Una mutación de ganancia de función en la adenilatociclasa Confiere resistencia al Isoflurano en C. elegans

Owais Saifee, MD, Ph.D.3, 4 [Graduate Student], Laura B. Metz, B.Sc.1 [Asistente de Investigación],Michael L. Nonet, Ph.D.3, 4 [Profesor], C. Michael Crowder, MD, Ph.D. [Dr.Seymour] y Rose T. Brown1, 2,4 [Profesor]

1 Departamento de Anestesiología de la Universidad de Washington Escuela de Medicina de St. Louis, Missouri2 Departamento de Biología del Desarrollo, Universidad de Washington Escuela de Medicina de St. Louis,Misuri3 Departamento de Anatomía y Neurobiología de la Escuela de Medicina de la Universidad de Washington, St. Louis,Misuri4 División de Biología y Ciencias Biomédicas de la Facultad de Medicina de la Universidad de Washington St.Louis, Missouri

ResumenContexto ­ Los anestésicos generales volátiles inhiben la liberación de neurotransmisores por un mecanismo que no se entiende completamente. La evidencia genética en C. elegans ha demostrado que un mecanismo principal de acción de los anestésicos volátiles que actúan a concentraciones clínicas en este organismo es la inhibición presináptica de neurotransmisión . Para definir los componentes adicionales de este mecanismo de acción , C. elegans mutantes aislados como supresores fenotípicas de una mutación en la sintaxina , un componente esencial de la maquinaria de la liberación de neurotransmisores , fueron hechos pruebas de anestesia de fenotipos de sensibilidad .Métodos ­ Se midió la sensibilidad a concentraciones de isoflurano en los ensayos de locomoción en C. elegans adultos . La sensibilidad al inhibidor de la acetilcolinesterasa aldicarb se utiliza como un ensayo para el nivel de la liberación de acetilcolina en C. elegans . Las comparaciones de la sensibilidad isoflurano (medidos por la EC50 ) fueron hechas por un de ajuste simultáneo de curvas y F ­test.Resultados ­ Entre los mutantes supresores sintaxina , js127 fue el más resistente al isoflurano con una EC50 de aproximadamente el triple. El mapeo genético , secuenciación, y la transformación fenocopia js127 mostró que era un alelo de Acy ­ 1 , que codifica una adenilato ciclasa expresado en todo el sistema nervioso C. elegans y en el músculo . js127 se comportó como unamutaciónn de ganancia en ACY ­ 1 y aumentó los niveles de monofosfato de adenosina cíclico . Pruebas de los mutantes simples y dobles junto con la expresión tisular selectiva de la mutación js127 revelado que acia ­ 1 actúa en las neuronas dentro de un G s ­ PKA ­ vía UNC­ 13 dependiente de regular el comportamiento y la sensibilidad isoflurano .

Conclusiones ­ La activación de la adenilato ciclasa neuronal antagoniza la inhibición de isoflurano locomoción en C. elegans .

IntroducciónLos anestésicos generales volátiles (AV) tienen un complejo conjunto de acciones sobre la neurotransmisión que se suman para producir anestesia general . Los AV promueven la transmisión sináptica inhibitoria por potenciación de tipo ácido γ ­ aminobutryico A y los receptores de glicina y disminuyendo las transmisión excitatoria por múltiples mecanismos potenciales . La liberación del transmisor se reduce en tanto sinapsis inhibitorias y excitatorias por el vaso , pero la potencia y la eficacia VA son mayores en sinapsis excitatoria . Por lo tanto , el efecto neto de los AV presinápticos debe ser una disminución en el centro excitabilidad del sistema nervioso. Las pruebas bioquímicas y electrofisiológicas han implicado la inhibición de los canales de sodio como un mecanismo molecular mediante el cual los AV inhiben la liberación de neurotransmisores . Sin embargo , el bloqueo de los canales de sodio no se tiene en cuenta para el inhibición completa de la liberación del transmisor , por lo menos en algunas sinapsis ; más bien, el transmisor de liberación que se encuentra de manera mecánica debajo del canal de sodio es un buen candidato como el objetivo de AV residual .

En el nematodo C. elegans , se encontró que una mutación inusual en el gen unc ­ 64 , el cualcodifica la sintaxina neuronal , bloquearon totalmente los efectos conductuales de las concentraciones clínicas de isoflurano ( por esto nos referimos a concentraciones que caen dentro de la gama utilizada para la anestesia humana , hasta 2 veces las concentraciones alveolares mínimas de isoflurano que se produce concentración acuosa 0,62 mM ; CE50 isoflurano contra la locomoción coordinada en C. elegans a 22 º C = 0,7­1 % en volumen ; 1 % en volumen de isoflurano a 22 º C = 0,58 mM ) . La sintaxina es una de las tres proteínas esenciales SNARE presinápticos que actúa en concierto con otras proteínas a mediar la fusión de las vesículas sinápticas con la membrana presináptica . La mutación inusual , designada unc ­64 ( MD130 ) , produce un syntaxina truncada que antagoniza predominantemente la sensibilidad de los AV a lo largo de la sensibilidad con que se expresa una reducción de los niveles de la sintaxina , lo que resulta en otro fenotipo consistentes con una disminución de la liberación del transmisor excitatorio . Es importante destacar que otros fenotipos de liberación del transmisor eran hipersensibles a los AV , por ejemplo , unc ­64 ( MD130 ) tiene un 20 a 30 veces más alta sensibilidad que la EC50 isoflurano de lo contrario fenotípicamente similares VA hipersensibles unc ­64 ( md1259 ) y unc ­64 ( JS21 ) mutantes. Por lo tanto , la sintaxina truncada no es indirectamente responsable por antagonizar la reducción de la liberación del transmisor , sino más bien , los datos son más consistentes con la interacción de la syntaxin con otra proteína esencial para la sensibilidad a los AV. .

