Trabajos Originales

Estandarizacin de valores normales de linfocitos CD3, CD4, CD8 y relacin CD4/CD8 por citometra de flujo en individuos sanos colombianos

Luz M. Avila, Carmen P. Gmez, Ruby S. Ros, Ernesto Laverde

Objetivo: estandarizar valores de referencia de CD4/ CD3 y CD8/CD3 por citometra de flujo (FACS) y usar estos valores de referencia para el monitoreo de clulas T CD4(+) en pacientes con infeccin por VIH, y comparar la tcnica de FACS con la de inmunofluorescencia. Sujetos de estudio: cien adultos clnicamente sanos y serolgicamente aptos para ser donantes de sangre entre los 18 y 45 aos de edad. La toma de la muestra fue realizada entre las 8:00 a.m. y las 10:00 a.m.

Mtodos: citometra de flujo para recuentos absolutos de CD4, CD8 y CD3 e E inmunofluorescencia directa (IFD) para CD4 y CD8 Resultados: los valores absolutos de CD4/CD3 variaron entre 338 y 1.548, y los de CD8/CD3 entre 800 y 1.119. La relacin CD4/CD8 oscil en un amplio rango, entre 0.69 a 2.5. Al comparar ambas tcnicas se observ una gran variacin en los resultados. Conclusiones: los rangos de variacin para CD4/CD3 y CD8/CD3 son muy amplios en la poblacin normal estudiada y son ms bajos que los informados en la literatura. No son comparables los valores obtenidos por las tcnicas de FACS e IFD.

Introduccin n los linfocitos T, una de las clulas efecto-ras de la respues-ta inmune, hay dos grandes marcadores

que permiten la subdivisin en dos poblaciones funcionalmente distintas: la molcula CD4 que se expresa en la mayora de los linfocitos T cooperadores o ayu-dadores y la molcula CD8, mar-cador principal de los linfocitos T citolticos o citotxicos (1). La medicin de linfocitos CD4 y de subpoblaciones de linfo-citos ha contribuido de manera muy importante para entender la fisiopatologia de la enferme-dad por el virus de inmunodefi-ciencia humana (VIH) (1-3), y es requerida por el clnico para un mejor seguimiento de estos pacientes. Varios autores han in-formado una ms rpida progre-sin de la infeccin por VIH asintomtica a SIDA, cuando existen menos de 200 clulas CD4 por mm3 (3). La medicin de los CD4 se usa para clasifi-car la infeccin, para determi-nar la eleccin de protocolos

Luz Mabel Avila, Carmen Patricia Gmez, Ruby Estella Ros: Laboratorio de Inmunologa Clnica Hospital Militar Central; Dr. Ernesto Laverde: Jefe Servicio de Medicina Interna Hospital Militar Central. Santa Fe de Bogot.

158 Acta Mdica Colombiana Vol. 21 N 4 ~ Julio-Agosto ~ 1996

LEONICLine

Carolina LeonLine

Carolina LeonLine

Valores normales de linfocitos

c l nicos de manejo y para monitorear la eficiencia de la terapia antiviral, pues existe co-rrelacin entre el nmero de CD4, la progresin de la infec-cin y la aparicin de enferme-dades oportunistas y neoplasias. Sin embargo, no todos los in-formes estn de acuerdo con este comportamiento (4). La tipificacin de los linfocitos CD4 y CD8 se realiza actual-mente en nuestro medio por la tcnica de inmunofluorescencia y el resultado es el producto de la cuenta de leucocitos totales y de la fraccin (porcentaje) de linfocitos medidos por tcnicas manuales o automatizadas; el re-sultado se obtiene en porcentaje de marcacin con anticuerpos monoclonales unidos al isotio-cianato de fluorescena. Esta tcnica es tediosa e impre-cisa, inclusive con anticuerpos monoclonales fluorescentes y microscopios especiales. Ade-ms, tiene gran riesgo de conta-minacin para el profesional de la salud que la ejecuta. La tcnica de citometra de flujo (FACS) (5) permite analizar las propiedades de las clulas espe-cficas al pasar a travs de un orificio a gran velocidad -pudien-do analizar una suspensin celu-lar para diversas medidas en for-ma simultnea, a la velocidad de casi 5.000 clulas/sg-, al combi-nar el disgregador de luz y la medicin del volumen coulter con los anticuerpos monoclonales, que adems pueden identificar de manera simultnea una clula marcndola con dos fluoro-cromos. El encuentro de la clula con el haz de lser es interpre-tado por el sistema en forma di-ferente, estrechamente relaciona-do con el tamao celular y con su granularidad. El nivel de cambio

