72932536 Cinetica Enzimatica Ejercicios Resueltos

7/24/2019 72932536 Cinetica Enzimatica Ejercicios Resueltos

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1-Orden de reaccin. La enzima Glicerol-3 fosfato deshidrogenasa se inactiva irreversiblemente

en presencia de ciclohehanediona con una cintica aparente de primer orden. Sin embargo, cuando

se vara la concentracin del agente inactivante en la cubeta se observa !ue la cintica se modifica.

"#pli!ue este resultado calcule el valor real de la constante de velocidad de la reaccin.

$%&'( )m*+ . 1

t )min+ "nzimaactiva

remanente

)+

1. 1.

1 /. 00.

/3./ 2.

3 .4 4.3

4 0. 3.

0.1 .4

/ . /.1

1 24. 4.3

Sugerencias5

a+'emuestre !ue la cintica de inactivacin es de primer orden aparente 6 calcular la constante de

primer orden 6 la vida media )no olvide las unidades+.

b+'etermine si la constante de primer orden vara con la concentracin del reactante %&' 6

escriba una e#presin para la velocidad !ue inclu6a a todos los reactantes.

c+ 7 partir de esta ecuacin identifi!ue !ue es lo !ue vara en cada e#perimento 6 lo !ue se

mantiene constante 6 diga por!ue la cintica aparece como si fuese de primer orden.


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----------regresar al ndice de la seccin-------------------regresar al ndice general------------

Ensayo actividad de una enzima.La enzima m8lico deshidrogenasa cataliza la reduccin de

o#aloacetato con 97'&, a malato 6 97':. "n el siguiente e#perimento se sigui la desaparicin

del 97'&, midiendo su absorbencia a 34 nm ); *-1cm-1+. Si se emplearon 32 ng deprotena de la preparacin enzim8tica, en una cubeta de 3 mL, para este e#perimento, determine la

actividad de la enzima en unidades internacionales 6 la actividad especfica de esta preparacin.

mpo )min+ . .1 . .3 .2 .2 1.2 .

sorbencia 1.34 1. 1. 1. 1.1 1.1 1. .//


3 Efecto de la concentracin de enzima. "n el siguiente e#perimento con la enzima fosfatasa

8cida de semillas de trigo germinadas se vari la concentracin de la enzima en cubeta a dos

concentraciones de sustrato 6 se obtuvieron los resultados siguientes5

$enz( )l+ $el

)nmol?min+

2 1./ .30

1 4.2/ 13.1/
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12 2./2 1/.142

0.0 2./4

2 /.40/ 3.

3 11.44 30.

a+ @%omo varia la velocidad de la reaccin en funcin de la cantidad de enzima aAadidaB

b+ @Cu pasa si dividimos la velocidad registrada por la cantidad de enzima aAadida al ensa6oB

c+ @Dtilizando la ecuacin de *ichelis-*enten e#pli!ue sus respuestas a las preguntas anterioresB


4-Cintica de una enzima. La actividad de la 7cetil-%o7 carbo#ilasa, medida con tres diferentes

concentraciones de enzima 6 a diferentes concentraciones de sustrato fu la siguiente5

$"nz( )g deprotena+

.1 . .2

$7cetil%o7( )*+ >el )mol ? min+

.2 .02 .24 1.303

.14 .4 1.1 .2

.3 .2 1.12 ./1
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.3 .4 1.32 3.43

.2 .022 1.4/4 3.2

.2/ .0 1.4/0 3.1

a+ %alcular para cada e#perimento el valor de Em 6 el valor de >ma#.

b+ @Son los valores de Em 6 >ma# iguales o diferentesB

c+ "#pli!ue si lo !ue observ es lo !ue esperaba obtener

d+ Sabiendo !ue la enzima pesa grs?mol, haga una gr8fica de >ma# vs mol de enzima.

e+ @Cu represnta la pendiente de esta gr8ficaB

f+ @"n !u se parece el valor anterior a la 7ctividad especfica ; >ma#?mg de protena en molmin-1mg de enzima-1B

g+ @Cu pasa con la medida de actividad especfica cuando la enzima no est8 puraB


2-Problema sobre un ensayo de actividad enzimtica. %onsidere a la enzima Fnvertasa, !ue

cataliza la hidrlisis de Sacarosa a fructosa 6 glucosa. "sta enzima posee una Em para sacarosa de

.2 m* 6 una constante cataltica de 102 min-1. Si se mide su actividad en presencia de .2 m*

de sacarosa con 2 pmol de enzima en la cubeta - @!u velocidad de cat8lisis se observar8B - @!ufraccin representa esto de la >ma# !ue se podra calcular en esta reaccin si se variase la

cantidad de sacarosaB - @%u8nto sustrato habra !ue aAadir para !ue la velocidad observada

alcanzase ./2 de la >ma#B - @Cu importancia podra tener esto para la posible aplicacin

industrial de la enzimaB - "#pli!ue sus respuestas.

