Cinetica Enzimatica TP Med Odonto Nov

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Procedimiento General para el Informe de Laboratorio de Actividad Enzimtica El informe de este laboratorio debe ser entregado al finalizar el prctico. Por tal motivo, se exigir que los grupos de trabajo ingresen con un informe parcial. Debe estar escrito a mano, en cuadernillo cuadriculado, tamao oficio, siguiendo el formato de identificacin y contenidos acostumbrado. Debe contener portada (1 hoja), Introduccin y objetivos (1 hoja), Aspectos tericos (1 hoja mx.), Materiales y Mtodos (2 hojas mx.). Objetivos claros, que no se confundan con actividades; Tablas de datos, clculos y grficos correspondientes a los ensayos 1 y 2 de la gua. Las tablas de datos, clculos y grficos correspondientes a los ensayos 3 y 4, deben ser agregados durante el prctico. Las tablas preliminares pueden estar incorporadas, listas para agregar los datos donde corresponda, a medida que los obtenga. Tablas y grficos deben ser claros. Los grficos en papel milimetrado, indicando ttulo y rtulos de los ejes, con las respectivas unidades de medida. La discusin y conclusiones finales no deben exceder de media pgina cada una y limitarse a demostrar una evaluacin de los datos obtenidos y su nexo con la teora. Contener un desarrollo de ideas lgico y coherente con la secuencia de actividades propuestas. Ser relevante la ortografa y redaccin.

Instituto de Biologa Vegetal y Biotecnologa Fundamentos Biolgicos de la Medicina

PRCTICO DETERMINACIN DE ACTIVIDAD ENZIMTICA INTRODUCCIN Espectrofotometra: La Enzimologa que se ocupa del estudio de la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas y las causas de su variacin. Los ensayos enzimticos se emplean rutinariamente en muchos laboratorios clnicos para el diagnstico de numerosas enfermedades, ya sea observando velocidades de reaccin anormales o bien niveles enzimticos inadecuados en el plasma u otros tejidos. Un ensayo enzimtico se basa en la capacidad de una enzima de transformar un sustrato en un producto especfico. Normalmente ya sea sustratos o productos son coloreados, es decir absorben fotones a una longitud de onda determinada. Ello permite seguir el avance de la reaccin mediante Espectrofotometra. Por otro lado, el empleo de reactivos especficos que reaccionan con sustratos o productos generando compuestos coloreados facilita el seguimiento de un ensayo enzimtico. La espectrofotometra es el mtodo de anlisis ptico ms usado en las investigaciones qumicas y biolgicas. Se aprovecha la propiedad de ciertos compuestos o molculas de absorber radiacin electromagntica. Todas las sustancias pueden absorber radiaciones dentro del espectro UV- Visible. Por ejemplo, el vidrio transparente absorbe radiacin de longitudes de ondas que no pertenecen al espectro visible, en tanto que el agua absorbe fuertemente en la regin del infrarrojo. Las longitudes de onda de las radiaciones que una molcula puede absorber y la eficiencia con la que se absorben dependen de la estructura atmica y de las condiciones del medio (pH, temperatura, fuerza inica, constante dielctrica), por lo que dicha tcnica constituye un valioso instrumento para la determinacin y caracterizacin de biomolculas. Los diferentes tipos de radiacin electromagntica: rayos X, luz ultravioleta (UV), luz visible, luz infrarroja (IR), ondas de radio, etc., se propagan a la misma velocidad, pero difieren en longitud de onda y frecuencia. El ojo humano detecta la radiacin en un rango de longitudes de onda de 400 a 780 nm, llamada luz visible (1 nm=10-9m). La luz del espectro visible y del UV cercano (200 a 400 nm) posee la energa necesaria para producir sobre ciertos compuestos, llamados cromforos, transiciones de electrones desde un orbital de menor energa a otro de mayor energa. Las sustancias coloreadas absorben luz visible y su color corresponde a la radiacin no absorbida. La absorcin de las radiaciones ultravioletas, visibles e infrarrojas, depende de la estructura de las molculas, y es caracterstica para cada sustancia qumica. Adems, la absorcin y transmitancia de luz depende de la concentracin del cromforo. Ley de Lambert-Beer: La relacin entre la absorcin de la luz y la concentracin de una solucin se representa por la Ley de Lambert-Beer. La Ley de Lambert-Beer seala que la cantidad

