipo A (EDNRA) (k = 9), la
transgelina (TAGLN) (k = 9), la integrina alfa 11 (ITGA11) (k = 8), el gen de la alfa-actina del
músculo liso aórtico (ACTA2) (k = 8) o el receptor de estrógenos alfa (ESR1) (k = 8) (para
ver el listado completo, consultar Tabla Suplementaria 2).
En lo que respecta a genes con un betweenness igual a 1, obtuvimos 4 resultados: se trata
del gen de la cadherina 13 (CDH13), un gen miembro de la familia de oncogenes RAS
(RAP2C) y los genes RING1 y YAP1.
En cuanto a la relación funcional entre los genes que conforman la red, el análisis mediante
DAVID nos proporcionó las principales rutas biológicas en las que se encontraban
implicados. La Tabla 2 refleja los procesos biológicos de los principales genes implicados.
Como puede observarse, la mayor parte de estos genes se encuentran relacionados con el
desarrollo.
25
Figura 1. Red construida a partir de genes expresados en el endometrio normal. Para una
visualización de la imagen a mayor resolución, consultar Figura suplementaria 1.
26
Tabla 2. Principales procesos biológicos en los que se ven implicados los genes con expresión propia del endometrio receptivo. FDR: false
discovery rate.
Proceso biológico Genes implicados p-valor FDR
Proceso de especificación
del patrón
HOXA11, ZEB1, HOXD10, GLI1, HOXD11, EDNRA, ALDH1A2, PCGF2, HOXA6, LEFTY2, RAB23,
HOXA10, PKD2, AXIN2, SMAD5, EMX2, RING1, SMAD4, GAS1, SMAD1, HOXD9, HOXD4, ROR2,
PTCH1, PBX1, CHRD
2’11·10-5 3’5·10-7
Morfogénesis embrionaria
TWSG1, HOXA11, PTK7, SMAD4, PRRX1, SKI, GAS1, SMAD1, ZEB1, HOXD10, HOXD11, GLI1,
HOXD9, ALDH1A2, PCGF2, MSX1, OSR2, HOXA6, HOXD4, HOXA10, RAB23, ROR2, PBX1,
PTCH1, TGFB1I1, CHRD
4’22·10-6 7’02·10-8
Regionalización HOXA11, EMX2, RING1, SMAD4, GAS1, HOXD10, GLI1, HOXD11, HOXD9, ALDH1A2, PCGF2,
HOXA6, HOXD4, HOXA10, RAB23, ROR2, PTCH1, PBX1, AXIN2, CHRD
3’65·10-7 6’06·10-8
Morfogénesis embrionaria
de los miembros
HOXD9, ALDH1A2, MSX1, HOXA11, PRRX1, RAB23, HOXA10, PBX1, PTCH1, SKI, GAS1,
HOXD10, HOXD11
5’8·10-7 9’65·10-10
Morfogénesis embrionaria
del apéndice
HOXD9, ALDH1A2, MSX1, HOXA11, PRRX1, RAB23, HOXA10, PBX1, PTCH1, SKI, GAS1,
HOXD10, HOXD11
5’8·10-7 9’65·10-10
Desarrollo del sistema
esquelético
TWSG1, PDLIM7, HOXA11, SMAD5, PRRX1, ZEB1, GAS1, SMAD1, HOXD10, GLI1, HOXD11,
HOXD9, PCGF2, OSR2, MSX1, HOXA6, HOXD4, HOXA10, ROR2, PBX1, AXIN2, PHEX, CHRD
9’92·10-7 1’65·10-12
Formación del patrón
proximal/distal
HOXD9, ALDH1A2, HOXA11, HOXA10, PBX1, HOXD10, GLI1, HOXD11 1’22·10-9 2’03·10-12
Adhesión celular
LIMS1, PCDHA3, ITGA11, PTK7, PCDHB15, PCDHGA5, DCHS1, VCL, ISLR, WISP1, COL27A1, ILK,
COL6A3, COL6A2, PKD2, ZYX, THBS3, CDH24, PCDHB7, PCDHB8, PCDHB4, ACTN1, PCDH18,
EMILIN1, CDH13, LAMA4, FREM1, CPXM1, ROR2, CNTN4, TGFB1I1, ABL1, TRIP6, PARVA,
MUC16
1’89·10-9 3’14·10-12
27
4.1.2. Endometriosis
La Figura 2 muestra la red construida a partir de los genes con expresión característica en la
endometriosis. En este caso se observa claramente un mayor número de genes formando
parte de la red si comparamos con la red de endometrio sano receptivo, lo cual es indicativo
de la gran complejidad molecular de la patología.
Figura 2. Red de expresión de la endometriosis. Para una visualización de la figura a mayor
resolución, consultar Figura suplementaria 2.
Al analizar la red, de nuevo encontramos ciertos genes con un alto grado de centralidad;
algunos ejemplos son la interleucina 6 (IL6) (k = 141), el gen tumoral p53 (TP53) (k = 131),
la ciclina A2 (CCNA2) (k = 130), el gen BRCA1 (k = 130), la ciclina dependiente de quinasas
(CDK1) (k = 129), el gen AKT1 (k = 126), el factor de crecimiento endotelial vascular
28
(VEGFA) (k = 126), el gen de la ciclina B1 (CCNB1) (k = 122) o el de la topoisomerasa II
(TOP2A) (k = 115), entre otros.
En lo que respecta a genes con alto grado de centralidad por su valor de betweenness igual
a 1, destacan los genes CAPSL y RARRES1.
Estos genes constituyen elementos esenciales de la red de interacción genética propia de la
endometriosis (el listado completo de genes con alto grado de centralidad puede consultarse
en la Tabla suplementaria 2).
Al tratar de extraer información acerca de los procesos biológicos relacionados con los
genes que forman la red, obtuvimos los resultados que se reflejan en la Tabla 3.
Fundamentalmente se trata de genes relacionados con procesos propios del ciclo celular, lo
que nos indica que el ciclo celular es un proceso que se encuentra altamente activado en la
enfermedad de endometriosis, debido fundamentalmente a su carácter proliferativo.
4.1.3. Análisis funcional de la expresión génica diferencial
Se realizó un análisis mediante el software RAMONA con el objetivo de identificar las rutas y
los procesos biológicos en los que se ven implicados los genes propios del endometrio sano
y receptivo al compararlos con los genes con expresión propia de la endometriosis.
Asimismo, el análisis mediante esta técnica permite la obtención de un diagrama en el cual
se muestran los procesos biológicos con una importancia destacable.
Como procesos biológicos destacan la división nuclear, la respuesta de la célula a
sustancias inorgánicas, la elongación del ADN para su replicación o la señalización
mediante el interferón gamma (Tabla suplementaria 3). Estos procesos biológicos además
aparecen representados en forma de diagrama, lo que ayuda a una visualización más
directa de los resultados obtenidos (Figura 3).
En lo que respecta a las rutas, cobran especial relevancia el ciclo celular, la vía de
señalización del interferón gamma, la biosíntesis de hormonas esteroideas, la absorción
mineral y algunas rutas relacionadas con el desarrollo tumoral (Tabla suplementaria 4).
29
Tabla 3. Relación de los principales procesos biológicos en los que se ven implicados los genes con expresión propia de la endometriosis.