Para identificar la proteína que interactúa con syntaxina correspondiente ( s ) esencial para la sensibilidad de VA , probamos C. elegans mutantes aislados en una pantalla para supresores de reducción de syntaxin. La lógica de la prueba de estos mutantes es que uno o más de las mutaciones supresoras podría estar en el supuesto objetivo VA sintaxina ­que interactúan y

pueden ser resistente al VA . En efecto , ya se ha informado de que algunos de estos supresores eran resistentes , sin embargo , el nivel de resistencia no era tan grande como la que en unc ­ 64 ( MD130 ) y fue muy probablemente debido a un efecto indirecto sobre la elevación de la liberación del transmisor . Aquí informamos sobre un mutante supresor de sintaxina adicional cuyo nivel de resistencia es similar a la de los MD130 y define , en parte, el mecanismo por el que se regula la sensibilidad VA en C. elegans .

Materiales y MétodosCepas de C. elegans y los transformantesCepas de C. elegans mutantes se obtuvieron del Centro de Genética Caenorhabditis, que esfinanciado por el Centro Nacional de Institutos de Salud Nacional para Recursos de Investigación (Bethesda, MD). Las cepas se cultivaron como se ha descrito anteriormente en medio de crecimiento de nematodos agar 9. N2 var Bristol era la cepa de tipo salvaje y el fondo genético para todos los mutantes.Las cepas mutantes utilizados para este trabajo son las siguientes: BIG: unc­13 (E376), unc­13 (E376); acia­1 (js127) III, unc­13 (S69); acia­1 (js127) III, unc­13 (S69), gsa­1 (ce81) LGIII: unc­64 (E246), acia­1 (js127), acia­1 (js127) / +, acia­1 (js127) unc­64 (E246), acia­1 (js127) / + unc ­64 ( E246 ) , acia ­ 1 ( nu329 ) , acia ­ 1 ( js127 ) ; SNB­ 1 ( md247 ) V , acia ­ 1 ( js127 ) ; unc ­ 10 ( md1117 ) X, CRH­ 1 ( n3315 ) , acia ­ 1 ( js127 ) CRH­ 1 ( n3315 ) , UNC­ 64 ( E246 ) ; jsEx558 [ acia ­ 1 ( P260S ) Prol ­ 6 :: GFP ] , unc ­64 ( E246 ) ; jsEx570 [ acia ­ 1 (+ ) Prol ­ 6 :: GFP ] , unc ­64 ( E246 ) ; jsEx571 [ acia ­ 1 (+ ) Prol ­ 6 :: GFP ] , unc ­64 ( E246 ) ; jsEx575 [ acia ­ 1 ( L2444S ) Prol ­ 6 :: GFP ] , unc ­64 ( E246 ) ; jsEx579 [ Psnb ­ 1 :: acia ­ 1 ( P260S ) Prol ­ 6 :: GFP ] , unc ­64 ( E246 ) ; jsEx580 [ Pmyo ­ 3 :: acia ­ 1 ( P260S ) Prol ­ 6 :: GFP ] LGV : SNB­ 1 ( md247 ) LGX : unc ­ 10 ( md1117 ) , kin­ 2 ( ce179 ) . Sólo Extracromosómica : jsEx558 [ acia ­ 1 ( P260S ) Prol ­ 6 :: GFP ] , jsEx570 [ acia ­ 1 (+ ) Prol ­ 6 :: GFP ] , jsEx571 [ acia ­ 1 (+ ) Prol ­ 6 :: GFP ] , jsEx575 [ acia ­ 1 ( L2444S ) Prol ­ 6 :: GFP ] , jsEx579 [ Psnb ­ 1 :: acia ­ 1 ( P260S ) Prol ­ 6 :: GFP ] , jsEx580 [ Pmyo ­ 3 :: acia ­ 1 ( P260S ) Prol ­ 6 :: GFP ] , jsEx676 [ gsa ­ 1 (+ ) Prol ­ 6 :: GFP ] . js127 doble mutantes con SNB­ 1 ( md247 ) , UNC­ 10 ( md1117 ) , UNC­ 13 ( E376 ) , y unc ­ 13 ( S69 ) fueron construido con RBF­ 1 ( js232 ) marcó cepas Unc. RBF­ 1 se encuentra en el centro de cromosoma III y se usa para marcar el cromosoma no js127 III . js127 ; él ­ 8 hombres fueron apareados en RBF­ 1 ; Unc hermafroditas , y ( js127 homocigóticos) progenie hiperactivo seleccionado de las crías de animales heterocigotos . La siguiente generación se examinó para la progenia no interaciva ( js127 ; Unc ) . Se verificó la homocigocidad de md247 y md1117 molecularmente mientras js127 se dedujo por la ausencia de js232 molecularmente .

La transformación de la línea germinal se llevó a cabo por la coninyeccion del plásmido de interés ,ADN pBluescript portador ( 200 g / ml ) , y el marcador de transformación dominante prol ­ 6 :: GFP ( pPHGFP1 a 20­35 g / ml ) 10 . Los transformantes se seleccionaron al anotar la expresión de GFP en un microscopio de disección , y la los etables se aislaron . jsEx570 y jsEx571 se obtuvieron a partir de la inyección de pPR1522 en unc ­ 64 ( E246 ) a 15 g / ml . inyección PAC2 ( 10μg/ml ) en unc ­64 ( E246 ) dio ( 15μg/ml ) inyección jsEx558 y PAC3 en unc ­64 ( E246 ), producido jsEx575 . PAC2 y PAC3 también se introdujeron de forma

independiente en el alelo nulo equilibrada ACY ­ 1 ( pk1279 ) / dpy ­ 17 ( e164 ) con el fin de determinar si estos formas alteradas fueron capaces de rescatar letalidad mutante nula . PAC5 y pAC6 eran cada transforman en unc ­ 64 ( E246 ) y las líneas jsEx579 y jsEx580 aislados , respectivamente . Una vez que se establecieron líneas estables , las matrices individuales se cruzaron para eliminar la mutación unc ­64 ( E246 ) . jsEx676 fue creada por la inyección conjunta de pPD118.33 y pRP1505 .

