Respuesta inmunológica contra cepas de Norovirus humanos ...
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS ... · ii Guerra Naranjo, Cesar (2017)....
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS CARRERA DE BIOQUÍMICA CLÍNICA Caracterización de la respuesta inmunológica “in vivo” e “in vitro” de pacientes con tuberculosis pulmonar activa y latente. TRABAJO FINAL DE INVESTIGACIÓN PARA OPTAR POR EL TÍTULO PROFESIONAL DE BIOQUÍMICO CLÍNICO Autor: Cesar David Guerra Naranjo Email: [email protected] Tutora: Lourdes Alicia Pazmiño Ayala Email: [email protected] Quito DM, octubre 2017
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA DE BIOQUÍMICA CLÍNICA
Caracterización de la respuesta inmunológica “in vivo” e “in vitro” de pacientes
con tuberculosis pulmonar activa y latente.
TRABAJO FINAL DE INVESTIGACIÓN PARA OPTAR POR EL TÍTULO
PROFESIONAL DE BIOQUÍMICO CLÍNICO
Autor: Cesar David Guerra Naranjo
Email: [email protected]
Tutora: Lourdes Alicia Pazmiño Ayala
Email: [email protected]
Quito DM, octubre 2017
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Guerra Naranjo, Cesar (2017). Caracterización de la respuesta
inmunológica “in vivo” e “in vitro” de pacientes con tuberculosis
pulmonar activa y latente. Proyecto de investigación para optar
por el Título de Bioquímico Clínico. Carrera de Bioquímica
Clínica. Quito: UCE.
iii
DEDICATORIA
Este trabajo va dedicado con mucho amor para mis padres Marlene Naranjo y José
Guerra, a su vez mis hermanos Israel y Josué Guerra, quienes me apoyaron en todo
momento desde el inicio hasta el final, yo sé lo fuerte que fue ayudarme a cumplir esta
meta y jamás podré devolverles ese esfuerzo entregado hacia mí, pero lo que sí puedo
es por medio de mi profesión recompensar a cada uno de ustedes que lograron esta
etapa en mi vida. Sin ustedes jamás lo habría hecho familia.
“La mejor vida no es la más larga, sino la más rica en buenas acciones”.
Marie Curie
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AGRADECIMIENTOS
En primer lugar, quiero agradecer a Dios por darme la bendición más grande; una
hermosa familia, darme salud, bienestar, y muchas bendiciones a través de este tiempo.
Agradezco a mi Madre por apoyarme como nadie más lo hizo en mi vida, en momentos
de bajones y decaídas me apoyaba para jamás rendirme, hablándome de las cosas de
Dios, aquellas palabras que me daban aliento, económicamente, sentimentalmente,
todo esto fue por darle el orgullo más grande de mi vida, siempre dar y ser el mejor en
lo que hago.
A mis hermanos y mi padre que ellos suplieron el trabajo que me correspondía en
nuestro trabajo, con tal de que pudiera cumplir como estudiante, que nada me
perjudique, ellos tomaron ese papel que me correspondía y ahora rindió frutos.
A Jacobus H de Waard, mi mentor, asesor científico, amigo, que fue quien me motivo
por la investigación, apoyándome a lograr cosas que jamás pensaría que me sucederían,
también me dio el apoyo más grande para poder cumplir mi proyecto de investigación,
le seré eternamente agradecido.
A mi Tutora Lourdes Pazmiño, quien me tuvo mucha paciencia y gusto de poder
ayudarme en este proyecto sin pensar dos veces, que ahora rindió frutos y mi tribunal
del proyecto Walkyrie Aguilar, más que docente fue una gran amiga para mí, con
mucho respeto, siempre aconsejándome y ayudándome en todo lo que necesitaba, y
Eduardo Mayorga quien más que un docente uno puede pensar que es una gran persona
con quien hablar y solucionar cualquier duda, siempre dio oído abierto a los
comentarios y apoyo.
Así en general a mis amigos de la carrera, personas que me ayudaron con este proyecto;
les seré eternamente agradecidos el resto de mi vida. No se olviden que lograré ser un
gran Bioquímico clínico y ganador de Premio Nobel en investigación.
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA DE BIOQUÍMICA CLÍNICA
LUGAR DONDE SE REALIZÓ LA INVESTIGACIÓN
El desarrollo experimental del tema “Caracterización de la respuesta inmunológica
“in vivo” e “in vitro” de pacientes con tuberculosis pulmonar activa y latente”,
para optar por el Título de Bioquímico clínico, se realizó en Caracas Venezuela., en los
laboratorios de Tuberculosis del “Instituto de Biomedicina del Hospital José María
Vargas”.
ix
TABLA DE CONTENIDOS
INTRODUCCIÓN ........................................................................................................... 1
EL PROBLEMA .............................................................................................................. 3
1. Planteamiento del problema.................................................................................... 3
1.2 Formulación del problema o hipótesis del trabajo .................................................. 5
1.3 Preguntas directrices ............................................................................................... 5
1.4 Objetivos ................................................................................................................. 5
1.4.1 Objetivo General ................................................................................................. 5
1.4.2 Objetivos Específicos ......................................................................................... 5
1.5 Justificación e Importancia ..................................................................................... 6
MARCO REFERENCIAL .............................................................................................. 8
2 Antecedentes ........................................................................................................... 8
2.1 Fundamentación teórica .......................................................................................... 9
2.1.1 Género Mycobacterium ...................................................................................... 9
2.1.2 Patogenia ........................................................................................................... 12
2.1.3 Clínica de la Tuberculosis primaria. ................................................................. 14
2.1.4 Epidemiología ................................................................................................... 14
2.1.5 Aspectos inmunológicos ................................................................................... 16
2.1.6 Citoquinas e Interferón gamma ......................................................................... 17
2.1.7 Inmunoprotección ............................................................................................. 19
2.1.8 Cultivo de M. tuberculosis ................................................................................ 20
2.2 Marco Legal .......................................................................................................... 22
2.3 Hipótesis ............................................................................................................... 23
2.3.1 Ho: .................................................................................................................... 23
x
2.3.2 Hi: ..................................................................................................................... 23
2.4 Conceptualización de las variables ....................................................................... 23
METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN ........................................................... 24
3 Diseño de la investigación .................................................................................... 24
3.1.1 Enfoque de Investigación.................................................................................. 24
3.1.2 Nivel de Investigación ...................................................................................... 24
3.1.3 Tipo de Investigación........................................................................................ 24
3.2 Población y muestra .............................................................................................. 26
3.3 Materiales y Métodos............................................................................................ 27
3.3.1 Materiales.......................................................................................................... 27
3.3.2 Método .............................................................................................................. 28
3.4 Diseño de experimentación ................................................................................... 29
3.5 Operacionalización de las Variables ..................................................................... 29
3.6 Técnicas e instrumentos de recolección de datos ................................................. 30
3.7 Validez y confiabilidad ......................................................................................... 31
3.8 Control de calidad del ensayo ............................................................................... 33
3.9 Técnicas de procesamiento de datos ..................................................................... 33
ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS ......................................................... 34
4 Resultados ............................................................................................................. 34
4.1 Evaluación inmunológica “In vivo” con la Tuberculina humana ........................ 34
4.2 Cumplimiento de los criterios clínicos en los pacientes con tuberculosis ............ 35
4.3 Resultados hematológicos: Hemograma y biometrías .......................................... 36
4.4 Curva de calibración del Kit QuantiFERON Tb Gold Plus .................................. 38
4.5 Resultados de QuantiFERON-TB Gold en los pacientes ..................................... 39
xi
4.6 Respuesta celular de los Linfocitos CD4 y CD8 antes del tratamiento ................ 39
4.7 Respuesta celular de los Linfocitos CD4 y CD8 después del tratamiento ............ 40
4.8 Comportamiento de las células CD8 antes y después del tratamiento.................. 41
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ........................................................... 43
5 Conclusiones ......................................................................................................... 43
5.1 Recomendaciones ................................................................................................. 44
REFERENCIAS ............................................................................................................. 46
ANEXOS ......................................................................................................................... 52
xii
INDICE DE TABLAS
Tabla 1 Niveles de K según el nivel de confianza (%) ................................................... 26
Tabla 2 Metodologías de diagnóstico de Tuberculosis pulmonar ................................... 28
Tabla 3 Variables de la investigación ............................................................................. 30
Tabla 4 Interpretación de los resultados del QFT-Plus ................................................... 32
Tabla 5 Validación de los estándares .............................................................................. 38
Tabla 6 Exámenes de Laboratorio en Dx de Tuberculosis.............................................. 54
Tabla 7 Criterios clínicos de la OMS en pacientes con Tuberculosis ............................. 54
Tabla 8 Resultados de exámenes hematológicos ............................................................ 54
Tabla 9 Control de la Curva Estándar ............................................................................. 55
Tabla 10 Resultados QuantiFERON TB Gold Plus ........................................................ 55
INDICE DE GRÁFICOS
Gráfica 1 Porcentaje de pacientes por sexo. ................................................................... 34
Gráfica 2 Reacción inmunológica “in vivo” frente a la PPD. ......................................... 35
Gráfica 3 Porcentaje en respuesta a criterios clínicos. .................................................... 36
Gráfica 4 Concentración de Hemoglobina en pacientes masculinos. ............................. 37
Gráfica 5 Concentración de Hemoglobina en pacientes femeninos. ............................. 37
Gráfica 6 Resultados hematológicos. .............................................................................. 38
Gráfica 7 Comportamiento celular CD4 (TB1) y CD8 (TB2) antes del tratamiento. ..... 40
Gráfica 8 Comportamiento celular CD4 (TB1) y CD8 (TB2) después del tratamiento. 41
Gráfica 9 Comportamiento celular CD8 antes y después del tratamiento. ..................... 42
xiii
INDICE DE ANEXOS
Anexo 1 Guía de recolección de Datos. ........................................................................... 52
Anexo 2 Validación de la guía de recolección de datos .................................................. 53
Anexo 3 Tablas de recolección de datos .......................................................................... 54
Anexo 4 Árbol de problemas ........................................................................................... 56
Anexo 5 Diagrama de flujo procesamiento de muestras ................................................. 57
Anexo 6 Consentimiento Informado ................................................................................ 58
INDICE DE FIGURAS
Figura 1 Estructura del Género Mycobacterium. ............................................................ 10
Figura 2 Tinción Ziehl Neelsen. ..................................................................................... 11
Figura 3 Patogenia de M. tuberculosis. ........................................................................... 13
Figura 4 Distribución epidemiológica de la Tuberculosis en el mundo. ........................ 15
Figura 5 Respuesta inmunitaria frente a Infección por M. tuberculosis. ........................ 18
INDICE DE ECUACIONES
Ecuación 1 Cálculo de la muestra. .................................................................................. 26
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA DE BIOQUÍMICA CLÍNICA
Autor: David Guerra
Tutora: Lourdes Pazmiño
Caracterización de la respuesta inmunológica “in vivo” e “in vitro” de pacientes
con tuberculosis pulmonar activa y latente
RESUMEN
El presente estudio de investigación caracterizó la respuesta inmunológica “in vivo”
mediante la prueba de la tuberculina (PPD o TST) e “in vitro” con la medición de la
producción de Interferón Gamma dada por los linfocitos T CD4 y CD8 frente
estimulación previa con dos antígenos: ESAT-6 y CFP-10; se utilizó un método de
diagnóstico comercial del Kit QuantiFERON TB Gold Plus diseñado en sus
características comerciales para el diagnóstico de tuberculosis pulmonar activa y
latente.
Se seleccionaron pacientes con Tuberculosis pulmonar activa, sin antecedentes de
infección previa a MTB, diagnosticados por baciloscopía y confirmados por cultivo e
infectados con M. tuberculosis. La infección con M. tuberculosis se confirmó con PCR-
PRA (Analysis of Restriction Fragments, para Mycobacterium tuberculosis complex).
La infección con M. tuberculosis se confirmó con la prueba de tuberculina (PPD RT23
de Staten Serum Institute, Dinamarca) y la producción de Interferón Gamma (INF-)
en una muestra de sangre completa después de estimular (16-24 horas) con péptidos
derivados de ESAT-6 y CFP-10, los antígenos secretorios más importantes de M.
tuberculosis.
xv
Se usaron dos tipos de péptidos para la estimulación, péptidos cortos (10-15
aminoácidos) (AA), estimuladores de células CD4 y péptidos largos, (20-25 AA)
estimuladores de células CD8 y se determinó la presencia de Interferón Gamma con un
ELISA.
