UNPSJB - fcn.unp.edu.ar

Universidad Nacional de la Patagonia San Juan Bosco Facultad de Ciencias Naturales y Ciencias de la Salud.

Cátedra: Química Biológica I Año 2018

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CARPETA DE TRABAJOS

PRÁCTICOS

Departamento de Bioquímica

Facultad de Ciencias Naturales y

Ciencias de la Salud.

UNPSJB

Año 2018



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Bienvenido a este fascinante y poco conocido, mundo de la química de la vida. Aquí los

esperan nuevos desafíos, pero con la ventaja de que muchas herramientas ya las poseen. El

estudio de la química lo han comenzado un tiempo atrás, retomaran conceptos vistos y

construirán una integración que les permitirá desde lo simple a lo complejo entender el

funcionamiento de la vida a nivel molecular.

El equipo que los acompañara en este camino está integrado por:

Profesora adjunta: Dra. Crovetto, Cecilia.

Jefa de Trabajos Prácticos: Bqca. Alvarez, Vanesa.

Auxiliar de 1°: Bqco. Castillo, Marcelo.

Auxiliares alumnos : Figueroa, Maximiliano; Huentemilla, Cecilia y Zamora, Camila.



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Conceptos en Bioseguridad

El primer paso antes de entrar en un laboratorio debe ser tomar conciencia con la realidad

que representa. Se trata de un lugar para aprender, descubrir y enseñar, pero al mismo tiempo

es un lugar que, como casi todos, puede presentar peligros para la vida y salud de las personas.

Los accidentes pueden ser causados por:

Agentes físicos y mecánicos: Efectos traumáticos quemaduras por exposición a muy

altas/bajas temperaturas, cortaduras por vidrios o recipientes rotos, malas instalaciones que

generan posturas inadecuadas, caídas por pisos resbalosos, riesgo de incendios, inundaciones,

instalaciones eléctricas inadecuadas, etc.

Agentes químicos: Exposición a productos corrosivos, tóxicos, irritantes o cancerígenos por

inhalación, contacto con la piel o mucosas, por heridas o ingestión. Exposición a agentes

inflamables o explosivos.

Agentes biológicos: El riesgo dependerá de la naturaleza del agente, su patogenicidad,

virulencia, modo de transmisión y la vía de entrada natural al organismo (inhalación de

aerosoles, inyección por pinchazos con agentes punzantes, contacto).

El Riesgo químico es aquel riesgo susceptible de ser producido por una exposición no

controlada a agentes químicos la cual puede producir efectos agudos o crónicos . Los

productos químicos también pueden provocar consecuencias locales y sistémicas según la

naturaleza del producto y la vía de exposición.

Los agentes químicos pueden ingresar al organismo a través de diferentes vías:

Vía inhalatoria: el ingreso de un agente químico, a través de esta vía es muy

frecuente, ya que los vapores o gases se mezclan con el aire que se respira. Es

importante considerar que no necesariamente debe tratarse de un gas, sino que los

líquidos pueden mezclarse con el aire en forma de aerosoles, así como los sólidos

pueden incorporarse y trasladarse por el aire en forma de polvo muy fino en



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suspensión. Ejemplos de compuestos químicos que actúan por esta vía son: monóxido

de carbono, ácido cianhídrico, sulfuro de hidrógeno, vapores de mercurio, benceno,

metanol, nitrobenceno .

Vía digestiva: la intoxicación a través de esta vía se produce no sólo por la ingesta

directa del producto, sino también por elementos (entre los más frecuentes se

encuentran los lápices, biromes, etc.) o manos contaminadas que son llevados a la

boca. Algunas sustancias tóxicas, actúan de forma inmediata, como por ejemplo las

que ejercen una acción mecánica (tal sería el caso de los corrosivos); otras lo hacen

después de su absorción y luego de ser metabolizadas por el organismo, por lo que

pueden “parecer” inocuas en un primer momento.