de luz absorbida por un cuerpo depende de la concentracin en la solucin y de la distancia recorrida por el haz de luz. Consideremos un rayo de luz monocromtica (luz de una sola longitud de onda) de intensidad Io, que incide perpendicularmente sobre una cubeta rectangular de vidrio que contiene una solucin de un compuesto qumico que absorbe luz (o cromforo), el haz lo atravesar, el compuesto absorber una parte de la radiacin incidente (Ia) y dejar pasar el resto (It), de forma que se cumple: Io = Ia + It.

Si el compuesto absorbe a la longitud de onda dada, habr una prdida de intensidad al traspasar la solucin. Esto es, It es menor que Io. Cuanto mayor es el nmero de molculas del cromforo que se interponen al paso del haz, menor ser la intensidad de la luz transmitida. Dicho nmero de molculas depende de la distancia recorrida a travs de la solucin (camino ptico o largo de la cubeta = b) y de la concentracin de soluto en la muestra (c). El coeficiente de extincin molar () depende de la naturaleza de la muestra y define cuan fuertemente una substancia absorbe la luz a una dada longitud de onda, por unidad de concentracin molar. La relacin entre estos parmetros est dada por la ley de Lambert-Beer: It/Io = T- bc donde It, es la intensidad de luz que sale de la cubeta y que va a llegar a la celda fotoelctrica (radiacin o intensidad transmitida); y Io es la que intensidad con la que llega a la cubeta (radiacin intensidad incidente) y la relacin entre ambas (T) es la transmitancia. El signo negativo se debe a que la energa radiante decrece a medida que el recorrido aumenta. La ecuacin simplificada de la ley de Beer-Lambert es A = .b.c corresponde a la mnima ecuacin que relaciona la concentracin (c), la absorbancia de la muestra (A), la distancia recorrida por la radiacin, o sea ancho de cubeta (b), y el coeficiente de extincin molar (). La ley de Lambert-Beer se cumple para soluciones diluidas (inferiores a 1,0); para valores de c altos, vara con la concentracin, debido a fenmenos de dispersin de la luz, agregacin de molculas, cambios del medio, etc. Transmitancia: La transmitancia (T) de una sustancia en solucin es la relacin entre la cantidad de luz transmitida que llega al detector una vez que ha atravesado la muestra (It), y la cantidad de luz que incidi sobre ella (Io), y se representa normalmente en tanto por ciento:

% T = It/Io x 100 La transmitancia nos da una medida fsica de la relacin de intensidad incidente y transmitida al pasar por la muestra. La relacin entre %T y la concentracin no es lineal, pero asume una relacin logartmica inversa. Absorbancia: La absorbancia (A) es un concepto ms relacionado con la muestra, puesto que nos indica la cantidad de luz absorbida por la misma, y se define como el logaritmo de 1/T, en consecuencia: A = log 1/T = -log T = -log It/ Io Cuando la intensidad incidente y transmitida son iguales (Io = It), la transmitancia es del 100% e indica que la muestra no absorbe a una determinada longitud de onda, y entonces A vale log 1 = 0. Esta relacin indica que la absorbancia aumenta en forma lineal con la concentracin (con un paso ptico constante), mientras que la transmitancia disminuye en forma exponencial. Estas ecuaciones slo son vlidas si la radiacin incidente es monocromtica y la absorcin ocurre en un volumen de seccin transversal uniforme. Espectrofotmetro El espectrofotmetro es un instrumento que permite comparar la radiacin absorbida, o transmitida, por una solucin que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia. Cuando se desea estimar la longitud de onda absorbida por un compuesto puro, el aparato permite variar la longitud de onda (espectro visible y UV cercano) del rayo de luz que incidir sobre una solucin de este, y medir en una fotocelda la intensidad de la luz que logra traspasarla. Con los datos obtenidos se construye un espectro de absorcin. Esto es, una representacin grfica que indica la cantidad de luz absorbida a diferentes valores de , manteniendo constantes el camino ptico recorrido (b) y la concentracin (c). A partir de una solucin diluida de un compuesto, cuya absorbancia mxima entra dentro del rango de medida del espectrofotmetro, se ver el valor de absorbancia a diferentes longitudes de onda frente a un blanco que contenga el disolvente de la solucin de la muestra a caracterizar. A partir del espectro de absorcin se obtendr el valor de al que el compuesto presenta la mayor absorbancia (max). Dicho se utilizar a la hora de hacer determinaciones cualitativas y cuantitativas del compuesto.