FDR: false discovery rate.
Proceso biológico Genes implicados p-valor FDR
Regulación de la
proliferación celular
XRCC4, HRAS, RARRES1, PTGS2, IL18, MMP7, FOXO1, TTK, IL15, IL10, TGFB1, CXCL10, CTNNB1, PGR, AGTR1, BDNF, S1PR1, CDKN2B, MYOCD, APOE, KIFAP3, IFNG, SERPINE1, IL1B, CCNA2, IL1A, EGFR, IRS2, CD40, JUN, VEGFA, WFDC1, RIPK2, ADAMTS1, FGFR2, CCL2, FGFR3, ERBB4, DRD2, NFKBIA, CHEK1, TIMP2, ARNT, LIF, VDR, KRAS, PEMT, NKX3-1, EGF, KLF5, COL18A1, MUC2, BMP2, GNRH1, TGFBR1, SPHK1, BRCA2, FOXP3, BRCA1, KDR, CDKN1A, CDKN1B, ATF3, ETS1, DLX5, PLAU, NAMPT, E2F7, TACR1, PPARG, GNRHR, PTEN, EDNRA, NOS3, FGF1, FGF2, LTA, CDC7, CDC6, TP53, ESR2, CDK4, GAL, MMP12, TNFSF13B, MDM2, MDM4, CXCL1, TNF, TBC1D8, FOXM1, PML, COMT, CDH5, STAT6, IGF1R, PTN, GPNMB, IL4, TXNIP, IL6, CTLA4, IGF1, IGF2, CDKN3, CLEC11A, SOD2, NRAS, IRF6, PTCH1, ID4, IGFBP3, TOB1
4’05·10-14 7’41·10-11
Ciclo celular PRC1, TTK, AURKA, PTTG1, AURKB, WTAP, TGFB1, CTNNB1, CDKN2B, OIP5, IFNG, MAP3K8, CDCA2, H2AFX, CCNA2, MAP2K6, ASPM, CDCA3, EGFR, LIG1, SGOL2, PIM1, MND1, TACC3, AHR, TACC2, UHRF1, MAD2L1, SPAG5, ZWINT, NEK2, ANLN, CHEK1, SPC25, NCAPG2, FBXO5, HELLS, MKI67, NUF2, BRCA2, CDC20, NDC80, TPD52L1, HGF, BRCA1, CDKN1A, CDKN1B, GAS2L3, KIF23, CDC14A, E2F7, E2F8, MLH1, GTSE1, FAM83D, AKT1, CCNE2, KIF2C, MCM7, FANCI, CDC7, CDC6, CDK1, KIF11, KIF15, TPX2, TP53, NUSAP1, PBK, MCM2, CDK4, MCM3, UBE2C, MCM6, FANCD2, BUB1B, MDM2, MDM4, FOXM1, PML, CEP55, CENPA, NCAPG, HJURP, KRT7, BUB1, TRIP13, TXNIP, MSH6, MSH2, DLGAP5, PSRC1, CENPF, BIRC5, CENPE, RACGAP1, CDC25C, CDKN3, CCNB1, CCNB2, IRF6, CKS2, ID4
1’00·10-7 1’84·10-4
Fases del ciclo
celular
KIF23, PRC1, MLH1, TTK, AURKA, AURKB, PTTG1, GTSE1, AKT1, FAM83D, KIF2C, CDKN2B, OIP5, CDCA2, H2AFX, CCNA2, ASPM, CDCA3, EGFR, CDC7, CDC6, CDK1, KIF11, SGOL2, KIF15, PIM1, TPX2, NUSAP1, MND1, PBK, CDK4, TACC3, UBE2C, TACC2, MAD2L1, SPAG5, FANCD2, ZWINT, BUB1B, MDM2, NEK2, ANLN, CHEK1, CEP55, SPC25, NCAPG, NCAPG2, KRT7, BUB1, FBXO5, HELLS, TRIP13, MSH6, MKI67, DLGAP5, NUF2, BRCA2, CENPF, CDC20, TPD52L1, BIRC5, NDC80, CENPE, HGF, CDKN3, CDC25C, CCNB1, CDKN1A, CCNB2, CDKN1B, CKS2, ID4
3’10·10-8 5’68·10-5
Regulación del
ciclo celular
PTGS2, TTK, PTEN, TGFB1, GTSE1, AKT1, CCNE2, CDC42, CDKN2B, IL1B, H2AFX, CCNA2, LTA, IL1A, CDC7, EGFR, CDK1, CDC6, CYP1A1, PIM1, TP53, NUSAP1, TACC3, UBE2C, CDK4, JUNB, MAD2L1, ZWINT, JUN, BUB1B, MDM2, TNF, NEK2, PML, ANLN, CHEK1, LIF, BUB1, FBXO5, EGF, ERCC2, BMP2, MSH2, DLGAP5, SPHK1, IGF1, CENPF, BRCA2, IGF2, BIRC5, CENPE, CDKN3, CDC25C, BRCA1, CCNB1, CDKN1A, CDKN1B, ETS1, CKS2, ID3
2’72·10-5 4’98·10-2
Fase M KIF23, PRC1, TTK, MLH1, AURKA, PTTG1, AURKB, FAM83D, KIF2C, OIP5, CDCA2, H2AFX, CCNA2, ASPM, CDCA3, CDC6, CDK1, KIF11, SGOL2, KIF15, TPX2, MND1, NUSAP1, PBK, TACC3, UBE2C, TACC2, MAD2L1, FANCD2, SPAG5, ZWINT, BUB1B, NEK2, ANLN, CHEK1, CEP55, SPC25, NCAPG, NCAPG2, BUB1, FBXO5, HELLS, TRIP13, MSH6, MKI67, DLGAP5, NUF2, CENPF, BRCA2, CDC20, BIRC5, NDC80, CENPE, HGF, CDC25C, CCNB1, CCNB2, CKS2
4’92·10-4 9’00·10-1
30
Figura 3. Diagrama elaborado con RAMONA en el cual aparecen reflejados los procesos biológicos más relevantes al comparar la expresión
génica del endometrio normal receptivo con la propia de la endometriosis. En verde aparecen reflejados los procesos biológicos destacados
(ruta de señalización mediada por el interferón gamma, respuesta celular a sustancias inorgánicas, elongación del ADN, proceso de biosíntesis
del óxido nítrico, proliferación de células precursoras neuronales, regeneración, formación del patrón proximal/distal y parto). La imagen puede
consultarse a mayor resolución en la Figura suplementaria 3.
31
4.2. Perfil proteómico
Al igual que para el perfil de expresión génica, se realizaron análisis de la relación existente
entre las distintas proteínas características de cada situación experimental. Los resultados
de dichos análisis se muestran a continuación.
4.2.1. Endometrio normal
La Figura 4 muestra la red generada a partir del perfil proteómico del endometrio normal.
Como proteínas altamente conectadas destacan la albúmina (k = 17), el receptor de
estrógenos alfa ESR1 (k = 10), PAX2 (k = 9), la proteína ALPP (k = 9) y la proteína
morfogenética del hueso BMP4 (k = 8). Como proteínas con un valor de betweenness igual
a 1, encontramos MAP2K6, SLC6A2 y DNALI1 (Tabla suplementaria 2). La imagen original
puede consultarse a mayor resolución en la Figura suplementaria 4.
