Efecto del surfactante sobre la fibrosis pulmonar: estudios in

vitro e in vivo

Efecto del surfactante sobre la fibrosis pulmonar: estudios in

vitro e in vivoDr. Luis Guillermo Vázquez de Lara Cisneros.

SUSTANCIA TENSIOACTIVA PULMONAR (SURFACTANTE)SUSTANCIA TENSIOACTIVA

PULMONAR (SURFACTANTE)

Complejo lipoproteínico producido por los neumocitos tipo II, destaca en su composición un alto contenido de DPPC y la presencia de apoproteínas específicas

Complejo lipoproteínico producido por los neumocitos tipo II, destaca en su composición un alto contenido de DPPC y la presencia de apoproteínas específicas

Composición del Surfactante Pulmonar (SP)

Composición del Surfactante Pulmonar (SP)

1 Y. Y. Zuo, et al., "Current perspectives in pulmonary surfactant--inhibition, enhancement and evaluation," Biochim. Biophys. Acta 1778(10), 1947 (2008).

PC insaturada33%

DPPC36%

PG10%

PE3%

PI1%

SPM2%

Chol2%

DG1%

Lyso-bis-PA2%

Proteinas 10%

PROTEÍNAS ESPECÍFICAS DEL SURFACTANTE

PROTEÍNAS ESPECÍFICAS DEL SURFACTANTE

• HIDROFÓBICAS• SP-B• SP-C

• HIDROFÍLICAS• SP-A• SP-D

• HIDROFÓBICAS• SP-B• SP-C

• HIDROFÍLICAS• SP-A• SP-D INMUNIDAD NATURAL

Sistema del surfactanteSistema del surfactante

• Función biofísica– Disminuye la tensión

superficial– Evita el colapso

alveolar– Estabiliza el alveolo– Disminuye el trabajo

respiratorio

• Función biofísica– Disminuye la tensión

superficial– Evita el colapso

alveolar– Estabiliza el alveolo– Disminuye el trabajo

respiratorio

2P

r

Ley de Laplace

Diámetro de la burbujaTe

nsi

ón

su

pe

rfic

ial m

N/m

2

Sistema del surfactanteSistema del surfactante

• Función en la inmunidad:– Fracción lípida

• Bacteriostático

– SP-D• Aglutinación de bacterias

– SP-A• Opsonización de bacterias• Aumenta la fagocitosis por los macrófagos alveolares.• Modulación de la secreción de citocinas en macrófagos y

linfocitos alveolares

• Función en la inmunidad:– Fracción lípida

• Bacteriostático

– SP-D• Aglutinación de bacterias

– SP-A• Opsonización de bacterias• Aumenta la fagocitosis por los macrófagos alveolares.• Modulación de la secreción de citocinas en macrófagos y

linfocitos alveolares

El surfactante en enfermedades pulmonares

El surfactante en enfermedades pulmonares

• Modificación de:– Concentración

• Enfermedad de membrana hialina

– Estructura• Deficiencia de SP-B o SP-C

– Función• Inactivación por proteínas, fosfolipasas, ácidos

grasos– SIRPA– Síndrome de aspiración de meconio– Infecciones

• Modificación de:– Concentración

• Enfermedad de membrana hialina

– Estructura• Deficiencia de SP-B o SP-C

– Función• Inactivación por proteínas, fosfolipasas, ácidos

grasos– SIRPA– Síndrome de aspiración de meconio– Infecciones

Sistema del surfactanteSistema del surfactante

• Otras funciones:– Modulador de la actividad de células que no

pertenecen al sistema inmune• Fibroblastos pulmonares• ?

• Otras funciones:– Modulador de la actividad de células que no

pertenecen al sistema inmune• Fibroblastos pulmonares• ?

Fibrosis Pulmonar IdiopáticaFibrosis Pulmonar Idiopática

• Se caracteriza por la proliferación de fibroblastos y acumulación de matriz extracelular

• Las regiones de lesiones crónicas con cicatrización y panalización contrastan con regiones de lesión aguda en donde se observan focos de fibroblastos y miofibroblastos que proliferan activamente .

Cool y col.

FPIFPI

• Histológicamente se observan zonas fibróticas en forma de panal de abejas que se alternan con áreas aparentemente sanas.