Vía dérmica: algunos contaminantes producen intoxicación por absorción cutánea. Los

tóxicos liposolubles se caracterizan por su toxicidad. La exposición puede suceder por

contacto directo, por deposición (por ejemplo cuando el aerosol o el vapor impactan

con la piel) o bien por contacto con superficies en las que se encuentra depositado el

contaminante (tal como sucede durante el mantenimiento o limpieza de equipos, tras

la aplicación de productos fitosanitarios, etc.). Debe tenerse presente que algunos

contaminantes provocan diferentes efectos y que distintos contaminantes pueden

estar presentes en un mismo ambiente al mismo tiempo. No probar ni oler, bajo

circunstancia alguna, productos químicos con vistas a su identificación.

Clasificación de los agentes químicos según su peligrosidad

Explosivos: son aquéllas sustancias y/o preparaciones que pueden explotar bajo

efecto de una llama o que son sensibles a los choques o fricciones. Ejemplo:

nitroglicerina.

Inflamables: son líquidos, mezcla de líquidos, o líquidos que contienen sustancias

sólidas, en solución o suspensión, que despiden vapores inflamables a una

temperatura no mayor de 135ºC, en vaso abierto.

Sólidos inflamables: son sustancias sólidas no consideradas como explosivos que son

capaces, espontáneamente o bajo condiciones accidentales, de causar incendio por

fricción, por absorción de humedad, por cambios químicos o físicos espontáneos o

como resultado del calor retenido durante su elaboración. Ejemplo: metaldehído.



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Espontáneamente inflamables: son sólidos inflamables que pueden calentarse de

manera espontánea al contacto con el aire o por fricción. Ejemplo: fósforo blanco.

Reactivos con el agua o la humedad: son sólidos que, bajo la acción del agua o la

humedad se transforman espontáneamente en inflamables o bien despiden gases

inflamables. Ejemplo: carburo de calcio que al contacto con el agua genera acetileno.

Gases inflamables: son sustancias gaseosas que forman una mezcla inflamable

cuando se mezclan con el aire en la proporción mínima del 13%. Ejemplos: butano,

propano.

Sustancias comburentes: son sustancias habitualmente incombustibles capaces de

liberar fácilmente oxígeno, activando la combustión de otros materiales e

intensificando la violencia de la misma. Es importante evitar su contacto con

materiales combustibles. Ejemplo: oxígeno, nitrato de potasio, peróxido de

hidrógeno.

Corrosivos: son productos químicos que causan destrucción de tejidos vivos y/o

materiales inertes. Ejemplos: ácido clorhídrico, ácido fluorhídrico.

Radiactivos: son sustancias que emiten radiaciones nocivas para la salud.

Peligroso para el medio ambiente : son sustancias provocan daños al ecosistema a

corto o largo plazo.

Se sugiere leer las fichas de seguridad química internacional de ciertas sustancias a ser

utilizadas en distintos Trabajos Prácticos, con el fin de una correcta manipulación de los

mismos y minimización de posibles accidentes en el área de trabajo.

Las reglas básicas de seguridad que se establecen a continuación tienen como objetivo

proteger la salud de todos aquellos que trabajen dentro de un laboratorio y a evitar

accidentes y contaminaciones.

Un elemento clave de la seguridad es la información que permita prevenir, reconocer y

minimizar los riesgos presentes en una institución y, en particular, en un laboratorio.



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EQUIPOS DE SEGURIDAD (Barreras primarias)

Guardapolvo: para no llevar ni traer contaminantes del medio ambiente y

como barrera de contención de las proyecciones o salpicaduras de elementos

corrosivos. Debe quitarse al retirarse del laboratorio.

Guantes: para proteger las manos en el caso de que se usen elementos

cáusticos, tóxicos o patológicos.

Barbijos: para evitar la entrada de polvos a las vías respiratorias.

Anteojos de seguridad: para proteger los ojos de las proyecciones y

salpicaduras

Pro pipetas: para evitar respirar los vapores y posible ingestión de distintas

sustancias. Jamás pipetear con la boca

SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

Usted debe saber

1- Localización dentro del edificio.

2- Ubicación a la llave de agua, gas, interruptores de corriente y desagüe.

3- Identificación de los recipientes adecuados para los residuos patológicos y residuos no

patológicos.

