UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLAREAL- ING. AGROINDUSTRIAL

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FACTORES QUE ALTERAN LA ACTIVIDAD ENZIMATICA EN LA AGROINDUSTRIA

ENZIMAS

Son molculas de naturaleza proteica especializadas en la catlisis de las reacciones biolgicas. Son biocatalizadores.

LasEnzimasson ingredientes de gran utilidad en la industria de alimentos, se emplean como agentes activos que permiten transformar los alimentos durante el proceso y al mismo tiempo otorgarles las caractersticas sensoriales que los identifican. Entre las aplicaciones ms comunes se encuentran:

Queso madurado y semimadurado Queso fresco Pan y productos de panadera Pizzas listas para consumo Comidas preparadas listas para consumo Productos lcteos fermentados Vegetales encurtidos y/o fermentados Productos crnicos madurados Bebidas alcohlicasTodas las enzimas son protenas, tienen una estructura tridimensional globular y slo presentan actividad cuando tienen una conformacin espacial que permite establecer una descomposicin ptima de los aminocidos de su centro activo o cataltico.

Especificidad y mecanismo de accinUna reaccin qumicaA===>B tiene lugar porque cierto nmero de molculas A se encuentran con la suficiente energa como para alcanzar un estado activado, que denominamosestado de transicin, en el que es muy probable que se establezca o se rompa algn enlace qumico y se forme entonces el producto P.La velocidad de una reaccin ser proporcional a la concentracin de molculas en ese estado de transicin. Por eso hay 2 mtodos generales mediante los cuales se puede acelerar la velocidad de una reaccin qumica:

-Elevar la temperatura: pues se incrementa el n1de molculas capaces de alcanzar el estado de transicin (en muchas reacciones qumicas la velocidad se duplica cada 101C de aumento de la T).

-Aadir un catalizador: que se combina con losreaccionantesde forma transitoria y produce un estado de transicin con menor energa de activacin. (Nota: la energa libre de activacin es la diferencia entre la energa libre -G- de 1molde sustancia en el estado de transicin y la de 1molde sustancia en el estado inicial).

PRINCIPALES FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMATICA:Las enzimas incrementan de forma considerable la velocidad de las reacciones quecatalizan. Son 4 los factores que parecen contribuir al gran incremento de velocidad producido por las enzimas:

Concentracin del sustrato.-A mayor concentracin del sustrato, a una concentracin fija de la enzima se obtiene la velocidad mxima. Despus de que se alcanza esta velocidad, un aumento en la concentracin del sustrato no tiene efecto en la velocidad de la reaccin.Concentracin de la enzima.-Siempre y cuando haya sustrato disponible, un aumento en la concentracin de la enzima aumenta la velocidad enzimtica hacia cierto lmite.Temperatura.-Un incremento de 10C duplica la velocidad de reaccin, hasta ciertos lmites. El calor es un factor que desnaturaliza las protenas por lo tanto si la temperatura se eleva demasiada, la enzima pierde su actividad.pH.-El pH ptimo de la actividad enzimtica es 7, excepto las enzimas del estmago cuyo pH ptimo es cido.Presencia de cofactores.-Muchas enzimas dependen de los cofactores, sean activadores o coenzimas para funcionar adecuadamente. Para las enzimas que tienen cofactores, la concentracin del cofactor debe ser igual o mayor que la concentracin de la enzima para obtener una actividad cataltica mxima.

EJEMPLO: PARDEAMIENTO ENZIMATICO:Un claro ejemplo sobre los factores que alteran la actividad de las enzimas es justamente caso del pardeamiento enzimtico, ya que en empresas agroindustriales es vital para la elaboracin de productos que van dirigidos al comercio interior y exterior; por ende necesitamos alterar la actividad enzimtica. El pardeamiento enzimtico es una reaccin de oxidacin en la que interviene como substrato el oxgeno molecular, catalizada por un tipo de enzimas que se puede encontrar en prcticamente todos los seres vivos, desde las bacterias al hombre. En el hombre es la responsable de la formacin de pigmentos del pelo y de la piel. En los cefalpodos produce el pigmento de la tinta, y en los artrpodos participa en el endurecimiento de las cutculas del caparazn, al formar quinonas que reaccionan con las protenas,insolubilizndolas. En los vegetales no se conoce con precisin cul es su papel fisiolgico. El enzima responsable del pardeamiento enzimtico recibe el nombre de polifenoloxidasa, fenolasa o tirosinasa, en este ltimo caso especialmente cuando se hace referencia a animales, ya que en ellos la tirosina es el principal substrato. Tambin se ha utilizado el trmino cresolasa, aplicado a la enzima de vegetales. Se descubri primero en los championes, en los que el efecto de pardeamiento tras un dao mecnico, como el corte, es muy evidente.