Figura 4. Red construida a partir de proteínas expresadas en el endometrio normal.
32
Al realizar el análisis funcional de este conjunto de proteínas mediante DAVID, obtuvimos
los resultados que se muestran en la Tabla 4. Los procesos en los que se ven implicadas
están relacionados fundamentalmente con el desarrollo, aunque ninguno de ellos es
estadísticamente significativo.
Proceso biológico Proteínas implicadas p-valor FDR
Desarrollo óseo BMP4, TWSG1, CHRDL2, TNFSF11, BMP1, NF1, STC1, IHH, HOXD11
4’51·1011 0’0745
Embarazo MUC1, PPARD, FLT1, PRLHR, ADM, TRO, HSD11B2, IHH
1’57·1012 0’2583
Osificación BMP4, TWSG1, CHRDL2, TNFSF11, BMP1, NF1, STC1, IHH
2’06·1011 0’3404
Desarrollo renal BMP4, HNF1B, MYO1E, NF1, LEF1, PAX2, HOXD11
5’14·1011 0’8458
Tabla 4. Principales procesos biológicos en los que se ven implicadas las proteínas con
expresión propia en el endometrio normal. FDR: false discovery rate.
4.2.2. Endometriosis
La red del perfil proteómico de la endometriosis se muestra en la Figura 5. El análisis de la
red mediante Cytoscape nos mostró una única proteína con alto grado de conectividad: la
albúmina (k = 30). No se detectó ninguna proteína con valor de betweenness igual a 1
(Tabla suplementaria 2).
Tras el análisis de los procesos funcionales del conjunto de proteínas con expresión
característica de la endometriosis, se detectaron los procesos biológicos que aparecen
reflejados en la Tabla 5. Como puede observarse, la mayor parte de estos procesos se
relacionan con respuestas a procesos inflamatorios, un elemento característico de la
endometriosis.
33
Figura 5. Red construida a partir de proteínas expresadas en la endometriosis. La imagen
original puede consultarse con detalle a mayor resolución en la Figura suplementaria 5.
Proceso biológico Proteínas implicadas p-valor FDR
Respuesta
inflamatoria aguda
TF, A2M, C9, APCS, C3, CFB, CLU, CFH, SERPINA3, ITIH4, SERPINA1, CFI
3’10·101 4’84·104
Respuesta de
defensa
KNG1, TF, A2M, C9, APCS, C3, CFB, CLU, HP, APOA4, APOL1, SERPINA3, CFH, ITIH4, SERPINA1, CFI, APOM
6’24·103 9’72·106
Respuesta
inflamatoria
KNG1, TF, A2M, APCS, C9, C3, CFB, CLU, ITIH4, SERPINA3, CFH, SERPINA1, CFI
9’23·104 1’44·107
Respuesta a heridas KNG1, TF, A2M, APCS, C9, C3, CFB, CLU, FGB, CFH, SERPINC1, ITIH4, SERPINA3, SERPINA1, CFI
1’54·106 2’39·109
Respuesta a la fase
aguda
TF, A2M, APCS, SERPINA3, ITIH4, SERPINA1
1’06·108 1’66·1012
Tabla 5. Principales procesos biológicos en los que se ven implicadas las proteínas con
expresión característica de la enfermedad de endometriosis. FDR: false discovery rate.
34
4.2.3. Análisis funcional de la expresión proteica diferencial
Al aplicar un análisis mediante el software RAMONA con el objetivo de identificar los
procesos biológicos en los que se ven implicadas las proteínas propias del endometrio sano
y receptivo al compararlos con las proteínas con expresión propia de la endometriosis
obtuvimos de nuevo procesos relacionados con la respuesta inflamatoria, entre ellos la
regulación de la respuesta inmune humoral o la respuesta en fase aguda (Tabla
suplementaria 5 y Figura suplementaria 6).
4.3. Intersección entre transcriptoma y proteoma
Con el fin de conocer la existencia de genes o proteínas comunes a ambas situaciones
experimentales, llevamos a cabo la construcción de la intersección de ambas situaciones. El
resultado global de estas comparaciones se muestra en la Figura 6. En la Tabla 6 se
especifican cuáles son esos elementos comunes para cada una de las situaciones
analizadas.
Figura 6. Diagrama de Venn que muestra los elementos comunes a los distintos conjuntos
de datos analizados. EN: endometriosis; NE: endometrio normal.
35
Comparación establecida Elementos comunes Total
Transcriptoma NE vs transcriptoma EN HOXA11, TRAF3IP2, RUNX1T1, PGR, ESR1, SFRP4, SCGB2A1, CNN1, CYP1B1, TAGLN, EDNRA, KCNMA1, FBXO32, TMEM200A, RIMKLB, EMX2, RXFP1, BNC, FJX1, PTCH1, MFAP5, HOXA10
22
Proteoma NE vs proteoma EN ALB 1
Transcriptoma NE vs proteoma NE PTGER3, ESR1, PCDHB15, CALD1, HOXD11, TWSG1, ARMC9, KIAA1644, SKI, HAND2, SERTM1, CSNK1E
12
Transcriptoma EN vs proteoma EN VEGFA, C3, CP, RXFP1 4
Tabla 6. Elementos comunes entre las distintas comparaciones establecidas.
4.4. Metabolómica
El estudio del perfil metabolómico del endometrio normal y la enfermedad de endometriosis
demostró la asociación de los metabolitos que se detallan en la Tabla 7 (se ha mantenido la
nomenclatura original). Se encontraron 25 metabolitos asociados al endometrio receptivo y 5
relacionados con la endometriosis. Además, cabe destacar la presencia del metabolito
nafarelina, común a ambas situaciones experimentales.
Endometrio receptivo Endometriosis
Norendoxifen Endoxifen Danazol Tamoxifen Mifepristone
17-
hydroxymethylethist
erone
N-acetyl-b-D-
galactosamine
Endoxifen
sulfate
4-
hydroxytamoxi
fen sulfate
Tamoxifen-N-
glucuronide
Alpha-
hydroxytamoxifen Nafarelin
Estrone Allylestrenol
4-
hydroxytamoxi
fen-O-
glucuronide
N-Didesmethyl-
tamoxifen
Alpha-
hydroxytamoxifen
-O-glucuronide
Levonorgestrel
Tamoxifen N-
oxide
3,4-
Dihydroxytam
oxifen
4-
hydroxytamoxi
fen-N-
glucuronide
11a-
hydroxyprogeste
rone
Medroxyprogeste
rone Gestrinone
Alpha-
hydroxy-N-
desmethyl-
tamoxifen
Alpha-
hydroxy-N-
desmethyltam
oxifen
Norelgestromi
n Nafarelin
Endoxifen O-
glucuronide Norethindrone
Tabla 7. Metabolitos característicos del endometrio normal y la endometriosis.
36
4.5. Perfil de miRNAs
Tras la búsqueda bibliográfica, se detectaron 4 microRNAs característicos de la receptividad
endometrial (miR-30b, miR-30d, miR-494 y miR-923) (Altmäe et al., 2013). En cuanto a los
implicados en la endometriosis, se obtuvo un listado de 111 microRNAs (Tabla
suplementaria 1). Cabe destacar la presencia de un miRNA común al endometrio receptivo y
la endometriosis: se trata del microRNA miR-30b.