Fig. 1: Espectro de absorcin del p-nitrofenil fosfato en agua

El espectro de absorcin de un cromforo depende, fundamentalmente, de la estructura qumica de la molcula. No obstante, hay una gran cantidad de factores que originan variaciones en los valores de max y , entre los que se incluye el pH, la polaridad del solvente o molculas vecinas y la orientacin de los cromforos vecinos. Una vez obtenido el valor de max para un compuesto puro, se debe construir una grfica que exprese la relacin entre la absorbancia y la concentracin del compuesto puro, denominada curva de calibracin. Para esto, se mide la absorbancia A del compuesto a diferentes concentraciones de solucin. Estos valores de absorbancia se representan en el eje de abscisas (eje de x) y los de concentracin en el eje de ordenadas (eje de y). Se observar que, a bajas concentraciones, el aumento de concentracin se corresponde con un incremento lineal en la absorbancia (zona de cumplimiento de la ley de Lambert-Beer). A concentraciones altas la linealidad se pierde y se observa que la lnea se aplana, por lo que las medidas son poco fiables. Esta curva de calibracin permite estimar la concentracin de una muestra desconocida del mismo compuesto, al interpolar la absorbancia que esta produce en la recta obtenida.

Fig. 2: Curva de calibracin para una solucin de albmina srica bobina en = 700 nm y un paso ptico de 1 cm. Cintica enzimtica: Las enzimas son catalizadores biolgicos de naturaleza proteica. Una determinada enzima (E) se combina con un determinado sustrato (S) formando un complejo enzima sustrato (E-S), el cual se descompone para dar el producto (P) y la enzima libre (E):

!"#"$"""""""""""""""""""!$""""""""""""""""""!"#"%"La cintica enzimtica estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Estos estudios proporcionan informacin directa acerca del mecanismo de la reaccin cataltica y de la especificidad de la enzima por el sustrato. La velocidad de una reaccin catalizada por una enzima puede medirse con relativa facilidad, ya que en muchos casos no es necesario purificar o aislar la enzima. El tiempo de incubacin, concentracin de enzima, concentracin de sustrato, pH, presencia de cofactores, temperatura del medio, etc., son factores que influyen en la cintica de reaccin. Por esta razn la medida se realiza siempre en las condiciones ptimas de estos factores y se utilizan concentraciones saturantes de sustrato. En estas condiciones, la velocidad de reaccin observada es la velocidad mxima (Vmax). La velocidad puede determinarse midiendo la aparicin de los productos o la desaparicin de los reactivos.

Las reacciones enzimticas se caracterizan porque aunque aumente la concentracin de sustrato, la velocidad no aumenta linealmente, apareciendo un efecto de saturacin. La saturacin ocurre cuando todos los sitios activos de la enzima estn ocupados por sustrato.