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-Problema sobre una reaccin con dos sustratos.

La enzima 7spartato transaminasa, !ue cataliza la reaccin5

7spartato : #oglutarato Glutamato : #aloacetato

se realizaron los siguientes tres e#perimentos el siguiente e#perimento5

$7sp( ; 1 m* $#G( ; . m* $#G( ; .2 m*

$#G(

)m*+

>el

)mol?min+$7sp(

)m*+

>el

)mol?min+$7sp(

)m*+

>el

)mol?min+

. .444 .0 .411 .0 .4

.1 .31 .4 1. .4 .10

.30 .01 .101 1.0 .101 3.310

.3 3.33 .332 1.2 .332 3.

./4 3.02 .240 1./3 .240 4.13

.4/3 4.34 1.1 .31 1.1 4.34

a+ %alcule Em 6 >ma# para cada sustrato.

b+ @%ambian las >ma#B "#pli!ue su respuesta

c+ "#pli!ue !ue pas en el segundo e#perimento, con respecto al tercero.

d+ @%Hantos 6 cu8les valores de Em debo considerar para describir la afinidad de la enzima por

sus substratosB

e+ @Cu conclusin se podra sacar de esos datosB



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0- Problema sobre la energa de activacin.

=ara la enzima catalasa se realiz un e#perimento en el !ue se determin la velocidad de

descomposicin del per#ido de hidrgeno en ausencia en presencia de 1 n* de enzima en el

ensa6o.

I vel)sin catalasa+ vel)con catalasa+

)J%+ )mol?s+ )mol?s con 1n*K"t+

4 .4"- .41

1 0.04"-/ .44

12 1.31"- .40

./"- .4/0

2 3.2"- .23

3 2.04"- .2/

-Suponiendo !ue la concentracin de per#ido de hidrgeno fue suficiente para garantizar la

saturacin de la enzima, calcular la energa de activacin de la reaccin con o sin enzima 6 discuta

sus resultados. );1./0 cal?mol?JE+



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-Efecto de temperatura sobre una enzima

Los valores de Em 6 >ma# siguientes se determinaron midiendo la hidrlisis de bromuro de

acetilcolina catalizada por la esterasa bovina a diferentes temperaturas5

I )J%+ K*)m*+ Mcat)mol min-1pmolN$"(t-1+

.43 .30

2 .302 .3

3 .332 .34

32 .32 .3

42 1.2 .13

a+ @Cu intervalo de termperaturas deberan emplearse como datos para calcular la energa de

activacin de la reaccin catalizada por la enzimaB.

c+ =ara ralizar el c8lculo anterior5 @debera emplearse los valores de Em o de kcat.

b+-@=or !u varaKMcon la temperaturaB )sugerencia5 vea la deficincin deKM+.


/- Efecto del p! sobre la "ma#.Los siguientes valores de velcidad inicial de enzimas fueron

obtenidos para la -Cuimotripsina actHando sobre un sustrato artificial )ester etlico de acetil-L-triptofano+5

p& >el )unidades

internacionales+

p& >el )ui+

2.4 1 . 1/


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2. 1/ 0.

2. 3 0.4

.4 // 0. 3

.2 11 . 3

. 141 .4 331

sigue en las columna 3 6 4. /. 30

a+ 'etermine los valores de pEa)s+ del )los+ grupo)s+ involucrado)s+ en este comportamiento.

b+ 'iga !ue residuos de amino8cido podran responsables de esta respuesta.

c+ Si el e#perimento se e#tendiera hacia la regin m8s alcalina de la escala de p& !ue cabra

esperar )e#pli!ue su respuesta+.


1-Problemas sobre in$ibicin

Se realizaron estudios de inhibicin para dos enzimas diferentes presentes en el suero bovino. Se

vari la concentracin de sustrato a en ausencia 6 en presencia de tres concentraciones diferentes

de inhibidores de cada enzima. "n cada caso encontrar5

a%"l tipo de inhibicin.

b%"l valor de Em 6 >ma#.


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c%"l valor de Ei para el inhibidor.