En relación con los genes diana (o targets) sobre los que actúan estas pequeñas moléculas
de ARN, los 4 microRNAs asociados a la receptividad endometrial actúan en total sobre 188
genes diana (eliminando las posibles dianas comunes a distintos miRNAs). Para los 111
microRNAs relacionados con la endometriosis encontramos un total de 6463 genes diana
sobre los cuales se ha descrito que estos miRNAs ejercen algún tipo de acción (los listados
completos aparecen en la Tabla suplementaria 6).
Todos los genes diana de los microRNAs propios del endometrio receptivo, salvo 18 de ellos
(IRF2, SENP2, TAF1C, HOXA11, ZNF609, TAB1, ADAP2, ADC, COPS7A, HAGH, RAB35,
SLC27A1, HDHD3, POLR3H, ZNF227, CARS2, FKTNl y MED28), son comunes a los genes
diana de los microRNAs relacionados con la endometriosis.
Con el fin de conocer cuántos de los genes que se encuentran regulados a nivel global por
los microRNAs característicos de cada situación se encuentran expresándose de forma
habitual en dichas situaciones, procedimos a comparar los perfiles transcriptómicos de cada
una de las situaciones con los perfiles de dianas de microRNAs. Los resultados obtenidos se
muestran en la Figura 7. Puede observarse cómo, en el caso del endometrio receptivo, solo
5 de los genes regulados por los microRNAs característicos se expresan de forma habitual.
Se trata de los genes SMAD1, ZBTB38, SOX4, FAM60A y HOXA11.
Por otro lado, 337 de los 6463 genes sobre los que actúan los microRNAs característicos de
la endometriosis se encuentran expresándose de forma diferencial durante la enfermedad
(Figura suplementaria 7). El análisis funcional de estos genes, que se muestra en la Tabla 8,
indica como procesos biológicos relacionados el ciclo celular y la proliferación.
37
Proceso biológico Genes implicados p-valor FDR
Ciclo celular KIF23, PRC1, CDC14A, E2F7, E2F8, MLH1, TTK, AURKA, AURKB, PTTG1, WTAP, TGFB1, CTNNB1, CCNE2, AKT1, KIF2C, MCM7, CDKN2B, OIP5, FANCI, MAP3K8, IFNG, CDCA2, H2AFX, CCNA2, MAP2K6, EGFR, CDC7, CDC6, KIF11, SGOL2, PIM1, TP53, MCM2, CDK4, TACC3, MCM3, UBE2C, AHR, MCM6, UHRF1, MAD2L1, SPAG5, BUB1B, MDM2, MDM4, FOXM1, ANLN, CHEK1, CEP55, HJURP, NCAPG, KRT7, BUB1, TXNIP, MSH6, MKI67, MSH2, NUF2, BRCA2, CENPF, CDC20, BIRC5, RACGAP1, CDC25C, BRCA1, CCNB1, CDKN1A, CCNB2, CDKN1B, ID4
2’09·10-9 3’71·10-6
Regulación de la
proliferación celular
NAMPT, HRAS, PTGS2, E2F7, PPARG, MMP7, FOXO1, TTK, GNRHR, PTEN, IL10, TGFB1, CTNNB1, EDNRA, PGR, BDNF, CDKN2B, MYOCD, KIFAP3, IFNG, SERPINE1, IL1B, FGF2, CCNA2, EGFR, CDC7, CDC6, IRS2, TP53, CD40, CDK4, MMP12, JUN, VEGFA, RIPK2, MDM2, MDM4, FGFR2, CXCL1, CCL2, FGFR3, FOXM1, NFKBIA, CHEK1, COMT, LIF, IGF1R, VDR, KRAS, KLF5, TXNIP, IL6, TGFBR1, BRCA2, IGF2, CLEC11A, BRCA1, KDR, SOD2, NRAS, CDKN1A, CDKN1B, ATF3, ETS1, DLX5, ID4, IGFBP3, PLAU, TOB1
1’39·10-8 2’47·10-4
Procesos del ciclo
celular
KIF23, PRC1, TTK, MLH1, AURKA, PTTG1, AURKB, TGFB1, CTNNB1, AKT1, KIF2C, CDKN2B, OIP5, IFNG, CDCA2, H2AFX, CCNA2, MAP2K6, EGFR, CDC7, CDC6, KIF11, SGOL2, PIM1, TP53, TACC3, UBE2C, CDK4, MAD2L1, SPAG5, BUB1B, MDM2, MDM4, CHEK1, ANLN, CEP55, NCAPG, KRT7, BUB1, MSH6, MKI67, MSH2, NUF2, CENPF, BRCA2, BIRC5, CDC20, RACGAP1, CDC25C, BRCA1, CCNB1, CDKN1A, CDKN1B, CCNB2, ID4
1’09·10-4 1’95·10-1
Fases del ciclo
celular
KIF23, PRC1, TTK, MLH1, CHEK1, ANLN, AURKA, PTTG1, CEP55, AURKB, AKT1, KIF2C, CDKN2B, NCAPG, OIP5, KRT7, BUB1, CDCA2, H2AFX, CCNA2, CDC7, EGFR, MSH6, CDC6, KIF11, MKI67, SGOL2, PIM1, NUF2, CENPF, BRCA2, CDC20, BIRC5, CDC25C, UBE2C, TACC3, CDK4, CCNB1, CDKN1A, MAD2L1, CDKN1B, CCNB2, SPAG5, BUB1B, MDM2, ID4
1’74·10-3 3’09
Regulación de la
muerte celular
programada
HRAS, PTGS2, MMP9, MLH1, FOXO1, FASLG, NFKB1, TLR4, PTEN, TGFB1, IL10, AKT1, BDNF, IFNG, PIK3CA, IL1B, FAS, FGF2, TOP2A, MAP2K6, EGFR, PPP2R1A, SOCS3, PIM1, ESR1, TP53, ECT2, TNFRSF10A, TNFRSF10B, JUN, VEGFA, RIPK2, TNFAIP3, IFIH1, CCL2, NFKBIA, CDH1, GCH1, IGF1R, VDR, AHRR, KRAS, BCL3, PLAGL2, ERCC2, TXNIP, MSH6, HERPUD1, IL6, MSH2, TGFBR1, BRCA2, BIRC5, IGF2, BIRC3, BRCA1, SOD2, NRAS, TNFSF10, CDKN1A, CDKN1B, ETS1, PDCD6, IGFBP3
9’58·10-4 1’71·10
Tabla 8. Principales procesos biológicos en que se encuentran implicados los genes con expresión característica de la endometriosis comunes
a los genes diana de los microRNAs en la endometriosis. FDR: false discovery rate.
38
Figura 7. Diagrama de Venn que muestra los elementos comunes entre los conjuntos de
datos referentes a los perfiles transcriptómicos y de microRNAs. EN: endometriosis; NE:
endometrio normal.
39
5. DISCUSIÓN
El análisis de datos obtenidos a partir de la aplicación de las llamadas tecnologías –ómicas
nos ofrece una visión más amplia de una situación fisiológica o patológica determinada. En
nuestro caso, tratamos de detectar las diferencias existentes a nivel de genómica,
transcriptómica, proteómica, metabolómica y microRNAs entre dos situaciones relacionadas
con el endometrio: la receptividad endometrial y la endometriosis.