Los pacientes con Tuberculosis pulmonar activa, fueron citados después de terminar la
segunda fase del tratamiento (dos meses), luego de lo cual se tomó una muestra de
sangre para determinar que la respuesta celular frente a los antígenos cortos y largos,
mediante las células CD4 y CD8. En el estudio se evidenció una producción de
Interferón gamma antes y después del tratamiento más elevada por las células CD8 que
por las CD4.
Finalmente, se evidenció que la producción de interferón gamma por parte de los
linfocitos T CD8 y CD4 con la estimulación previa con los dos antígenos: ESAT-6 y
CFP-10; permiten diagnosticar únicamente el estado de infección con Mycobacterium
tuberculosis, pero no puede diferenciar el estado de la infección activa y latente.
Palabras clave: PPD (Tuberculina) PCR; ELISA; INTERFERON Gamma,
Baciloscopía, PCR PRA (Restriction Fragment Analysis), Tuberculosis pulmonar.
xvi
CENTRAL UNIVERSITY OF ECUADOR
FACULTY OF CHEMICAL SCIENCES
CAREER OF CLINICAL BIOCHEMISTRY
Author: David Guerra
Tutor: Lourdes Pazmiño
Characterization of the "in vivo" and "in vitro" immunological response of
patients with active and latent pulmonary tuberculosis
ABSTRACT
The present research study was characterized by the "in vivo" immune response using
the tuberculin test (PPD or TST) and "in vitro" with the measurement of Interferon
Gamma production by CD4 and CD8 T lymphocytes against stimulation previous with
two antigens: ESAT-6 and CFP-10; a commercial diagnostic method of the
QuantiFERON TB Gold Plus kit designed in its commercial characteristics was used
for the diagnosis of active and latent pulmonary tuberculosis.
Patients with active pulmonary tuberculosis were selected, with no history of previous
infection with MTB, diagnosed by smear microscopy and confirmed by infection and
infected with M. tuberculosis. The infection with M. tuberculosis is confirmed with
PCR-PRA (Analysis of Restriction Fragments, complex for Mycobacterium
tuberculosis).
Infection with M. tuberculosis is confirmed with the tuberculin test (PPD RT23 from
Staten Serum Institute, Denmark) and the production of Interferon Gamma (INF-) in
a whole blood sample after stimulating (16-24 hours) with peptides derived from
ESAT-6 and CFP-10, the most important secretory antigens of M. tuberculosis.
xvii
Two types of stimulation drugs are used: short peptides (10-15 amino acids) (AA),
stimulators of CD4 cells and long peptides, (20-25 AA) stimulators of CD8 cells and
the presence of Interferon Gamma was determined with a ELISA
Patients with active pulmonary tuberculosis were cited after completing the second
phase of treatment (two months), after which a blood sample was taken to determine
the cellular response to short and long antigens, through the cells CD4 and CD8. In the
study, gamma interferon production was shown before and after the higher treatment
by CD8 cells than by CD4 cells.
Finally, it was evidenced that the production of interferon gamma by the CD8 and CD4
T lymphocytes with the previous stimulation with the two antigens: ESAT-6 and CFP-
10; it allows to diagnose the infection status with Mycobacterium tuberculosis, but the
state of active and late infection cannot be differentiated.
Keywords: PPD (Tuberculin) PCR; ELISA; INTERFERON Gamma, Bacilloscopy,
PRA (Restriction Fragment Analysis), Pulmonary Tuberculosis.
1
INTRODUCCIÓN
La tuberculosis es una de las diez causas principales de mortalidad en el mundo. En el
año 2016, 10,4 millones de personas enfermaron de tuberculosis y 1,7 millones
murieron por esta enfermedad (entre ellos 0,4 millones de personas con VIH). Más del
95% de las muertes por tuberculosis se producen en países de ingresos bajos y
medianos. (OMS, 2017). Siete países acaparan el 64% de la mortalidad total; encabeza
esta triste lista la India, seguida de Indonesia, China, Filipinas, el Pakistán, Nigeria y
Sudáfrica. (OMS, 2017).
La incidencia mundial de la TB está disminuyendo en aproximadamente un dos por
ciento al año, ritmo que habría que acelerar al 4–5% anual si se quieren alcanzar las
metas fijadas para 2020 en la Estrategia fin a la Tuberculosis. (OMS, 2016) En 2015 el
número mundial estimado de nuevos casos (incidentes) de TB fue 10,4 millones, de los
cuales 5,9 millones (56%) en hombres, 3,5 millones (34%) en mujeres y 1,0 millón
(10%) en niños. Las personas VIH-positivas representaron 1,2 millones (11%) de todos
los casos nuevos de TB. (OMS, 2016).
La alta incidencia de tuberculosis se debe a su fácil modo de trasmisión, a través de
partículas expelidas por un paciente bacilífero por la tos y estornudo. La enfermedad
ataca preferentemente los pulmones, pero puede también infectar otros órganos como
los riñones, el hígado, la piel, meninges, etc. Es más grave en niños y ancianos, que
pueden llegar a morir por su presencia. Iniciado el tratamiento con los medicamentos
normalizados, el enfermo deja de contagiar a partir de los quince o veinte días.
(Cascante, Pascar, & Et Al. 2007).
El Capítulo 1 trata el Problema que contiene: El planteamiento del problema, seguido
de la formulación del problema o hipótesis de trabajo, preguntas directrices y los
Objetivos el cual contiene: Objetivo General y Objetivos Específicos.
El Capítulo 2 detalla el Marco referencial con: Antecedentes y Fundamentación teórica,
Marco legal, Hipótesis nula y alterna y la Conceptualización de las Variables.
El Capítulo 3 detalla la Metodología de la Investigación a aplicarse, compuesta por:
Diseño de la investigación, Población y muestra, Materiales y métodos, Diseño de
2
experimentación, Operacionalización de las variables, Técnicas y recolección de datos
y técnicas de procesamiento de datos.
El Capítulo 4 contiene Análisis y discusión de resultados obtenidos en el proyecto de
investigación.
El Capítulo 5 contiene las Conclusiones y Recomendaciones pertinentes del proyecto
de investigación.
3
CAPÍTULO I
EL PROBLEMA
1. Planteamiento del problema
La tuberculosis es una infección bacteriana con alta tasa de mortalidad e incidencia
mundial, actualmente en el mundo, un tercio de la población está infectada con
tuberculosis. (CDC, 2016). La gran implicancia de casos a nivel mundial asevera que
10,4 millones de personas están enfermas activas y 1,4 millones muertas por
tuberculosis. (OMS, 2017). En el continente americano la tasa de incidencia es de
22.1/100.000 habitantes y países de Latinoamérica como Venezuela y Ecuador se
colocan dentro los escenarios 2 y 4 de incidencia actual correspondientemente; es decir
25 – 50/100.000 casos en Venezuela y más de 50/100.000 habitantes en Ecuador.
(OPS, 2016).
Una de las razones de su significativa incidencia según la OMS (2017) se debe que su:
“Fácil transmisión de persona a persona, cuando un enfermo de tuberculosis pulmonar
estornuda, tose o escupe, éste expulsa bacilos tuberculosos al aire y basta que una
persona inhale para quedar contagiada”, este tipo de transmisión e infección
compromete a los pulmones específicamente. También existen formas extra
pulmonares de tuberculosis, según MSP (2016) como: “ganglionar, pleural,
abdominal, renal, pericárdica, meníngea y hasta de la piel”. De todos los infectados a
través de estornudos, aproximadamente un 20% desarrolla la enfermedad pulmonar
activa, mientras que el resto permanece en un estado de latencia, que no es contagioso.
La infección en estado de latencia es un punto crítico de salud, que por factores de
riesgo que debilitan al sistema inmunitario y llegan a desencadenar la activación de la
infección; tales factores de riesgo como: infecciones por VIH, abuso de sustancias
nocivas, silicosis, diabetes mellitus, enfermedad renal grave, bajo peso corporal,
trasplantes de órganos, cáncer de cabeza y cuello, enfermedades auto inmunitarias y
entre otros factores que alteren el estado inmunológico normal de una persona.
(CDC, 2017)
Ambos estados de tuberculosis presentan un problema a nivel de Salud Pública, sea
este activo o latente; en el primer caso, en aquellos pacientes con la infección activa,
4
su diagnóstico se basa en pruebas que consisten de primer orden con los criterios
clínicos base como: tos por más de quince días, fiebre, sudoraciones nocturnas y
pérdida de peso que presenten los mismos, seguido de exámenes clínicos como:
radiológicos, inmunológicos, hematológicos y por último de un cultivo microbiológico
de esputo; lo cual conlleva un proceso que toma de 3 a 4 semanas hasta su reporte final
incluido la susceptibilidad antibiótica. (Bonachera y Bernal M, 2014).
Esto implica un retraso para brindar un tratamiento rápido y adecuado hacia los
pacientes que están con la infección activa. (MSP, 2016). En el segundo caso, los
pacientes que se encuentran con la infección latente, es decir el 80% del total de
pacientes infectados con M. tuberculosis. Según la OMS (2014) manifiesta: “Uno de
cada cinco personas afectadas con tuberculosis en la región de las Américas
desconoce que tiene la enfermedad”, este criterio toma inicio a un gran problema de
Salud Pública, ya que no se cuenta con un método diagnóstico de certeza rápida y que
permita el poder establecer la diferencia entre tuberculosis activa y latente.
(OPS, 2016).
El único método inmunológico intradérmico que se utiliza para poder diagnosticar la
infección con alguna mycobacteria se basa en la Prueba de la tuberculina (PPD o TST),
pero su sensibilidad y especificidad son muy variables y bajas; ya que su reacción con
el sistema inmune se ve alterado en pacientes con VIH, vacunación a niños con la BCG
durante los últimos diez años e inmunosuprimidos es por ello la gran necesidad actual
de poder evaluar una técnica de laboratorio clínico que permita diferenciar a una
persona infectada entre tuberculosis activa o latente. (Pinna, 2007).
Para cumplir con el propósito de la investigación fue necesario evaluar un método
inmunológico tipo ELISA que, basado en la respuesta de los linfocitos T CD4 y CD8
frente a dos antígenos ESAT6 y CFP10 y con la producción de Interferón Gamma
mediante el Kit comercial QuantiFERON TB Gold Plus, pueda evidenciar la
posibilidad de parametrizar una diferencia entre la infección activa y latente, con el
status de salud del paciente. En aquellos individuos con infección latente poder
empezar la profilaxis adecuada, temprana y necesaria para disminuir así en mayor
proporción la incidencia global de la misma.
5
1.2 Formulación del problema o hipótesis del trabajo
En el diagnóstico clínico de laboratorio no existe una prueba o método específico que
permita la diferenciación en pacientes con tuberculosis pulmonar activa y latente. El
Kit QuantiFERON TB Gold Plus enuncia el diagnóstico de tuberculosis activa y latente
para MTB mediante la producción de Interferón Gamma por medio de las células CD4
y CD8, por lo cual éste es el punto de partida que permite investigar si se puede
establecer o no un método de diagnóstico rápido y específico para diferenciar entre una
tuberculosis pulmonar activa y latente, mediante la evaluación inmunológica con dos
antígenos de MTB: (ESAT6 y CFP10).
1.3 Preguntas directrices
¿Son lo suficientemente sensibles y específicos los métodos usados para el diagnóstico
de tuberculosis en el laboratorio clínico del Hospital?
¿Qué métodos o criterios de laboratorio clínico se usan para el diagnóstico y
diferenciación de un paciente con infección por tuberculosis pulmonar activa y latente?
¿Cuánto tiempo se genera en brindar un diagnóstico oportuno para TB pulmonar?
1.4 Objetivos
1.4.1 Objetivo General
• Caracterizar la respuesta inmunológica “in vivo” e “in vitro” de pacientes
con tuberculosis pulmonar activa y latentes.
1.4.2 Objetivos Específicos
• Diagnosticar pacientes con Tuberculosis pulmonar por baciloscopía y
cultivo.
• A partir de los aislamientos clínicos en esputo de pacientes, identificar con
PRA (PCR Restriction Fragment Analysis) el aislamiento como
Mycobacterium tuberculosis complex (MTC).
• Determinar la respuesta inmunológica in vivo a los pacientes con
tuberculina humana (respuesta a la tuberculina: PPD o TST).