4- Localización de matafuegos: identificar la ubicación de los extintores (Ver Anexo: Uso de

Extintores).

5- Localización de puertas de salida: identificar todas las posibles puertas de emergencias

cercanas al laboratorio en el cual trabaja.



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Hábitos personales para trabajar con seguridad

Usar todos los elementos de seguridad en todo momento en que este realizando una

experiencia.

Lavarse las manos todas las veces que sea necesario, luego de manipular materiales

viables, luego de quitarse los guantes y antes de retirarse del laboratorio.

Prohibido comer, beber, fumar, almacenar alimentos para uso humano en áreas de

trabajo.

Evitar el uso de accesorios colgantes (aros, pulseras, collares).

Trabajar con el cabello recogido.

Lavar todo el material de vidrio antes y después de las experiencias.

Cuando en alguna etapa de la experiencia puedan producirse vapores irritantes o

tóxicos, debe trabajar bajo campana.

No realice experiencias no indicadas en el trabajo práctico sin consular con el docente.

No use material de vidrio rajado o roto.

Cuando caliente un tubo de ensayo u otro elemento no dirija la boca del mismo al

rostro de sus compañeros o suyo propio.

Consulte si tiene que eliminar algún producto químico.

Evite derrames al trasvasar líquidos.

Cuando finalice su trabajo deje todo su material limpio y ordenado, mesada limpia y

controle que las llaves de gas estén cerradas y los equipos eléctricos apagados.



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Pautas para la aprobación del cursado de la asignatura

La asistencia al 85 % de los Trabajos Prácticos y con la aprobación del 75% de los mismos; la

aprobación de cada Trabajo Práctico se obtendrá con la aprobación de un cuestionario sobre el

mismo y su respectivo informe.

Aprobar los exámenes parciales o sus respectivos recuperatorios. En caso de no lograrlo, podrá

rendir un recuperatorio final que abarque los contenidos del o de los parciales desaprobados

siempre y cuando haya aprobado por lo menos un parcial o su recuperatorio. La asignatura

tiene previstos tres exámenes parciales. (Reglamento de Alumnos de la FCN y CS de la

UNPSJB).

Condiciones para la aprobación de la asignatura

El examen final es oral. La asignatura tiene régimen promocional. Los alumnos deberán

obtener nota 7 o más en cada parcial, aprobar el 100 % de los Trabajos Prácticos y un coloquio

final oral integrador. El examen libre se realizará en un lapso de dos días. (Reglamento de

Alumnos de la FCN y CS de la UNPSJB).



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Ruta de aprendizaje

A continuación se establecen pautas que los ayudara a ir formando orden y criterio en el

trabajo individual y en equipo…………….animo que todo es posible con esfuerzo, compromiso y

perseverancia.

Previo al seminario y trabajo Práctico

Individual

Lectura de la bibliografía sugerida en el programa de estudio, para la comprensión del

tema a desarrollar en el Trabajo Práctico.

Lectura interpretativa de la experiencia de laboratorio.

Construcción de un glosario de términos desconocidos.

Lectura comprensiva de la guía de funcionamiento del instrumental de laboratorio,

fichas de seguridad de los diferentes reactivos.

Resolución de la guía de estudio del trabajo práctico (obligatoria).

Grupal

Resolución de problemas teóricos-prácticos.

Discusión grupal de las inquietudes que surjan a lo largo de la cursada.

Investigación de datos desconocidos y no aportados por la cátedra. (valores de

referencia, valores normales, etc.).

Construcción de un diagrama de flujo de la actividad práctica, con el objetivo de

optimizar el tiempo de trabajo grupal. Para el desarrollo del mismo, tener en cuenta la

preparación de reactivos, extracción de muestras, tiempos y condición de reacciones,

estabilización de equipos.



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Día de Seminario

Individual

Entrega de la guía de estudio correspondiente al trabajo práctico a desarrollar.

Puesta en común de las diferentes dudas que surjan.

Instrucción docente para el desarrollo de la actividad práctica.

Grupal

Contextualización (en el caso de ser posible) del problema a resolver en el trabajo practico.