Fig. 3: Variacin de la concentracin de las especies qumicas que participan en una reaccin catalizada por enzimas, en funcin del tiempo. La mayora de las reacciones biolgicas transcurren lentamente si no son catalizadas. Las enzimas hacen que el equilibrio de esas reacciones sea alcanzado rpidamente. Al seguir la velocidad de aparicin de producto (o de desaparicin del sustrato) en funcin del tiempo se obtiene la llamada curva de avance de la reaccin, curva de progreso o simplemente, la cintica de la reaccin. Para estimarla, es necesario elegir un intervalo de lectura que sea vlido para un rango amplio de concentraciones de enzima, y donde la concentracin de sustrato no sea limitante, de modo tal que se logre ocupar todos los sitios activos en las molculas de enzima, alcanzando un punto de saturacin. As, a medida que la reaccin transcurre, la velocidad de acumulacin del producto va disminuyendo porque se va consumiendo el sustrato, hasta llegar a un mximo de produccin por intervalo de tiempo (Fig. 3). La pendiente de esta curva corresponde a la velocidad inicial de reaccin (Vo) a tiempo cero. Se aprecia que, inicialmente la velocidad se mantiene constante (la curva es una recta) y que posteriormente sta decae. Dado que la velocidad disminuye hasta hacerse constante, se mide la velocidad inicial de la reaccin (Vo). De esta forma, la medida de Vo se realiza antes de que se consuma el 10% del total del sustrato, de manera que pueda considerarse la concentracin de sustrato como esencialmente constante a lo largo del experimento. Adems, en estas condiciones no es necesario considerar la reaccin inversa, ya que la cantidad de producto formada es tan pequea que la reaccin inversa apenas ocurre.3)&/.-(&'4&)$*/&'0%$&5#,2'

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V

Fig. 4: Curva de Progreso de la reaccin As: Vo = Cantidad de sustrato consumido (o producto formado) (moles, mmoles) Tiempo (min, hr) Existen dos tipos de ensayos enzimticos: a) Ensayo de tiempo fijo: en este ensayo se detiene la reaccin enzimtica despus de un tiempo determinado y se mide la concentracin de producto formado o de sustrato consumido. Este tipo es el ms sencillo y el ms utilizado. b) Ensayo cintico: es este caso se determina la concentracin de sustrato o de producto en forma continua durante el transcurso del ensayo o a una serie de tiempos muy prximos. Se obtienen grficos como el de la figura 1, con pendiente positiva para las determinaciones de producto o de pendiente negativa para las determinaciones de sustrato. Para estudiar la cintica enzimtica se mide el efecto de la concentracin inicial de sustrato sobre la velocidad inicial de la reaccin, manteniendo la cantidad de enzima constante. Es decir, se utiliza slo el rango de tiempo en el cual la velocidad de reaccin se mantiene constante. Si se representa la velocidad de reaccin frente a la concentracin de sustrato se obtiene una hiprbola rectangular, cuya expresin matemtica se conoce como Ecuacin de Michaelis-Menten (figura 3). A bajas concentraciones de sustrato la velocidad inicial es directamente proporcional a dicha concentracin. Cuando la concentracin inicial de sustrato es pequea, la velocidad inicial es directamente proporcional a la concentracin de sustrato, y por tanto, la reaccin es de primer orden. Cuando la concentracin de sustrato es muy elevada, la velocidad de reaccin tiende a un lmite superior conocido como velocidad mxima (Vmax). La enzima se encuentra saturada por el sustrato, y la velocidad ya no depende de la concentracin inicial de sustrato. En este punto, la reaccin es de orden cero.

Figura 3

El parametro Km se denomina constante de Michaelis-Menten y es la concentracin de sustrato a la cual la enzima funciona a la mitad de su velocidad mxima. En efecto, si Km = [S], la ecuacin de Michaelis-Menten se reduce a v = Vmax/2. La representacin de Lineweaver-Burk, como transformacin lineal de la ecuacin de Michaelis-Menten permite obtener de manera fiable la Vmax y la Km. En la representacin de Lineweaver-Burk se presentan los inversos de las velocidades enzimticas obtenidas frente a los inversos de las respectivas concentraciones de sustrato. Se obtiene as una recta cuyo corte con el eje de abcisas equivale a vale 1/Km y con el eje de ordenadas a 1/Vmax. La pendiente es Km/Vmax. De esta forma, a partir de los datos experimentales se puede calcular grficamente, los valores de Km y Vmax de un enzima para diversos sustratos.