Fibrosis Pulmonar IdiopáticaFibrosis Pulmonar Idiopática

• Incidencia 30 casos por 100 000• No hay tratamiento• Muerte 3 a 5 años después de los

primeros síntomas

PatogénesisPatogénesis

Teoría de una reparación aberrante

Teoría de una reparación aberrante

• Activación aberrante del epitelio • Liberación de mediadores fibrogénicos

por parte de las células epiteliales• Estimulación de focos de fibroblastos,

disminuyendo su apoptosis y aumentando la liberación de factores fibrogénicos.

ANTECEDENTESANTECEDENTES

• En algún momento de la patogénesis de la fibrosis pulmonar, los fibroblastos entran en contacto con el surfactante.

• El surfactante disminuye la proliferación y la secreción de mediadores de la inflamación en fibroblastos de pulmón.

• En algún momento de la patogénesis de la fibrosis pulmonar, los fibroblastos entran en contacto con el surfactante.

• El surfactante disminuye la proliferación y la secreción de mediadores de la inflamación en fibroblastos de pulmón.

Efecto del surfactante sobre fibroblastos de pulmón

humano normal

Efecto del surfactante sobre fibroblastos de pulmón

humano normal

OBJETIVOSOBJETIVOS

• Determinar el efecto sobre la tasa de crecimiento y apoptosis de fibroblastos de pulmón incubados en presencia de surfactante.

• Determinar la expresión de mRNA para colágena tipo I, TIMP-1, MMP-1 en cultivos de fibroblastos de pulmón incubados en presencia de las sustancias mencionadas.

• Determinar el efecto sobre la tasa de crecimiento y apoptosis de fibroblastos de pulmón incubados en presencia de surfactante.

• Determinar la expresión de mRNA para colágena tipo I, TIMP-1, MMP-1 en cultivos de fibroblastos de pulmón incubados en presencia de las sustancias mencionadas.

EFECTO DE SURVANTA SOBRE LA TASA DE CRECIMIENTO CELULAR EN MEDIO

SIN SUERO

EFECTO DE SURVANTA SOBRE LA TASA DE CRECIMIENTO CELULAR EN MEDIO

SIN SUERO

ENSAYO DE ELISA PARA FRAGMENTACIÓN DE DNA

ENSAYO DE ELISA PARA FRAGMENTACIÓN DE DNA

0

0.5

1

1.5

2

Control Survanta Survanta + SP-A

DE

NS

IDA

D O

PT

ICA

EFECTO DE SP-A Y SURVANTA SOBRE LA EXPRESIÓN DE mRNA DE COLÁGENA

EFECTO DE SP-A Y SURVANTA SOBRE LA EXPRESIÓN DE mRNA DE COLÁGENA

1 2 3 4

1) CONTROL

2) SP-A 50 g/ml

3) SURVANTA 500 g/ml

4) SURVANTA + SP-A 0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

CONTROL SP-A SURV SURV SP-A

RE

LA

CIO

N C

OL

AG

EN

A/1

8S

COLÁGENA

18 S

EFECTO DE SURVANTA SOBRE LA CONCENTRACIÓN DE COLÁGENA EN EL

MEDIO DE CULTIVO

EFECTO DE SURVANTA SOBRE LA CONCENTRACIÓN DE COLÁGENA EN EL

MEDIO DE CULTIVO

EFECTO DE SP-A Y SURVANTA SOBRE LA EXPRESIÓN DE mRNA DE COLAGENASA

EFECTO DE SP-A Y SURVANTA SOBRE LA EXPRESIÓN DE mRNA DE COLAGENASA

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

RE

LA

CIÓ

N C

OL

AG

EN

AS

A/G

AP

DH

R 0 0 0,36775056 0,17025796

1 2 3 4

1) CONTROL

2) SP-A 50 g/ml

3) SURVANTA 500 g/ml

4) SURVANTA + SP-A

1 2 3 4

COLAGENASA

18 S

CONCLUSIONESCONCLUSIONES

• SURVANTA:– Induce la apoptosis en cultivos de fibroblastos

de pulmón humano normal.

– Disminuye la expresión génica y síntesis de pro 1(I) colágena.

– Aumenta la expresión génica de MMP-1 y actividad colagenolítica en el medio.

