AISLAMIENTO, EVALUACIÓN Y SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS TOLERANTES A ETANOL

Pontificia Universidad JaverianaDepartamento de Microbiología – Facultad de ciencias

Laboratorio Biotecnología Industrial06 de Marzo del 2013

Objetivo. Aislar cepas microbianas que puedan representar una alternativa, en la tolerancia a diferentes concentraciones de etanol y diferentes concentraciones de glucosa. Materiales y métodos. Al desarrollar la práctica se tomaron 10g de la muestra a analizar (uvas), esto se adiciono a un frasco que contenía 90mL de agua peptonada que correspondía a la dilución 10-1, a partir de esta se realizaron diluciones seriadas 10-2 y 10-3 adicionando 0.5mL a tubos que contenían 4.5mL de agua peptonada. De las diluciones 10-2 y 10-3 se realizaron siembras en superficie en el medio YPG y se llevo a incubación a 30°C por 48 horas. De la dilución 10 -2

se tomo 0.1mL y sembró en medio YPG a diferentes concentraciones de etanol y de la dilución 10-3 se sembró en glucosa (4%, 8% y 12%) luego se llevo a incubar 30°C por 48 horas. Resultados. Los resultados obtenidos fueron divididos, en resistentes a concentraciones de etanol y resistentes concentraciones de glucosa, obteniendo diversidad de microorganismos como levaduras, bacilos Gram negativos, bacilos Gram positivos y cocos Gram positivos. Conclusiones. La presencia de levaduras, bacilos y cocos presentes en las bebidas fermentadas masato, chicha, guarapo, uvas y miel de plaza tiene la capacidad de resistir dichas concentraciones de etanol y de glucosa, permitiendo su crecimiento y así su aislamiento.

Palabras claves: tolerancia, fermentación, glucosa y etanol

INTRODUCCIÓN

En la enología, o ciencia y arte de la producción de vinos, un microorganismo resistente a las altas concentraciones de etanol es esencial. Esto debido a que el microorganismo fermentador, quien es el productor del alcohol, tiene que

soportar estas condiciones, buscando una mayor producción o en términos económicos optimización de los procesos industriales, se ha generado toda una gama de investigaciones, para encontrar un microorganismo más apto, tolerante y resistente a

diferentes concentraciones de etanol y de glucosa. (1)

La composición de la membrana del microorganismo es el principal elemento de interacción entre este y el etanol, la membrana compuesta de glucanos, azucares, ácidos grasos y compuestos derivados del ergosterol; para el caso especifico de Saccharomyces cerevisiae, el ergosterol y los hopanoides son compuestos que le dan rigidez a la membrana y son los que directamente interactúan con los alcoholes como el etanol debido a su naturaleza química, el alcohol es un metabolito secundario que sale de la membrana de la levadura por difusión simple (2).

En esta práctica se usaron muestras fermentadas de (masato, chicha, guarapo, miel de plaza y uvas), para aislar microorganismos resistentes a diferentes concentraciones de sustratos (glucosa y etanol). En bebidas como el masato este es un concepto bastante importante, ya que esta bebida es de alta producción suramericana; su preparación es a base de altas cantidades de panela y la producción de etanol en esta bebida de tipo casero es significante (2).

MATERIALES Y MÉTODOS

Para el aislamiento e identificación de microorganismos tolerantes al etanol y a glucosa se evaluaron muestras de bebidas fermentadas (masato, chicha, guarapo, miel) y frutas (uvas).

Se pesaron 10g de las muestras anteriores y se adicionaron a 90mL de agua peptonada 0.1% (p/v) la cual correspondería a la dilución 10-1, a partir de esta se realizaron diluciones seriadas tomando 0.5mL y adicionándolos a tubos que contenían 4.5mL de agua peptonada 0.1% (p/v) 10-2 y 10-3 luego se tomaron 0.1mL y se realizo la siembra por superficie en agar YPG y se llevaron a incubar por 48 horas a 30°C. (3)

Luego para evaluar la tolerancia a etanol y a glucosa de los microorganismos se sembró de manera homogénea en superficie a partir de la dilución 10-2 en medio YPG con diferentes concentraciones:

Tolerancia a etanol.

Agar YPG con 4% de etanol.

Agar YPG con 8% de etanol.

Agar YPG can 12% de etanol.

Tolerancia a glucosa.

Agar YPG 4% de glucosa.

Agar YPG 8% de glucosa.