en la luz es una caracterstica particular de cada poblacin de clulas y la medida de ese valor permite la identificacin de cada clula. La molcula fluorescente se une al anticuerpo monoclonal, absorbiendo la luz del lser y por consiguiente emitiendo luz en otra longitud de onda; este fen-meno facilita la identificacin de subgrupos especficos dentro de las grandes poblaciones celulares. La posibilidad de analizar gran-des nmeros de clulas en for-ma cuantitativa y reproducible, aumenta significativamente la confianza y la precisin de los resultados. Existe una variacin circadiana del nmero de linfocitos CD4 (6), que es ms bajo en las maanas (800 a 1.100) y ms alto en las noches (2.200); este fenmeno puede acentuarse por distintas circustancias, no todas de fcil identificacin y control, como el estrs (7-8), el ejercicio (9), los glucocorticoides exgenos, los ni-veles de cortisol en el suero, las relaciones sexuales y otras (10-13) Malone y cols (14) estudiaron 16 pacientes con SIDA y 8 indi-viduos normales, a los cuales les tomaron cuatro diferentes mues-tras de sangre durante tres das, y encontraron una diferencia importante en la cuenta total de CD4 (+) entre las horas de la maana y la tarde, pero no en el porcentaje de CD4/CD3. El propsito de este estudio es estandarizar los valores de refe-rencia CD4/CD3 y CD8/CD3 en individuos colombianos sanos por la tcnica de FACS, usar es-tos valores de referencia para el monitoreo de clulas CD4(+) en pacientes con infeccin por VIH y comparar la tcnica de inmuno-fluorescencia con la de FACS.

Material y mtodos Sujetos Se estudiaron 100 individuos normales, 60 hombres y 40 mu-jeres, donantes entre 18 y 45 aos de edad, seleccionados en el Banco de Sangre del Hospi-tal Militar Central segn crite-rios de inclusin establecidos (Tabla 1). La toma de la mues-tra fue realizada entre las ocho y las diez de la maana. En todos se midieron los CD4/ CD8 por FACS y en 15 tambin por inmunofluorescencia, con el fin comparar las dos tcnicas.

Mtodos Citometra de flujo: se uso el citomtro de flujo Facscount de Becton Dickinson para recuen-tos absolutos de CD4/CD8/CD3. Se tomaron 5 ml de sangre a cada individuo, con EDTA. Se adicionaron 50 l de sangre total a cada tubo CD3/CD4 y CD3/CD8, se incubaron una hora a temperatura ambiente en com-pleta oscuridad. Se procesaron controles zero, bajo, medio y alto a los cuales se agreg sangre total de un indivi-duo clnicamente sano y se con-tinu el procedimiento como la muestra. Se adicion una solucin fijadora (formaldehdo) a cada tubo y se incub por 30 minutos a tempe-ratura ambiente en completa os-curidad. Previo a cada paso se agit en el vrtex. Para los controles, una vez cumplido el perodo de in-cubacin se adicion: - CD3/CD4 Control Zero - CD3/CD8 Control Bajo - CD3/CD4 Control Medio - CD3/CD8 Control Alto Se mezcl y se ley inmediata-mente. Una vez pasados los con-troles se leen las muestras.