6
• Determinar la respuesta inmunológica in vitro (producción de INF-g) a los
pacientes, estimulando los linfocitos T CD4 y CD8 con antígenos ESAT6 y
CFP10.
• Determinar que la respuesta de CD8 esta correlacionada a la Tuberculosis
activa y la respuesta de las células CD4 a una infección latente o una
tuberculosis en vía de curación.
• Comparar el tiempo del método QuantiFERON TB Gold Plus con otros
métodos de diagnóstico de tuberculosis pulmonar (PPD y Cultivo
microbiológico).
1.5 Justificación e Importancia
La tuberculosis es la décima causa de mortalidad a nivel mundial, (OMS, 2015) y en
la República Bolivariana de Venezuela constituye la décimo primera causa de muerte
con un valor porcentual del 0,41% (MPPS, 2011). En Ecuador la tasa de mortalidad
corresponde al 2.43/100.000 habitantes. (MSP, 2015)
Dentro del grupo total de personas con Tuberculosis a nivel mundial, el 82%
corresponden a los pacientes que presentan tuberculosis pulmonar. (OMS, 2015). Esto
genera una preocupación para la Organización Mundial del Salud en primera instancia
y a nivel de Sudamérica dentro de los Programas Nacionales de control de Tuberculosis
tanto en Venezuela como a su vez en Ecuador son muy importantes, ya que son países
con alta incidencia de la misma. (OPS, 2016).
Siendo este un problema de Salud Pública a nivel mundial; países como Japón, Reino
Unido e Italia evalúan métodos de diagnóstico rápido basados en la respuesta
inmunológica de células CD4 y CD8 con la producción de Interferón gamma,
queriendo llegar a un diagnóstico rápido y oportuno; para la diferenciación entre una
tuberculosis pulmonar activa y latente. (Yi et al., 2016).
Se toma como referencia países de Latinoamérica que presentan alta incidencia frente
a esta infección, uno de ellos es Venezuela, como eje de un alto grupo de personas con
infección de Mycobacterium tuberculosis y que servirán de estudio para la evaluación
antigénica del método planteado, por medio de ELISA usando antígenos específicos
de Mycobacterium tuberculosis. (MSP, 2016)
7
Genera una gran importancia para la Salud pública y también en la mejora de la calidad
de vida de las personas el llegar al nivel de diagnóstico diferencial entre la infección
activa y latente, debido a que se podrá dar inicio a un tratamiento oportuno, rápido y
adecuado en aquellos pacientes con la infección de forma activa y así como también
brindar una profilaxis en aquellos que se encuentran en un estado de latencia.
(OPS, 2016).
La implicancia de la evaluación de este método, generará para los Programas de
Control y Seguimiento de tuberculosis la necesidad de medir los gastos acumulados y
que implican para realizar un diagnóstico completo de tuberculosis, así como el tiempo
involucrado. En base al Costo vs Beneficio del diagnóstico oportuno, evidenciar que
este es el punto de partida para lograr avanzar en la erradicación de esta infección a
nivel local, nacional y mundial; tal cual es el objetivo imperativo para la Organización
Mundial de la Salud en infecciones respiratorias como la Tuberculosis.
8
CAPÍTULO II
MARCO REFERENCIAL
2 Antecedentes
En base a la bibliografía utilizada se establece como referencia a documentos que
enuncian los criterios y puntos de base para esta investigación como se describe en:
Una primera evaluación realizada en Italia de este nuevo tipo de ensayo de liberación
de interferón-γ, QuantiFERONTB Plus (QFT-Plus), que incluye un tubo de antígeno
adicional (TB2), estimulando las células T CD4 + y CD8 + en contacto de pacientes
con tuberculosis. Los pacientes se examinaron en busca de infección latente de
tuberculosis mediante prueba cutánea de tuberculina, QFT-Plus y QuantiFERON-TB
Gold in Tube (QFT-GIT). QFT-Plus tiene una asociación más fuerte con las medidas
sustitutivas de exposición a la tuberculosis que QFT-GIT en adultos para detectar
infección latente de tuberculosis. La respuesta de interferón-γ en el nuevo tubo de
antígeno utilizó una estimación indirecta de la respuesta específica CD8 + y se
correlaciona con el aumento de la exposición a Mycobacterium tuberculosis, lo que
sugiere una posible utilidad en la identificación de personas con infección reciente.
(Barcellini, Borroni et al., 2016)
El estudio realizado en Japón evaluó el rendimiento diagnóstico de QFT-Plus y se
comparó con el de QuantiFERON-TB Gold In-Tube (QFT-GIT). Se tomaron muestras
de sangre de 162 pacientes con tuberculosis y confirmada bacteriológicamente
(TB)activos y 212 voluntarios no infectados con Mycobacterium tuberculosis; estas
muestras fueron procesadas con QFT-GIT y QFT-Plus. El rendimiento diagnóstico de
QFT-Plus fue tan preciso como el de QFT-GIT a pesar de la falta del antígeno TB7.7.
Sin embargo, para obtener la mejor sensibilidad lo da el valor de corte para QFT-Plus
que sin comprometer especificidad de QFT-GIT. (Yi y Sasaki, 2016).
En España el uso de QuantifFERON (QTF) indica que la introducción de estas técnicas
en la asistencia cotidiana constituye sin duda el primer salto cualitativo en casi 100
años de aproximación al diagnóstico de la tuberculosis latente. Sin embargo, son muy
escasos los estudios que han investigado el comportamiento de estas técnicas en
determinados grupos de población, tales como los pacientes con distintos estados de
9
inmunodepresión y con alto riesgo de desarrollar tuberculosis activa. Este trabajo
pretende evaluar la aplicabilidad y utilidad de una de estas pruebas el QuantifFERON
(QTF), en el diagnóstico de la tuberculosis latente, presenta por primera vez datos en
pacientes de riesgo seleccionados en el ámbito de un centro hospitalario español.
(Cascante, Pascar, Eguía, y Hueto, 2007).
Un estudio en una clínica de Zambia investiga la sensibilidad del nuevo ensayo de
liberación de interferón gamma (IGRA), QuantiFERON-TB Gold Plus (QFT-Plus),
para la TB activa (utilizada como sustituto de la PPD o TST en la infección tuberculosa
latente). Muestras consecutivas analizadas en adultos mayores de 18 años con
tuberculosis pulmonar mediante la técnica Xpertw MTB / RIF (esputo), fueron
reclutados entre junio de 2015 y marzo de 2016. Muestras clínicas de sangre fueron
analizadas con QFT-Plus y la sensibilidad se definió como el número positivo dividido
por el número total probado, usando la regresión logística, se compararon con factores
asociados (VIH) con los resultados positivos de QFT-Plus para tuberculosis. De 108
pacientes 90 fueron positivos por QFTPlus, 11 fueron negativos y siete tuvieron
resultados indeterminados; la sensibilidad fue del 83% (IC 95% 75-90). En general, la
sensibilidad de QFT-Plus es similar a la de la prueba cutánea de tuberculina y otros
IGRA. Si bien la sensibilidad general no se ve afectada por el estado del VIH, la
sensibilidad QFT-Plus fue menor entre las personas que viven con VIH. (Telisignhe y
Amofa-sekyi, 2017).
2.1 Fundamentación teórica
2.1.1 Género Mycobacterium
El género Mycobacterium está integrado por bacilos largos de 3 a 5µm de longitud o
curvos en forma de maza, inmóviles, no esporulados, con abundantes gránulos
citoplasmáticos, que poseen una resistencia mayor a la tinción por los colorantes
comunes, pero una vez teñidos son resistentes a la decoloración con una mezcla de
alcohol ácido. Desde el punto de vista de los requerimientos atmosféricos algunos son
aerobios y otros microaerófilos. (Murray et al., 2014)
En cuanto a la velocidad de crecimiento algunas especies son de crecimiento rápido y
otras lento. Se destaca en su estructura una gran riqueza en lípidos (20-60%)
10
(Figura 1). El contenido de bases de guanina más citosina en la molécula de ADN es
de 62 a 70 moles %. El género comprende 50 especies, entre ellas patógenos primarios,
oportunistas y saprofitas. La especie más importante es Mycobacterium tuberculosis,
la cual vamos a utilizar como modelo al referirnos a las principales características del
género. (Robledo et al., 2006).
Figura 1 Estructura del Género Mycobacterium.
Composición química de la estructura interna de la bacteria Mycobacterium
tuberculosis. (Laynes, 2016).
Mycobacterium tuberculosis
En la práctica se acostumbra señalar como sinónimos a M. tuberculosis y bacilo
tuberculoso o MTB, pero conviene recordar que, taxonómicamente, existen dos
especies emparentadas genéticamente y, a la vez, aunque poco frecuente, agentes de
tuberculosis pulmonar, que son: M. bovis, M. pinnipedii, M. microti, M. africanum, M.
canetti y M. caprae. (Freund y Schapire, 1997).
11
Morfología, estructura, composición e identificación
La morfología característica suele ser bacilar, ligeramente curvada, siendo la
observable en frotis provenientes de cultivo más regular que la que se observa en frotis
de materiales patológicos. Como todas las células procariotas, las mycobacterias
poseen un citoplasma, la membrana celular y un espacio periplásmico que lo separa de
una gruesa y compleja pared celular. (Forero, Cristobal, y Desco, 2006).
Es imposible clasificar las mycobacterias en grampositivas o gramnegativas. Una vez
que captan los colorantes básicos el alcohol no las decolora, independientemente del
tratamiento con yodo. Los bacilos tuberculosos verdaderos se caracterizan por su
resistencia a la decoloración, es decir, la mezcla de alcohol etílico al 95% y ácido
clorhídrico al 3% (ácido-alcohol), decolora rápidamente todas las bacterias, excepto las
mycobacterias. (Veropoulos et al., 1999).
Figura 2 Tinción Ziehl Neelsen.
Baciloscopía de esputo de pacientes con infección activa a MTB, los bacilos de color
rosado-vino son MTB. (LRNT, 2015). (Renault, 2010)
12
Tal resistencia depende de la integridad de la cubierta cérea. La técnica de Ziehl-
Neelsen se emplea para la tinción y la identificación de las bacterias acidorresistentes;
(Figura 2). En extensiones de esputo o cortes de tejido se demuestra la presencia de
mycobacterias por la fluorescencia amarillo-naranja después de aplicar los colorantes
fluorocrómicos (Auramina y Rodamina). (Andrade, 1996).
Naturaleza de la envoltura de M. tuberculosis
La envoltura bacteriana provee protección y soporte a las bacterias y también posee
mecanismos que permiten el intercambio de sustancias entre la bacteria y el medio
ambiente. Hay una marcada similitud tanto química como estructural entre las
envolturas de la mayoría de las bacterias, Mycobacterium tuberculosis y otras
mycobacterias son biológicamente similares a las bacterias Gram positivas (aunque
frente a la tinción de Gram; las mycobacterias son débilmente Gram positivas o no se
tiñen), pero tienen aspectos distintos. En especial, se debe destacar que, aunque ambos
poseen peptidoglicano, las moléculas unidas o asociadas a este polímero.
(Dinnes et al, 2007).
Fisiología y metabolismo
El metabolismo de las mycobacterias es muy variable, encontrándose las
mycobacterias de crecimiento rápido, que crecen en menos de tres días en medios
simples, así como mycobacterias que crecen lentamente y necesitan medios más ricos,
hasta M. leprae que aún no ha podido ser cultivada en medios sin células.
(Steingart et al, 2006)
2.1.2 Patogenia
Los núcleos goticulares conteniendo muy pocos bacilos, dispersos en el aire,
provenientes de un sujeto enfermo con tuberculosis pulmonar activa, son lo
suficientemente pequeños para no quedar atrapados en el aparato mucociliar bronquial
y así alcanzar el espacio terminal aéreo donde comienza la multiplicación (Figura 3).
El foco inicial es casi siempre de localización subpleural generalmente ubicado en la
zona media de los pulmones donde el mayor flujo aéreo favorece el establecimiento de
los bacilos inhalados. (Herranz y Bernaola, 2007).
13
Figura 3 Patogenia de M. tuberculosis.
El comienzo de su división es a través de los macrófagos como proceso desencadena
reacciones inflamatorias con la capacidad de ser granulomas que posteriormente
formarán necrosis. (Lúcida, 2008).