Enzima


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$hidro#isuccnico(

)m*+

. 1. . 2.1

$Sustrato( $Glu()m*+

>elocidades iniciales )mol ? min ? mg=rot+

. .2/ .4 .3 .4

1.4 1.1 ./1 .0 .21

./ 1.3 1.43 1.1/ .0

2. 1./4 1.0 1.4 1.1/

. .1/ 1./4 1./4 1.2

1.3 . . 1.// 1.04

1. .3 .33 .4 1./

2.1 . .23 .2 ./


11-Problema sobre in$ibicin

"l siguiente e#perimento fu realizado con la fosfoenolp6ruvato5p6ruvil tranferasa de

streptococcus sp. "ste enzima participa en la sntesis de la pared celular de las bacterias 6 cataliza


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la transferencia de un grupo piruvilo a un precursos del pptidoglicano, liberando fosfato. La

fosfomicina )elocidad

)nmol min-1

mg=rot-1+

.03 .4/

2 .23 ./

1 .4 .12

2 . 1.0

2 .1 1.4

1 ./ ./

a+Fdentifi!ue el tipo de inhibicin !ue se presenta

b+ %alcule el valor de la F2para este inhibidor a la concentraciones m8s baPa 6 m8s alta de sustratoempleadas en el e#perimento.

b+ @Cu diferencias observa entre este par8metro calculado con diferentes concentraciones de

sustratoB

c+ Suponga !ue encuentra reportados en la literatura otros inhibidores de esta enzima !ue actHan

por un mecanismo semePante a este compuesto, pero descubre !ue en varios casos los autores

emplearon diferentes concentraciones de ="= para estudiar el efecto del inhibidor. @Sera v8lido

comparar los valores deKFreportadosB - e#pli!ue su razonamiento.


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&. &.- En este problema se nos pide analizar como progresa la inactivacin de una

enzima en el tiempo. '(u) la ciclo$e#anodiona *C!+% es un reactivo (ue modifica

(umicamente con la enzima y el producto de esta reaccin es una protena (ue pierde

su actividad enzimtica original. Por tanto) en este e#perimento) la enzima es un

reactante y su actividad enzimtica es el recurso metodolgico (ue sirve para evaluar

la concentracin remanente de protena no modificada por la C!+) en cada uno delos tiempos muestreados.

,e puede determinar si la reaccin (umica es de primer orden) o se encuentra en

condiciones tales (ue progresa como si lo fuese *aun(ue estrctamente no lo sea% ello

gracias a (ue la reacciones con cintica de primer orden *o de pseudoprimer orden%

muestran una relacin lineal entre el logaritmo natural de la concentracin de

reactante remanente y el tiempo transcurrido. +e modo (ue) si obtenemos los

logartmos de los valores de concentracin de la enzima remanente *no importa (ue

se trate de un porcentae% resultan las siguientes grficas.


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/a figura superior muestra la grfica logartmica) en la (ue se puede observar (ue

ambos conuntos de puntos describen razonablemente una recta) no as en la grfica

directa de 0E1 vs. tiempo *panel inferior%. Este resultado indica (ue la inactivacin

observada sigue una cintica de primer orden con respecto a la concentracin de

enzima en la condiciones empleadas. /as pendientes de estas lneas son

numricamente iguales a las constantes de primer orden) o de pseudoprimerorden)pero con signo negativo) de modo (ue basta cambiar el signo para determinar el valor

de las constantes buscadas.

2ote (ue ambas rectas presentan pendientes muy distintas) esto significa (ue la

concentracin de C!+ si tiene un efecto sobre la velocidad de la reaccin ann(ue) en

las condiciones e#perimentales empleadas) este efecto no se manifiesta en los &34

minutos (ue dura el e#perimento posblemente por(ue este reactivo se encuentra en

gran e#ceso. ,in embargo) una e#presin correcta para la velocidad de la reaccin

debera incluir ambos reactantes y la ley de velocidad indicara (ue el orden de

reaccin es superior a & *uno para la enzima y no sabemos e#actamente cuanto para

la C!+%.

5inalmente) el recuadro en la figura superior muestra (ue las constantes aparentes

calculadas varan linealmente con la cantidad de C!+ empleada en el e#perimento y

la lnea cruza el punto #)y *4)4%. Esto nos indica (ue el orden de reaccin para la C!+

es tambin de & y la pendiente de esta grfica nos indica el valor de la constante de 3o

orden. y la e#presin final para la velocidad sera

v6 k30C!+10E1) en donde k36 4.437 m8-&min-& 6 4.9: 8-&s-&.

En condiciones en las (ue 0C!+1 es muc$o mayor (ue 0E1) la enzima se agota sin (uela 0C!+1 disminuya apreciablemente. Esto es muy frecuente en la inactivacin de

enzimas) ya (ue la concentracin de protena apenas alcanza los cientos de

g;m/) lo

(ue para una molcula de &4444 gr;mol de P8 *si se trata de na protena pe(ue a lo largo de la incubacin.


