Post on 28-Jan-2016
SolubilidadEs un balance entre atracciones
1. Atracciones disolvente-disolvente
2. Atracciones soluto-soluto
3. Atracciones disolvente-soluto
Habrá disolución sólo si 3 es mayor que 1 y que 2
Solubilidad de proteínas y separaciones por precipitación
• Solubilidad de proteínas en fuerza iónica baja• Precipitación a fuerza iónica alta• Precipitación con disolventes orgánicos• Precipitación con polímeros• Precipitación por afinidad• Precipitación por desnaturalización selectiva
– pH– disolventes orgánicos– temperatura
Scopes, R. K. Protein purification (1994)
Precipitación a fuerza iónica baja “Salting in”
La solubilidad de las proteínas es resultado de interacciones polares con el disolvente, interacciones iónicas con las sales presentes y fuerzas electrostáticas repulsivas entre moléculas con cargas del mismo signo.
+ ++
+ ++
+ ++
- --
+ --+
+ -
+ ++
- --
+ ++
- --
Repulsión
Atracción
Poca atracción/repulsiónen el P.I.
Poca atracción/repulsiónentre agregados heterogéneos
Precipitación a fuerza iónica baja “Salting in”
Este comportamiento es útil en experimentos de diálisis y debe considerarse durante la filtración en gelLa precipitación isoeléctrica se puede modificar agregando sales que afecten el pH isoeléctrico
Precipitación a fuerza iónica alta “Salting out”
El fenómeno de precipitación a fuerza iónica alta depende principalmente de la hidrofobicidad de la proteína
Se puede entender como un equilibrio de competencia entre la sal y la proteína por el agua de solvatación
P·(H2O)n + AB P + A+·(H2O)x + B-·(H2O)x
Precipitación a fuerza iónica alta “Salting out”
La solvatación de una región hidrofóbica es un fenómeno demandante desde el punto de vista entrópico
Precipitación a fuerza iónica alta “Salting out”
Precipitación a fuerza iónica alta “Salting out”
¿Por qué (NH4)2SO4?
Puntos a considerar
• Efectividad de la precipitación
• Interacción directa con la proteína
• Influencia del pH en la distribución de especies
• Solubilidad de la sal
• Hºdis
• Densidad de la disolución concentrada
• Precio
Precipitación a fuerza iónica alta “Salting out”
Serie liotrópica o serie de Hofmeister
SCN– < ClO4– < NO3
– < Br– < Cl– < acetato < SO4
2– < PO43–
NH4+ > K+ > Na+
¿Por qué?Hofmeister, F. (1888) Arch. Exp. Pathol. Pharmakol. 24, 247-260.
Precipitación a fuerza iónica alta “Salting out”
¿Cuánto pongo?
Precipitación a fuerza iónica alta
“Salting out”
Log S = A - m[(NH4)2SO4]
Precipitación por disolventes
¿Qué disolventes?
¿Qué hacen los disolventes?
¿Se desnaturalizan las proteínas?
Precipitación por disolventes
¿Cuánto disolvente?
Precipitación por disolventes
¿Desnaturalización, la puedo usar?
Precipitación por afinidad
Agregado lineal formado por un anticuerpo policlonal y una proteína monomérica
Agregado lineal formado por un anticuerpo y una proteína dimérica
Agregado tridimensional formado por anticuerpos y una proteína tetramérica
Precipitación por desnaturalización selectiva
Precipitación por desnaturalización selectiva
Con temperatura