Consideramos de vital importancia conocer el patrón característico de la receptividad
endometrial, ya que algunos autores han sugerido que las técnicas de reproducción asistida
podrían incrementar su tasa de éxito con una correcta identificación del endometrio
receptivo para la implantación así como con la modulación del endometrio hacia esta fase
receptiva (Von Grothusen et al., 2014), con el impacto que ello tendría en la sociedad.
Una de las situaciones en las que la receptividad endometrial se ve afectada es la
endometriosis, en la que los métodos empleados para su diagnóstico tienen un carácter
invasivo (Wang et al., 2014), además de la inexistencia de marcadores específicos, lo que
implica que, en muchos casos, el diagnóstico se haga en fases avanzadas (Fassbender et
al., 2012). Por ello, consideramos que la aplicación de las tecnologías –ómicas para la
búsqueda de marcadores y perfiles característicos de la enfermedad puede resultar de gran
ayuda en el campo de la Biología de la Reproducción.
Para reflejar las interacciones entre los distintos elementos analizados, nos hemos servido
de la construcción de redes complejas. Se han propuesto algunos métodos computacionales
para caracterizar la importancia de los nodos en las redes complejas (Wang et al., 2014). En
este trabajo, para la evaluación de los parámetros de las redes construidas con STRING, se
utilizó Cytoscape, un software libre que integra redes de interacción molecular con datos de
expresión de alta resolución y otro tipo de datos moleculares (Shannon et al., 2003). Gracias
a esta herramienta hemos analizado dos medidas clásicas de centralidad de redes (Zhao et
al., 2014): la centralidad de grado (degree centrality) y la intermediación (betweenness).
Hemos realizado un análisis tanto de los genes con expresión característica en el
endometrio receptivo como de los genes que habitualmente se encuentran expresándose
diferencialmente durante la endometriosis. En el primer caso, encontramos que los genes
están relacionados fundamentalmente con procesos biológicos propios del desarrollo;
además, estos genes implicados en el desarrollo mostraban un alto grado de conectividad
cuando se estudiaban las relaciones funcionales entre los mismos, indicando que juegan un
papel clave para la receptividad endometrial. Entre ellos se incluyen la quinasa ligada a
integrinas (ILK), la transgelina (TAGLN) el receptor endotelial de tipo A (EDNRA) o el
40
receptor de estrógenos alfa (ESR1). Estos genes constituyen nodos esenciales en las redes
y, por ello, estudios posteriores centrados en su relevancia en la receptividad endometrial
pueden aportar información de gran utilidad en el conocimiento de este complejo proceso.
Cabe destacar que 2 de los genes clasificados como altamente conectados en la red de
expresión (TAGLN y ACTA2) ya habían sido previamente descritos como genes clave
implicados en receptividad endometrial: pertenecen al grupo de 238 genes incluidos en el
array de receptividad endometrial, utilizado actualmente en la práctica clínica (Díaz-Gimeno
et al., 2011).
Nuestros resultados están de acuerdo con estudios previos en los que se analizaba la
ventana de implantación, un periodo único temporal y espacial en el cual el endometrio es
receptivo para la implantación embrionaria. En ellos se detectaron numerosos procesos
biológicos que ocurrían de forma simultánea o secuencialmente. Entre ellos se incluía la
regulación del ciclo celular (al igual que en nuestro caso), además de procesos de
angiogénesis, mecanismos de defensa puestos en marcha por agentes antibacterianos y
detoxificantes, transporte de iones y agua, acciones de factores de crecimiento, acción y
metabolismo de hormonas esteroideas, y producción de proteínas de matriz extracelular o
glicoproteínas de superficie y una variedad de factores de transcripción, por nombrar los
más significativos (Giudice, 2004). Todos estos procesos relacionados con el desarrollo
tienen la función de preparar al endometrio para un posible embarazo, posibilitando así el
aporte de nutrientes y señales necesarias.
En lo que respecta a los genes característicos de la endometriosis, hemos detectado la
presencia de genes altamente conectados en las redes, como por ejemplo la interleucina 6
(ILK6), la ciclina dependiente de quinasas (CDK1), el factor de crecimiento endotelial
vascular (VEGFA), el gen de la serina – treonina proteín quinasa 1 (AKT1), la ciclina B1
(CCNB1) o la topoisomerasa II (TOP2A).
En la literatura se ha descrito el papel de algunos de estos genes en el desarrollo y
progresión de la endometriosis. Incluso, en ciertos casos, se ha podido demostrar como la
presencia de polimorfismos de nucleótidos simples en algunos de estos genes se ha
asociado -en ciertas poblaciones- con el riesgo de padecer endometriosis: es el caso de los
genes TP53 (Camargo-Kosugi et al., 2014; Li et al., 2015) y BRCA1 (Govatati et al., 2015).
Ambos genes se relacionan con procesos tumorales, lo cual podría explicar el carácter
proliferativo de la enfermedad cuando alguno de ellos presenta variaciones (si bien sería
necesaria una validación posterior para corroborar estas suposiciones).
Asimismo, se tienen evidencias del papel de otros de estos genes en la patogénesis de la
enfermedad: es el caso de la ciclina B1 (CCNB1), que mediaría la proliferación de las
41
células endometriales hacia localizaciones ectópicas influenciado por la acción de hormonas
ováricas (Tang et al., 2009).
Otro de los genes altamente conectados en la red de expresión de endometriosis es el gen
AKT1. Recientemente se ha demostrado que su expresión se encuentra elevada en fases
tempranas de la endometriosis, mientras que se expresa de forma moderada en fases más
tardías (Fabi et al., 2014) y, de hecho, la activación de la ruta de las distintas isoformas de
AKT jugaría un papel crucial en el establecimiento de tejido endometrial en localizaciones
ectópicas (Kim et al., 2014). Además, la sobreexpresión de este gen está asociada con la
fertilidad reducida en pacientes normales (Fabi et al., 2014). En este sentido, estudios
posteriores centrados en este gen podrían ayudar a comprender los mecanismos que
conducen a la reducción de la fertilidad.
A nivel general, los genes que hemos detectado como característicos de la endometriosis
fundamentalmente están implicados en procesos relacionados con el ciclo celular, como la
proliferación o la propia regulación del ciclo y de algunas de sus fases. Aunque no se han
encontrado mutaciones en genes que demuestren ser causativas de la enfermedad, se han
propuesto diferentes hipótesis para la formación de la misma, entre las que destacan las
debidas a procesos inflamatorios, de angiogénesis, de apoptosis y de proliferación celular
(Baranov et al., 2015), lo cual guarda, al menos en parte, concordancia con nuestros
resultados.
Además de analizar datos transcriptómicos en ambas situaciones experimentales, hemos
procedido a la búsqueda y análisis de datos proteómicos, ya que en algunos casos se ha
demostrado que los estudios de expresión génica de los transcritos no han sido capaces de
predecir la abundancia y/o la función de las proteínas porque existen procesos biológicos y
celulares que pueden alterar la relación entre la abundancia de proteínas y los niveles de
expresión del ARNm (Bellver et al., 2012). No debemos dejar de lado este hecho y por ello
debemos considerar que la integración de análisis de proteómica y transcriptómica puede
proporcionar información valiosa acerca de las rutas subyacentes a los complejos y
altamente dinámicos sistemas biológicos (Domínguez et al., 2009).