3.- Para resolver este problema es necesario observar (ue la absorbencia registrada

representa la desaparicin del 2'+!) (ue es el sustrato de la reaccin. En este caso

la este(uimetra de la reaccin implica (ue por cada evento de reaccin) una molcula

de 2'+! desaparece y) por tanto) lo (ue necesitamos $acer para calcular la

velocidad es determinar el Cambio de absorbencia del 2'+! por unidad de tiempo)

para luego convertirlo a cambio de concentracin de 2'+! mediante la ley de

/ambert-?eer
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' 6c l c6 ';*e l%

de donde se sigue (ue

' 6 c l c;t6 *';t%;*l%

,i graficamos la absorbencia contra el tiempo transcurrido) la pendiente de la curva

descrita por la grfica ser *y3-y&%;*#3-#&% 6 ';t. /a (ue en este caso ser

numricamente negativa *por tratarse de la desaparicin de un producto%. ,in

embargo) podremos notar en la figura inmediata inferior) (ue la relacin no describe

una recta perfecta) por lo (ue es necesario considerar tan slo el periodo inicial) en el

(ue las concentraciones de sustratos y productos no $an cambiado apreciablemente y)por tanto) los punto se apro#iman razonablemente a una recta.

's) con una pendiente inicial de -4.:3@A Babs;min y una longitud para el paso de luz

de la celda del espectrofotmetro de & cm *l% se obtiene una velocidad de desaparicin

de 2'+! de =.:

&4-=8 min-&) lo (ue en : m/ del volumen de cubeta representa

*=.:

&4-=mol /-&min-&%

*:

&4-:/% 6 *&.=@

&4-Amol min-&%.

/as unidades internacionales *B% de actividad enzimtica son moles de producto

formado o reactante consumido por minuto) de modo (ue si & mol e(uivale a&47

mol) la velocidad ser *v 6 &.=@

&4-&

mol min-&% 4.&=@ B.


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5inalmente) la actividad especfica es l actividad enzimtica dividida por la

concentracin de protena) es decir a.e.6 4.&=@ B;:= ng) pero debido a (ue la

concentracin de protena suele e#presarse en mg a.e.6 4.&=@ B ; :=&4-7mg 6 9=9:

B;mg de protena.


:.- En este problema se nos pide determinar grficamente la relacin entre la

velocidad de la reaccin catalizada) vs.la cantidad de solucin de protena a


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proporcional a la "elocidad m#ima y a su vez la "ma# es proporcional a la

concentracin total de enzima a


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de enzima tenemos curvas ms elevadas. Como es de esperar) cuando dividimos la

velocidad por la concentracin de protena empleada) la tres curvas se superponen

*ver panel ? de la figura%) dado (ue a(u la velocidad ya slo depender de la

concentracin de sustrato. Esta es una manera comHn de representar las curvas de

saturacin por su sustrato de las reaccines enzimticas) ya (ue no su forma es la

misma sin importar cuanta enzima se emple en el e#perimento.

/os pneles de la derec$a en la figura anterior *C)+% son representaciones de

/ineIaver-?urJ) en esta representacin se grafica &;velocidad vs.&;0sustrato1) por lo

(ue tambin se le conoce como la grfica de dobles recprocos. /os valores de &;v

frente a la &;Sdescriben una lnea recta) cuya pendiente es numricamente igual a

K8;V8'Gy (ue intesecta al ee KLK en un valor numrico igual a &;V8'Gy si la recta se

prolonga a travs del cuarto cuadrante intersecta al ee KGK en un valor numrico

igual a -&;K8. En la figura) el panel derec$o inferior *C% muestra (ue la K8es

independiente de la concentracin de enzima a de los sitios activos slo depende de la afinidad relativa entre la enzima y el

sustrato) propiedad (ue no cambia con la concentracin total de enzima. Esto mismo

puede deducirse de la ecuacin de 8ic$aelis-8enten) ya (ue en ella) la concentracin

deEDy la de sustrato no son interdependientes. El panel superior dere$o *+% reitera

(ue al dividir la velocidad por la concentracin de enzima empleada las tres lneas se

superponen.

,i a$ora graficamos velocidad m#ima obtenida contra la cantidad de enzima

a


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Este valor nos dice (ue una molcula de enzima es capz de convertir :::44

molculas de sustrato a poducto por segundo y es e(uivalente a la actividad especfica

de una enzima pura *V8'G;0Protena1%) e#cepto por la unidades empleadas. +ado (ue

para determinar este Hltimo nHmero no necesitamos una estimacin e#acta del peso

molecular de la enzima) no del nHmero de sitios activos por molcula de protena) este

valor es el ms frecuentemente reportado en diversas tablas de parmentros cinticos

y propiedades de enzimas. ,in embargo) cuando la preparacin no es pura el

denominador de este conciente ser mayor) debido a la contribucin de los

contaminantes a la cantidad total de protena) en consecuencia) la actividad especfica

disminuir. +e este modo) la actividad especfica es un buen indicador del grado de

pureza de una preparacin enzimtica.