La constante de Michaelis-Menten (Km) es un parmetro cintico importante, que permite evaluar la afinidad de la enzima por el sustrato. A menor Km, mayor afinidad del enzima por el sustrato, y a mayor Km, menor afinidad. La Km del sustrato natural es menor que la de los sustratos anlogos. Si dos sustratos de la misma enzima tienen distinta Km, el que presente mayor Km tiene menor afinidad por la enzima, y la reaccin transcurre siempre a menor velocidad que con el sustrato de menor Km, salvo a concentraciones saturantes de sustrato, donde la V = Vmax. Los valores de Km de muchas enzimas son prximos a los de la concentracin fisiolgica de sus sustratos, de forma que pequeas variaciones en la [S] pueden suponer grandes cambios en la velocidad de toda una ruta metablica. En el presente prctico, se estudiar en primer lugar la cintica de aparicin de producto para la reaccin de la fosfata cida, usando un ensayo de tipo cintico. Ello nos permitir determinar el tiempo durante el cual la velocidad inicial de reaccin se mantiene constante. Por otra parte, como la velocidad de la reaccin depende de la cantidad de enzima presente en el medio de ensayo, se determinar la concentracin de enzima apropiada para el ensayo. En segundo lugar, utilizando un ensayo de tiempo fijo, se determinar la constante de Michaelis-Menten (Km) para el sustrato.

TRABAJO PRCTICO DETERMINACIN DE ACTIVIDAD ENZIMTICA Para la determinacin de la actividad enzimtica se utilizar como modelo de trabajo la enzima fosfatasa. Esta enzima es de gran inters prctico en clnica humana. Las fosfatasas (ortofosfrico monoster fosfohidrolasa), son enzimas ampliamente distribuidas en los sistemas biolgicos, que hidrolizan el enlace ster fosfrico entre un grupo fosfato y un radical orgnico, liberando fosfato inorgnico. Existen dos tipos de fosfatasas: alcalinas y cidas. Las alcalinas funcionan a pH bsico (pH ptimo entre 9 y 10) estn presentes en rin, hgado, intestino y hueso. Su concentracin en suero aumenta en las enfermedades hepatobiliares y seas, entre otras. La medida de niveles anormales indican la existencia de enfermedades seas degenerativas (raquitismo, osteomalacia, hiperparatiroidismo secundario, osteosarcoma) o bien daos hepticos. El aumento fisiolgico de los niveles plasmticos de fosfatasa alcalina se produce en animales en fase de crecimiento (se est formando tejido seo) o en hembras gestantes (fosfatasa alcalina de la placenta). El grado de destruccin o dao celular guarda relacin con la cantidad de enzima presente en suero. La fosfatasa cida no tiene su funcin an bien conocida, encontrndose principalmente en la glndula prosttica del adulto y en los eritrocitos. Una fosfatasa cida srica elevada sugiere casi siempre un carcinoma metastsico, como puede verse en el 80 % de los casos de carcinoma prosttico. Como sustrato de la fosfatasa cida utilizaremos un compuesto artificial, el pnitrofenil-fosfato (pNPP), que posee un grupo fosfato en su estructura que es reconocido e hidrolizado por la enzima fosfatasa cida. El sustrato al ser hidrolizado origina un producto, el p-nitrofenol (pNP), que es coloreado en medio alcalino y absorbe a una longitud de onda de 405 nm, por lo que su aparicin en el transcurso de la reaccin puede seguirse colorimtricamente. Es posible detener la reaccin de la fosfatasa cida mediante la adicin de concentraciones elevadas de NaOH, o agregando a la reaccin un exceso de fosfato, que inhibir la actividad enzimtica.