Championes cortados, mantenidos a temperatura ambiente y fotografiada a distintos tiempos.

En el campo de los alimentos, el pardeamiento enzimtico puede ser un problema muy serio en frutas, championes, patatas y otros vegetales, y tambin en algunos crustceos, e incluso en la industria del vino, al producir alteraciones en el color que reducen el valor comercial de los productos, o incluso los hacen inaceptables para el consumidor. Estas prdidas son muy importantes en el caso de las frutas tropicales y de los camarones, productos trascendentales para la economa de muchos pases poco desarrollados. A pesar del nombre genrico de pardeamiento (browning en ingls), los colores formados son muy variables, marrones, rojizos o negros, dependiendo del alimento y de las condiciones del proceso. En algn caso, como en las pasas, otras frutas secas, la sidra, el t o el cacao, el pardeamiento enzimtico contribuye al desarrollo de los colores caractersticos de estos productos, aunque como se ha indicado, en otros muchos constituye un problema grave. Adems de la alteracin del color, los productos formados pueden reaccionar con las protenas, insolubilizndolas. Por otra parte, puede producirse tambin una prdida nutricional, ya que aunque la polifenoloxidasa no oxida directamente al cido ascrbico, esta vitamina puede destruirse al reaccionar con intermedios de la reaccin.

La reaccin de pardeamiento enzimtico

El pardeamiento enzimtico es un conjunto complejo de reacciones, que se inicia por la o las reacciones catalizadas de forma enzimtica. La primera de ellas, cuando el sutrato presente es un monofenol, es su transformacin en difenol. La segunda, la transformacin del difenol en quinona. En el caso de la tirosina (monofenol) se forma primeramente la dopa (difenol) y luego la dopaquinona (quinona). A partir de la formacin de la quinona, la reaccin progresa de forma espontnea. Las quinonas se pueden convertir en trifenoles por reaccin con el agua, y posteriormente oxidarse a hidroxiquinonas. Todas estas sustancias son muy reactivas, dando lugar a polmeros y reaccionando con otras sustancias presentes en el alimento, especialmente protenas. Los productos finales, llamados melaninas, son de color muy oscuro, o negro, e insolubles en agua. Estos polmeros tienen propiedades antimicrobianas, y podran ser un mecanismo de defensa de los vegetales contra infecciones.

Substratos Los sustratos de la reaccin pueden ser monofenoles o difenoles. La tirosina es el sustrato principal de la polifenoloxidasa en los crustceos, y tambin se encuentra presente en vegetales como la lechuga o en los championes. En los vegetales, el sustrato ms extendido es probablemente el cido clorognico, en el que el grupo fenlico se encuentra unido a un resto de azcar, que se encuentra, entre otros, en manzanas, peras, melocotones, ciruelas, uvas, aguacates y patatas. En algunos vegetales se encuentran adems DOPA, dopamina, p-cresol, cido cafeico y otros fenoles. Las polifenoloxidasas son tambin en muchos casos capaces de oxidar aminas aromticas para formar o-aminofenoles.

Control de la reaccin de pardeamiento El control natural de la actividad de la polifenoloxidasa se produce fundamentalmente mediante la compartimentalizacin de los sustratos. El enzima se encuentra en los plstidos y cloroplastos (en los vegetales superiores), y tambin en el citoplasma celular, mientras que los compuestos fenlicos que pueden servir de sustratos se acumulan en vesculas. Cuando se rompe la compartimentalizacin por un dao mecnico, como el triturado, corte o congelacin y descongelacin, la reaccin de pardeamiento se puede producir. Tambin se produce la inhibicin del enzima por los productos de la reaccin. Adems de manteniendo la compartimentalizacin, la reaccin de pardeamiento se puede frenar actuando sobre diferentes factores: Evitando el contacto del oxgeno con la superficie de corte Bajando al temperatura Reduciendo el pH Desnaturalizando el enzima Generalmente estos factores actan de forma combinada. As, el descenso de pH puede actuar inicialmente reduciendo la actividad del enzima, (su pH ptimo est entre 5 y 7), pero tambin, si es suficientemente bajo, desnaturalizndola de forma irreversible. Los reductores pueden actuar de varias formas, entre ellas revertiendo la reaccin de quinonas a fenoles. Tambin pueden actuar directamente sobre el centro activo del enzima, transformando el cobre 2 en cobre 1, que se disocia ms fcilmente. El sulfito y la cistena, adems de reaccionar con las quinonas reducindolas a difenoles, inactivan el enzima. Los sulfitos presentan el problema de su toxicidad diferenciada para algunas personas, un pequeo porcentaje de los asmticos, que pueden sufrir crisis severas con cantidades incluso inferiores a los lmites legales. Consecuentemente, existe una tendencia a reducir la utilizacin de sulfitos, unque no siempre es posible.