Contrucciones PlasmidicaspRP1522 , un 14 kb clon genómico que contiene el locus ACY ­ 1 11 , se obtuvo a partir CelineMoorman , Ph.D. (Laboratorio Hubrecht , Centro de Genética Biomédica , Utrecht, Holanda) y Ronald Plasterk , Ph.D. (Profesor , Laboratorio Hubrecht , Centro de Genética Biomédica , Utrecht , Países Bajos ) . El único par de bases acia ­ 1 ( js127 ) fue introducida en este clon usando el DpnI mediada por mutagénesis dirigida al sitio Protocolo 12 para crear un clon genómico ( PAC2 ) que codifica la forma mutante de P260S ACY­ 1 . Específicamente , pRP1522 se mutagenizó usando OL # 897 ( ATTCAGTCTGTGATGTCTAAAAAGGTACGCA )y OL # 898 ( TGCGTACCTTTTTAGACATCACAGACTGAAT ) . Del mismo modo , pRP1522 fue mutagenizado usando OL # 955 ( TTGGCAAGAAAGGATTCTGAGTTGGAGACACAG ) y OL # 956 ( CTGTGTCTCCAACTCAGAATCCTTTCTTGCCAA ) para crear PAC3 , un clon acia ­ 1 genómico capaz de albergar una lesión L244S en el modelo de la mutacion activa adenilatociclasa aislada en Dictyostelium 13 . Ambas construcciones se secuenciaron para verificar la introducción apropiada de la lesión genomica deseada . El uso de este mismo método de mutagénesis , un sitio de restricción BamHI fue diseñado antes de la 1 ­ acia sitio de iniciación por mutagénesis PAC2 usando OL # 1026 ( TCTTGTCTTCTGGATCCATGGACGACGATGT ) y OL # 1027 ( ACATCGTCGTCCATGGATCCAGAAGACAAGA ) para producir pAC4 . El acia ­ 1 a continuación, promotor fue reemplazado con el promotor del snb ­ 1 sinaptobrevina para producir un constructo , PAC5 , para la expresión selectiva de la forma P260S en las neuronas . Esto se logró intercambiando el fragmento de pAC4 SacII / BamHI con el fragmento de la SacII / BamHI GTTAGTATCATTCGAAACATACC ) y OL # 1029 ( AGCTTTCCGCGGAAATC ­ TAGG ) amplificación del SNB­ 1 promotor de pRM248 . pAC6 fue creado de la misma manera con el OL # 1028 y OL # 1030 ( GCTGCGGCCGCGGGTCGGC ) para amplificar el myo ­ 3 promotor de pPD96.52 para estudiar la expresión selectiva del músculo. pPD118.33 es una Pmyo ­ 2 :: GFP y pRP1505 es una de tipo salvaje GSA ­ 1 constructo y se obtuvo de Ronald Plasterk .

Unc ­64 ( E246 ) supresor de pantalla

Una pantalla genética no clonal se realizó mediante mutagénesis convencional . Se mutagenizan hermafroditas unc ­64 ( E246 ) L4­ por etapas durante cuatro horas en 50 mM etil metano sulfonato . Para recuperar mutantes recesivos , segunda generación de auto progenie fueron examinados para animales móviles . A partir de una placa dada de aproximadamente 50 a 150 Progenie F1 , a lo sumo un supresor de candidato F2 se seleccionó clonalmente y se paso . La supresión fue verificada en la próxima generación y se inició posterior retrocruzamiento . Esto se realiza generalmente en el apareamiento con machos de tipo salvaje

, doble heterocigotos F1 los hombres han sido cruzados en unc ­64 ( E246 ) y varios descendientes hermafroditas Unc clonales . La próxima generación se proyectó para desplazar a los animales para reticular la unc ­64 Sup dobles mutantes . Después de al menos dos rondas de retrocruzamiento , se cruzaban los de unc ­64 ( E246 ) con el fin de obtener el único supresor mutante. Presencia de el supresor se verificó en el esfuerzo por reintroducir el alelo de UNC­ 64 ( E246 ) y que muestra la retención de la supresión de la parálisis . En siete rondas de selección de un total de 24.000 Se recuperaron genomas haploides , supresores de catorce . Otros supresores aisladas en el pantalla se han descrito en otra parte.