Entrega del diagrama de flujo.

Día de la Actividad Práctica de Laboratorio

Entrega de la guía de estudio correspondiente al trabajo practico a desarrollar.

Desarrollo de la experiencia

Discusión de resultados obtenidos.

Entrega de pre informe con los resultados obtenidos.

Próximo encuentro

Grupal

Entrega de informe según guía de elaboración de informe de laboratorio.



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Guía para la elaboración de informe de la práctica de laboratorio

Encabezado

Nombre de la asignatura

Nombre de los alumnos

Fecha

Trabajo Práctico

Nombre del tema, ej. : Lípidos.

Título……………………………………………………………………………………………..

Debe reflejar el tema, ámbito o asunto que compete desarrollar. El título no debe ser

muy extenso. Su lectura debe dar la idea general de lo que tratara la práctica.

Objetivos

Los objetivos se definen según el tema de laboratorio y reflejan lo que se espera

lograr al final del trabajo.

La forma de escribir un objetivo es con un verbo en infinitivo, por ejemplo: Describir,

Realizar, Demostrar, Verificar, Medir, Calcular, Contrastar, Conocer, etc.

Marco teórico

Síntesis de los conceptos que se relacionan con el tema. Una extensión limitada

requiere que el estudiante sintetice las ideas adquiridas de la investigación del

material bibliográfico que se contrastara con lo aprendido en las clases y en el



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laboratorio. El proceso de redacción implicará discernir lo esencial de lo

complementario, o de lo no importante para el desarrollo de la práctica. Aquí es

importante plantearse inquietudes: ¿Por qué? ¿Cómo? ¿Para qué? ¿Cuándo? ¿Qué?

Lista de materiales, equipos y reactivos.

Escribir una lista simple con los materiales esenciales usados, las herramientas

requeridas y los equipos necesarios.

Desarrollo de la práctica

Aquí se describirán en forma breve los procesos que requiere la ejecución de la

práctica.

El desarrollo de la práctica contendrá las explicaciones de todo aquello que surja y no

estaba detallado explícitamente en las indicaciones del trabajo práctico.

Resultados

Datos de medias.

Cálculos

Esquemas

Gráficos

Tablas

Fotos

Análisis de resultados

Luego de realizar las mediciones y cálculos correspondientes estos deben ser

analizados por el equipo de trabajo. Se debe centrar en interpretar los datos,

contrastarlos con los cálculos, con los valores de referencia. Aquí inicia una puesta en

común, de intercambio y construcción de criterio, de supuestos colectivos referentes

a un mismo problema.



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Conclusiones y recomendaciones

Comprendidos y analizados los resultados de la práctica, el estudiante puede ahora

emitir un juicio sobre ellos. No solo indicar si fueron o no correctos, sino indicar el por

qué se dieron esos resultados. Aquí también deben indicarse si se cumplieron o no los

objetivos de la práctica.

Bibliografía

Citas bibliográficas para describir e identificar fácilmente las fuentes de las cuales se

extrajo la información utilizada para la construcción del informe

Existen diferentes normas para la elaboración de una bibliografía, la cátedra sugiere

las que se conocen como normas de Vancouver (ver anexo al final de la carpeta).

Indicaciones generales

Redacción: Esta debe ser en un estilo simple y descriptivo, cuidando la gramática y la

ortografía. Las referencias bibliográficas serán de utilidad para evitar el plagio y

deberán manejarse según las normas para citas bibliográficas.

Formato del texto: El tipo de letra, tamaño y márgenes pueden ser los que WORD

tiene por defecto al crear un documento nuevo. Se recomienda utilizar tipos de letras

simples como la CALIBRI, con tamaños de 12 para el texto principal, 10 para las notas

al pie y 14 para títulos. Párrafo interlineado 1,5. Justificado.

Imágenes, figuras y fotografías: estas deben ser claras y de fácil comprensión, dado

que darán soporte a las ideas presentadas en el texto. Si las imágenes se obtienen de

páginas web o de bases de datos, debe indicarse su procedencia por medio de una cita

bibliográfica. Si las fotos no son realizadas por el autor del informe, debe indicarse

también su procedencia. Debe incluirse un pie de imagen o de foto según

corresponda, para referenciarla en el texto.