=.- En este problema se nos pide determinar la actividad como fraccin de la V8'G

para la enzima invertasa) la manera ms simple de proceder es reordenar la ecuacin

de 8ic$alis y 8enten como sigue

/o (ue nos indica (ue se alcanza el ::> de la V8'G) como V8'G6 kC'DED) se tiene vel

6 &A= min-&3.= &4-7mol 4.:: 6 una actividad de 4.44&97 mol min-&. '$ora)

segHn lo abtenido arriba) para obtener un @= > de la V8'Gbastar con (ueS;*K8S%

6 4.@=) de donde al despear , tendremos ,6K84.@=;*&-4.@=% 6 &@K8. /o (ue

significa (ue $abr (ue a


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7.- En este problema se pide calcularK8y V8'Gpara una enzima (ue posee dossustratos. En este caso) podemos variar la cancentracin de o#oglutarato y mantener

la concentracin de aspartato constante y viceversa. El problema consiste en saber

(ue concentracin de aspartato debo emplear cuando varo el o#oglutatato y (ue

concentracin de o#oglutaroto es recomendable mantener) al variar el osoglutarato.

'(u) e#isten dos valores para laK8) dado (ue este valor representa la cocentracin

de sustrato (ue ocupa =4> de los sitios activos de la enzima en el estado estacionario)

sin embargo) se pueden ocupar estos sitios activos con ambos sustratos y) por tanto)

$abr unaK8*o#oglutarato % y otraK8*aspartato%.

/a figura sigiente muestra la grfica de velocidad contra concentracin de sustrato

*panel iz(uierdo) para los : e#perimentos% y la de &;v vs &;s *panel derec$o%.

Puede observarse (ue las curvas y las rectas correspondientes a los e#perimentos & y

: e#trapolan a la misma V8'G) este es el primer diagnstico. /a V8'Ges la velocidad

de catlisis cuado la enzima se encuentra saturada con sus sustrato) pero dado (ue

a(u $ay dos sustratos) $abr (ue saturar con ambos. Esto significa (ue cuandovariamos la concentracin de aspartato) la concentracin de o#oglutarato debe estar


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saturante desde el primero $asta el Hltimo tubo medido y viceversa. ,i esto no se

asegura) entonces el resultado ser como el mostrado en el e#perimento 3) en el (ue la

V8'Gdeterminada es considerablemente inferior al valor real) decimos (ue se trata de

un valor aparente. '$ora -Mcmo sabemos (ue la concentracin de un sustrato es o no

saturanteN- bueno) como se vi en el problema anterior) nosotros nos apro#imamos al

@=> de la V8'Gcuando la concentracin de sustrato es &@ vecesK8. En este caso)$abr (ue elegir una concentracin de o#oglutarato igual a &@K8*o#oglutarato %

cuando se vara el aspartato y viceversa.

El problema es (ue de entrada) no sabemos cual es el valor de laK8para ninguno de

los sustratos y) por tanto) no es posible determinar a priori (ue concentracin ser

saturante. Para resolver este dilema se realiza un primer e#perimento y se determina

el valor de F8 para un sustrato *el (ue se vari%. En nuestro caso) se trata del

e#perimento con o#oglutarato variable. Con este resultado) se calcula el valor de

K8*o#oglutarato % aparente y se realiza entonces otro variando la concentracin de

aspartato con una concentracin de osoglutarato de al menos 34K8*o#oglutarato %.

+e este nuevo e#perimento se determina a$ora laK8*aspartato%) con lo (ue podemossaber si la concentracin de aspartato empleada anteriormente fue realmente

saturante. ,i la respuesta es afirmativa) ambos valores de V8'Gdeben ser muy

cercanos. +e lo contrario) es necesario repetir el primer e#perimento con una

concentracin de sustrato mayor a la empleada inicialmente.

En nuestro caso) laK8*o#oglutarato% determinada en el primer e#perimento es 4.433

m8 y la V8'G9.=9 mol min-&. En el segundo e#perimento) realizado con 4.43 m8 de

o#oglutarato) la concentracin no fue realmente saturante y no es sorprendente ver

(ue el valor de "ma# es inferior al anterior *3.47

mol min-&% y laK8*aspartato%

obtenida no es necesariamente el valor real tampoco *4.4: m8%. ,in embargo) en eltercer e#perimento) la concentracin de o#oglutarato fue de 4.= m8) es decir) 33 veces

laK8*o#oglutarato% del primer e#perimento *(ue por cierto) aHn no sabemos si es

cercana al valor real%) por consiguiente la V8'G es a$ora mayor *9.= mol min-&) de

$ec$o ms cercana a la obtenida en el primer e#perimento% y el valor de

K8*aspartato% es a$ora 4.473 m8.