Mapeo genético de los supresores y la identificación molecular de las lesiones

Todas las pruebas de mapeo y la complementación se realizaron mediante métodos genéticos estándar .Los supresores se agruparon inicialmente en base a su fenotipo de comportamiento y luego posteriormente fueron colocados en grupos de complementación por ensayos de complementación . js127 era un aislar alelo individual y se colocó en el cromosoma III basado en la vinculación con lon ­ 1 . Específicamente , js127 E246 machos se aparearon en lon ­ 1 E246 hermafroditas que resulta en js127 E246 / lon ­ 1 E246 cruzada . Esta progenie cruzada E246 eran homocigotos , pero eran fenotípicamente no Unc por copia js127 , es decir , js127 actuó predominantemente a suprimir el fenotipo E246 Unc . A partir de este heterocigotos trans, 7 de 31 Lon progenie eran También fenotípicamente no Unc través de la adquisición de un solo ejemplar de js127 por recombinación . Esta localización se perfeccionó mediante la asignación de tres factores con lon ­1 y dpy ­ 18 . lon ­ 1 dpy ­ 18 UNC­ 64 se colocó sobre js127 E246 y los 18 Lon recombinantes no Dpy no pudo segregar js127 , colocando js127 cerca o a la izquierda de lon ­ 1 .La asignación de estructura fina era realizado utilizando los polimorfismos de nucleótido únicode la cepa de Hawai , CB4856 17 . Los polimorfismos de nucleótido único que los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción fueron alterados elegido para el análisis , ya que podrían ser calificados simplemente mediante amplificación por PCR de ese región genómica y la posterior digestión con enzimas de restricción . En primer lugar, un dpy ­ 1 daf­ 2 js127 lon ­ 1 cepa UNC­ 64 se construye colocando dpy ­ 1 ( e1) daf­ 2 ( e1370ts ) en trans con js127 lon ­ 1 UNC­ 64 . 122 Sup Lon Unc progenie clonal fueron pases y 9 placas contenía Dpy Daf progenie. Dpy Daf animales Se pasaron entonces a la temperatura permisiva , 20 ° C durante daf ­ 2 , a evaluar la locomoción con el fin de verificar la presencia de js127 . A continuación , se aparearon machos CB4856 en esta cepa , y los machos cruzada progenie resultantes se aparearon nuevo en dpy ­ 1 daf­ 2 js127 lon ­ 1 unc ­ 64 hermafroditas , con el fin de obtener un máximo de un cromosoma recombinante por la progenie . La progenie de este cruce se le hicieron pruebas de Lon no Daf animales , lo que sólo el resultado de un evento de recombinación entre el daf ­2 y lon ­ 1 . 239 recombinantes se aislaron y luego cada cromosoma recombinante se homozygosed y anotó para js127 por su fenotipo Sup . La ubicación de cada evento de recombinación se determinó por anotando el genotipo de cada solo polimorfismos de nucleótido . Los cebadores de PCR y la ubicación de polimorfismos de un solo nucleótido están disponibles bajo petición . El examen de la Lon Sup Clase Unc de recombinantes js127 coloca a la derecha del cósmido F10F2 , mientras que la información de la clase Lon Unc de recombinantes js127 posicionado a la izquierda de cósmido C35D10 . este

región de aproximadamente 273 Kb contenía un estimado de 82 genes , uno de los cuales era una adenilato ciclasa gen , ACY ­ 1 . La secuenciación del 1 acia ­ marco de lectura abierta de js127 puesto de manifiesto un cambio de un solo nucleótido C ­ > T que resulta en una lesión P260S en la proteína . Una PCR / ensayo de digestión fue desarrollado para anotar la presencia de esta lesión molecular . PCR amplificación de un producto de 210 pb usando OL # 872 ( TCTTGAAGAGG ­ CCGGATACATT ) y OL # 896 ( AAAATGCATGCGTAGCCTTTTAG ) , seguido por la digestión con BglI dio como resultado en un modelo de restricción de 192bp y 18 pb de tipo salvaje y un fragmento de 210 pb sin digerir de js127 .

Ensayos de comportamiento y de la drogaEnsayos de locomocion se realizaron a temperatura ambiente ( 20­22 ° C ) en al menos 20 jovenes adultos hermafroditas mediante la recopilación de imágenes de la cámara CCD con una serie de tramas LG3 ( Scion Corporation, Frederick , MD) cada 2,5 a 5 s con un aumento entre 0,5 X y 0.8X . Los platos estaban tranquilamente colocados en el microscopio durante cinco a diez minutos antes de iniciar formación de imágenes . Se recogió una serie de imágenes de locomoción basal antes de dejar caer una barra de metal desde una altura constante sobre las placas para servir como un estímulo mecánico para excitar la 18 animales . Una serie similar de imágenes se recogió después de este estímulo mecánico . La velocidad de locomoción se calculó entre imágenes sucesivas midiendo el lineal desplazamiento en la posición de la cola de cada animal . Velocidades más de cuatro imagenes consecutivas se calcularon y se promediaron para evaluar la locomoción tanto basal como estimulada .Los ensayos se realizaron por triplicado .

La sensibilidad aguda a los inhibidores de acetilcolinesterasa aldicarb se analizó mediante la transferencia de 20­25 animales a placas que contiene el aldicarb y el control de la evolución en el tiempo de los animales parálisis. Los animales se cuentan como paralizado si aparecían hipercontraídos y fracasaban para moverse incluso si pinchó con un alambre de platino . Aldicarb , 2 ­ metil ­ 2 ­ [ metiltio ] proprionaldehyde O­ [ metilcarbamoil ] oxima , se obtuvo a partir Chem.Services, Inc. (West Chester , PA) y se preparó como una solución 100 mM de valores en un 70% etanol . Aldicarb se añadió al medio de agar nutriente de crecimiento después del autoclavado .

Ensayos de dispersión isoflurano se realizaron a 22­24 ° C con jóvenes adultos hermafroditas como fue descrito previamente. Los gusanos fueron transferidos en tampón de S ­ basal a 9,5 cm dispersión de agar placas sembradas en su borde con la bacteria E. coli . Placas de dispersion se colocaron a continuación en varias concentraciones atmosféricas de isoflurano (medidos posteriormente por cromatografía de gases ) y entonces a los animales se les permite dispersarse. La fracción de los adultos (placa de aproximadamente 50/ensayo ) presentar en el anillo bacteriana dividido por el número total de adultos después de 40 min se obtuvo como el índice de dispersión .