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Tablas: son un recurso para mostrar datos o información en forma resumida. El

significado de las filas y columnas debe explicarse ya sea con títulos o en el pie de

tabla. Las tablas en el texto no deben ser largas y abarcar muchas hojas, de ser este el

caso podrían colocarse como anexo.

Cálculos y procesos matemáticos: los cálculos y procesos matemáticos en general

deben empezar con un planteamiento, y luego indicar de forma explícita (con texto

que acompañe a la formula) los pasos entre una formula a otra. Numerar las

ecuaciones permite no repetirla varias veces.



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Trabajo Práctico de Laboratorio: ESPECTROFOTOMETRÍA

Objetivos

- Reforzar el aprendizaje del uso del espectrofotómetro.

- Realizar el espectro de absorción de sustancias puras: soluciones de dicromato de potasio.

- Realizar una curva de absorbancia vs concentración.

- Determinar la concentración de una muestra problema de dicromato de potasio.

Fundamento teórico

La espectrofotometría comprende una serie de técnicas analíticas usadas para análisis cuali y

cuantitativo.

Una radiación electromagnética se puede describir como un flujo de partículas llamadas

fotones, o bien como una onda propagándose en el espacio. De esta última descripción se

toma el concepto de longitud de onda, definiéndolo como la distancia entre dos máximos

consecutivos de la onda.

Figura 1: Naturaleza de una onda

Esta es inversamente proporcional a la energía de la misma, de tal manera que el espectro de

radiaciones electromagnéticas abarca un amplio rango de energías, las de menor energía son

las ondas de radio y las de mayor energía son las llamadas radiación gamma.



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Figura 2: Espectro electromagnético

Figura 3: Regiones del espectro electromagnético

La región UV se define como el rango de longitudes de onda de 195 a 400 nm. Es una región

de energía muy alta. Provoca daño al ojo humano así como quemadura común. Los

compuestos con dobles enlaces aislados, triples enlaces, enlaces peptídicos, sistemas

aromáticos, grupos carbonilos tienen su máxima absorbancia en la región UV, por lo que ésta

es muy importante para la determinación cualitativa y cuantitativa de compuestos orgánicos.

Diversos factores -como pH, concentración de sal y el disolvente- que alteran la carga de las

moléculas, provocan desplazamientos de los espectros UV. La fuente de radiación ultravioleta

es una lámpara de deuterio.



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En la región visible apreciamos el color visible de una solución y que corresponde a las

longitudes de onda de luz que transmite, no que absorbe. El color que absorbe es el

complementario del color que transmite. Por tanto, para realizar mediciones de absorción es

necesario utilizar la longitud de onda en la que absorbe luz la solución coloreada. La fuente de

radiación visible suele ser una lámpara de tungsteno y no proporciona suficiente energía por

debajo de 320 nm.

Las principales ventajas de la espectrofotometría son:

Sensibilidad relativa elevada.

Facilidad para realizar mediciones rápidas.

Grado de especificidad relativamente elevado.

Para obtener la máxima sensibilidad en una determinación debe conocerse la longitud

de onda de mayor absorción de la sustancia analizada, que no deberá coincidir con una

alta absorción de otras sustancias presentes en la reacción.

Intervalo de longitudes de

onda (nm)

Color de luz absorbida Color complementario

transmitido

400-435 Violeta Amarillo verdoso

435-480 Azul Amarillo

480-490 Azul verdoso Anaranjado

490-500 Verde azulado Rojo

500-560 Verde Purpura

560-580 Amarillo verdoso Violeta

580-595 Amarillo Azul

595-650 Anaranjado Azul verdoso

650-750 Rojo Verde azulado



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El análisis cuantitativo por absorción, se basa en la absorción selectiva de radiación en la zona

visible del espectro electromagnético que se produce cuando dicha radiación, atraviesa una

solución coloreada que contiene al analito de interés y que se coloca en una celda, dando lugar