Un inhibidor muy eficiente la la actividad de la polifenoloxidasa de los crustceos es el cido brico, aunque actualmente est prohibido su uso, dados los riesgos de toxicidad. Se utilizan sulfitos. El cido ascrbico, es un inhibidor de la reaccin muy eficaz en principio, al reconvertir las quinonas en fenoles, pero la inhibicin es solamente temporal, al agotarse el cido ascrbico con el transcurso de la reaccin. Adems, posteriormente puede ocasionar problemas, ya que el dehidroascrbico formado puede dar lugar a una reaccin de pardeamiento especfica. Dependiendo de las condiciones de uso, el cido ascrbico puede tambin destruir el enzima al modificar las histidinas del centro activo por reacciones mediadas por radicales libres.Los agentes quelantes, capaces de eliminar los tomos de cobre del centro activo del enzima, y consecuentemente inactivarla, son inhibidores muy eficientes. Pueden utilizarse el EDTA, pirofosfato, y especialmente el cido ctrico, que combina el efecto de la acidez con la capacidad secuestrante de metales.

Algunas otras sustancias, como el cido benzoico y otros compuestos aromticos, actan reduciendo la actividad del enzima al competir con los sustratos. Y, por supuesto, la desnaturalizacin trmica, por ejemplo mediante escaldado con vapor, es un sistema muy eficaz, cuando puede utilizarse. Otras enzimas relacionadas Las lacasas son capaces de oxidar difenoles con los grupos OH en posicin para. Estas enzimas tienen un centro activo semejante al de la polifenoloxidasa, tambin con iones de cobre unidos a histidina, pero el mecanismo de actuacin es distinto. En la reaccin se generan radicales libres, que pueden inducir otras reacciones de oxidacin. Son glicoprotenas con un contenido importante de glcidos, y generalmente son muy poco especficas en cuanto a substrato. Se encuentran en algunos vegetales superiores, pero sobre todo en algunos hongos fitopatgenos. Pueden representar un problema en el caso de contaminacin de las uvas

Concentracin de sustratoAl principio un aumento de la concentracin de substrato produce un aumento rpido de la velocidad de reaccin, pero si se sigue aumentando la concentracin de substrato, la velocidad de reaccin comienza a disminuir; vemos que a muy altas concentraciones de substrato se observa que no cambia la velocidad de reaccin, se dice que los centros activos de la enzima se encuentran saturados. La velocidad de reaccin que se obtiene a esa alta concentracin de substrato se define como la velocidad mxima (vm) de la reaccin enzimtica bajo las condiciones especificadas. La concentracin de substrato [S], a la semivelocidad mxima de reaccin ( v ) se puede determinar de la figura y representa la constante de Michaelis o km, la cual es una caracterstica para cada enzima. La inversa de km, o 1/ km, mide aproximadamente la afinidad de la enzima por el substrato. Mientras ms pequeo sea el valor de km, mayor ser la afinidad de la enzima por el substrato. Si varias enzimas compiten en el metabolismo por el mismo substrato, ste ser transformado preferentemente por la enzima con mayor afinidad.

En el cuadro a continuacin se resumen las principales Enzimas empleadas a nivel industrial:GrupoNo. EC

-Amilasa (Bacillus licheniformis B. Subtilis, B. Amyloliquefaciens)Hidroliza almidn residual en jugo de caa. Aditivo empleado en cervecera obtencin de la malta

-Amilasa (Aspergillus oryzoae, A. Sojae, A. effusus)Obtencin de hidrolizados de almidn con alto contenido de maltosa. Aditivo en panadera

-Amilasa (malta, Bacillus polymixa circulans, B. cereus)Hidrolizados de almidn con alto contenido de maltosa. Aditivo empleado en cervecera obtencin de la malta

Pululanasa (Aerobacter aerogens, B. cereus)Hidrlisis de enlaces de almidn, enzima de destamificacin

Amiloglucosidasa(Aspergillus niger, A. oryzae, Rhizopus delemar)Obtencin de glucosa a partir de hidrolizados de almidn con amilasa. Aditivo en la elaboracin de cerveza ligera

Glucosa isomerasa(Streptomyces actinoplanis, S. missouriensis, S. ribigenosus, S. olivaceus, Bacillus coagulans)Obtencin de fructosa a partir de jarabes de glucosa

Ciclodextrina glucosil (Bacillus macerans, B. megaterium, B. circulans)Produccin de alfa, beta y gama ciclodextrinas a partir de hidrolizados de almidn con amilasa

Dextranasa(Penicillium funiculosum, P. lilacinum, C. gracialae)Eliminacin de dextranas en jugo de caa de azcar

-Galactosidasa (Mortierella vinacea)Hidrlisis de rafinosa en jugo de azcar de remolacha