Monofosfato de adenosina cíclico ( AMPc ) y el ensayo de unión competitivaLos niveles de cAMP endógeno se miden a partir de animales adultos jóvenes utilizando un ensayo competitivo ELISA de unión ( Amersham Biosciences , Piscataway , NJ ) 21 . Tipo salvaje , acia ­ 1 ( nu329 ) , y acia ­ 1 ( js127 ) los animales fueron cultivados en la cepa guanilato ciclasa de E. coli deficientes DHP1 F­ glnV44 ( AS) recA1 endA1 gyrA96 ( NalR ) thi1 hsdR17 spot1 rfbD1 cyaA 22 . Se obtuvieron cultivos sincronizados de los adultos utilizando métodos estándar . Aproximadamente 200 de los adultos envasadosse resuspendieron en 1 ml de tampón de lisis y se sonicó con tres 20 ­ s pulsos utilizando una micropunta . Las concentraciones de proteína se midieron usando un ensayo de Bradford ( BioRad, Hercules , CA ) . Los ensayos se realizaron por triplicado .

Análisis estadísticoLas curvas de concentración / respuesta se ajustaron por regresión no lineal utilizando la ecuación: y = min + ( max ­ min ) / ( 1 + ( [ Iso ] / CE50 ) ­ k ) . El mínimo se vio obligado a 0 . La CE50 fueron utilizados como la medida de la sensibilidad de las cepas de isoflurano . EC50s se compararon con fines estadísticos diferencias por ajuste de curvas simultánea descritos por Waud 23 utilizando GraphPad Prism 5 Software ( GraphPad Software, Inc. , San Diego , CA ) . Los valores de error después de la EC50 los valores son el error del ajuste . Los valores de error para los niveles de cAMP fueron SD de ensayos por triplicado . Valores de error para los ensayos de aldicarb fueron SEM de ensayos por triplicado . Las tasas de locomoción y de AMPcniveles se compararon por dos caras de la t ­ prueba . El momento en el que la mitad de los animales se fueron paralizado en los ensayos de parálisis aldicarb se comparó las diferencias estadísticas por ajuste de la curva simultánea utilizando GraphPad Prism Software 5 . estadística significativa diferencias fueron en la p < 0,05. Para comparaciones múltiples , el umbral de importancia era < 0,05 / # de comparaciones .

ResultadosLa mutación js127 se aisló en una pantalla para las mutaciones que mejoran la locomoción de los UNC­ 64 con alelos para la reduccion de sintaxina , E246 . js127 suprime fuertemente la lenta locomoción no coordinada de unc ­ 64 ( E246 ) ( fig. 1A , B ) . En efecto , después de la estimulación , el js127 E246 cepa mutante doble trasladó a velocidades no se distinguen de los animales de tipo salvaje y fue el mutante supresor más fuerte aislado en la pantalla ( fig. 1B ) . Para probar si esta la supresión de la locomoción se asoció con un aumento en la liberación de acetilcolina , se midieron las sensibilidades al aldicarb . El aldicarb es un inhibidor de la acetilcolinesterasa que se usa ampliamente para medir los niveles de la transmisión colinérgica en C. elegans mutantes con la salvedad de que sensibilidad aldicarb es una medida indirecta de la liberación del transmisor y solo mide la liberación de acetilcolina . Los mutantes con una disminución de la liberación de acetilcolina son más resistentes a la parálisis por el aldicarb , y esto se puede medir convenientemente mediante ensayos cinéticos . js127 E246 fue significativamente menos resistentes a aldicarb de unc ­ 64 ( E246 ) , consistente con una mejora de la función de la sintaxina para mediar la fusión de vesículas sinápticas y el transmisorliberar . La mutación js127 se cruzo con unc ­64 ( E246 ) y su sensibilidad isoflurano se midió .

js127 era fuertemente resistente a isoflurano con una CE50 más de 3 veces la de la cepa de tipo salvaje y totalmente resistente a concentraciones de isoflurano en el rango clínico (fig. 1D ) .

Para identificar la lesión genética responsable de los fenotipos en js127 , la supresión de lalento fenotipo locomoción de E246 se asignó genéticamente. El fenotipo de supresión asignado a un intervalo de 273 Kb en el brazo izquierdo del cromosoma III ( fig. 2A ) . El C. elegans secuencia del genoma predice 82 genes en este intervalo , una de las cuales es ACY ­ 1 , que codifica una adenilato ciclasa demostrado previamente para regular la liberación de neurotransmisores en C. elegans y por sus homólogos más cercanos de los mamíferos 24­26 . El gen ACY ­ 1 fue secuenciado en la js127 mutante y un C> T transición mutación se encontró en el codón 260 que resulta en prolina a serina lesión de sentido erróneo ( fig. 2B ) . Proline 260 mentiras dentro de una región altamente conservada en el N­terminal extremo del dominio C1a , uno de los dominios catalíticos citoplasmáticas . Para confirmar que la mutación P260S fue de hecho responsable de los js127 fenotipos , una acia ­ 1 genómico plásmido se construyó con la mutación P260S y animales transgénicos que expresan el plásmido se generaron . El P260S transgén suprime fuertemente los defectos de locomoción unc ­ 64 ( E246 ) a niveles similares a los de la js127 E246 ( fig. 2C ) . Del mismo modo el transgén en la ausencia de unc ­64 ( E246 ) confiere resistencia isoflurano alto nivel , en realidad mayor que que en js127 ( p < 0,007 vs ACY ­ 1 ( js127 ) ) ( fig. 2D ) . Basándose en el mapeo , la identificación de un lesión , y fenocopia por transformación , llegamos a la conclusión de que el C> T transición que resulta en una P260S cambio en ACY ­ 1 es la mutación js127 . Confirmando nuestra asignación de js127 a ACY ­ 1 , Este idéntica ACY­ 1 ( P260S ) lesión fue aislado de forma independiente en otro laboratorio de una forma similar pantalla para supresores de una mutación diferente que reduce la liberación de neurotransmisores en C.elegans 25 . Esto sugiere que relativamente pocas mutaciones en Acy­ 1 resultando de este fenotipo.