Acta Med Colomb Vol. 21 N 4 - 1996 159

L.M. Avila y cols.

Inmunofluorescencia directa: Separar los linfocitos a partir de 5 a 10 ml de sangre perifrica heparinizada, mediante gradiente de Ficoll-Hypaque (d: 1077). La-var con PBS y resuspender en RPMI + 5% de SBF. Contar el nmero de clulas recuperadas por ml en cmara de Neubawer. En cada tubo, como marcadores linfocitarios se vayan a determi-nar, colocar 1.000.000 de clu-las por tubo. Centrifugar a 1.800 rpm por cinco minutos. Elimi-nar el sobrenadante y aadir 5l del anticuerpo monoclonal mar-cado con fluorescencia corres-pondiente (Ref. Cirumedics). In-cubar durante 30 a 45 minutos a 4C. Aadir 1 a 2 ml de RPMI + SBF al 5% y centrifugar a 1.800 rpm por cinco minutos. Elimi-nar el sobrenadante, resuspender cada botn y aadir una gota de RPMI + 5% SBF, resuspender una vez ms cada tubo y tomar 5 a 10 l sobre la lmina. Ex-tender suavemente con una laminilla. Leer en el microsco-pio de inmunofluorescencia y determinar el 1 % de cada subpo-blacin.

Anlisis estadstico El anlisis estadstico se realiz para un intervalo de confianza de 95% y con una distribucin normal Z.

Resultados Al analizar un total de 100 indi-viduos clnicamente sanos que

cumplieron los criterios de selec-cin anteriormente mencionados, se obtuvieron valores absolutos de linfocitos CD4/l entre 338 y 1.548, con una media de 943 y de CD8 entre 80 y 1.169, con una media de 624 (Tabla 2). La relacin de CD4/CD8 en este estudio comprende un rango

160

Valores normales de linfocitos

amplio, que oscila entre 0.69 y 2.5. Al clasificarla segn sexo, vara entre 0.69 y 2.6 en hom-bres y entre 0.66 y 2.5 en muje-res, con medias de 1.6 y 1.58, respectivamente (Tabla 2). Al comparar la tcnica de in-munofluorescencia con la de FACS, se observ una gran va-riacin en los resultados de los valores absolutos de CD4 y CD8 y de la relacin de CD4/ CD8 (Tabla 3).

Discusin Se observ que en individuos normales y clnicamente saluda-bles, la variacin de los valores absolutos de linfocitos es muy amplia, con cifras de CD4 entre 338 y 1.612. Este dato podra dar pie para reevaluar el inicio de la terapia antirretroviral en pacientes infectados por VIH, es-tablecida con cifras inferiores a 500 clulas CD4/l, pues parece que en nuestra poblacin estos recuentos celulares son ms ba-jos. Al comparar las dos tcnicas uti-lizadas, FACS e inmunofluo-rescencia directa, se observ una gran diferencia en los resulta-dos, lo cual nos indica que no deben ser analizados en forma paralela y reafirma la importan-cia de hacer el monitoreo de los individuos seropositivos as como el seguimiento de quienes reciben terapia antiviral con la tcnica de FACS, que presenta ms ventajas en cuanto a preci-sin, exactitud, sensibilidad, especificidad y que, adems, dis-minuye el ndice de riesgo de contaminacin para el profesio-nal que la realiza. Se debe considerar que cada pa-ciente tiene diferentes valores normales, que slo deben ser

comparados con informes ante-riores de l mismo, teniendo en cuenta qu tcnica se utiliz pre-viamente para esta cuantifica-cin, ya que no se puede realizar una equivalencia entre las dife-rentes tcnicas.

Conclusiones Los rangos de variacin de CD4/ CD3 y de CD8/CD3 son muy amplios en la poblacin normal colombiana. No son comparables los valores obtenidos por las tcnicas de FACS y de inmunofluorescencia directa.