Agar YPG 12% de glucosa.

Estas siembras se llevaron a incubar por 48 horas a 30°C y finalmente se

realizo coloración de gram para identificar los microorganismos presentes en las muestras analizadas. (3)

RESULTADOS

Los resultados obtenidos en la práctica de laboratorio se presentan a continuación en la tabla 1 en la que se muestran el número de colonias presentes de cada muestra con su respectiva dilución, para las diferentes concentraciones de glucosa como para las de etanol.

En la coloración de gram se observaron diferentes morfologías de los microorganismos presentes en las muestras (masato, guarapo, chicha, miel y uvas) tales como levaduras, bacilos Gram positivos, bacilos Gram negativos y cocos Gram positivos.

En el recuento de UFC/g o mL Anexo 1 en las diferentes concentraciones de etanol al igual que en las de glucosa el resultado obtenido fue >104 ya que eran incontables.

Determinación y número de colonias de microorganismos tolerantes a diferentes concentraciones de etanol y de glucosa

  ETANOL/GLUCOSA  4% 8% 12%  N° DIL GRAM N° DIL GRAM N° DIL GRAM

UVAS

0/010 ²/⁻10 ³⁻

  0/010 ²/⁻10 ³⁻

  0/010 ²/⁻10 ³⁻

 

0/010 ²/⁻10 ³⁻

  0/010 ²/⁻10 ³⁻

  0/010 ²/⁻10 ³⁻

 

84/19510 ²/⁻10 ³⁻

Cocos Gram Negativos

0/20610 ²/⁻10 ³⁻

  0/13010 ²/⁻10 ³⁻

Levaduras

CHICHA

incont/incont10 ²/⁻10 ³⁻

Levaduras / Bacilos Gram

positivos0/incont

10 ²/⁻10 ³⁻

Levaduras / Bacilos Gram

positivos0/incont

10 ²/⁻10 ³⁻

Levaduras / Bacilos Gram

positivos

0/010 ²/⁻10 ³⁻

  0/010 ²/⁻10 ³⁻

  0/010 ²/⁻10 ³⁻

Cocos Gram positivos

incont/incont10 ²/⁻10 ³⁻

Levaduras / Bacilos Gram

positivos0/incont

10 ²/⁻10 ³⁻

Levaduras / Bacilos Gram

positivos0/incont

10 ²/⁻10 ³⁻

Levaduras / Bacilos Gram

positivos

incont/16110 ²/⁻10 ³⁻

Levaduras 0/21610 ²/⁻10 ³⁻

Levaduras / Cocos Gram

positivos0/269

10 ²/⁻10 ³⁻

Levaduras / Cocos Gram

positivos

336/36710 ²/⁻10 ³⁻

Levaduras / Bacilos Gram

positivos0/253

10 ²/⁻10 ³⁻

  0/19310 ²/⁻10 ³⁻

Levaduras / Bacilos Gram

positivosMASATO incont/incont 10 ²/⁻

10 ³⁻Levaduras / Cocos Gram

positivos

0/0 10 ²/⁻10 ³⁻

  0/incont 10 ²/⁻10 ³⁻

Levaduras / Bacilos Gram

positivos

incont/incont10 ²/⁻10 ³⁻

Levaduras / Cocos Gram

positivos0/0

10 ²/⁻10 ³⁻

Bacilos Gram positivos

0/26910 ²/⁻10 ³⁻

Levaduras / Cocos Gram

positivos

MIEL 131/10210 ²/⁻10 ³⁻

Levaduras 0/11910 ²/⁻10 ³⁻

Levaduras 0/19210 ²/⁻10 ³⁻

Levaduras

GUARAPO incont/incont10 ²/⁻10 ³⁻

Levaduras / Cocos

yBacilos Gram

positivos

0/incont10 ²/⁻10 ³⁻

Levaduras / Cocos

yBacilos Gram

positivos

0/incont10 ²/⁻10 ³⁻

Levaduras / Cocos Gram

positivos

Tabla 1. Determinación y número de colonias de microorganismos tolerantes a etanol y a glucosa (elaboración propia)

Discusión

En la actualidad es de gran importancia la identificación de microorganismos resistentes y productores de etanol, ya que como el bioetanol muchos compuestos son producidos por fermentación alcohólica de los azúcares presentes en materiales renovables. Dicha fermentación está influenciada por factores como la concentración de azúcares del sustrato y el microorganismo fermentador que se emplee. De acuerdo con reportes

previos cuando S. cerevisiae se encuentra cultivada a altas concentraciones de azúcar (menores a 30 – 40%), bajo condiciones de alta concentración de oxígeno disuelto, ya que la levadura convierte su metabolismo oxidativo a oxidoreductivo o fermentativo y se incrementa la producción de etanol (4)