Excepcionalmente se encuentra el foco inicial en otras áreas (como: piel, intestino,
orofaringe, genitales). En la mayoría de los casos el foco pulmonar inicial es único,
aunque en un 25% de los casos pueden ser múltiples. En el pulmón las bacterias son
ingeridas por los macrófagos alveolares, los cuales pueden tener un bajo grado de
actividad antimycobacteriana como para eliminar pequeñas cantidades de bacilos.
(Brown y Wallace, 2010).
Sin embargo, la multiplicación bacteriana no puede ser impedida y, eventualmente,
destruye los macrófagos. Desde el torrente sanguíneo son atraídos hacia el foco
linfocitos y monocitos, diferenciándose los últimos en macrófagos que ingieren las
bacterias liberadas de las células degeneradas, y lentamente se desarrolla una o más
áreas de neumonitis. (Chaturvedi y Cockcroft, 1992).
14
2.1.3 Clínica de la Tuberculosis primaria.
Primo infección tuberculosa En cualquier área donde el bacilo se localice provocará
una reacción inflamatoria que constituye el chancro de inoculación, habitualmente
pulmonar y mucho menos frecuentemente digestivo, cutáneo o mucoso. Alrededor del
bacilo se agrupan una serie de células mononucleadas linfocitos y macrófagos con
algunas células gigantes (células de Langhans). El centro de este folículo o granuloma
suele necrosarse y luego se calcifica. En la mayoría de los casos se produce la
destrucción de las mycobacterias y la única evidencia de infección es un test cutáneo
de hipersensibilidad a la tuberculina positivo y otras veces los bacilos pueden persistir
en forma latente. (Milburn, 2001).
En una minoría de casos los antígenos en el complejo primario (foco pulmonar inicial
más ganglio linfático regional) alcanzarían una concentración suficiente, que el
desarrollo de hipersensibilidad resultaría en una necrosis y calcificación visible
radiológicamente. Junto con el desarrollo de hipersensibilidad pueden asociarse
manifestaciones alérgicas como eritema nodoso o queratoconjuntivitis flictenular. La
mayoría de estos casos quedan en esta primoinfección que da lugar a la alergia
tuberculínica y a la inmunidad tuberculosa, que provoca un estado defensivo en el
organismo hacia nuevas infecciones o a la diseminación de la infección en curso.
(Oxlade, Schwartzman y Menzies, 2007).
Esta inmunidad fallará bajo alguna circunstancia que produzca inmunodepresión,
provocando una enfermedad tuberculosa meses o años después de la infección por el
mismo bacilo: reinfección endógena o por reinfección exógena (adquisición de un
nuevo bacilo del exterior). (Kumar, y Cotran, 2003).
2.1.4 Epidemiología
M. tuberculosis infecta a 1.7 billones de personas en el mundo (1/3) de la población
mundial) y causa 3 millones de muertes por año (Figura 4). Los dos factores esenciales
para su rápida diseminación son el hacinamiento, que favorece la transmisión aérea, y
la población con baja resistencia natural. La distribución etaria de la enfermedad refleja
el grado de transmisión en una población dada. (OMS, 2015).
15
Figura 4 Distribución epidemiológica de la Tuberculosis en el mundo.
Ecuador y Venezuela muestran para el año 2008 estar entre los 1.000y 9.999 nuevos
casos del año. (IERM, 2010).
Es por esta razón que la enfermedad en la vejez es generalmente debida a reactivación
de una infección adquirida en el pasado, mientras que en los niños pequeños indica
transmisión activa en la comunidad. Además, actualmente la tuberculosis está siendo
más frecuentemente diagnosticada en adultos jóvenes y la principal razón es la
infección por VIH en estos pacientes. La incidencia de tuberculosis activa en esta
población es mucho mayor que en la población general y debido a esta observación es
que se incluye desde 1993 a la tuberculosis pulmonar o extrapulmonar en la definición
de caso de SIDA. Según los criterios del CDC (Center for Disease Control, EE.UU.),
todo paciente VIH positivo con menos de 200 células CD4 y un cuadro de tuberculosis
diagnosticado equivale a un estadio SIDA. (Bermejo, Clavera y De La Rosa, 2007).
16
2.1.5 Aspectos inmunológicos
La tuberculosis es el prototipo de infección de la cual la respuesta inmune de tipo
celular es esencial para su control. Si bien se ha comprobado una producción abundante
de anticuerpos durante la infección, no se ha demostrado su papel en la defensa del
huésped. Éste casi no tiene una respuesta inmunológica en las primeras semanas, en las
que los bacilos se multiplican libremente en el espacio alveolar, adentro de los
macrófagos. (Araujo et al., 2008).
El efecto bacteriostático de estos macrófagos alveolares sobre los bacilos parece ser
variable y muy débil. La respuesta a la infección por mycobacterias es el ejemplo
clásico de una respuesta inmune mediada por células a un parásito intracelular
facultativo. Las mycobacterias, dentro de las células fagocíticas, son capaces de evadir
la respuesta humoral y mantener viabilidad por largos períodos de tiempo. Las células
T toman parte en la activación y regulación de los macrófagos y en el control del
crecimiento mycobacteriano. (Hernández, Mata, Aguilar y Orozco, 2011).
La respuesta TH1 que constituye la respuesta inmune protectora a M. tuberculosis, se
encuentra controlada por interleuquina-1 e interleuquina-12, mediada por células T
CD4 secretando interleuquina-2 e interferón gamma-interferón (IFN- γ),
probablemente, algunas células T CD4 se diferencien y conviertan en células T de
memoria de larga vida, expresando un fenotipo de memoria. (HICKS, 2014).
En la inmunidad anti-mycobacteriana están implicados diferentes grupos de células T
incluyendo las células T CD4 alfa/beta, las células T CD8 alfa/beta y las células T
gamma/delta. Ambos, los fagocitos y los microorganismos sintetizan proteínas con el
fin de facilitar su sobrevida. Los datos recientes muestran una fuerte correlación entre
la producción de interferón gamma (INF-) en las células T gamma/delta y la
manifestación de tuberculosis pulmonar primaria, lo cual es consistente con la hipótesis
de que estas células tienen un efecto inmune protector en la infección. Las células T
CD8, han mostrado ser protectoras en contra de M. tuberculosis en el ratón. Los datos
obtenidos por experimentación sugieren que el modo primario de acción de estas
células es la secreción de citoquinas, más que una actividad lítica directa de las células
17
CD8. Su acción es prolongar la sobrevida del huésped infectado. La respuesta inmune
controla, pero no elimina al patógeno. (García y Figueroa, 2001).
La falta de una respuesta inmune apropiada da como resultado una tuberculosis aguda
activa. En la mayoría de los casos de infección por M. tuberculosis, el individuo
permanece asintomático y no infeccioso. Esta latencia clínica a menudo se extiende
durante toda la vida del individuo. Sin embargo, la reactivación de la infección latente
puede ocurrir en respuesta a perturbaciones de la respuesta inmune, produciendo
enfermedad activa. La infección por virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), la
diabetes mellitus, el tratamiento con corticosteroides, el envejecimiento y el abuso de
drogas o alcohol, aumentan el riesgo potencial de reactivación de enfermedad latente.
M. tuberculosis persiste en los macrófagos dentro de un granuloma en los huéspedes
infectados. (García, Sarmiento y Acosta, 2009).
2.1.6 Citoquinas e Interferón gamma
El control inmunológico de la infección por MTB está basado en una respuesta de
células T tipo 1(TH1). La producción de IL-12 es inducida después de la fagocitosis de
M. tuberculosis, por los macrófagos y células dendríticas, las cuales desarrollan una
respuesta TH1 con producción de IFN-γ. La importancia de IL-12, en el control de la
infección por MTB se puede observar en el ratón deficiente del gene-IL-12. Cuando
estos ratones se infectan, muestran una carga bacteriana importante y una disminución
del tiempo de sobrevida en relación con los ratones del grupo control. Esto
probablemente se debe a una reducción sustancial en la producción de IFN-γ25. Los
humanos con mutaciones en los genes IL-12p40 o en el receptor de IL-12 presentan
una disminución en la producción de IFN-γ en las células T y son más susceptibles a
la diseminación de BCG y a las infecciones por M. avium, aunque no a la de M.
tuberculosis. (Rosas y Arce, 2007).
18
Figura 5 Respuesta inmunitaria frente a Infección por M. tuberculosis.
Proceso de activación del sistema inmunitario, desencadena reacciones como la
producción de Interferón gamma por células CD4 y CD8. Fuente: (Renault, 2010)
El interferón gamma (IFN-γ) es clave en el control de la infección por M. tuberculosis.
Esta citoquina es producida por las células CD4 y CD8 durante la infección tuberculosa
y por las células asesinas naturales (NK). Recientemente, se ha reportado la producción
de IFN-γ dependiente de IL-12 en los macrófagos alveolares infectados con
mycobacterias. El ratón deficiente en IFN-γ (knock-out, GKO) es más susceptible a M.
tuberculosis virulentos. Los individuos con deficiencias en los genes del IFN-γ o del
receptor del IFN-γ están en riesgo de padecer infecciones mycobacterianas graves,
incluyendo a M. tuberculosis. (Hernández, Mata, Aguilar y Orozco, 2011).
El efecto de la falta IFN-γ es el crecimiento sin control del bacilo en los órganos del
ratón GKO, y aunque se forman granulomas, éstos se vuelven rápidamente necróticos.
En estos ratones la activación de los macrófagos es defectuosa y la expresión de NOS2
es baja factores que posiblemente contribuyan en gran medida a la susceptibilidad.
Aunque la producción de IFN-γ sola es insuficiente para el control de la infección por
19
M. tuberculosis, se requiere de esta citoquina para tener una respuesta protectora a este
patógeno. (Nelson & Et al, 1998). El IFN-γ es producido tanto por sujetos PPD
positivos sanos como por enfermos. Si bien, la producción de IFN-γ puede variar
mucho entre sujetos y algunos estudios sugieren que los niveles de IFN-γ están
disminuidos en pacientes con tuberculosis activa la medición nada más de esta
citoquina puede no ser un correlato confiable de respuesta inmune protectora. De
hecho, un estudio reciente mostró que M. tuberculosis puede impedir a los macrófagos
responder adecuadamente al IFN-γ. Esta capacidad de M. tuberculosis para limitar la
activación de los macrófagos por el IFN-γ sugiere que la cantidad de IFN- γ producida
por las células T, no es tan predictiva del resultado como lo es la habilidad de las células
para responder a esta citoquina. (Lambert et al., 2003).
2.1.7 Inmunoprotección
La BCG es una vacuna con microorganismos vivos atenuados en forma irreversible,
derivada de una cepa de M. bovis (Bacilo de Calmette y Guerin, en honor a sus
creadores). Esta cepa entra en los macrófagos y se replica brevemente antes de ser
destruida, y debería desencadenar el mismo tipo de respuesta inmune que M.
tuberculosis, asumiendo que los antígenos más importantes están expresados. Ya han
sido administrados billones de dosis a nivel mundial teniendo escasos efectos
colaterales (chancro de inoculación, adenopatía localizada), que la hacen una de las
vacunas más seguras conocidas. Una contraindicación es el paciente inmunodeprimido
(SIDA). (Cascina et al, 2000)
La vacunación en niños produce una disminución del 60-80% de la incidencia de
tuberculosis en una población dada. Su uso es recomendable en áreas de alta
prevalencia de infección tuberculosa. En tanto que la BCG no previene la infección,
generalmente previene contra la progresión a enfermedad clínica y su efectividad en
prevenir la enfermedad generalizada en niños es sorprendente (7-8 veces menos que en
población no vacunada). El efecto de la vacunación con BCG en la hipersensibilidad a
la tuberculina depende de la edad de vacunación y el intervalo al realizar el test cutáneo,
disminuyendo el porcentaje de test positivo cuando menor haya sido la edad en que se
administró la última dosis. (OMS, 1995).
20
Profilaxis para Tuberculosis
El tratamiento primario de infecciones por mycobacterias es la quimioterapia
antibacteriana que se detalla:
Los dos fármacos principales utilizados para combatir la tuberculosis (antifímicos) son
la isoniazida y la rifampicina. Los otros son pirazinamida, etambutol y estreptomicina.
Los fármacos de segunda línea son más tóxicos, menos eficaces o tienen ambas
características, y se recurrirá a ellos sólo en circunstancias extremas (ineficacia
terapéutica y resistencia a múltiples fármacos). (Griffith et al, 2009).