Es decir) a$ora podemos determinar (ue la concentracin de aspartato empleada en

el primer e#perimento fue &7 vecesK8*aspartato%) cercano a la saturacin) pero se

deseamos resultados aHn ms limpios) $abra (ue repetir este e#perimento con una

concentracin aHn mayor *digamos 3 m8%.


A.- En este problema se nos pide calcular la energa de activacin de 'r$enius) para

ello) el procedimiento ms sencillo es el obtener una grafca de /og*k% vs. &;D

*absoluta% y la pendiente de esta grafica ser igual a -Ea;Q *siendo Q la constante

universal de los gases%. En este caso no tenemos el valor de k) sino tan slo el valor de

la velocidad de reaccin. ,in embargo) la pendiente de una grfica de 'r$enius es


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Ello gracias a (ue la velocidad es proporcional a la concentracin de reactante *v6 k

R% y asumiendo (ue sta no se modific durante el e#perimento. /o (ue significa (ue

para efectos del clculo de la pendiente y de la energa de 'ctivacin) es e(uivalente

graficar la J o la velocidad directamente) siempre (ue las mediciones se $allan

realizado con un cantidad constante de reactante.

/a fugura anterior muestra la grfica directa de velocidad vs. Demperatura) la (uemuestra (ue la velocidad de la reaccin crece e#ponencialmente con la temperatura.

Dambin es claro) (ue en el caso de la reaccin catalizada) no se observa una cada en

el rango de temperatura empleado) lo (ue nos dice (ue no se presenta

desnaturalizacin trmica de la protena y) por ello) es posible emplear todos los

puntos para construir el graRfico de 'r$enius) mismo (ue se muestra a la derec$a de

la figura anterior. 2ote (ue para realizar esta igura las temperaturas fueron primero

convertidas a temperaturas absolutas en oF.

+e la pendiente de la grfica y sabiendo (ueR6&.@A cal mol-&oF-&se obtienen los

valores para la energa de 'ctivacin de la reaccin catalizada por la enzima y en

ausencia de catalizador) ya (ueE'6 pendiente -& R. '(u se puede ver (ue la

energa de activacin de la reaccin catalizada por la enzima es cerca de veces


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menor (ue la de la reaccin en ausencia de enzima. /o (ue confirma (ue las enzimas

actHan reduciendo el tama


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En la grfica de la derec$a) se puede ver la recta (ue se obtiene en el grfico /n*J% vs

&;D) del (ue se deduce una energa de activacin de &.@7 Fcal;mol. 2tese como

clramente el punto (ue corresponde a la mayor temperatura no cae sobre la recta.

Esto debido a (ue este punto presenta una mezcla de los efectos de la temperaturasobre la velocidad de catlisis y sobre la velocidad de desnaturalizacin de la

protena.


@.- En este problema se nos pide determinar el valor del pFa del grupo involucrado

en la respuesta de la enzima frente al p!. 's) $aciendo una grfica de la actividad

frente al p!) se obtiene la curva siguiente *lnea contnua%


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Esta curva es e(uivalente a una curva de titulacin como las (ue se ven cuando se

a


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encuentran relativamente aleados de A *9.A para los carbo#ilatos y para el tiol%) en

el interior de las protenas y especialmente en el sitio activo de las enzimas) se pueden

observar desviaciones impertantes de los pFa) causadas por las caractersticas de

polaridad del sitio activo) (ue son casi seimpre muy diferentes a las del medio acuoso

puro.

c% 5nalmente) la lnea punteada de la figura anteror indica de manera apro#imada lo

(ue se espera observar a valores de p! muc$o ms alcalinos. En esas condiciones) la

desprotonacin masiva de muc$os aminocidos) es decir casi todas las $istidinas) los

tioles y la gran mayora de lisinas) as como muc$as argininas) perdern su carga

positiva provocando la desestabilizacin de numerosos puentes de sal en la protena)

con lo (ue la estructura se ver severamente afectada. Consicuentemente) se espera a

(ue un p! superior a &4 u &&) la actividad comenzar a desiminuir abruptamente y

para un p! de &3 o &: la enzima presentar una actividad nula. Esto es casi siempre

cierto) pero cabe aclarar (ue algunas protenas de bacterias alcaloflicas y (ue se

encuentran en medios e#tremos pueden soportar p! cercanos a &9 sin perdida de la

actividad.