Reaccin enzimtica Fosfatasa pNPP

ACTIVIDADES: I. Anlisis de datos. En esta parte del trabajo, usted analizar los resultados de ensayos de tipo cintico para fosfatasa cida obtenidos por el profesor. Cada grupo de trabajo debe determinar la concentracin ptima de enzima a utilizar para los ensayos siguientes y obtener la curva de calibracin para p-nitrofenol. Para la realizacin de los ensayos realizados y propuestos, se utiliza una preparacin comercial de fosfatasas cidas, extrada de germen de trigo (Sigma). MATERIALES Y MTODOS Ensayo 1: Curva de calibracin para p-nitrofenol. Se realiz un ensayo espectrofotomtrico para determinar la relacin entre cantidad de p-nitrofenol (moles p-nitrofenol) y Absorbancia (A, 405 nm). La curva permitir establecer la cantidad de producto formado en una reaccin enzimtica, a intervalos de tiempos determinados y en condiciones ptimas de pH y temperatura. Se tom 6 tubos de ensayo y se agreg 0, 1, 2, 3, 4 y 5 ml de una solucin 60 M de p-nitrofenol (preparada en NaOH 20 mM), respectivamente. Luego, a cada tubo se aadi suficiente solucin de NaOH 20 mM hasta completar un volumen final de 5 ml. La solucin obtenida fue mezclada y transferida a un tubo de espectrofotmetro y se midi la absorbancia a 405 nm. El tubo sin p-nitrofenol, fue utilizado como blanco para ajustar la absorbancia del colormetro a cero. Ensayo 2: bsqueda de una dilucin adecuada de enzima y Curva de progreso. El ensayo enzimtico que se utiliza para fosfatasas normalmente es un ensayo de tiempo fijo, por lo que se debe determinar en primer lugar la dilucin adecuada de enzima, de modo de obtener una velocidad de aparicin de producto (Vo) constante durante el tiempo de ensayo. Esto es de vital importancia en el caso de fosfatasas, debido a que sufren inhibicin por producto. Dos diluciones de extracto enzimtico fueron preparadas a partir de una solucin stock de 1 mg/ml. Para esto se tom 0,5 ml de la solucin stock y se complet a 5 ml con una solucin de BSA al 0,1%. De esa manera obtuvo una dilucin 1:10 del extracto enzimtico, con concentracin de 0,1 mg/ml. Desde esta dilucin 1:10, se tom una alcuota de 0,5 ml y se agreg 4,5 ml de una solucin de BSA al 0,1%, obteniendo una dilucin enzimtica 1:100 (concentracin de la enzima 0,01 mg/ml). Se prepar 3 tubos, que contenan 2 ml de tampn 0.1 M citrato (pH 4,8) y 2 ml de 2,5 mM p-nitofenil fosfato disdico (pNPP). Los tubos fueron incubados durante unos minutos en un bao termoregulado a 37C, para permitir que la solucin alcanzara la temperatura del ensayo. La reaccin fue iniciada mediante la adicin de 1 ml de la dilucin enzimtica indicada anteriormente (sin diluir, dilucin 1:10 y 1:100) en cada tubo, respectivamente.

La mezcla de reaccin fue homogeneizada por agitacin del tubo e inmediatamente se tom una alcuota de 0,5 ml de cada mezcla, la que fue transferida a otro tubo de ensayo con 4,5 ml de NaOH 0.1M. La adicin de NaOH detiene la reaccin y proporciona el medio de pH alcalino, adecuado para la determinacin de p-nitrofenol. Esta muestra corresponde al valor de tiempo cero. Luego de 10, 20, 30 y 40 minutos de iniciada la reaccin, se repiti el procedimiento anterior, tomando alcuotas de 0,5 ml de cada medio de reaccin, que fueron transferidos a tubos de ensayo con 4,5 ml de NaOH 0.1 M. Se determin la absorbancia de los tubos a 405 nm. Como blanco se utiliz un tubo que no contena extracto enzimtico (tubo 0 de la curva de calibracin para pnitrofenol). Resultados: Ensayo 1: Curva de calibracin para p-nitrofenol. Tubo 1 2 3 4 5 6 Volumen (ml) 60 M pNP 0 1 2 3 4 5 Concentracin moles pNP Absorbancia 405 nm 0,000 0,151 0,296 0,460 0,594 0,746

a) Grafique Abs 405 nm (eje y) versus moles de p-nitrofenol en la muestra (eje x). Recuerde que la curva de calibracin obtenida ser posteriormente utilizada para la determinacin enzimtica de la fosfatasa cida. b) De acuerdo a los resultados obtenidos, indique si la determinacin de p-nitrofenol obedece la Ley de Lambert-Beer. Ensayo 2: Bsqueda de una dilucin adecuada de enzima y curva de progreso. Absorbancia 405 nm Extracto enzimtico Dilucin 1:10 (1 mg/ml) (0,1 mg/ml) 0,091 0,013 0,389 0,059 0,638 0,102 0,835 0,149 0,926 0,184