Summary Lymphocytes CD4 and CD8 subpopulations are affected by the HIV infection and their quan-tification is very valuable for the patient's followup. Normal val-ues vary widely, because of methodological differences. The purpose of this study was to es-tablish normal values for T lym-phocytes in healthy Colombian patients and to compare these findings when performed by flow cytometry and immunofluores-cence techniques. One hundred healthy adults serologically apt to be blood donors were studied. Absolute values for CD3/CD8 varied between 800 and 1.119 and the relation CD4/CD8 be-tween 0.69 and 2.5. A great varia-tion in the results was found when comparing both tech-niques. Reference values for our population are lower than those traditionally reported and they must be taken into account to reevaluate the control of HIV infected patients.

Agradecimientos A Laboratorios Glaxo e Inmunolab por la dona-cin de los reactivos utilizados en este estudio.

Referencias 1. Brinchmann J E , Vartda F, Thorsby E.

T Lymphocyte Subset Changes in Human Immunodeficiency Virus Infection. J Acq Inm Synd 1989; 2: 398-403.

2. McCune J M . HIV-1: the infective pro-cess in vivo. Cell 1991; 64: 351.

3. Giorgi JV, Fahey J L , Smith DC, Hultin LE, Cheng H, Mitsuyasu RT, Detels R. Early effects of HIV on CD4 lymphocytes in vivo. J Immunol 1987; 138: 3725-3730.

4 . Castro KG, Valdiserri RO, Curran J W . Perspectives on HIV/AIDS Epidemiology and Prevention from the Eigh th Interna-tional Conference on AIDS. Am J Public Heath 1992; 82:1465-1470.

5. Landay AL, Auer R, Bach BA, Borowitz M, Civin CI, Duque RE, et al. Clinical Applications of Flow Citometry: Quality Assurance and Immunophenotyping of pe-ripheral Blood Lymphocytes. NCCLS Document H42 1992; 12: 1-75.

6. Westermann J, Reinhard P, Lymphocite subsets in the blood: a diagnostic window on the lymphoid system? Immunol Today 1990; 11:406-410.

7. Khansary D, Murgo AJ , Faith RE. Ef-fects on stress on immune system. Immu-nol Today 1990; 11: 170-175.

8. Maisel AS. Knowlton KU. Fowler P. Rearden A, Ziegler M G . Motutsky; HJ . et al. Adrenergic control of c i r c u l a t i n g -phocyte subpopulations. J Clin Invest 1990; 85: 462 -467 .

9. Schawarz L. Immunorregulatory hormo-nes circulating lymphocyte subpopulation before and after endurance exercise of dif-ferent intensities. Int Sports Med 1992; 12: 359-366.

10. Hulstaert F, Hannet L, Deneys V, et al. Age related changes in human blood Lym-phocyte subpopulations. Clin Immunol Immunophatol 1994; 70: 152-158.

11. R o m e r o S M C , Ros R, Fuentes M, Franco I, Londoo JD, Juliao H, Valle R. Estimacin de los niveles de pobla-ciones de linfocitos CD4 y CD8 en indi-viduos fumadores y no fumadores. Labimed 1995; 13: 6-10.

12. Weiss SH, Klein CW, Mayor R. Bes ra J, Denny TN. Idiophatic CD4+ T Lympho-cytopenia. Lancet 1992; 340: 608-609.

13. Soriano V, Hewlett I, Heredia A, Pe-dreira J. Gutirrrez M, Bravo R, Cas-tro A, Gonzalez Lahoz. Idiopathic CD4+ T-Lymphocytopenia. Lancet 1992; 340-(Sep): 607-608.

14. Malone JL, Simms TE, Gray GC, Wag-ner KF, Burge JR, Burke DS. Source of variabiliaty in repeat T- Helper lympho-cytes counts from immunodeficiency vi-rus type I infected patients. Total lympho-cyte count fluctuation diurnal cycle are important. J Acquired Immun Defic Synd 1990; 3: 144-151.

Acta Med Colomb Vol. 21 N 4 - 1996 161