a que el rayo emergente difiera del

incidente. Es así, que el proceso de

absorción disminuye el poder

radiante (intensidad) de la radiación

transmitida desde un valor Io

(correspondiente al haz incidente)

hasta un valor I (correspondiente al

haz que emerge de la solución). La

absorción no es el único proceso por

el cual se reduce el poder de

radiación de la luz que atraviesa la

solución. Las reflexiones en la

superficie de la celda, así como la

dispersión causada por partículas en suspensión también contribuyen a esa disminución. Para

compensar estas pérdidas, se coloca primero en la celda una solución "en blanco" constituida

por el disolvente y todos los constituyentes del sistema investigado, menos el que quiere

determinarse. Así el poder radiante de la radiación transmitida corresponde al poder radiante

incidente original, menos las pérdidas por reflexión, dispersión, etc. Se designa a este poder

radiante como Io y es igual al poder radiante incidente "corregido", cuando el "blanco" se

reemplaza por la muestra. La radiación que absorbe la muestra se determina entonces,

comparando la intensidad del haz transmitido cuando no hay muestra (Io) con la del haz

transmitido cuando hay muestra (I).

La transmitancia (T) de una sustancia en solución es la relación entre la cantidad de luz

transmitida que llega al detector una vez que ha atravesado la muestra, It, y la cantidad de luz

que incidió sobre ella, Io, y se representa normalmente en tanto por ciento: % T = It/Io x 100

La transmitancia nos da una medida física de la relación de intensidad incidente y transmitida

al pasar por la muestra. La relación entre %T y la concentración no es lineal, pero asume una

relación logarítmica inversa.

Figura 4: Perdidas por reflexión y dispersión



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La absorbancia (A) es un concepto más relacionado con la muestra puesto que nos indica la

cantidad de luz absorbida por la misma, y se define como el logaritmo de 1/T, en

consecuencia: A = log 1/T = -log T = -log It/ Io. Cuando la intensidad incidente y transmitida

son iguales (Io = It), la transmitancia es del 100% e indica que la muestra no absorbe a una

determinada longitud de onda, y entonces A vale log 1 = 0.

La ley de Lambert-Beer, rige los cálculos cuantitativos, Esta ley expresa la relación entre

absorbancia de luz monocromática (de longitud de onda fija) y concentración de un cromóforo

en solución: relacionada con la longitud de paso óptico b (en cm) a través de la solución y la

concentración c (moles/l) del soluto absorbente de la solución en la siguiente forma:

A = log I/Io = ε·b·c

Donde ε es la absortividad molar, característica de la especie absorbente y función de la

longitud de onda de la luz. Al término -log I/Io se lo denomina absorbancia, A, entonces

A= ε b c ó A= a b c

La expresión anterior, es la forma más conveniente de la ley de Beer para fines analíticos,

pues la absorbancia es directamente proporcional a la concentración del analito absorbente de

interés (a mayor número de moléculas mayor interacción de la luz con ellas) cuando la

absortividad y el camino óptico se mantienen constantes.; también depende de la distancia

que recorre la luz por la solución –a igual concentración, cuanto mayor distancia recorre la luz

por la muestra más moléculas se encontrará. Como A es adimensional, las dimensiones de ε

dependen de las de b y c. La segunda magnitud (b) se expresa siempre en cm mientras que la

primera (c) se hace, siempre que sea posible, en M, con lo que las dimensiones de ε resultan

ser M-1·cm-1. Este coeficiente así expresado, en términos de unidades de concentración molar

(o un submúltiplo apropiado), se denomina coeficiente de extinción molar (εM). Cuando, por

desconocerse el peso molecular del soluto, la concentración de la disolución se expresa en

otras unidades distintas de M, por ejemplo g·L-1, las dimensiones de ε resultan ser distintas,

por ejemplo g-1·L·cm-1, y al coeficiente así expresado se denomina coeficiente de extinción

específico (εs).



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La ley de Lambert-Beer se cumple para soluciones diluidas; para valores de c altos, ε varía con

la concentración, debido a fenómenos de dispersión de la luz, agregación de moléculas,

cambios del medio, etc.