Tiempo (minutos) 0 10 20 30 40

Dilucin 1:100 (0,01 mg/ml) 0,009 0,022 0,027 0,033 0,135

Utilizando la curva de calibracin para p-nitrofenol, determine la cantidad de producto formado luego de 10, 20, 30 y 40 min de ensayo. Antes de ello, debe restar la

absorbancia determinada para cada tubo a tiempo 0 a cada uno de los tubos de la serie. Este valor de Abs distinto a 0 corresponde a coloracin propia de cada mezcla de reaccin, debido probablemente al extracto enzimtico o degradacin de sustrato. moles p-nitrofenol producidos Extracto enzimtico Dilucin 1:10 Dilucin 1:100 (1 mg/ml) (0,1 mg/ml) (0,01 mg/ml)

Tiempo (minutos) 0 10 20 30 40

c) Grafique la cantidad de producto formado versus tiempo. Decida con cul de las diluciones enzimticas empleadas se observa un aumento constante en la formacin del producto (pNP) durante el tiempo de ensayo. Utilice la dilucin enzimtica seleccionada para sus futuras determinaciones. e) Calcule la velocidad inicial de reaccin (Vo) en cada caso. [NOTA: Para la realizacin de los clculos de la cantidad de p-nitrofenol formado, no olvide que el volumen del ensayo es de 5 ml y que la alcuota del ensayo utilizada (0,5 ml) fue diluida a 5 ml para la determinacin de producto (absorbancia a 405 nm)]. II. PARTE EXPERIMENTAL Utilizando los principios tericos y leyes enunciados en esta gua, los estudiantes realizarn el total de esta seccin. Mediante ensayos de tiempo fijo, estudiarn ciertas propiedades de la fosfatasa cida: determinacin de Km para pNPP y efecto inhibitorio de fosfato. Ensayo 3: Determinacin de la Constante de Michaelis para p-nitrofenilfosfato. Prepare una serie de tubos que contengan 0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5 y 1 ml de pNPP 25 mM. Agregue suficiente tampn citrato 0.1 M (pH 4.8) a cada uno, hasta alcanzar un volumen final de 4 ml. Incube los tubos en un bao trmico a 37C por unos minutos. D inicio a la reaccin mediante la adicin de 1 ml de la dilucin de enzima a cada tubo y mezcle bien. La dilucin de enzima de trabajo adecuada, corresponde a aquella que usted determin en el ensayo 2. Tome alcuotas de 0.5 ml del medio de reaccin a los 20 min de iniciada la reaccin y transfiralos a un tubo que contenga 4,5 ml de NaOH 0,1 M. Mida la absorbancia (A) a 405 nm y determine la cantidad de p-nitrofenolato formado en cada caso. Utilice como blanco el tubo que no posee sustrato. a) Calcule los moles de p-nitrofenol liberados por la enzima a cada concentracin de sustrato. b) Calcule la velocidad de reaccin obtenida (moles de p-nitrofenol formados/ml

enzima. h) para cada concentracin de sustrato (concentracin molar final en el ensayo). c) Grafique actividad fosfatasa cida v/s concentracin de sustrato (concentracin molar final en el ensayo). Indique si la enzima sigue cintica de Michaelis-Menten. d) Con los datos obtenidos realice un grfico de Lineweaver-Burk (dobles recprocos). Determine a partir del grfico los valores de Vmax y Km para pNPP. Ensayo 4: Inhibicin de la actividad enzimtica por fosfato inorgnico. Este experimento debe realizarse utilizando la misma dilucin enzimtica del ensayo 3 y en el mismo da de la determinacin del Km. Explique el porqu. Repita el experimento realizado para la determinacin de la Km, pero adems agregue 0.2 ml de fosfato de sodio 0.05 M (pH 4.8) a cada tubo. No olvide ajustar el volumen final de la reaccin a 4 ml con tampn citrato. a) Calcule la velocidad de reaccin para cada concentracin de sustrato. b) Grafique actividad fosfatasa cida (moles de p-nitrofenol/ml enzima.h) v/s concentracin de sustrato. c) Con los datos obtenidos construya un grfico de Lineweaver-Burk (dobles recprocos). Incluya adems los resultados obtenidos en la experiencia 4. Qu tipo de inhibicin observa? d) Calcule a partir de sus datos la constante de inhibicin (Ki) para fosfato inorgnico.

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