En esta categoría están kanamicina, capreomicina, etionamida, cicloserina, ofl oxacina
y ciprofloxacina. En Estados Unidos se recomienda un régimen de cuatro
medicamentos que incluye isoniazida, rifampicina, pirazinamida y etambutol para
personas que muestran riesgos leve y moderado de infectarse con bacilos tuberculosos
farmacorresistentes. Los factores de riesgo incluyen migración reciente de algún país
de América Latina o de Asia; personas con infecciones por VIH o que están en peligro
de contraerlas y viven en un área en que hay una prevalencia pequeña de bacilos
tuberculosos resistentes a múltiples fármacos, y sujetos que han recibido un tratamiento
con un régimen que no incluyó rifampicina. (Robledo et al, 2006)
2.1.8 Cultivo de M. tuberculosis
Los medios para el cultivo primario de mycobacterias deben incluir uno de tipo no
selectivo y otro selectivo. Los de este último tipo contienen antibióticos para evitar la
proliferación excesiva de bacterias y hongos contaminantes. Se conocen tres fórmulas
generales que pueden utilizarse para los dos tipos mencionados de medios.
Medio de agar semi-sintético
Los medios de esta categoría (como Middlebrook 7H10 y 7H11) contienen sales
definidas, vitaminas, cofactores, ácido oleico, albúmina, catalasa y glicerol; el medio
7H11 contiene también hidrolizado de caseína. La albúmina neutraliza los efectos
tóxicos e inhibidores de los ácidos grasos en la muestra o el medio de cultivo. Los
grandes inóculos permiten la proliferación en los medios mencionados, en el curso de
semanas; dado que se necesitan tales inóculos, los medios mencionados pueden ser
21
menos sensibles que otros para el aislamiento primario de mycobacterias. Los medios
de agar semi-sintéticos se utilizan para observar la morfología de las colonias para
evaluar la susceptibilidad y si se les agrega antibióticos y verde de malaquita, sirven
como medios selectivos. (Vincent y Gutierrez, 2007).
Medios de huevos pesados
Los medios en cuestión (como el de Lowenstein-Jensen) contienen sales definidas,
glicerol y sustancias orgánicas complejas (como serían huevos frescos o yemas de
huevo, harina de papa y otros ingredientes en combinaciones). Se incluye el verde de
malaquita para inhibir la proliferación de otras bacterias. Los inóculos pequeños en
muestras teñidas de los pacientes proliferarán en dichos medios en un lapso de tres a
seis semanas. Los medios en cuestión, con la adición de antibióticos, se utilizan como
medios selectivos. (Herranz y Bernaola, 2007).
Caldos (medio líquidos para M. tuberculosis)
Los caldos señalados (Middlebrook 7H9 y 7H12) permiten la proliferación de inóculos
pequeños. Por lo común, las mycobacterias proliferan en cúmulos o masas, dado el
carácter hidrófobo de la superficie celular. Si se agregan ésteres hidrosolubles de ácidos
grasos (tweens), humedecen la superficie y permiten la proliferación dispersa en el
medio líquido. En ellos es más rápida la multiplicación de los microorganismos que en
medios complejos. (Dorronsoro y Torroba, 2007).
Prueba de la tuberculina PPD
Esta prueba estudia la hipersensibilidad frente a antígenos proteicos de M. tuberculosis.
La tuberculina de Koch (OT: old tuberculin) era un extracto de caldo de bacilo
tuberculoso. En 1934 Siebert creó un precipitado proteico que llamó derivado proteico
purificado (PPD) y que se usa hasta hoy. La reacción se prueba con la
intradermorreacción de Mantoux. Se inyectan en la dermis de la cara anterior del
antebrazo 0,1 ml de tuberculina de 5 UT. Después de 72 hs se mide el diámetro de la
induración producida (no del eritema). La interpretación de los diámetros de las
induraciones es la siguiente: 10 mm Positiva 5-9 mm Dudosa 0-4 mm Negativa.
(Herranz y Bernaola, 2007).
22
Diagnóstico molecular de las mycobacteriosis
El diagnóstico de las mycobacteriosis se basa en la amplificación genómica de
fragmentos secuenciales de ADN aislado a partir de cultivos de esputo en pacientes
con tuberculosis pulmonar activa, procede desde la extracción de ADN a través del
cultivo y en base a la amplificación del gen. Esta técnica molecular, basada en la
amplificación por PCR del gen hsp65 y su posterior análisis del polimorfismo de los
fragmentos de restricción (RFLP), mediante dos enzimas de restricción (BstEII y
HaeIII), consigue una identificación rápida, precisa y económica de todas las cepas
micobacterianas en los laboratorios clínicos. Aunque existen otras técnicas similares
(vg., PCR-RFLP del 16S-23S), ésta es, actualmente, la mejor desarrollada, con una
aplicación práctica de indudable valor. A título de ejemplo, se puede obtener el
resultado final en la misma jornada laboral. (Bauquerez y et al., 2009).
2.2 Marco Legal
Basado en la Constitución de la República del Ecuador en su Art. 32.- “La Salud es un
derecho que garantiza el Estado cuya realización se vincula al ejercicio de otros
derechos”; Por lo tanto esta misma ley en su Art. 6.- “Es responsabilidad del Ministerio
de Salud Pública numerales 5.- Regular y vigilar la aplicación de las normas técnicas
para la detección , prevención, atención integral y rehabilitación, de enfermedades
transmisibles, no transmisibles, crónico-degenerativas, discapacidades y problemas de
salud pública declarados prioritarios y determinar las enfermedades transmisibles de
notificación obligatoria, garantizando la confidencialidad de la información”. De
conformidad con los artículos planteados se establece optar el presente trabajo de
Investigación en el apoyo y soporte al Programa Nacional de Control de la Tuberculosis
en el Ecuador.
Ley orgánica de Salud el Programa Nacional de prevención y Control de la
Tuberculosis, se establece brindar resultados en la prevención, diagnóstico, control y
vigilancia de la Tuberculosis, así como en el tratamiento estandarizado directamente
observado que conduzca a la reducción de la tuberculosis en el país.
Finalmente, basado en el Objetivo 4.6 del Plan Nacional del Buen Vivir 2013-2017 que
establece “Impulsar la formación de talento humano para la innovación social, la
23
investigación básica y aplicada en áreas de producción priorizadas, así como la
resolución de problemas nacionales, incentivando la articulación de redes de
investigación e innovación con criterios de aprendizaje incluyente”. Complementando
estos argumentos en el soporte hacia el proyecto enunciado por parte de Cesar David
Guerra Naranjo estudiante de la Carrera de Bioquímica Clínica en la Facultad de
Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador.
2.3 Hipótesis
Se estableció para la presente investigación las siguientes hipótesis:
2.3.1 Ho:
Los pacientes con tuberculosis pulmonar activa responden a los antígenos ESAT6 y
CFP10, con una mayor producción de interferón gamma por los linfocitos CD4 que los
CD8.
𝐻𝑂: 𝜇1 = 𝜇2
2.3.2 Hi:
Los pacientes con tuberculosis pulmonar activa no responden a los antígenos ESAT6
y CFP10, ni con mayor actividad en producción de interferón gamma por los linfocitos
CD4 y CD8.
𝐻𝑖 : 𝜇1 ≠ 𝜇2
2.4 Conceptualización de las variables
En el presente estudio de investigación se trabajó con las siguientes variables:
Variable 1: Métodos de diagnóstico propicios de pacientes con tuberculosis pulmonar
activa y latente.
Variable 2: Caracterización de la respuesta inmunológica “in vivo” e “in vitro” de
pacientes con tuberculosis pulmonar activa y latente.
24
CAPÍTULO III
METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN
3 Diseño de la investigación
3.1.1 Enfoque de Investigación
El presente trabajo de investigación usa el paradigma de enfoque cuantitativo, el cual
hace referencia según (Monje, 2011): “La investigación experimental se ha ideado con
el propósito de determinar, con la mayor confiabilidad posible, relaciones de causa-
efecto, para lo cual uno o más grupos, llamados experimentales, se exponen a los
estímulos experimentales y los comportamientos resultantes se comparan con los
comportamientos de ese u otros grupos, llamados de control que no reciben el
tratamiento o estímulo experimental” y también manifiesta que: “Es aquella que
permite con más seguridad establecer relaciones de causa a efecto. Usa un grupo
experimental y de control, el investigador manipula el factor supuestamente causal, usa
procedimientos al azar para la selección y asignación de sujetos y finalmente el
tratamiento es artificial y restrictivo”. Es por esta razón que se empleó en el presente
estudio, debido a que se determinó la relación entre las variables planteadas y con ellos
se probó la veracidad o no veracidad de las hipótesis planteadas.
3.1.2 Nivel de Investigación
Además se empleó el nivel de investigación aplicativo que según en lo correspondiente
a este nivel usando como referencia a lo suscrito por Supo (2013): ”El nivel aplicativo
plantea resolver problemas o intervenir en la historia natural de enfermedad, la cual
enmarca la innovación técnica, artesanal e industrial como la científica” a su vez según
Marín (2008): “Esta forma de investigación requiere la combinación de los métodos
analítico y sintético, en conjugación con el deductivo y el inductivo, con el fin de
responder los cuestionamientos del objeto que se investiga”.
3.1.3 Tipo de Investigación
El tipo de investigación empleado para este documento referencial se basa en el tipo
es de tipo con intervención del investigador conllevando al concepto observacional y
experimental, manifiesta Villalobos (2011): “Un estudio experimental implica tomar
25
mediciones del sistema bajo estudio, manipular el sistema y luego tomar mediciones
adicionales usando el mismo procedimiento para determinar si la manipulación ha
modificado los valores de las mediciones; en contraste, un estudio observacional no
necesita manipulación experimental. Por el contrario, los datos son recogidos y las
correlaciones entre predictores y la respuesta son investigadas” y según Álvarez
(2001): “Estudios experimentales y observacionales. En ambos tipos de estudios, el
efecto de las diferencias de una variable independiente (o variables) en el
comportamiento de una variable dependiente es observado. La diferencia entre los dos
tipos es la forma en que el estudio es conducido; cada uno de ellos puede ser muy
efectivo.”
Los pasos básicos para un experimento son:
• Planeamiento estadístico de la investigación, lo cual incluye encontrar fuentes de
información, selección de material disponible en el área y consideraciones éticas
para la investigación y el método propuesto. Se plantea un problema de estudio,
• Diseñar el experimento concentrándose en el modelo y la interacción entre
variables independientes y dependientes. Se realiza un muestreo consistente en la
recolección de datos referentes al fenómeno o variable que deseamos estudiar. Se
propone un modelo de probabilidad, cuyos parámetros se estiman mediante
estadísticos a partir de los datos de muestreo. Sin embargo, se mantiene lo que se
denominan «hipótesis sostenidas» (que no son sometidas a comprobación). Se
valida el modelo comparándolo con lo que sucede en la realidad. Se utiliza
métodos estadísticos conocidos como test de hipótesis o prueba de significación.
• Se producen estadísticas descriptivas.
• Inferencia estadística. Se llegará a un consenso acerca de qué dicen las
observaciones acerca del mundo que observamos.
• Se utilizará el modelo validado para tomar decisiones o predecir acontecimientos
futuros. Se produce un reporte final con los resultados del estudio.
La Caracterización de la respuesta inmunológica “in vivo” e “in vitro” de pacientes
con tuberculosis pulmonar activa y latente partirá con un enfoque cuantitativo puesto
que se contiene datos numéricos cuantificables de exámenes en base sanguíneos en
26
búsqueda de los analitos reaccionantes a Tuberculosis (Interferón gamma), esto
conlleva a un nivel aplicativo tal como ya se lo señala parte de los métodos y
herramientas usadas para ser evaluadas en una investigación ya sea la modificación de
herramientas clásicas de la triada en tuberculosis ya expuesta (marco teórico), y
finalmente con un aporte observacional y experimental que conlleva el uso y aplicación
de las herramientas de historias clínica de los pacientes del Hospital José María Vargas,
localizado en Caracas, Venezuela, con alta demanda de pacientes con Tuberculosis.
3.2 Población y muestra
La población a aplicar fueron los pacientes del Hospital San José de Caracas Venezuela
que ingresan al área de Neumología con la clínica representativa de tuberculosis
pulmonar. Partiendo de este punto, el modelo de muestreo probabilístico por racimos
o clústers el cual aplica será la siguiente ecuación:
𝑛 =𝑁 ∙ 𝑍2 ∙ 𝑝 ∙ (1 − 𝑝)
(𝑁 − 1) ∙ 𝑒2 + 𝑍2 ∙ 𝑝 ∙ (1 − 𝑝)
Ecuación 1 Cálculo de la muestra.