En conjunto, estos resultados sugieren que el surfactante puede tener un

efecto antifibrosante In vivo

En conjunto, estos resultados sugieren que el surfactante puede tener un

efecto antifibrosante In vivo

Efecto de la DPPC, el PG, y la PE sobre la expresión de colágena, en cultivos de

fibroblastos de pulmón humano normal

Efecto de la DPPC, el PG, y la PE sobre la expresión de colágena, en cultivos de

fibroblastos de pulmón humano normal

Yair Romero L

ObjetivoObjetivo

Determinar el efecto de los fosfolípidos más representativos del surfactante pulmonar en la

expresión de colágena en fibroblastos de pulmón humano normal.

Efecto de Survanta, DPPC, PG y PE 600 mg*L-1

sobre la expresión génica de colágena

Efecto de Survanta, DPPC, PG y PE 600 mg*L-1

sobre la expresión génica de colágena

Efecto de los componentes del SP a dosis fisiológicas por 24 hrs.

Efecto de los componentes del SP a dosis fisiológicas por 24 hrs.

Curva dosis respuesta de la PE a 48 hrs Curva dosis respuesta de la PE a 48 hrs

Efecto de la PE 50 mg*L-1 en el tiempoEfecto de la PE 50 mg*L-1 en el tiempo

ConclusionesConclusiones

• A dosis altas dipalmitoilfosfatidilcolina, fosfatidilglicerol, fosfatidiletanolamina disminuyen la expresión de colágena.

• A dosis que corresponden a la concentración del surfactante pulmonar en el interior del alveolo, sólo la PE disminuye significativamente la expresión de colágena.

• La fosfatidiletanolamina actúa de manera tiempo y dosis dependiente.

Efecto del surfactante y la fosfatidiletanolamina sobre la fibrosis

pulmonar en un modelo in vivo

Efecto del surfactante y la fosfatidiletanolamina sobre la fibrosis

pulmonar en un modelo in vivo

Modelo de fibrosis pulmonar in vivo

Modelo de fibrosis pulmonar in vivo

• Administración de bleomicina transtraqueal a ratones susceptibles.

• Cepa C57BL/6• Se midió:

– Curva ponderal de los animales– Colágena con la técnica de hidroxiprolina y/o

Sircoll– Analisis histopatológico

• Tinción de Masson

Administración del surfacante pulmonar por vía inhalada

Administración del surfacante pulmonar por vía inhalada

Protocolo para la administración de surfactante inhalado

Protocolo para la administración de surfactante inhalado

• Los fosfolípidos del surfactante se metabolizan aproximadamente en 48 horas.

• En el modelo de bleomicina, la fibrosis se obtiene alrededor del día 20

Diseño experimentalDiseño experimental

Grupo 1

Solucion salina intrataqueal

Nebulizaciones con solución

salina

Grupo 2

Bleomicina intratraqueal

Nebulizaciones con solución

salina

Grupo 3

Bleomicina intratraqueal

Nebulizaciones con surfactante

Grupo 4

Bleomicina intratraqueal

Nebulizaciones con surfactante

+ PE

Grupo 5

Bleomicina intratraqueal

Nebulizaciones con PE

Concentración de colágenaConcentración de colágena

Grupo n Colágena total (µg/mL) (promedio±SD)

p (comparado con grupo 2)

Control (grupo 1) 7 51.9 ± 22.1 .003Salina (grupo 2) 7 99.2 ± 8.1Survanta (grupo 3) 7 73.6 ± 18.8 .327Survanta enriquecido con PE (grupo 4)

6 51.02 ± 29.7 .004

PE 5 56.63 ± 24.1 .02

Estudio histopatológicoEstudio histopatológico

H & E

M

Control (no bleomicina)

PESurvanta + PE

SurvantaSalina

ConclusionesConclusiones

• El surfactante enriquecido con fosfatidiletanolamina mejora la fibrosis cuando es administrado tempranamente en el modelo murino de fibrosis pulmonar.

IMPLICACIONESIMPLICACIONES

• En conjunto, estos resultados sugieren que la administración temprana de surfactante pudiera tener un efecto terapéutico en patología pulmonar que conduce a fibrosis del parénquima

AgradecimientosAgradecimientos

• Yair Romero López• Nathalie Rosales• Beatriz Tlatelpa