En el análisis del conjunto de proteínas características del endometrio receptivo de nuevo se
detectaron procesos relacionados con el desarrollo, como el desarrollo renal o el óseo, y
también procesos relacionados con el embarazo. Todo ello vuelve a indicar que el
endometrio, cuando se muestra receptivo, expresa proteínas implicadas en el alojamiento de
un nuevo blastocisto y posterior desarrollo del mismo. Además, detectamos proteínas
altamente conectadas en la red proteica del endometrio receptivo, tales como la albúmina
(ALB), el receptor de estrógenos alfa (ESR1), la proteína PAX2, la alcalina fosfatasa
42
placentaria (ALPP) y la proteína morfogenética del hueso (BMP4). Hasta la fecha, no se ha
descrito el papel que juegan dichas proteínas en la receptividad endometrial. Por ello,
consideramos que análisis avanzados centrados en estas proteínas pueden aportar
información interesante acerca de los complejos mecanismos subyacentes al proceso de
receptividad.
En lo que respecta al análisis funcional de las proteínas características de la endometriosis,
encontramos procesos de tipo inflamatorio. Este resultado nos parece coherente, puesto
que es bien conocido el carácter inflamatorio de la enfermedad y de hecho los procesos
inflamatorios se perfilan como una de las causas clave para la aparición de la endometriosis
y la progresión de la misma hacia distintas fases de severidad (Baranov et al., 2015). En lo
que respecta a la centralidad de la red, únicamente se detectó como relevante la albúmina.
Creemos que este hecho es una consecuencia de la expresión de la interleucina 6 (IL6), ya
que la producción de la albúmina en el fluido peritoneal se encuentra regulada por este gen
(Boutten et al., 1992). Como se ha descrito anteriormente, este gen constituye un elemento
central en la red de expresión de la endometriosis.
Todos los elementos catalogados como centrales en las redes tanto de expresión génica
como proteica podrían considerarse potenciales dianas terapéuticas, cuya validación
requiere de estudios posteriores.
Otro de los resultados destacables es la existencia de genes y/o proteínas comunes a
ambas situaciones experimentales. Este hecho requiere de estudios posteriores en mayor
profundidad a través de los cuales pueda establecerse una relación biológica entre las dos
situaciones, tales como alteraciones en los mecanismos de traducción o de modificación
postraduccional, cuyo abordaje terapéutico podría ser también de sumo interés.
El análisis de metabolitos propios de cada una de las situaciones experimentales puso de
manifiesto la presencia de 25 compuestos metabólicos propios del endometrio receptivo y
tan solo 5 característicos de la endometriosis. Llama la atención la presencia de un
metabolito común a ambas situaciones experimentales: la nafarelina.
La nafarelina, cuya estructura se muestra en la Figura 8,
(http://www.hmdb.ca/metabolites/HMDB14804) es un agonista sintético de la hormona
liberadora de gonadotropinas (GnRH) (Mizutani et al., 1995) Suele emplearse en los ciclos
de reproducción asistida (fertilización in vitro o inyección espermática intracitoplasmática,
fundamentalmente) para preparar al endometrio para alojar a un nuevo blastocisto (Takeuchi
et al., 2001).
Además, este compuesto es utilizado para el alivio de los síntomas propios de la
endometriosis, ya que se ha podido comprobar cómo es capaz de calmar el dolor
43
característico asociado a la enfermedad (Brown et al., 2015). Se ha demostrado que este
compuesto tiene efectos sobre el metabolismo lipídico de las pacientes, haciendo que
aumenten los niveles de lipoproteínas de alta densidad (HDL), colesterol total o algunas
lipoproteínas, entre otros (Kurabayashi et al., 2000); a pesar de que induce ciertas
modificaciones en el metabolismo de las pacientes que lo toman, hasta la fecha no se ha
descrito ningún tipo de efecto adverso negativo como el descrito por ejemplo para otros
compuestos como el danazol, asociado al desarrollo de cáncer ovárico (Cottreau et al.,
2003). Ya que este compuesto se encuentra presente en ambas situaciones experimentales,
las investigaciones podrían dirigirse a estudiar cómo el tratamiento con nafarelina puede
ayudar a conducir al endometrio de las mujeres con endometriosis hacia un estado
receptivo, del mismo modo que se utiliza para la preparación del endometrio en mujeres
sometidas a técnicas de reproducción asistida.
Por otro lado, teníamos interés en conocer cómo los microRNAs se encontraban regulando
la acción de sus dianas características, ya que consideramos que estas moléculas juegan
un importante papel en la regulación de la expresión génica. Hubo pocas coincidencias entre
los genes diana de los miRNAs propios del endometrio receptivo y los genes que
Figura 8. Estructura molecular de la nafarelina (C66H83N17O13).
44
habitualmente se encuentran expresándose en esta situación. Además, cuando se trató de
construir la red de interacción entre estos genes, no parecía existir una fuerte relación. Sin
embargo, y en parte debido al elevado número de genes diana de los miRNAs relacionados
con la endometriosis, en este caso sí que se encontraron altas coincidencias (337 de los
6463 genes diana de los microRNAs ya se han descrito como implicados en endometriosis).
Además, al realizar el análisis funcional de estos genes coincidentes se vio cómo de nuevo
se encontraban implicados en la proliferación y el ciclo celular. En definitiva, gran parte de
los genes diana de los microRNAs coinciden con los genes con expresión propia de la
endometriosis, indicando un papel relevante, posiblemente crucial, de estas moléculas en la
regulación de la función endometrial.
Sin embargo y debido al alto volumen de datos utilizado para la endometriosis (lo cual se
debe a su vez a los criterios de búsqueda de datos empleados), consideramos que los
resultados obtenidos no están proporcionando una información del todo fiable y por ello
creemos apropiado y planteamos como un futuro estudio hacer un análisis de los miRNAs
algo más restringido, incluyendo en los análisis un menor número de miRNAs y dianas, pero
más específicos de la enfermedad. Todo ello iría encaminado al desarrollo de terapias que
pudieran actuar bloqueando o mimetizando las funciones de algunos de estos miRNAs
implicados en enfermedad, lo que constituye una nueva y potente estrategia terapéutica
para el tratamiento de la endometriosis (Marí-Alexandre et al., 2015).
Del mismo modo, nos gustaría destacar que todos los genes diana de los microRNAs
propios del endometrio receptivo, salvo 18 de ellos (IRF2, SENP2, TAF1C, HOXA11,
ZNF609, TAB1, ADAP2, ADC, COPS7A, HAGH, RAB35, SLC27A1, HDHD3, POLR3H,
ZNF227, CARS2, FKTNl y MED28), son comunes a los genes diana de los microRNAs
relacionados con la endometriosis, con lo cual estos 18 genes podrían constituir piezas
clave en la receptividad endometrial y su ausencia en las pacientes con endometriosis
podría explicar los fallos en la implantación.