En las bebidas fermentadas como en las uvas y la miel se observó crecimiento tanto en glucosa como en etanol, también se pudo observar como su crecimiento disminuía con

respeto a la dilución lo cual indica que fue correcta la metodología. En las muestras tanto las levaduras productoras de etanol crecen en las concentraciones de glucosa (4%, 8% y 12%) y resisten las concentraciones de etanol (4%, 8% y 12%) al igual que los bacilos, sin embargo en unas muestras no se presentó ningún tipo de crecimiento ver (tabla 1).

En cuanto a la las muestras de masato, chicha y guarapo se observó crecimiento de levaduras salvajes las cuales en los procesos de fermentación sirven para la elaboración del vino iniciando dicho proceso, lo cual muestra que soportan diferentes concentraciones de etanol, los bacilos Gram negativos, bacilos Gram positivos y cocos Gram positivos posiblemente son pertenecientes al grupo de bacterias acido lácticas o contaminantes ya que ellos no realizan procesos de fermentación que den como resultado etanol, simplemente aprovecharon las concentraciones de glucosa para desarrollarse.

La conservación de alimentos fermentados naturalmente como el masato constituye parte importante de la alimentación de los pobladores de la Amazonía peruana. El masato es una bebida tradicional, constituye el substrato principal para el establecimiento de una microflora mixta ambiental, incluyendo las bacterias lácticas como responsables de la fermentación maloláctica, láctica y otras propiedades de interés industrial, (5)

Entre las bacterias acidolacticas encontramos los lactobacilos que son productores de sustancias inhibitorias contra microorganismos indeseables, lo que permite una mayor preservación natural del producto. En particular especies de Lactobacillus productoras de sustancias antimicrobianas y tolerantes al etanol, se convierten por lo tanto en una alternativa viable para el desarrollo de un producto inocuo de alta calidad que pueda cumplir con los estándares más exigentes. (5)

La composición lipídica de la membrana de las levaduras donde se puede encontrar concentraciones de entre 40%-80% de esteroles y fosfolípidos insaturados según la especie de la levadura, generan una alta rigidez y disminución de la permeabilidad de la membrana favoreciéndose de esta manera el paso de la glucosa al interior de la célula; así mismo, los esteroles evitan

la cristalización de las cadenas de ácidos grasos, lo cual es un factor de adaptación de las levaduras al etanol por composición lipídica de la membran en esteroles y ácidos grasos de cadena larga. (Ilustración 1)

Conclusión

Al trabajar con muestras (masato, chicha, guarapo, miel y uvas) se observo que la presencia de levaduras, bacilos, cocos presentes tanto en las bebidas fermentadas como en las uvas, tiene la capacidad de resistir dichas concentraciones de etanol y de glucosa, permitiendo su aislamiento.

Bibliografía

1. Mesas, J. M; Alegre, M. T. El papel de los microorganismos en la elaboración del vino. Universidad de Santiago de Compostela.

2. Charles W. Bamforth. Alimentos, fermentación y microorganismos. Editorial. Acribia, S.A. Pag 31-34.

Ilustración 1. Adaptación de la Membrana: Aumento de Ácidos grasos de cadena larga

3. Pedroza A., Matiz A., Quevedo B., Rodríguez A., Manual de introducción a la microbiología. Editorial Pontificia Universidad Javeriana.2007. Bogotá.

4. Peña C, Arango R. EVALUACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE ETANOL UTILIZANDO CEPAS RECOMBINANTES DE Saccharomyces cerevisiae A PARTIR DE MELAZA DE CAÑA DE AZÚCAR. Dyna rev.fac.nac.minas vol.76 no.159 Medellín Sept./Dec. 2009

5. Sedano J, Selección de cepas nativas de lactobacillus con actividad inhibitoria y tolerantes al etanol aisladas de “masato”. Universidad nacional mayor de San Marcos, Facultad de ciencias biológicas, Lima – Peru 2006

http://www.utu.edu.uy/Escuelas/departamentos/canelones/vitivinicultura/Bioquimica%20Enologica/Teoricos/Tolerancia%20al%20etanol.pdf