(Saccharomyces cerevisaie, S. carlsbergensis)Produccin de azcar invertido

Isomaltulosa sitasa(Ervina rhapontici, R. rubrum)Produccin de isomaltulosa

Proteasa(Bacillus licheniformis: alcalasa, B. subtilis:neutrasa)Obtencin de hidrolizados protenicos. Hidrlisis y decoloracin de hemoglobina. Obtencin de gelatina. Modificacin de propiedades funcionales de protenas

Pronasa(Streptomyces griseus)Hidrlisis total de protenas

Papana (papaya)Ablandamiento de carne de res. Eliminacin de la turbidez en fro de la cerveza. Medicamento auxiliar digestivo

Lipoxigenasa (soya)Aditivo en panadera

-Glucanasas (Penicillium emersonii, Aspergillus niger, Bacillus subtilis)Aditivos en cervecera

Pectinasas(Aspergillus niger)Extraccin y clarificacin de jugos de fruta

Naringinasa(Aspergillus niger)Eliminacin del sabor amargo en jugo de toronja

Tanasa(Aspergillus oryzae, A. niger)Aditivo en la produccin de t instantneo

Renina (ternera,Mucor mihei, M. pusillus, Endothia parastica)Produccin de queso

Lactasa(Aspergillus niger, A. oryzae, Kluyveromyces fragilis)Hidrlisis de lactosa en leche y en suero de leche

Lisozima (clara de huevo, ltex de papaya)Aditivo en leches maternizadas. Aditivo como agente antibacteriano

Glucosa oxidasa (Aspergillus niger)En combinacin con catalasa en la eliminacin de glucosa en clara de huevo. Estabilizante de alimentos por eliminacin de oxgeno (mayonesa, bebidas)

5Fofodiesterasa(Penicillium citrinum)Produccin de mononucletidos portenciadores del sabor

Termolisina, Termoasa (Bacillus thermoproteoliticum)Proteasa usada en la sntesis enzimtica del Aspartame

Sulfidril oxidasa (leche)Eliminacin del sabor a cocido de leches esterilizadas

Lipasas (pregstricas,Mucor mihei, Aspergillus niger, Rhizopus oryzae)Maduracin acelerada de quesos. Reacciones de interesterificacin. Aditivo en alimentos para animales domsticos. Modificacin de grasas (produccin de sustituto de cocoa)

Aspartasa(E. coli)Produccin de cido mlico a partir de cido fumrico

Aspartato decarboxilasa(Pseudomonas dacunhae)Produccin de alinina a partir de cido asprtico

Fumarasa(Brevibacterium flavum, B. ammoriiagenes)Produccin de cido mlico a partir de cido fumrico

Aminotransferasa(Paracoccus denitrificans)Produccin de fenilalanina a partir del cido fenilpirvico

Fenilalania amino liasa(Rhodotorula glutinis)Produccin de fenilalanina a partir del cido cumrico

Catalasa(Aspergillus niger)Eliminacin de perxido de hidrgeno

Inulinasa (Aspergillus sp. Candida pseudotropicalis, K. marxianus)Hidlisis de polmeros de fructosa (inulina) de ciertos vegetales, como chicorea, alcachofa de Jerusaln, agave tequilero, etc.

Celulasas y Hemicelulasas(Trichoderma viride, T. reesei, Aspergillus niger)Hidrlisis de vegetales y residuos agrcolas. Aditivos en la alimentacin animal. Aditivos en procesos de extraccin de alginatos

Antocianinasa(A. niger)Decoloracin de jugos y vino

Enzima malolctica(Schizosaccharomyces pombe, Leuconostoc oenos, Lactobacillus delbruekii)Fermentacin secundaria del vino

Amonocilasas(Aspergillus oryzae)Resolucin de mezclas racmicas de aminocidos

Hidantoinasa (hgado de ternera)Produccin de D-aminocidos

Diacetil reductasa(S. cerevisiae)Eliminacin de diacetilo en cerveza

Limonato dehidrogenasa (Pseudomona sp., A. globiformis)Eliminacin de armargor en ctricos causado por la limonina, industrializacin jugo naranja

Alcohol oxidasa (levadura)Aplicaciones similares a la glucosa oxidasa con etanol en vez de glucosa

Pepsina, tripsina (animal)Hidrolizados protenicos. Medicamento auxiliar digestivo

Bromelina (pia)Medicamento auxiliar digestivo

Superxido dismutasa (bacterias marinas)Propuesta como antioxidante

Estaquiasa (Aspergillus niger)Eliminacin de compuestos que inducen flatulencia al consumir soya

Fuente: G. Garibay, Q. Ramrez, L. Mungua, 2014, Biotecnologa AlimentariaBIOQUIMICA I