En el proceso de una determinación fotométrica, uno de los aspectos más importantes es la

selección de la longitud de onda apropiada para las mediciones de absorbancias. Esta selección

se realiza sobre una curva obtenida con la absorbancia de una solución del analito

(cromoforo) investigado, obtenida a varías longitudes de onda, es decir una curva de la A

(ordenadas) en función de λ (abscisas). La gráfica así obtenida se designa como el espectro de

absorción del analito. A

partir del espectro de

absorción se obtendrá el

valor de λ al que el

compuesto presenta la

mayor absorbancia

(λmax). Dicho λ se

utilizará a la hora de

hacer determinaciones

cualitativas y

cuantitativas del

compuesto. El espectro

de absorción de un

cromóforo depende, fundamentalmente, de la estructura química de la molécula. No

obstante, hay una gran cantidad de factores que originan variaciones en los valores de λmax y

εM, entre los que se incluye el pH, la polaridad del solvente o moléculas vecinas y la

orientación de los cromóforos vecinos; y cada uno afecta de forma particular. Por ejemplo,

variaciones originadas por cambios de pH son debidas al efecto de éste sobre la ionización del

compuesto.

Una técnica experimental de amplia difusión en espectrofotometría visible es el uso de una

curva de calibrado. Para su construcción se preparan soluciones de un compuesto de

diferentes concentraciones del mismo, determinándose para cada una de ellas el valor de

absorbancia a λmax. Estos valores de absorbancia se representan en el eje de abscisas (eje de

x) y los de concentración en el eje de ordenadas (eje de y). Se observará que, a bajas

Figura 5: Espectro de absorción del permanganato de potasio a diferentes concentraciones



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concentraciones, el aumento de concentración se corresponde con un incremento lineal en la

absorbancia (zona de cumplimiento de la ley de Lambert-Beer). A concentraciones altas la

linealidad se pierde y se observa que la línea se aplana, por lo que las medidas son poco

fiables.

La representación de Lambert-Beer, A = ε·b·c, nos permitirá calcular el valor del coeficiente de

extinción molar, que corresponde a la pendiente de la recta. A continuación se mide la

absorbancia de la solución problema y la concentración de la especie absorbente se lee en la

curva de calibrado. Si el sistema en estudio cumple con la ley de Beer la curva de calibrado será

una línea recta que pasa por el origen . Sin embargo en la práctica, la línea es recta sólo hasta

un cierto límite de concentración, y después de este aparecen desviaciones de la ley causadas

por factores tanto químicos como instrumentales. Si las desviaciones de la curva no son

considerables, las determinaciones cuantitativas son factibles.

1. Trazado de la curva espectral (Espectro de absorción del compuesto).

1.a. Preparar a partir de una droga patrón una solución del componente que se desea

determinar en una concentración estipulada y trazar la curva espectral, realizando para ello

una serie de medidas de absorbancia a distintas longitudes de onda y [c] constante.

Prender el equipo y dejar estabilizar.

Seleccionar la longitud de onda.

Ajustar 100 % T o 0 % A con el Blanco de reactivos.

Reemplazar el blanco por la muestra y leer absorbancia.

Seleccionar una nueva longitud de onda y repetir las operaciones.

1.b construcción de la curva espectral graficando: Absorbancia vs longitud de onda y

seleccionar aquella donde la A sea máxima. Se logra así máxima sensibilidad y

reproducibilidad.



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2. Curva de calibración Absorbancia vs Concentración

Seleccionar la longitud de onda de máxima absorbancia obtenida en la curva espectral.

Preparar una soluciones patrones de concentraciones crecientes y perfectamente

conocidas en el componente determinar

Medir la absorbancia de la muestra problema.

Graficar Absorbancia vs concentración.

Si la sustancia cumple con la Ley el gráfico será una recta y será posible sacar un factor ya que

la pendiente de la recta será la misma en todos los puntos. Así se podrá calcular la

concentración de la muestra problema.

Si la sustancia no cumple la Ley, el gráfico será una curva y se extrapolará dentro de un rango

apropiado para calcular el valor de la muestra problema.