La capacidad para reproducir los fenotipos de js127 por transformación sugiere que el mutación confiere una ganancia de función a ACY­ 1 . Consistente con esta hipótesis , js127 heterocigotos suprimen significativamente la locomoción lenta de unc ­64 ( E246 ) ( fig. 3A ) . js127 también confiere un fenotipo dominante hipersensibilidad aldicarb , mientras que el reductionof ­función alelo ACY ­ 1 ( nu329 ) 27 es el aldicarb resistente ( fig. 3B ) . Lo mismo sucede con isoflurano, la sensibilidad , el alelo ACY ­ 1 ( nu329 ) tiene un fenotipo hipersensible isoflurano , opuesta a la que de Acy­ 1 ( js127 ) ( fig. 3C , D ) . Sin embargo , a diferencia de la expresión transgénica de ACY­ 1 ( P260S ) , los transgenes que expresan de tipo salvaje ACY ­ 1 adicional o ACY ­ 1 con una mutación previamente demostrado que confiere actividad constitutiva en Dictyostelium adenilato ciclasa 13 no eran resistente al isoflurano ni estos transgenes suprimir lenta locomoción de unc ­64 ( E246 ) fenotipos ( fig. 3D , E) . Por lo tanto , P260S parece ser una particularmente fuerte de ganancia de función y mutación . Para probar directamente la hipótesis de que js127 era una mutación de ganancia de función , comparamos los niveles de cAMP en animales enteros acia ­ 1 ( js127 ) , acia ­ 1 ( nu329 ) , y animales de tipo salvaje. En consonancia con los datos genéticos , los niveles de cAMP fueron significativamente mayores en js127 que en animales de tipo salvaje y significativamente más bajos en nu329 ( fig. 3F ) . Por lo tanto , se concluye que js127 confiere un aumento en la

actividad ­ 1 ACY de la adenilato ciclasa.

ACY ­ 1 se expresa en todo el sistema nervioso C. elegans y en la pared del cuerpo muscular . Por lo tanto , es posible que el aumento de la actividad ACY ­ 1 en las células musculares en lugar de neuronas es responsable de los fenotipos js127 . Para probar esta hipótesis , ACY ­ 1 ( P260S ) fue selectividad se expresa en neuronas o musculares utilizando promotores específicos de tipo celular. acia ­ 1 ( P260S ) impulsada por el promotor pan­ neuronal Psnb ­ 1 suprimido fuertemente la lenta locomoción de unc ­64 ( E246 ), mientras que la expresión en el músculo con el Pmyo ­ 3 promotor no produjo supresión perceptible ( fig. 4A ) . Del mismo modo , pan­ neuronal acia ­ 1 ( P260S ) produjeron alto nivel resistencia a isoflurano mientras que la sensibilidad isoflurano del músculo ACY ­ 1 ( P260S ) era similar a la de tipo salvaje . ( fig. 4B , C ) . Llegamos a la conclusión de que ACY ­ 1 adenilato ciclasa actúa en las neuronaspara suprimir el fenotipo mutante sintaxina y regular la sensibilidad isoflurano .

Para definir el camino mediante el cual ACY­ 1 regula la liberación del transmisor y el isofluranosensibilidad, hemos probado los fenotipos de las mutaciones en los genes que podría estar en el camino . La adenilato ciclasa seestimula normalmente por G s . C. elegans tiene un G s gen , GSA ­ 1 , el cual se ha demostrado previamente para promover la liberación del transmisor colinérgico y neurodegeneración 14,24,25,27,28 . Encontramos que al igual que acia ­ 1 ( js127 ) un activador mutación , ce81 , 24 en GSA ­ 1 era fuertemente resistente a isoflurano ( fig. 5A ) . Del mismo modo, los animales transformadas con copias adicionales de tipo salvaje gsa ­ 1 también fueron resistentes isoflurano ( fig. 5A ) . La proteína quinasa A ( PKA ) es una diana aguas abajo clásica de adenilato ciclasas y tiene previamente implicado en ACY­ 1 de señalización 25,29 . Probamos un alelo de pérdida de función de la Kin­ 2 , que codifica una subunidad reguladora negativa de la PKA . De acuerdo con ACY ­ 1 señalización a través de PKA para regular la sensibilidad isoflurano , el kin­ 2 la pérdida de función de mutantes era resistente fuertemente isoflurano ( fig. 5A ) . proteína de unión al elemento de respuesta a AMPc (CREB ) es un factor de transcripción que puede ser activada por fosforilación de PKA y regula la expresión de numerosos genes 30 . CREB es más claramente implicado en la plasticidad sináptica y desarrollo neuronal , pero también ha sido demostración para promover la expresión de presináptica sintaxina 31 . Por lo tanto , hemos considerado la hipótesis de que ACY­ 1 podría promover sináptica transmisión y reducir la sensibilidad isoflurano mediante la activación de CREB . Sin embargo , un nulo la única mutación en C. elegans homólogo de CREB 32 , CRH ­ 1 , tenía sensibilidad normal a isoflurano y no suprimir la resistencia de isoflurano js127 en el acia ­ 1 ( js127 ) CRH­ 1 ( null) doble mutante ( fig. 5A ) . La CRH­ 1 ( null) mutante resistente a aldicarb coherente con la hipótesis de que la CRH ­ 1 favorece el desarrollo de la neurotransmisión colinérgica ( figura 5B ) , sin embargo , como para la resistencia isoflurano la CRH ­ 1 (nulo ) mutante no suprimió la aldicarb hipersensibilidad fenotipo de Acy­ 1 ( js127 ) . Una salvedad notable a atribuir la aldicarb fenotipo de la resistencia a la CRH ­ 1 (nulo ) mutante es un mutante que sólo se probó y el fenotipo no fue rescatado por la transformación. Por lo tanto , la resistencia podría ser el aldicarb debido a una mutación de fondo desconocido . Sin embargo , los datos no demuestran definitivamente que la C. elegans CREB no actúa aguas abajo de ACY ­ 1 para controlar la neurotransmisión y sensibilidad isoflurano .