&4.- parte a. En este problema) podemos graficar los valores de velocidad frente a laconcentracin de sustrato para las series obtenidas sin y con las distintas

concentraciones del in$ibidor. Esto se muestra en la figura (ue sigue) en el panel

inferior iz(uierdo. 'un(ue es posible estimar los valores de Fm y "ma# *en ausencia

del in$ibidor% y los valores de las constantes aparentes en presencia del in$bibidor en

esta figura) el estimado ser difcil de $acer) debido a (ue la "ma# es una valor lmite

(ue debe e#trapolarse y el valor de Fm debe estimarse una vez (ue se conoce la

"ma#) lo (ue significa (ue un mal estimado de "ma# dar un mal estimado de Fm.

Bna manera sencilla de resolver este problema es realizar la grfica (ue se presenta

en el lado iz(uierdo de la figura) la representacin de &;v vs. &;s propuesta por

/ineIaver U ?urJ permite) unindo los puntos con una recta) determinar los valores

de &;"ma# a partir de la intercepcin con el ee ordenado y -&;Fm a partir de laintercepcin de la recta e#trapolada al ee de las abscisas. 'un(ue e#isten otras

formas de graficar estos datos (ue pueden ser ms convenientes desde el punto de

vista del estimado numrico obtenido) esta es la ms e#tendida en la literatura.

a% ' partir de la representacin mostrada en el panel derec$o de la figura) puede

tambin determinarse el tipo de in$ibidor (ue se tiene) (ue en este caso es

acompetitivo *tambin llamado incompetitivo%) dado (ue las rectas (ue unen cada

una de las series de puntos son paralelas. 2ote (ue a(u de poco sirve emplear un

anlisis de regresin lineal) dado (ue los errores e#perimentales provocan (ue las

rectas obtenidas por regresin no presenten la misma pendiente. En estos casos) una

vez (ue se $a decidido (ue los puntos realmente representan rectas paralelas) lomeor es tomar una regla y trazar todas las recta paralelas buscando (ue el conunto


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de lneas realmente describan) tan cercnamente como sea posible) el conunto de

puntos e#perimentales.

b% '(u) el Hnico valor de "ma# para la enzima es el determinado en ausencia del

in$ibidor *

%. Es decir &;"ma# 6 4.@7= *

mol-&min mg prot% "ma# 6 &.49

*

molmin-&mg prot-&%. /os valores obtenidos con las otras rectas representan tan sloparmetros cinticos aparentes cuyo valor reflea las alteraciones impuestas sobre la

actividad enzimtica por la presencia del in$ibidor. Fm se determina por

consiguiente del valor de la intercepcin con las absisas de esta misma recta i.e.-&;Fm

6 -3.9 m8-& Fm 6 -&;-3.9 m8 6 4.9&A m8 dep-nitrofenilfosfato. Esto significa (ue

cuando la concentracin dep-nitrofenilfosfato en el medio de reaccin *al p! y

temperatura empleados en este e#perimentos% alcanzan 4.9&A m8) el =4> de los

sitios activos de la enzima se encontrarn saturados y por tanto la actividad der

igual a la mitad de la m#ima (ue puede observarse en dic$as condiciones.

c% 5inalmente) dado (ue los in$ibidores acompetitivos afectan al valor de la

intercepcin con la ordenada de la grfica de *&;v)&;s%) los valores de este parmetro

pueden emplearse para calcular grficamente el valor de Fi sin recurrir al lgebra.

Para ello) basta graficar estos valores frente a la concentracin de in$ibidor empleada

en cada serie de determinaciones) lo (ue se muestra en el panel iz(uierdo superior.

'(u) se unen los puntos con una recta y se e#trapolan al ee de las absisas) el punto

de crte es numricamente igual a -Fi 6 -34.9A

8 Fi 6 34.9A

8 debromolevamisol. 2ote (ue el primer punto de la grfica representa el valor de la


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intercepcin cuando la concentracin de in$ibidor el cero) es decir) este punto es

numricamente igual a &;"ma#.

parte b. a% /a solucin de este problema es muy semeante a la descrita para el

problema anterior) de manera (ue no abundaremos en los detalles. '(u) el patrn del

grfico de /ineIeaver-?urJ es claramente no paralelo) sin embargo) $abr (uedterminar si las rectas se cortan en un punto sobre el ee de las ordenadas) o sobre un

punto en el segundo o tercer cuadrante. /a distincin entre ambos casos debe $acerse

nuevamente al observar todo el conunto de puntos y el empleo de la regresin lineal

aporta poco para una eleccin adecuada del conunto de rectas y del punto de corte

entre ellas. En el caso presente es claro (ue el meor patrn es un abanico de rectas

