Proteínas: Proteínas:

Métodos para su Métodos para su

EstudioEstudio

Propiedades Espectroscópicas

• Todos los aminoácidos absorben luz en la región infraroja

• Sólo Phe, Tyr, & Trp absorben UV

• Absorbancia a 280 nm es un buen diagnóstico para aminoácidos

• Espectros en NMR son característicos de cada residuo en una proteína, y medidas de alta resolución en NMR pueden usarse para elucidar la estructura 3D de las proteínas

Espectrofotometría

Separación de Aminoácidos

• Mikhail Tswett, botánico ruso, separó pigmentos coloreados de plantas por ‘cromatografía’

• Existen muchos métodos cromatográficos para separar mezclas de aminoácidos– Cromatografía de intercambio iónico– Cromatografía líquida de alta performance

(HPLC)

Cromatografía de Intercambio Iónico

Perlitas del polímero

tienen grupos cargados

positiva (int. aniónico) o

negativas (int. catiónico)Mezcla de proteínas es

añadida a columna con

intercambiador (cat)

Proteínas se mueven por la columna a velocidades determinadas por su carga neta al pH que se está

usando. En el intercambiador catiónico, las proteínas con mayor carga negativa se moverán más

rápido y eluirán antes

Intercambiador aniónico:

p. ej. Dietil aminoetil

celulosa (DEAE)

Intercambiador catiónico:

p. ej. Carboximetil –

celulosa (CM)

Intercambiador catiónico:La resina tendrá carga negativa e intercambiará cationes (p. ej. Na+) por un aminoácido cargado positivamente

p.ej. Carboximetil celulosa

Biochemistry 2/e - Garrett & Grisham

Copyright © 1999 by Harcourt Brace & Company

Biochemistry 2/e - Garrett & Grisham

Copyright © 1999 by Harcourt Brace & Company

Cromatografía de Partición / Tamiz molecular

Mezcla de proteínas es añadida a la Mezcla de proteínas es añadida a la

columna la cual contiene un polímerocolumna la cual contiene un polímero

Moléculas de proteínas se separan en base Moléculas de proteínas se separan en base

a tamaño; las más grandes es añadida a la a tamaño; las más grandes es añadida a la

columna la cual cpasan más libremente y columna la cual cpasan más libremente y

aparecen en las primeras fraccionesaparecen en las primeras fracciones

Cromatografía de Afinidad

Electroforesis

Electroforesis en geles de poliacrilamida

Luego de la tinción : con nitrato de plata o Azul de Coomassie

Determinación el peso molecular de una proteína “problema”

Separación de proteínas en dos dimensiones:

1: En base a su punto isoeléctrico

Segundo: En base a su peso molecular

Arbol filogenético basado en secuencia de una

proteína/gen conservado

Insulina consiste de dos cadenas polipeptídicas, A y B, mantenidas unidas por dos puentes disulfuro. La cadena A tiene 21 residuos y la cadena B tiene 30 residuos.

La secuencia mostrada es la de la insulina bovina.

Determinando la Secuencia Una Estrategia de Ocho Pasos

• 1. Si hay más de una cadena polipeptídica, separarlas.

• 2. Romper (reducir) puentes disulfuro• 3. Determinar composición de c/ cadena• 4. Determinar residuos N- y C-terminal• 5. Cortar c/cadena en fragmentos

pequeños y determinar su secuencia

Determinar la Secuencia Una Estrategia de Ocho Pasos

• 6. Repetir paso 5, usando procedimiento de corte diferente para generar un

juego diferente de fragmentos • 7. Reconstruir la secuencia de la proteína

a partir de la secuencia de fragmentos que se sobreponen

• 8. Determinar las posiciones de los puentes disulfuro

Especificidad de Endopeptidasas

Enzima Fuente Especificidad

Tripsina Páncreas bovino Rn-1 = +: Arg, Lys; Rn ‡ Pro Quimiotripsina Pancreas bovino Rn-1 = grandes: Phe, Trp, Tyr

Rn ‡ ProElastasa Páncreas bovino Rn-1 pequeños neutros:

Ala, Gly, Ser, Val, Rn ‡ ProTermolisina B.thermoproteolyticus Rn Ile, Met, Phe, Trp, Tyr, Val

Rn-1 ‡ ProPepsina Mucosa gástrica bovina Rn=Leu, Phe, Trp,Tyr, Rn-1 ‡ProEndopeptidasa V8 Staphylococcus aureus Rn-1 ‡ Glu

Especificidad de exopeptidasas

Enzima Fuente Especificidad

Carboxipeptidasa A Páncreas bovino Rn ‡ Arg. Lys, Pro; Rn-1 ‡ ProCarboxipeptidasa B Páncreas bovino Rn = Arg, Lys; Rn-1 ‡ ProCarboxipeptidasa C Hojas cítrico Todos los residuos C-terminal

libres; pH óptimo = 3.5Carboxipeptidasa Y Levadura Todos los residuos C-terminal

libre, pero lento con Rn = GlyLeucine aminopeptidasa Riñón porcino R1 ‡ ProAminopeptidasa M Riñón porcino Todo residuo N-terminal libre

Paso 1:Separación de cadenas

• Interacción entre subunidades depende de fuerzas débiles

• Separación es llevada a cabo con :- pH extremo - 8M urea- 6M guanidina HCl- concentración alta de sales

(generalmente sulfato de amonio)

Paso 2:

Corte de Puentes Disulfuro

• Oxidación de Acido Perfórmico

• Agentes reductores Sulfhidrílicos

- mercaptoetanol

- ditiotreitol or ditioeritritol

- para prevenir recombinación, seguir con agente alquilante como iodoacetato

Paso 3:Determinar Composición de Aminoácidos

• Cromatografía de intercambio iónico

Paso 4:Identificar residuos N- y C-terminal

• Analisis N-terminal :– Reactivo de Edman (PTI)

– Tratamiento con PTI genera derivados de los aminoácidos que son Feniltiohidantoínas

– Libera al a.a. N-terminal y deja cadena intacta

• Otros compuestos:– Cloruro de dansilo (con aminas primarias,

también con e-amino de Lys)

– Ventaja: producto es fluorescente y puede detectarse en concentraciones muy bajas

Reactivo de Edman

Paso 4:

Identificar residuos N- y C-terminal

• Análisis C-terminal– Análisis enzimático (carboxipeptidasa)

– Carboxipeptidasa A corta cualquier residuo excepto Pro, Arg, y Lys

– Carboxipeptidasa B (pancreas de cerdo) sólo actúa en Arg y Lys

Pasos 5 y 6:

Fragmentación de las cadenas

• Fragmentación Enzimática– tripsina, quimiotripsina, clostripaina,

proteasa de staphylococcus

• Fragmentación Química– Bromuro de cianógeno

Fragmentación Enzimática

• Tripsin - corta en lado C de Lys, Arg

• Quimiotripsina – lado C de Phe, Tyr, Trp

• Clostripaina - como tripsina, pero ataca a las Arg más que a las Lys

• Proteasa de Staphylococcus– Lado C de Glu, Asp en buffer fosfato

– Específico para Glu en buffer acetato o bicarbonato

Corte por Bromuro de CianógenoCorte por Bromuro de Cianógeno

Paso 7:Reconstruyendo la Secuencia

• Usar dos o más agentes fragmentadores en experimentos separados

• Secuenciar todos los péptidos producidos (generalmente por degradación de Edman)

• Comparar y alinear péptidos con secuencias que se sobrepongan para determinar la secuencia de la cadena polipeptídica original

Reconstruyendo la Secuencia

Comparar corte por tripsina y proteasa de staphylococco en un péptido típico :

• Corte por Tripsina :

A-E-F-S-G-I-T-P-K L-V-G-K

• Proteasa de Staphylococcus:

F-S-G-I-T-P-K L-V-G-K-A-E

Reconstruyendo la Secuencia

• The correct overlap of fragments:

L-V-G-K A-E-F-S-G-I-T-P-KL-V-G-K-A-E F-S-G-I-T-P-K

• Secuencia Correcta:

L-V-G-K-A-E-F-S-G-I-T-P-K