Por último , la prueba de supresión de js127 fenotipos por reducción de función de las mutaciones en tres proteínas de liberación del transmisor maquinaria, UNC­ 10 ­ rab ­ 3 ­que interactúan las moléculas (RIM ) , SNB­ 1 ­ sinaptobrevina y UNC­ 13 ­ Munc13 . Para la resistencia isoflurano y aldicarb la sensibilidad , las mutaciones en los tres genes suprimidos fuertemente js127 ( fig. 5A , C , D, E ) . Por lo tanto , la activación de la adenilato ciclasa js127 no pasa por alto la fusión vesicular núcleo maquinaria para producir resistencia VA o mejorar la liberación del transmisor . Sin embargo , para los tasa de locomoción, sólo la locomoción de un fuerte unc ­ 13 alelos ( s69 ) no mejoró con js127 ( fig. 5F ) . unc ­13 ( E376 ) , un alelo más débil, siendo movido significativamente mejor en el fondo de js127 ( fig. 5F ) . Del mismo modo , las tasas de locomoción de tanto la pérdida de SNB­ 1 parcial de función y unc ­ 10 mutantes nulos mejoraron significativamente en un fondo mutante js127 . Por lo tanto , UNC ­ 10 y tal vez SNB­ 1 ( la relación epistatic de SNB­ 1 a ACY ­ 1 no es definitiva dado el alelo SNB­ 1 no es nulo ) no son necesarios para la promoción de la locomoción actividad de ACY ­ 1 . Por el contrario , UNC ­ 13 , al menos en el nivel de sensibilidad de estos ensayos , esepistático a ACY ­ 1 ( js127 ) .

DiscusiónA través de la detección de las mutaciones que suprimen los fenotipos de una reducción de la sintaxina función mutante , hemos identificado una mutación de ganancia de función de C. elegans ACY ­ 1 la adenilato ciclasa que antagoniza fuertemente la sensibilidad isoflurano . Nuestros datos son consistentes con un ACY ­ 1 vía de señalización como se muestra en la Figura 6 . Con respecto a la anestesia mecanismos , la cuestión más central que plantea este estudio es si ACY­ 1 es un objetivo anestésico y la mutación js127 bloquea directamente la inhibición de anestésico volátil ACY­ 1 . Esta hipótesis parece poco probable a la luz de nuestros resultados anteriores . Aunque no es tan VA resistentes como acia ­ 1 ( js127 ) , otros mutantes que suprimen unc ­64 ( E246 ) también son resistentes VA 7 . En general , hemos encontrado que las condiciones ambientales o mutaciones como ACY ­ 1 ( js127 ) que mejorar la liberación de neurotransmisores confieren resistencia VA 7,20,33 . Del mismo modo, los mutantes con reducción de la neurotransmisión se han encontrado para ser hipersensibles a AV 5,20,33 . Por lo tanto , la anestesia fenotipo de Acy­ 1 ( js127 ) se explica con mayor facilidad ya que debido a la indirecta mejora del proceso que bloque AV .

En C. elegans , sólo la sintaxina truncada y unc ­ 13 mutantes se han encontrado para desviarse a partir de la correlación entre los niveles de liberación de neurotransmisores y la resistencia VA 5,34 . La sintaxina truncada actúa de manera dominante para bloquear los efectos del VA sobre la liberación del transmisor sin otra manera detectable alterar el comportamiento o la neurotransmisión 5,34 . La resistencia VA del mutante syntaxin puede ser suprimido por la sobreexpresión de tipo silvestre­ UNC­ 13 , consistentes con un modelo en el que la sintaxina truncada en un dependientes de la dosis bloques mecanismo VA inhibición de la actividad de UNC­ 13 . Los unc ­ 13 mutantes , a pesar de haber reducido transmisorliberación , también fueron resistentes VA , y una cepa con una membrana específica UNC­ 13

fue VA resistentes , lo que sugiere que el modelo AV bloque de asociación con la membrana de la UNC­ 13 34 . Por lo tanto , hemos propuesto anteriormente que la UNC ­13 es un objetivo presináptica para la concentración clínica de los AV en C. elegans