En este trabajo se han analizado datos procedentes de varias tecnologías –ómicas, sin
embargo existen ciertos eventos moleculares que no pueden ser explicados mediante estas
estrategias y que necesitan análisis posteriores. Es el caso de la epigenómica: denominada
como la ciencia que estudia los cambios heredables en la expresión génica que ocurren sin
que haya cambios en la secuencia del gen (Egea et al., 2014), en los últimos años se
considera que juega un importante papel en el desarrollo de la endometriosis; tanto es así
que se cree que en parte la enfermedad podría desarrollarse por la expresión anormal de
ciertos genes que se debería a modificaciones epigenéticas como la metilación del ADN o la
heterocromatinización (Baranov et al., 2015).
45
Creemos además que la incorporación de datos procedentes de otras disciplinas como la
epigenómica, secretómica, lipidómica o glicómica pueden proporcionar información
importante que ayude a entender los procesos subyacentes a situaciones complejas, ya
sean fisiológicas (como la receptividad endometrial) o patológicas (como la endometriosis).
Otra de las disciplinas –ómicas sobre la cual la Biología de la Reproducción está
empezando a investigar es la secretómica, que describe las proteínas producidas por las
células en el medio adyacente (Egea et al., 2014). El secretoma estaría constituido por
aquellas proteínas y péptidos producidos y secretados por un grupo de células o por un
tejido en un tiempo determinado, en respuesta a ciertos estímulos o bajo ciertas condiciones
fisiológicas o patológicas (Bellver et al., 2012), con lo cual podría ser una herramienta de
gran utilidad para el estudio de los perfiles característicos de determinadas situaciones y que
además disminuye considerablemente el grado de invasividad.
Además, la aplicación de la información que se puede desprender de otras disciplinas como
la fisionómica o nutrigenómica puede ayudar en gran medida a modular los organismos
hacia direcciones concretas, con el objetivo de prevenir o ayudar a tratar ciertas situaciones
patológicas. Otra de las disciplinas estrella de estas nuevas tecnologías, la
farmacogenómica, colaboraría en la instauración de una medicina personalizada, acorde a
las necesidades individuales de cada paciente a partir de sus características genéticas.
El análisis de datos obtenidos a partir de la aplicación de estas disciplinas puede ayudar a
conocer en mayor profundidad el amplio abanico de procesos moleculares que tienen lugar
en estas complejas y dinámicas situaciones.
La integración de todos estos datos, denominada interactoma mediante Biología de
Sistemas, tiene una gran aplicabilidad y no solo ayuda al estudio de patologías que afectan
la receptividad endometrial, sino que también puede por ejemplo encontrar el mejor
espermatozoide y oocito que puedan resultar en fertilización y el mejor embrión que pueda
implantar y dar lugar a una vida, mejorando en definitiva el éxito de la reproducción asistida
(Egea et al., 2014). Por ello, este trabajo contribuye al hecho de que el estudio de las
relaciones a nivel global entre genes, proteínas, ligandos y metabolitos se perfila como una
potente estrategia para la comprensión de los procesos biológicos que tienen lugar en
organismos completos.
En definitiva, aunque las tecnologías “–ómicas” requieren aún mejoras de su
reproducibilidad y valor clínico predictivo basadas en cohortes de mayor tamaño y por tanto
aplicabilidad clínica (Altmäe et al., 2014), están abriendo más y más la puerta a la medicina
reproductiva y la tecnología. Todo indica que la información obtenida usando –ómicas está
cambiando el abordaje de los procedimientos de fertilización in vitro actuales. Gracias a
46
estas técnicas y su aplicación en el campo de la medicina reproductiva, se están
describiendo nuevos biomarcadores moleculares relacionados con problemas de infertilidad,
permitiendo el aumento de nuestro conocimiento con el objetivo de diseñar nuevos tests
diagnósticos o de selección con el objetivo de mejorar las tasas de éxito en las técnicas de
reproducción asistida (Egea et al., 2014).
47
6. CONCLUSIONES
1. El estudio del transcriptoma del endometrio receptivo indica que los genes
implicados en su funcionamiento normal forman parte de procesos relacionados con
el desarrollo, mientras que los genes que se expresan en la endometriosis están
relacionados con el ciclo celular y la proliferación.
2. El proteoma del endometrio receptivo participa en procesos de desarrollo y
embarazo. Sin embargo, las proteínas propias de la endometriosis están implicadas
en procesos relacionados con la inflamación y la respuesta a lesiones.
3. Todos los elementos catalogados como centrales en las redes, tanto de expresión
génica como proteica, podrían considerarse potenciales dianas terapéuticas, cuya
validación requiere de estudios posteriores.
4. La nafarelina, el metabolito detectado en ambas situaciones de estudio, constituye
un elemento de interés en el análisis de la regulación de la receptividad endometrial
y la endometriosis, dado su papel como agonista de las hormonas liberadoras de
gonadotropina y, por lo tanto, la posible implicación de estas hormonas en los
procesos biológicos normales y patológicos que tienen lugar en el endometrio.
5. El estudio de los microRNAs proporciona información importante acerca de los genes
diana sobre los cuales ejercen su acción. En el caso de la endometriosis, los genes
regulados por estas moléculas están asociados con procesos del ciclo celular.
6. La Biología de Sistemas constituye una herramienta esencial para la integración de
datos procedentes de las tecnologías –ómicas de alta resolución, y ayuda a
comprender la complejidad molecular del endometrio en situaciones normales y
patológicas.
48
49
7. BIBLIOGRAFÍA
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ANEXO I. ASIGNATURAS DE MÁSTER CURSADAS
MÓDULO 1: FUNDAMENTOS CONCEPTUALES
Seguridad en el laboratorio y experimentación animal
A través de esta asignatura se ha aprendido a identificar los distintos riesgos (físicos,
químicos y biológicos) a los que alguien puede verse expuesto en el laboratorio. Asimismo,
se nos permitió conocer la normativa de seguridad necesaria para trabajar en un laboratorio
y cómo actuar en caso de accidente. Se trata de una asignatura útil e imprescindible para
cualquier persona en contacto con los elementos propios de este tipo de instalaciones.
Genómica, bioinformática y biología de sistemas
En esta asignatura de carácter eminentemente práctico se profundizó en el aprendizaje del
manejo de bases de datos de distintos aspectos relacionados con la Biomedicina, como por
ejemplo el estudio de genomas, proteínas o mutaciones. Asimismo, se manejaron bases de
datos de Biología Molecular, utilizadas para la visualización de modelos proteicos
tridimensionales o para el diseño de sondas de oligonucleótidos, entre otros. Por otra parte,
se aprendió a identificar genes candidatos para distintas enfermedades y a analizar datos de
expresión génica obtenidos a partir de estudios con microarrays.
Proteómica y dinámica de proteínas
Esta asignatura del primer módulo nos introduce en aspectos básicos relacionados con el
proteoma humano y es necesaria para una buena comprensión de ciertos aspectos
relacionados con asignaturas de otros módulos. En ella se estudian procesos de
plegamiento, degradación, transporte y maduración de proteínas, así como las principales
técnicas y metodologías que se utilizan para los estudios proteómicos.
58
Regulación de la expresión génica y desarrollo
En esta asignatura se estudiaron conceptos relacionados con la regulación de la expresión
génica en distintos procesos, así como a lo largo del desarrollo: destacan el estudio de las
polimerasas y de los eventos relacionados con el silenciamiento génico. De forma
complementaria a estas nociones generales, se abordó el estudio de elementos esenciales
en la regulación de la expresión génica como los elementos genéticos móviles o el ADN
repetitivo. Merece ser mencionado asimismo el amplio abanico de técnicas propias de este
campo que se pudo conocer gracias a la asignatura.