Fórmula a aplicarse para poder iniciar el estudio con una población determinada.
(Robles, 2015).
N: es el tamaño de la población o universo (número total de posibles encuestados).
k: es una constante que depende del nivel de confianza que asignemos. El nivel de
confianza indica la probabilidad de que los resultados de nuestra investigación sean
ciertos: un 95,5 % de confianza es lo mismo que decir que nos podemos equivocar con
una probabilidad del 4,5%.
Tabla 1 Niveles de K según el nivel de confianza (%)
K 1,15 1,28 1,44 1,65 1,96 2 2,58
Nivel de
confianza
75% 80% 85% 90% 95% 95,5% 99%
Fuente: Autor de la investigación.
27
e: es el error muestra deseado. El error muestra es la diferencia que puede haber entre
el resultado que obtenemos preguntando a una muestra de la población y el que
obtendríamos si preguntáramos al total de ella.
p: es la proporción de individuos que poseen en la población la característica de
estudio. Este dato es generalmente desconocido y se suele suponer que p=q=0.5 que
es la opción más segura.
q: es la proporción de individuos que no poseen esa característica, es decir, es 1-p.
n: es el tamaño de la muestra (número de encuestas que vamos a hacer).
Z: nivel de confianza
(Villalobos G. 2011)
Por lo tanto, el tamaño de la muestra corresponde a un valor de 16 pacientes dentro del
estudio probabilístico.
3.3 Materiales y Métodos
3.3.1 Materiales.
• Historias Clínicas de pacientes del Hospital (Reportes del Laboratorio
microbiológico y hematológico)
• Muestras microbiológicas de DNA de aislados de esputo por parte de los
pacientes con tuberculosis pulmonar activa
• Insumos de Oficina
• Kit QuantiFERON-TB Gold Plus
• Material para biología molecular.
28
3.3.2 Método
La base del proyecto de investigación contiene una matriz a aplicarse en el estudio de
pacientes con tuberculosis pulmonar activa, ver (Tabla 2).
Tabla 2 Metodologías de diagnóstico de Tuberculosis pulmonar
Fuente: Qiagen QuantiFERON TB Gold Plus Kit Insert
Se reunió los datos de los pacientes del Hospital José María Vargas cuyo aporte se basa
en los resultados del período de abril y mayo del 2017 en base hemograma total y
cultivo microbiológico con los respectivos distintivos de fecha para evidenciar el
tiempo del resultado. Llevado a la par del análisis sanguíneo propuesto para
ARGUMENTO MÉTODO RECURSO
Análisis del comportamiento In
vitro de las células T CD4 y CD8 ELISA
QuantiFERON-TB Gold
Plus
Análisis del comportamiento In
vivo por medio de aplicación de
Tuberculina humana
Intradérmico PPD tuberculina humana
Amplificación de DNA de
Mycobacterias aisladas de
esputos clínicos
PCR Primers Tb11-Tb12
Genotipificación Mycobacterias PRA Enzimas de restricción
HaeIII y BstE2
Baciloscopía de esputos de
pacientes con TB pulmonar
activa
Ziehl Neelsen Tinción para BAAR
29
investigación actual. Reportados en su totalidad en hoja de Excel como programa para
el tratamiento de los resultados en general.
Criterios de inclusión
Se incluyeron en este estudio:
• Pacientes con baciloscopía con pacientes 1+, 2+ y 3+.
• Pacientes con clínica de tuberculosis: Tos, fiebre, sudoraciones nocturnas, y
pérdida de peso.
• Pacientes con positividad 10mm a PPD.
Criterios de exclusión
Se excluyeron de este estudio:
• Pacientes inmunodeficientes
• Pacientes con tratamiento previo de Tuberculosis
• Pacientes negativos a baciloscopía
• Pacientes negativos a PPD, <10mm
3.4 Diseño de experimentación
En base a las variables implicadas y la repetitividad y reproducibilidad de los métodos
a evaluar se aplicará un diseño longitudinal experimental con grupo control y
mediciones antes después.
3.5 Operacionalización de las Variables
El proyecto de investigación establece dos parámetros a analizarse, lo cual las variables
a medirse son los métodos de diagnóstico de tuberculosis y el segundo que tenemos el
mayor enfoque es la caracterización de la respuesta inmunológica “in vivo” e “in vitro”;
ver (Tabla 3).
30
Tabla 3 Variables de la investigación
Variable Dimensiones Indicadores
Métodos de diagnóstico de
Tuberculosis
Clínica del paciente Historia clínica y resultados
hemáticos
Convencional Baciloscopía, PCR, ELISA y
PPD.
Caracterización de la
respuesta inmunológica “in
vivo” e “in vitro”.
PCR Presencia del gen hsp56
ELISA sangre total
Densidad óptica del INF-
gamma producido (Menor
tiempo) CD4 y CD8
Tuberculina Diámetro de la pápula generada
Fuente: Autor de la investigación.
3.6 Técnicas e instrumentos de recolección de datos
La técnica de recopilación de datos según Sabino (2010) es: “todo proceder
sistemático que tiene como finalidad bajar los niveles de consumo de recursos para
alcanzar un fin determinado”.
Por lo cual en el presente estudio como técnica se empleó la Observación, en el análisis
de los datos relevantes de las historias clínicas. Según Puente (2008): “Es una técnica
que consiste en observar atentamente el fenómeno, hecho o caso, tomar información y
registrarla para su posterior análisis.”; es decir que “la observación es un procedimiento
de recolección de datos e información que consiste en utilizar los sentidos para observar
hechos y realidades sociales presentes y a la gente donde desarrolla normalmente sus
actividades”. (Fabrii, 2009).
31
El instrumento empleado es la Guía de observación, elaborada con parámetros que sean
útiles para la investigación. Según Aguilar (2005): “La Guía de observación es un
registro abierto o cerrado de algunos aspectos que se pueden observar directamente en
el individuo cuando éste realiza la actividad evaluativa”. Ver (Anexo 1).
3.7 Validez y confiabilidad
La validación se realizó por juicio de un experto en el área clínica de Inmunología, y
biología molecular con cargo de responsable de calidad del laboratorio clínico. Para lo
cual se adjuntará la solicitud, las instrucciones, la matriz de operacionalización de
variables y el instrumento de recolección de datos con el objetivo, de recolectar la
información estrictamente necesario de las historias clínicas de los pacientes, y sobre
los métodos usados para el diagnóstico laboratorial del Tuberculosis para el
correspondiente estudio. A su vez la validez para esta investigación los resultados de
positividad frente a la infección de MTB serán corroborados por los parámetros del Kit
QuantiFERON TB Gold Plus. Ver (Tabla 5).
La confiabilidad se refiere a la capacidad del instrumento para arrojar datos o
mediciones que correspondan a la realidad que se pretende conocer, o sea, la exactitud
de la medición, así como a la consistencia o estabilidad de la medición en diferentes
momentos. A mayor confiabilidad de un instrumento, menor cantidad de error presente
en los puntajes obtenidos. La estabilidad se relaciona con el grado en que el instrumento
permite los mismos resultados en aplicaciones repetidas. Se dice que un instrumento
es confiable si se obtienen medidas o datos que representen el valor real de la variable
que se está midiendo. La confiabilidad se puede aumentar:
• Aplicando las reglas generales de elaboración de instrumentos, de tal forma que
se eliminen los errores de medición, como preguntas ambiguas.
• Elaborando instrucciones claras que orienten el llenado o utilización de los
instrumentos.
• Aplicando las medidas de control de calibraciones adquiridas dentro del Kit
QuantiFERON TB-Gold.
La validez se refiere al grado en que un instrumento mide lo que se pretende medir. La
forma de garantizar la validez de un instrumento es construirlo una vez que las variables
32
han sido claramente especificadas y definidas, para que estas sean las que se aborden
y no otras; también se puede recurrir a la ayuda de personas expertas en el tema para
que revisen el instrumento, a fin de determinar si cumple con la finalidad establecida.
Tabla 4 Interpretación de los resultados del QFT-Plus
Nulo
(UI/ml)
TB1 CD4
(UI/ml)
TB2 CD8
(UI/ml) Mitógeno∗
Resultado
QuantiFERON Interpretación
≤ 8,0
0,35 y
25% del
valor del
nulo
Cualquier
Cualquiera Positivo†
Infección por
M. tuberculosis
probable
Cualquiera
0,35 y
25% del
valor del
nulo
Infección por
M. tuberculosis
improbable
<0,35 o
0,35 y
<25% del
valor nulo
<0,35 o
0,35 y
<25% del
valor nulo
0,5 Negativo
La probabilidad
de infección con
M. tuberculosis
no se puede
determinar
<0,35 o
0,35 y
<25% del
valor nulo
<0,35 o
0,35 y
<25% del
valor nulo <0,5
Indeterminado‡
>8,0§ Cualquiera
∗ Las reacciones al control positivo del Mitógeno (y en ocasiones a los antígenos TB) pueden estar fuera del rango del lector de
microplacas. Esto no afecta a los resultados. El software QFT-Plus notifica los valores > 10 ml como > 10 UI/ml.
† Si no se sospecha una infección por M. tuberculosis, un resultado inicialmente positivo puede confirmarse volviendo a analizar
por duplicado las muestras de plasma originales con el ensayo QFT-Plus ELISA. Si el análisis duplicado de una o de ambas réplicas da positivo, se considerará que el individuo ha dado positivo en el ensayo.
‡ Consulte el apartado “Resolución de problemas” para conocer las posibles causas.
§ En estudios clínicos, menos del 0,25% de los sujetos presentaron niveles de IFN-γ de > 8,0 UI/ml para el valor de Nulo.
Fuente: Qiagen QuantiFERON TB Gold Plus Kit Insert
33
3.8 Control de calidad del ensayo
La exactitud de los resultados del análisis dependerá de la precisión de la curva estándar
que se genere. Por consiguiente, deben revisarse los resultados extraídos de los
estándares antes de interpretar los resultados correspondientes a las muestras
analizadas.
Para que el ensayo ELISA se considere válido:
• El valor DO medio para el estándar 1 debe ser ≥ 0,600.
• El %CV de los valores DO de las réplicas del estándar 1 y el estándar 2 debe
ser ≤ 15%.
• Los valores DO de las réplicas del estándar 3 y el estándar 4 no deben presentar
una desviación mayor que 0,040 unidades DO respecto a su media.
El coeficiente de correlación (r) calculado a partir de los valores medios de absorbancia
de los estándares debe ser ≥ 0,98. El programa de análisis del QFT-Plus calcula y
muestra los valores de estos parámetros de calidad. Si no se cumplen los requisitos
indicados, se considera que el análisis no es válido y es preciso repetirlo. El valor DO
medio para el estándar cero (diluyente verde) debería ser ≤ 0,150. Si el valor DO medio
es > 0,150, debería revisarse el procedimiento de lavado de placas.
3.9 Técnicas de procesamiento de datos
Para la recolección, se encuentran detalladas las tablas usadas, ver (Anexo 2). También
se halla detallado el proceso de flujo aplicado en la investigación, ver (Anexo 4).
El proceso estadístico de análisis y presentación de resultados, son presentados en
forma clara y objetiva en gráficos de pastel, barras y dispersión para una mejor
apreciación de los resultados obtenidos en el proyecto de investigación.
34
CAPÍTULO IV
ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
4 Resultados
En el estudio entraron 16 pacientes, recuperada a su vez la información requerida para
la investigación, siendo así: el 69% de los pacientes corresponde a personas de sexo
masculino y el 31% a personas de sexo femenino, esto indica una mayor proporción de
2:1 aproximadamente (Gráfica 1). La recopilación de datos también establece que los
pacientes ingresados cumplen con los criterios de inclusión y exclusión ya que ninguno
tiene antecedentes de VIH Reactivo, inmunodepresión, tratamiento anti tuberculosis
previo, u otro antibiótico de consumo durante su proceso de manifestaciones clínicas.
Únicamente se refieren a medicamentos AINES (anti inflamatorios no esteroideos) de
uso por acción de dolor.
Gráfica 1 Porcentaje de pacientes por sexo.
Fuente: Autor de la investigación.