(ue se cortan en el ee de las ordenadas) por lo (ue puede decirse con facilida (ue el

in$ibidor es competitivo. 2ote (ue a pesar de tener la misma "ma#) las curva de la

grfica directa no dan la apariencia de tener la misma asntatota. Esto se debe a (ue

en cada una de las series de e#perimentos) al estar una concentracin de in$ibidor

distinta presente) se alcanza un grado de saturacin distinta de la enzima y por ello es

muy difcil decidir si todas las rectas) dada una concentracion de sustratosuficientemente alta) alacanzarn el mismo tec$o. Esto recalca la dificultad de

emplear la representacin directa para el clculo grafico de los valores de "ma# y

Fm. ,in embargo) con la ayuda de un programa de regresin no lineal) es posible

determinar un estimad de Fm y "ma# a partir de esta representacin) cuyo valor

constituye un meor estimado (ue el obtenido por cual(uiera de los mtodos grficos

descritos en la literatura) salvo (uiz una e#cepcin *ref%.

b% los valores de "ma# y Fm se obtiene de la serie realizada en ausencia de in$ibidor

*

% a(u) "ma# 6 &;4.: *

molmin-&mg prot-&% 6 3.7: *

molmin-&mg prot-&% y -&;Fm

6 -4.=& m8-& Fm 6 -&;-4.=& m8 6 &.@= m8 de glutamato.


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c% 5inalmente) el valor de Fi puede obtenerse a$ora del efecto (ue el in$ibidor

produce sobre la pendiente de la grfica de /ineIaver-?urJ *(ue en ausencia de

in$ibidor es numricamente igual a Fm;"ma#%. +e nuevo) si se grafica el valor de

estas pendientes frente a la concentracin de in$ibidor empleada *panel superior

iz(uierdo%. El valor obtenido para Fi es a$ora 3.: m8 de 3-$idro#isuccinato. Es

importante recalcar (ue cuando las rectas no se cortan en el ee KLK como en este

caso) esto significar (ue el in$ibidor * no competitivo% producir alteraciones en los

valores de la pendiente y de los interceptos con la ordenada del grfico *&;v) &;s%) por

tanto a(u se podrn obtener dos valores de Fi *usualmente llamados Fiu y Fic)

respectivamente%. /o (ue representa una medida inversa de la fuerza con la (ue el

in$ibidor se une a la enzima cuando esta tiene su sitio activo vaco *Fic% o de la fuerza

de unin a la enzima con el sitio activo ocupado *Fiu%) por ello es (ue se obtienen dos

valores de Fi. ,i todas las rectas se cortasen en un punto sobre el ee KGK) estosignificara (ue Fiu y Fic son numricmente idnticos) pero esta coincidencia no es el

caso ms comHn.



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&&.- En este problema se presenta un caso comHn en la investigacin farmacolgica.

,e trata de buscar un in$ibidor (ue sea efectivo contra una enzima (ue resulta vital

para un microorganimo y) por tanto) nos puede servir para defendernos de l. /o

primero (ue observamos) es (ue en lugar de $acer medidas a diferentes

concentraciones de sustrato en presencia y ausencia del activador) a(u se realizaron

determinaciones de la actividad a una u otra concentracin fia de sustrato y concantidades crecientes del in$ibidor.

a% Para identificar el tipo de in$ibidor (ue actHa) se pueden emplear diversas

estrategias) por eemplo) se pueden ordenar los datos de manera (ue se tienen dos

valores de velocidad y dos concentraciones de sustrato para diferentes

concentraciones de in$ibidor. Esto es lo (ue se $izo en la figura inferior *panel ?%.

2tese (ue si trazaraos rectas estas cruzaran $acia el lado negativo del ee. +ado (ue

las medidas de actividad se realizan sin a


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b% Qespecto al valor de =4) las curvas y los valores correspondiente se muestran en la

figura inmediata superior) panel '. Como puede observarse el valor de =4 decrese

cuando $ay menor cantidad de sustrato. El valor de =4 nos indica cuanto in$ibidor

re(uerimos para in$ibir la actividad de la enzima a la mitad en una cierta condicin.

Es evidente (ue el resultado nos dice (ue si $ay ms sustrato disponible el in$ibidor

ser menos efectivo y reflea la e#istencia de un componente competitivo en lain$ibicin) lo (ue no significa (ue la in$ibicin sea realmente competitiva.

c% Como puede verse) si otros in$ibidores se (uisieran comparar con este) primero

$abra (ue asumir (ue el mecanismo de in$ibicin es el mismo. Esto suele $acerse en

la investigacin farmacolgica) ya (ue a menudo los compuestos a ensayar son iguales

en su estructura (umica) e#cepto por uno o dos substituyentes. En segundo trmino)

los valores de =4 tendrn (ue $aber sido determinados con la enzima ensayada en

condiciones idnticas) e#cepto por la adicin del in$ibidor en estudio. Por ello) la

respuesta a la pregunta (ue se plantea en el problema es 2O - no es posible compara

los valores puesto (ue no fueron medidos bao las mismas condiciones.

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