MÓDULO 2: TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR, CELULAR Y GENÉTICA
Cultivos celulares, diferenciación y terapia celular
La asignatura de “Cultivos celulares” ayuda al conocimiento de las técnicas básicas
relacionadas con el cultivo celular más utilizadas en los ámbitos de la Biomedicina y
Biotecnología. Conocimos el instrumental que se utiliza normalmente para trabajar con
células. Además, manejamos cultivos celulares animales y llevamos a cabo varios ensayos
sobre ellos (ensayos de proliferación celular, ensayos de citotoxicidad…).
Ingeniería genética avanzada
La asignatura “Ingeniería genética avanzada” trata de profundizar en diversos aspectos
relacionados con la modificación genética de células y organismos, como las técnicas, sus
aplicaciones y las distintas implicaciones éticas que suponen su uso. Pudimos conocer las
principales herramientas utilizadas en la manipulación genética de células y organismos
(como enzimas, sondas, vectores…), y posteriormente pasamos a estudiar las formas de
manipulación de organismos y sus aplicaciones en la Biotecnología y Biomedicina.
59
MÓDULO 3: BIOMEDICINA
Neuroendocrinología
Esta asignatura permite conocer las bases funcionales del sistema nervioso y endocrino y la
interacción de ambos para regular la homeostasis corporal. Se estudiaron un amplio
conjunto de mecanismos de acción de las distintas hormonas que participan regulando la
fisiología del cuerpo humano, así como los efectos sobre la salud del exceso o carencia de
estas hormonas. Además, se analizaron los principales mecanismos que regulan la ingesta
de alimentos y su participación en la regulación del balance energético corporal.
Patología molecular y celular
La asignatura “Patología molecular y celular” nos acercó al conocimiento de las bases
moleculares de enfermedades (fundamentalmente cáncer y patología hipóxica) y a cómo se
puede aplicar este conocimiento al diagnóstico y tratamiento de las mismas. Asimismo, se
exploró ampliamente el estado actual de las técnicas de terapia génica y celular. En
definitiva, esta asignatura trata de ver cómo el conocimiento derivado del estudio de las
bases moleculares de las patologías puede ser aplicado al tratamiento de las mismas.
Biología molecular y celular del envejecimiento
Esta asignatura proporciona información avanzada acerca de los procesos y mecanismos
moleculares y celulares relacionados con el envejecimiento, particularmente conocimos las
enfermedades asociadas al envejecimiento cerebral y sus consecuencias. Por otra parte,
pudimos tener una visión cercana acerca de las terapias celulares y farmacológicas
empleadas en el tratamiento de estas enfermedades; estudiamos algunos de los
mecanismos relacionados con la apoptosis y, por último, pudimos conocer el papel que
juega el estrés oxidativo en el envejecimiento celular.
60
Citogenética molecular y clínica
Esta asignatura se centra en el estudio de los cromosomas, desde su organización hasta las
técnicas que se emplean para trabajar con ellos. En la parte clínica, se recibió información
acerca de las principales mutaciones cromosómicas (tanto de tipo numérico como
estructural) y sus consecuencias. Además, se recibieron clases prácticas relacionadas con
los conceptos del programa teórico, de gran utilidad para la comprensión del mismo.
Estrés celular
La asignatura “Estrés celular” ayuda a comprender las bases de los procesos relacionados
con el estrés oxidativo y sus consecuencias sobre los organismos. Además, se estudiaron
los principales mecanismos de defensa ante el estrés oxidativo con los que cuentan los
organismos, y cómo el conocimiento derivado del estudio de los mismos se ha utilizado con
distintas aplicaciones en la Biotecnología y Biomedicina.
Biotecnología diagnóstica
En esta asignatura se hace un recorrido por las técnicas utilizadas habitualmente en el
diagnóstico de diferentes enfermedades, desde la histología clásica hasta los últimos
avances en técnicas de secuenciación masiva. Todas estas técnicas se aplican
fundamentalmente con el objetivo de detectar mutaciones en genes de interés o en la
búsqueda de marcadores característicos de enfermedad; en definitiva, cada vez más se
trata de buscar metodologías capaces de dirigirnos hacia una medicina personalizada, y
esta asignatura nos permite conocer las principales aplicaciones de estas tecnologías de
última generación.
Es importante destacar, asimismo, el hecho de que en todas las asignaturas se recibió la
visita de profesorado e invitados externos especialistas en temas relacionados con la
materia vista en clase, lo cual nos acerca a aplicaciones reales de los contenidos de cada
uno de los cursos y contribuye a una formación mucho más completa.
61
ANEXO II. CURRICULUM VITAE
DATOS PERSONALES
APELLIDOS: Vargas Liébanas NOMBRE: Eva
SEXO: Mujer DNI: 77351933-N FECHA DE NACIMIENTO: 25-agosto-1992
DIRECCIÓN PARTICULAR: Puente de la Sierra, Comunidad El Valerín LOCALIDAD: Jaén CÓDIGO POSTAL: 23196
TELÉFONO MÓVIL: 617501862 CORREO ELECTRÓNICO: [email protected]
FORMACIÓN ACADÉMICA ESTUDIOS UNIVERSITARIOS: Grado en Biología por la Universidad de Jaén (2010 – 2014) “Mención Premio Extraordinario de Grado” ENSEÑANZAS DE POSTGRADO: Máster en Biotecnología y Biomedicina por la Universidad de Jaén (2014 – actualidad)
PARTICIPACIÓN EN EVENTOS DE DIFUSIÓN CIENTÍFICA
DENOMINACIÓN DEL EVENTO: Cuartas Jornadas sobre Investigación en Biotecnología y Biomedicina del Máster Universitario en Biotecnología y Biomedicina por la Universidad de Jaén LUGAR DE CELEBRACIÓN Y AÑO: Jaén, noviembre 2014 TIPO DE PARTICIPACIÓN: Oyente
62
BECAS/AYUDAS DISFRUTADAS
DENOMINACIÓN: Beca de colaboración en departamentos universitarios INSTITUCIÓN: Ministerio de Educación, Cultura y Deporte LUGAR DE REALIZACIÓN: Departamento de Biología Experimental – Universidad de Jaén FECHA: Noviembre 2013 – Julio 2014
IDIOMAS
IDIOMA: Español NIVEL: Nativo IDIOMA: Inglés NIVEL: Intermedio IDIOMA: Francés NIVEL: Avanzado (nivel B2 acreditado)
OTROS DATOS DE INTERÉS
Colaboración en Departamento de Biología Experimental durante curso académico 2012-
2013. Tareas: a) manejo de programas estadísticos especializados para el análisis de
muestras de microarray (R con paquetes de Bioconductor, TM4, DAVID, Babelomics e IPA)
y b) Introducción al análisis de componentes principales y análisis de clusters aplicado a
microarrays.
Manejo de herramientas ofimáticas (Office)
Manejo de software bioinformático y bases de datos
63
ANEXO III. CD – MATERIAL SUPLEMENTARIO