4.1 Evaluación inmunológica “In vivo” con la Tuberculina humana
Dentro de los resultados de laboratorio el 100% de los pacientes fue positivo para la
reacción intradérmica PPD, dando una respuesta inmunológica positiva e importante
MASCULINO
69%
FEMENINO
31%
SEXO
MASCULINO
FEMENINO
35
para el estudio, únicamente un paciente dentro de este grupo obtuvo un valor de 10 mm
de induración, en general todos estos valores obtenidos aseguran la prueba Mantoux
una respuesta positiva. (Gráfica 2).
Gráfica 2 Reacción inmunológica “in vivo” frente a la PPD.
La línea verde muestra el punto de corte para la prueba de PPD, valores menores
serían respuesta negativa a la reacción. Fuente: Autor de la investigación.
En base a los criterios incluidos del estudio, la baciloscopía de esputo seriado del día 1
y día 2; lo cual fueron positivos en un 100%, generando interpretaciones de 1+, 2+ y
3+. Aquí se agrega también el 100% de los pacientes con un cultivo positivo en
Lowestein Jensen y su identificación molecular el 100% presenta el gen Hsp65 propio
del complejo MTB.
4.2 Cumplimiento de los criterios clínicos en los pacientes con tuberculosis
Los pacientes en base a los signos y síntomas de tuberculosis, expresan un
comportamiento unánime con respecto al desarrollo y evolución de su infección en
estado activo. Ver (Gráfica 3).
0
5
10
15
20
25
30
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
PPD (mm)
PPD (mm)
36
Gráfica 3 Porcentaje en respuesta a criterios clínicos.
Los criterios enunciados son los principales que se manifiestan en pacientes con
Tuberculosis pulmonar activa. Fuente: Autor de la investigación.
Los 16 pacientes refieren positivamente a tos productiva por más de 15 días desde la
infección activa, sudoraciones nocturnas asociadas a pérdida de peso, apetito, ánimo
físico y psicológico, y finalmente fiebre como síntomas propios de la activación de
tuberculosis pulmonar.
4.3 Resultados hematológicos: Hemograma y biometrías
Dentro de los exámenes hematológicos, cada uno de los pacientes fueron clasificados
por sexo: masculino y femenino. Estos pacientes en ambos sexos muestran una
tendencia de disminución en la concentración de valores normales de hemoglobina
(13,3 y 18 g/dl en hombres; 11,7 a 15,7 g/dl en mujeres). (Castañeda & Buriticá 2012).
La disminución de estos valores (Gráfica 4 y 5), complementa el diagnóstico de
tuberculosis puesto que los pacientes con la infección activa presentan generalmente
anemia. El valor de hematocrito está de igual forma disminuido en su valor normal, el
conteo de células blancas no se halla alterado al mismo tiempo el conteo de células
rojas tampoco se halla alterado con respecto a sus valores normales 42% y 47% en
mujeres y hombre respectivamente. Ver (Gráfico 6). (OMS, 2014).
0
20
40
60
80
100
120
TOS (>15 DIAS) FIEBRE SUDORACIONES
NOCTURNAS
PERDIDA DE PESO
Porc
enta
je
Criterios clínicos
37
Las líneas de color azul representan el rango de valores normales para la
concentración de hemoglobina en pacientes masculinos.
Fuente: Autor de la investigación
Las líneas de color azul representan el rango de valores normales para la
concentración de hemoglobina en pacientes masculinos.
Fuente: Autor de la investigación
0.00
2.00
4.00
6.00
8.00
10.00
12.00
14.00
16.00
0 2 4 6 8 10 12
Conce
ntr
ació
n d
e H
emoglo
bin
a
Pacientes masculinos
HGB (g/dL)
Valores Normales
Gráfica 5 Concentración de Hemoglobina en pacientes femeninos.
Gráfica 4 Concentración de Hemoglobina en pacientes masculinos.
0.00
2.00
4.00
6.00
8.00
10.00
12.00
14.00
16.00
0 1 2 3 4 5 6
Conce
ntr
ació
n h
emoglo
bin
a
Pacientes femeninos
HGB (g/dL)
Valores Normales
38
Los valores hematológicos muestran que pacientes con tuberculosis pulmonar activa,
sus valores de hematocrito también se encuentran disminuidos, el resto de valores
celulares como, células blancas están normales.
Fuente: Autor de la investigación
4.4 Curva de calibración del Kit QuantiFERON Tb Gold Plus
La validación del Kit QuantiFERON-TB Gold fue mediante una curva de calibración
de los estándares del Kit, como establece el inserto. Todos los resultados fueron
aprobados, para que las mediciones en las muestras clínicas sanguíneas de los pacientes
sean garantizadas su confiablidad y validez.
Tabla 5 Validación de los estándares
CONTROL DE LA CURVA ESTÁNDAR
ANTES DEL TTTO
Ensayo Conce.
UI/ml
Media %CV Resultados
S1 4,00 1098,50 11,4 Aprueba
S2 1,00 282,00 5,0 Aprueba
S3 0,25 75,00 NA Aprueba
S4 0,00 45,00 NA Aprueba
Fuente: Qiagen QuantiFERON TB Gold Plus Kit Insert
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
HCT (%) MCV (fL) RBC (10^6/uL) WBC (10^3/uL)
Tendencia inferior a sus Valores
Gráfica 6 Resultados hematológicos.
39
4.5 Resultados de QuantiFERON-TB Gold en los pacientes
La producción de Interferón gamma por la estimulación en las células CD4 y CD8 con
los antígenos ESAT-6 y CFP-10, fueron procesadas en base al inserto del Kit
QuantiFERON-TB Gold, obteniéndose 16 muestras de sangre de los pacientes; antes
de su respectivo tratamiento anti tuberculosis. Los mismos fueron evaluados por
segunda vez, pero en un tiempo dos meses posteriores a su tratamiento.
Los resultados antes de su tratamiento enuncian que, los 16 pacientes fueron para
QuantiFERON TB Gold Plus positivos y con resultado de Infección por MTB
probables. Dos meses después de su tratamiento, los pacientes fueron evaluados
nuevamente su concentración de Interferón gamma, corroborando positivamente a su
infección por MTB probable.
4.6 Respuesta celular de los Linfocitos CD4 y CD8 antes del tratamiento
En los pacientes en el estado de infección activa y antes del tratamiento, la
concentración de Interferón Gamma, muestra que hay una mayor respuesta generada
por las células CD8 (Gráfico 7); representadas por el tubo TB2a, que por las células
CD4; representadas por el tubo TB1a; en este estado de la infección activa. Según el
inserto la respuesta celular CD8 anuncia mayor concentración de Interferón gamma
que las CD4 debido al estatus de infección activa, este comportamiento fue también
evaluado dos meses después del tratamiento de los pacientes, cuando estos ya están
controlados y el estatus de infección activa cesó.
Los péptidos ESAT-6 y CFP-10 si generan una respuesta celular adecuada, estos
péptidos son la base estructural antigénica más importante y potencial hasta el
momento del complejo MTB, que sirve de guía para el serodiagnóstico de tuberculosis
pulmonar activa. (Pimienta, Rodríguez et al, 2012)
40
Gráfica 7 Comportamiento celular CD4 (TB1) y CD8 (TB2) antes del tratamiento.
La tendencia es hacia TB2a, por parte del aumento en Interferón gamma producido
por las CD8 en fase activa. RStudio. Fuente: Autor de la investigación.
4.7 Respuesta celular de los Linfocitos CD4 y CD8 después del tratamiento
Dos meses después del tratamiento, en un estatus de infección en latencia o controlado,
se procesaron nuevamente 16 muestras sanguíneas de los pacientes de estudio y se
determinó la concentración de Interferón Gamma producida en este punto de su
evolución clínica. La producción de Interferón gamma por parte de las células CD8
(TB2d) es mayor su repuesta celular con respecto a la concentración de Interferón
gamma producido por parte de las células CD4 (TB1d) (Gráfico 8). Esto genera un
comportamiento de tendencia similar al proceso antes del tratamiento. El inserto del
Kit establece el poder diferenciar una tuberculosis pulmonar activa de una latente
mediante su concentración de Interferón gamma producidos por las células CD8, lo
cual se muestra que el comportamiento es igual de aumentado, en un estatus controlado
de la infección con MTB, se esperaba una disminución de Interferón gamma por parte
de las CD8, pero fue todo contrario.
41
Gráfica 8 Comportamiento celular CD4 (TB1) y CD8 (TB2) después del tratamiento.
La tendencia es hacia TB2a, por parte del aumento en Interferón gamma producido
por las CD8 en fase curada o latencia. RStudio.
Fuente: Autor de la investigación.
4.8 Comportamiento de las células CD8 antes y después del tratamiento.
Un análisis retrospectivo en base a la producción celular de Interferón gamma; ver
(Gráfico 9) únicamente por las células CD8 “antes (TB2a) y después (TB2d) de su
tratamiento”, indican un comportamiento variado de producción de Interferón gamma;
ya que no se observa una linealidad o tendencia general por parte de estas células, lo
cual como base del diagnóstico no es equivalente a una respuesta concreta, en
definitiva.
42
Gráfica 9 Comportamiento celular CD8 antes y después del tratamiento.
Las células CD8 antes y después del tratamiento, presentan un aumento elevado de
interferón gamma, pero no hay significancia de tendencia, más bien equiparada entre
los dos estados por igual; en fase activa como en fase de curación o latencia. RStudio.
Fuente: Autor de la investigación.
43
CAPÍTULO V
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
5 Conclusiones
Se puede concluir que en el proyecto de investigación se caracterizó la respuesta
inmunológica “in vivo” mediante la prueba de la tuberculina (PPD o TST) e “in vitro”
por medio del Kit QuantiFERON TB Gold Plus en pacientes con tuberculosis pulmonar
activa y latente; siendo así mediante los resultados analizados, el mejor método de
diagnóstico en sensibilidad y especificidad para diagnosticar tuberculosis en la
investigación fue “in vitro” mediante el Kit QuantiFERON TB Gold Plus, ya que esta
genera en 24 horas un resultado confirmatorio para la infección por el género MTB. En
cuanto a la búsqueda para la diferenciación entre tuberculosis pulmonar activa y
latente, no pudo presentarse un punto de corte para que permita esta diferenciación
mediante la producción de Interferón gamma por las células CD4 y CD8 con los
antígenos ESAT6 y CFP10, pero un paciente al ser positivo para la infección por MTB
mediante el Kit QuantiFERON TB Gold Plus y al no presentar manifestaciones clínicas
los pacientes con tuberculosis, se puede considerar un estado de latencia.
Se logró diagnosticar pacientes con Tuberculosis pulmonar por baciloscopía y cultivo,
estos después de un mes de cultivo fueron positivos con crecimientos de Unidades
Formadoras de Colonias (UFC) superiores a 10. La baciloscopía reportó pacientes
positivos que abarcaron con resultados de 1+, 2+ y 3+; para ser incluidos en este
proyecto.
A partir de los aislamientos clínicos de esputo de pacientes: Se identificaron con PRA
(PCR Restriction Fragment Analysis) genéticamente a Mycobacterium tuberculosis
complex (MTC), mostrando una fragmentación con enzimas de restricción BstEII
245bp y HaeIII 120/80bp, propia del complejo MTB complex.
Se determinó la respuesta inmunológica in vivo a los pacientes con tuberculina humana
(respuesta a la tuberculina PPD), logrando una respuesta positiva mayor a 10mm de
pápula en el 100% de la población de estudio.
44
Se determinó la respuesta inmunológica in vitro (producción de INF-g) a los pacientes,
estimulando los linfocitos T CD4 y CD8 con antígenos ESAT6 y CFP10 mediante
ELISA. Los pacientes antes de su tratamiento fueron positivos en un 100% de
sensibilidad a una infección de tuberculosis pulmonar por MTB probable; aplicado
mediante la metodología del Kit QuantiFERON TB Gold Plus. Dos meses después del
diagnóstico y tratamiento, fueron también positivos en un 100% a la infección por
MTB probable, lo cual nos indica que el kit funciona para un diagnóstico de MTB.
En la respuesta de las células CD8 no está correlacionada a la Tuberculosis activa
específicamente, puesto que se evaluó la producción de Interferón gamma dos meses
después de recibir tratamiento, estado en el cual los pacientes están controlados de su
infección (estado de latencia); esto generó un comportamiento de concentración de
Interferón gamma idéntico a las células CD8 antes del tratamiento (Gráfica 9), en base
a esto no hay una correlación que diferencie un estado activo de un latente. Las
respuestas de las CD4 (TB1) sí generan respuesta de producción de Interferón Gamma,
pero un mejor resultado se obtuvo por las células CD8 (TB2).