Tal UNC­ 13 ser un blanco directo de PKA y así ofrecer una hipótesis comprobable para lainusualmente fuerte resistencia VA de Acy­ 1 ( js127 ) ? En efecto , entre los mecanismos de liberación mutantes probados , sólo los fuertes unc ­ 13 alelos, s69 , se encontró que era incompetente para js127 supresión de la locomoción sin coordinación. Sin embargo, poco espontánea o evocada exocitosis se detecta a partir de las neuronas motoras colinérgicas unc ­13 ( S69 ) por electrofisiológico ensayos de 35­37 . Por lo tanto , mientras que la interpretación formal de nuestros experimentos genéticos epistasis es que UNC ­ 13 se encuentra aguas abajo de ACY ­ 1 , este resultado puede derivar del hecho de que unc ­ 13 ( S69 ) no tiene esencialmente la liberación del transmisor para ACY­ 1 para mejorar en lugar de ser UNC­ 13 de la objetivo directo de la GSA­ 1 ­ ACY­ 1 ­ vía PKA . Adicionalmente , tiene UNC­13/mUNC13 no se ha informado que es un objetivo de la PKA . Es más probable que la PKA fosforila algunos objetivo intermedio cuya actividad requiere UNC­ 13 . UNC ­ 13 es un diacil glicerol de unión proteína presináptica que interactúa con syntaxin , RIM , calmodulina , y otra presináptica proteínas para promover la liberación de neurotransmisores 38 . Un objetivo razonable es PKA candidato UNC­ 10 RIM. En los mamíferos , la PKA ha demostrado fosforilar RIM , y esto fosforilación es necesaria para la potenciación a largo plazo presináptica PKA ­dependiente ratón neuronas del cerebelo 39­41 . Interacción con RIM Munc13 es necesario para el normal priming vesícula sináptica en las neuronas del hipocampo de ratones 42 y RIM unión a Munc13se ha demostrado para reducir los niveles de Munc13 homodímeros , que son autoinhibitory 43 .Además de desinhibición de Munc13 , RIM se ha demostrado recientemente para promover presináptica localización de P y los canales de calcio de tipo Q cerca de la zona activa y de su interacción con otras proteínas presinápticas incluyendo Rab3 y pueden cumplir una función andamios 39,44,45 . Sin embargo , en C. elegans , si UNC ­ 10 RIM es el objetivo ACY­1/PKA , no es un objetivo esencial, ya ACY ­ 1 ( js127 ) es capaz de mejorar significativamente la locomoción de un mutante unc ­ 10 nulo. Lo mismo sucede con el mecanismo presináptica VA , UNC ­10 es no esencial como unc ­ 10 nulos mutantes son normalmente sensibles a isoflurano.

Un mecanismo ACY­1/PKA alternativo o adicional compatible con UNC­ 13 como la AV objetivo es la regulación de la degradación del proteasoma dependiente de la UNC­ 13 . En Drosophilaneuronas, Dunc ­ 13 (Drosophila UNC­ 13 ) los niveles sinápticos resultaron ser positiva regulado por AMPc y PKA 46 . La inhibición de la AMPc / PKA señalización resultó en una rápida y reducción sustancial de los niveles Dunc ­ 13 en la sinapsis , y esta disminución podrían ser bloqueados con inhibidores del proteasoma . Sin embargo, el mecanismo por el cual la vía cAMP / PKA regula la degradación proteasomal aparente de Dunc ­ 13 es oscuro.

¿Es el C. elegans y su mecanismo presináptico descrito aquí relevante para los mamíferos como mecanismo de anestesia ? Como se indicó anteriormente , la inhibición presináptica de liberacion exitatoria de neurotransmisores se ha demostrado en una variedad de modelos de mamíferos . Por lo tanto , una contribución de los efectos anestésicos presináptica a la

anestesia general, parece probable. la maquinaria presináptica en C. elegans esta altamente conservada en humanos, y el AV en concentraciones a las que los mutantes en la maquinaria presináptica se confieren resistencia están en el rango clínico . Así, el mecanismo C. elegans VA podría aportar de forma razonable a la anestesia general en los mamíferos. Un soporte experimental para esta conjetura se ha informado recientemente . Un sintaxina truncada sobre la base de la C. elegans VA resistente mutante se expresa en una línea de células neuroendocrinas en la rata y en el hipocampo y encontrado para antagonizar los efectos de las concentraciones clínicas de isoflurano en neurosecreción y la liberación del transmisor . Estos resultados sostienen que al menos algunos aspectos de la C. elegans presináptica se conservan en los organismos superiores .

Una cuestión importante a considerar cuando se habla de la posible pertinencia de la propuesta de C. elegans presináptica como mecanismo de anestesiade mamíferos es cómo conciliar la la función fundamental de la UNC­ 13 s con la inhibición diferencial volátil anestésicos de liberación del transmisor de distinta neuronal . En otras palabras , si UNC ­ 13 y su funcion en todas las sinapsis y son importantes objetivos anestésicos presináptica , ¿cómo pueden ciertos anestésicos volátiles uinhibir mas potentemente las sinapsis excitadoras en comparación con el efecto inhibidor que se muestra antes ? Los mamíferos UNC ­ 13 homólogos , Munc13 ­ 1 , 2 y 3 tienen roles funcionales diferentes que podrían contribuir a los efectos selectivos sinapsis de AV .

La liberacion de la mayoría de los terminales glutamatérgicos en el hipocampo del ratón requiere Munc13­1 mientras que la isoforma Munc13­1 y Munc13­2 funciona redundantemente en la liberacion GABAérgica por lo menos en la corteza cerebral y el hipocampo. En el cerebro de rata, la Munc13­1 se expresa en todo el sistema nervioso central, mientras que al expresion de Münc­13­2 está restringida a la corteza cerebral y el hipocampo. Munc­13­3 parece ser expresado exclusivamente en el cerebelo. Curiosamente, Munc13­1­y­2­Munc13 es mediada por la liberación diferente en su potenciación por diacilglicerol; Munc13­1 es es mucho menos eficaez en su potencia. Estas observaciones sugieren la hipótesis de que Munc13­1, el homólogo más cercano a C. elegans UNC­13, pueden ser más sensibles a los AV ya su débil potenciación es más eficazmente bloqueada por el AV en comparación con la de Munc13­2. La prueba de esta hipótesis es experimentalmente factible con la disponibilidad de ratón para cada una de las isoformas Munc13.