Instrumentación para la medición de absorbancias de la luz visible y ultravioleta:

espectrofotómetro UV-visible

La medición de absorbancia de la luz por las moléculas se realiza en unos aparatos llamados

espectrofotómetros. Aunque pueden variar en diseño, en especial con la incorporación de

ordenadores para el análisis de datos, todos los espectrofotómetros constan:

1. Una fuente de energía radiante: lámpara de deuterio y tungsteno.

2. Un monocromador para la selección de radiaciones de una determinada longitud de onda:

filtros, prismas, redes de difracción.

3. Un compartimento donde se aloja un recipiente transparente (cubetas o tubos) que

contenga la muestra Pueden ser de vidrio, cuarzo o plástico transparente. Para medir en UV se

deben usar las de cuarzo o sílice fundido, porque el vidrio no transmite la radiación UV.

4. Un detector de luz y un amplificador convertidor de las señales luminosas en señales

eléctricas.

5. Un registrador o sistema de lectura de datos.



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Desde el punto de vista operativo, el primer paso es seleccionar la fuente de luz y longitud de

onda a la que se va a realizar la medida. Hay espectrofotómetros de un solo haz (con una sola

celdilla para alojar la cubeta con la muestra) y de doble haz (con dos celdillas para dos

cubetas); en nuestro caso se trabajará con los de un solo haz. Se mide primero la absorbancia

del disolvente (conocido como blanco) y al que se le asigna el valor de cero mediante el ajuste

del mando, de forma que la intensidad incidente y transmitida sean iguales (Io = It), y por tanto

la absorbancia es cero. A continuación se pone en la celdilla la cubeta con la muestra y se lee la

absorbancia de ésta.

Calibración del espectrofotómetro

Prender el equipo llevando la llave hacia arriba. Esperar 15 minutos para que los

circuitos alcancen temperatura.

Elegir la longitud de onda deseada con el selector.

Verificar 0% de T. Se realiza en modo transmitancia y colocando un cuerpo negro en

reemplazo del tubo

Ajustar con el blanco el 0% de absorbancia trabajando con la tapa cerrada.

Reemplazar el blanco de reactivos por la muestra a analizar y leer el valor

correspondiente de absorbancia.



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PARTE EXPERIMENTAL

1- Espectro de absorción de solución de DICROMATO DE POTASIO para determinar la longitud

de onda a la cual presenta su máxima absorción.

Preparar solución 0,5 x10-3 M

Llevar a cero con agua antes de realizar cada lectura. Medir las absorbancias a distintas

longitudes de onda, con intervalos de 20 nm, desde 340 nm hasta 600 nm.

Graficar curva de absorbancia versus longitud de onda.

Observar cuál es la longitud de onda de mayor absorción que se utilizará para realizar

la curva de calibración y determinar la concentración de una muestra problema.

2- Confección de la curva absorbancia versus concentración:

A partir de la solución patrón realizar cinco diluciones: 1/2; 1/4; 1/6; 1/8; 1/10; 1/20

Medir sus absorbancias a la longitud de onda determinada anteriormente y graficar

absorbancia versus concentración.

3- Determinar si cumple o no con la ley de Lambert y Beer.

4- Determinar con la gráfica anterior la concentración de la muestra problema.

Problemas de entrega obligatoria (individual).

1- Al realizar un espectro de absorción de proteínas, se encontraron las siguientes

absorbancias:

Longitud de onda (nm) Abs

240 0,100

250 0,099

260 0,170

270 0,245

280 0,290

290 0,198

300 0,171



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310 0,115

Graficar y determinar la longitud de onda que utilizaría para medir proteínas. Justificar.

2- En una muestra de suelo se determinó nitritos por un método colorimétrico. La

absorbancia de la muestra a 540 nm fue de 0,52. En la curva de calibración se

encontraron los siguientes valores:

Absorbancia Concentración ( ug/ ml)

0,23 0,20

0,47 0,40

0,65 0,60

0,90 0,80

Determinar la concentración de nitritos en la muestra. ¿Es posible sacar un factor para

determinar nitritos en próximas muestras? Justificar.

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