Complementando los estudios que constan en los antecedentes, por primera vez se
midió la concentración de Interferón gamma mediante células CD4 y CD8, estos
valores no mostraron correlación entre su análisis antes y después del tratamiento, por
lo cual no sirven de parámetro para establecer diferencia entre activación y latencia.
Se comparó el tiempo del método QuantiFERON TB Gold Plus con otros métodos de
diagnóstico de tuberculosis pulmonar (PPD y cultivo). Siendo este método
QuantiFERON TB Gold Plus más rápido, sensible y específico puesto que este kit
contiene antígenos (ESAT6 y CFP10) que están en gran correlación antigénica de las
especies de Mycobacterium tuberculosis complex y ciertas no tuberculosas, por lo que
se pueden diferenciar estas no tuberculosas mediante la clínica y aislamientos
microbiológicos típicos de las MTB.
5.1 Recomendaciones
Para un diagnóstico rápido de una infección con MTB se recomienda utilizar el Kit
QuantiFERON TB Gold Plus, pero carece de un aspecto importante que no puede
45
diferenciarse un estado latente de un activo por las razones ya especificadas
anteriormente.
Se recomienda utilizar solo el tubo TB2, ya que tiene una mayor respuesta de
producción en Interferón Gamma por las células CD8 que las CD4 (tubo TB1). Así se
puede ahorrar recursos del cliente.
El uso o aplicación de la PPD, también conocida como la prueba intradérmica de
Mantoux en humanos no es una herramienta específica para determinar una infección
por MTB, ya que se halla también relacionada con infecciones de Mycobacterias no
tuberculosas y genera respuestas falsas positivas para tuberculosis. Se recomienda el
uso del kit QuantiFERON TB Gold Plus para un diagnóstico más rápido, sensible y
específico de infección por MTB.
Se puede recomendar seguir cultivando los aislados clínicos de esputo, ya que es un
Gold Standard para diagnóstico frente a la tuberculosis pulmonar, cuando existiere
posibles errores de manipulación de las muestras clínicas de pacientes.
Se recomienda a los Ministerios de Salud Pública de Venezuela y Ecuador evitar la
activación de una infección con MTB, implementando estas técnicas serológicas para
diagnosticar a tiempo a todos los pacientes con infección latente por MTB.
Se recomienda a los Programas de Control de Tuberculosis en Venezuela y Ecuador
promover el comportamiento adecuado en relación al “estornudo”, como un programa
de educación para la salud ya que es la fuente de salida y entrada de persona a persona,
animal a persona, animal a animal, para estar infectados con tuberculosis de forma
rápida a través de las gotitas de estornudos.
Se recomienda entrenamiento, preparación y manejo adecuado de muestras ya sean de
esputo, orina, LCR, etc. al personal de laboratorio que está expuesto a una posible
infección debido al poco conocimiento y generan una fuente rápida y altamente
patógena de contagio.
46
REFERENCIAS
Bauquerez, R. Blanc, L. Bierrenbach, A. Brands, A.; Ciceri, K. et al. (2009). Global
tuberculosis control: epidemiology, strategy, financing: WHO report 2009.
World Health Organization.
Dalal, S. y Hall, W. (1983). Approximating priors by mixtures of natural conjugate
priors. Journal of the Royal Statistical Society. Series B. Methodological.
Henderson, M. y Meyer, M. (2001). Exploring the Confidence Interval for a Binomial
Parameter in a First Course in Statistical Computing. The American Statistician.
ISSN 0003-1305. United States
Quade, D. (1979). Using weighted rankings in the analysis of complete blocks with
additive block effects. Journal of the American Statistical Association.
Kumar, V. y Cotran, R. (2003). Robbins basic pathology. Saunders Philadelphia.
Chaturvedi, N. y Cockcroft, A. (1992). Tuberculosis screening in health service
employees: who needs chest X-rays? Occupational Medicine.
Robledo, J. Mejía, G. Morcillo, N. Chacon, L.; Camacho, M. et al. (2006). Evaluation
of a rapid culture method for tuberculosis diagnosis: a Latin American multi-
center study. International Journal of TuberculosiS and Lung Disease.
Dinnes, J. Deeks, J. Kunst, H. Gibson, A. Cummins, E. Waugh, N. et al. (2007). A
systematic review of rapid diagnostic tests for the detection of tuberculosis
infection. Health Technol Assess.
Forero, M. Cristobal, G. y Desco, M. (2006). Automatic identification of
Mycobacterium tuberculosis by Gaussian mixture models. Journal of
Microscopy. Fuente recuperada 29/04/2017 de: http://www.blackwell-
synergy.com/doi/abs/10.1111/j.1365-2818.2006. 01610.x
Cover, T. (1965). Geometrical and Statistical Properties of Systems of Linear
Inequalities with Applications in Pattern recognition. IEEE Transactions on
Electronic Computers, 14.
47
Brown, L. Cai, T. y DasGupta, A. (2001). Interval estimation for a binomial proportion.
Statistical Science, 16th Edition.
Beran, R. y Millar, P. (1986). Confidence sets for a multivariate distribution. The
Annals of Statistics.
Frazier, P. y Yu, A. (2007). Sequential Hypothesis Testing under Stochastic Deadlines.
En: Neural Information Processing Systems. USA
French, S. (1986). Decision theory: an introduction to the mathematics of rationality.
Ellis Horwood Series In Mathematics And Its Applications.
Freund, Y. y Schapire, R. (1997). A Decision-Theoretic Generalization of OnLine
Learning and an Application to Boosting. Journal of Computer and System
Sciences.
Monje C. et al. (2011). Diseños de experimentación científica. Universidad de
Palermo. Argentina.
Supo J, (2013). Metodología de la investigación. Universidad Santa María. Ciudad de
Panamá.
Oletta, J. Carvajal, A. (2015). Datos epidemiológicos de la tuberculosis en Venezuela.
Asociación Integral de Política Pública. Fuente recuperada 4/04/2017 de:
http://aipop.org/web/datos-epidemiologicos-de-la-tuberculosis-en-venezuela/.
Lalvani, A. Pathan, A. McShane, H. Wilkinson, R. Latif, M. Conlon, C. et al. (2001).
Rapid detection of Mycobacterium tuberculosis infection by enumeration of
antigen-specific T cells. Am J Respir Crit Care Med N163.
Milburn, HJ. (2001). Primary tuberculosis. Curr Opin Pulm Med N7.
Riley, LW. (1995). Determinants of cell entry and intracellular survival of
Mycobacterium tuberculosis. Trends Microbiology.
Daniel, T. y Ellner, J. (1993). Immunology of tuberculosis. In: Lee BR, Earl SH,
editors. Tuberculosis. A comprehensive international approach. Lung biology
in health and disease. New York: Marcel Dekker.
48
Munk, M. y Kaufmann, S. (1991). The immune response to Mycobacterium
tuberculosis. Behring Inst Mitt.
Yoshida, N. (2001). Role of gamma/delta T-cells in the peripheral blood of patients
with pulmonary tuberculosis. Kurume Med J.
Cascante, J. Pascal, I. y Hueto, J. (2007). Diagnóstico de la Infección tuberculosa.
Servicio de Neumología. Hospital Virgen del Camino. Pamplona.
OMS. (2014). El diagnostico precoz es crucial para detectar la tuberculosis
farmacorresistente. Fuente recuperada 11 de abril 2017 de:
http://www.who.int/features/2014/tb-moldova/es/
De Kantor, I. y Ritacco, V. (2009). ¿Es suficiente la prueba tuberculínica para el
diagnóstico de la infección tuberculosa? Panel de consultores en Tuberculosis.
OMS, Buenos Aires. Argentina.
Oxlade, O. Schwartzman, y K. Menzies, D. (2007). Interferon-gamma release assays
and TB screening in high-income countries: a cost-effectiveness analysis. Int J
Tuberc Lung Dis.
Heriazon, A. Yager, J. Sears, W. Mallard, B. (2009). Induction of delayed-type
hypersensitivity and interferon-gamma to Candida albicans and anti-hen-egg
white lysozyme antibody as phenotypic markers of enhanced bovine immune
response. Vet Immunol Immunopathology.
Lambert, L. Rajbhandary, S. Qualls N, et al. (2003). Costs of implementing and
maintaining a tuberculin skin test program in Hospitals and Health
Departments. Infection Control Hospital Epidemiology.
Araujo, Z. Acosta, M. Escobar, H. Baños, R, et al. (2008). Respuesta inmunitaria en
tuberculosis y el papel de los antígenos de secreción de Mycobacterium
tuberculosis en la protección, patología y diagnóstico. Laboratorio de
Inmunología de Enfermedades Infecciosas. Instituto de Biomedicina. Caracas
Venezuela.
Bermejo, M. Clavera, I. y Michel de la Rosa, F. (2007). Epidemiología de la
tuberculosis. Servicio de Neumología. Hospital de Navarra. Pamplona. España
49
Hicks, A. (2014). Tuberculosis. Bitesized Inmunology. Agencia de protección de
Salud. Porton Down. Reino Unido.
García, M. y Figueroa, C. (2001). Respuesta inmune a la infección por Mycobacterium
tuberculosis. Una revisión de literatura. Revista del instituto nacional de
Enfermedades respiratorias. Vol 4 Nº 2.
Rosas. A, y Arce. A. (2007). Tuberculosis: Mecanismo de defensa, inmunopatogénesis
y biomarcadores. Departamento de Inmunología. Facultad de Medicina.
Universidad autónoma de nuevo león. México.
García, M. Sarmiento, M. y Acosta, E. (2010). La inmunidad antituberculosa y su
aplicación en el desarrollo de candidatos vacunales. Instituto Final. Centro de
investigación y producción de vacunas. La Habana. Cuba.
Hernández, R. Mata, D. Aguilar, D. y Orozco, H. (2011). Factores inmunológicos que
participan en la progresión de la tuberculosis pulmonar. Sección de patología
experimental. Departamento de patología. Instituto nacional de Ciencias
Médicas y Nutrición. México.
Andrade. R. (1996). Inmunología de la tuberculosis. Departamento de Inmunología.
Instituto nacional de laboratorios de Salud. Bolivia.
Dorronsoro, I. y Torroba, L. (2007). Microbiología de Tuberculosis. Servicio de
Microbiología. Hospital de Navarra. Pamplona. España
Herranz, M. y Bernaola, E. (2007). Características de la enfermedad tuberculosa en la
infancia. Unidad de Neumología y enfermedades infecciosas. Servicio de
pediatría. Hospital Virgen del Camino. Pamplona. España
Brown-Elliott, B. y Wallace, R-Jr. (2010). Infections due to nontuberculous
mycobacteria other than Mycobacterium avium-intracellulare. In: Mandell,
Douglas, and Bennett’s Principles and Practice of Infectious Diseases, 7th ed.
Mandell GL, Bennett JE, Dolin R (editors). Elsevier.
Fitzgerald, D. Sterling, TR. y Haas, D. (2010). Mycobacterium tuberculosis. In:
Mandell, Douglas, and Bennett’s Principles and Practice of Infectious Diseases,
7th ed. Mandell GL, Bennett JE, Dolin R (editors). Elsevier.
50
Gordin, F. y Horsburgh, CR-Jr. (2010). Mycobacterium avium complex. In: Mandell,
Douglas, and Bennett’s Principles and Practice of Infectious Diseases, 7th ed.
Mandell GL, Bennett JE, Dolin R (editors). Elsevier.
Griffith, D. et al. (2009). An Official ATS/IDSA Statement: Diagnosis, treatment, and
prevention of nontuberculous mycobacterial diseases. Am J Respir Crit Care
Med 2007; 175: 367. Jassal M, Bishai WR: Extensively drug-resistant
tuberculosis. Lancet Infect Dis.
Pfyffer, G. (2007). Mycobacterium: General characteristics, laboratory detection,
isolation, and staining procedures. In: Manual of Clinical Microbiology, 9th ed.
Murray PR et al. ASM Press.
Renault, C. y Ernst, J. (2010). Mycobacterium leprae. In: Mandell, Douglas, and
Bennett’s Principles and Practice of Infectious Diseases, 7th ed. Mandell GL,
Bennett JE, Dolin R (editors). Elsevier.
Vincent, V. y Gutierrez, M. (2007). Mycobacterium: Laboratory characteristics of
slowly growing mycobacteria. In: Manual of Clinical Microbiology, 9th ed.
Murray PR et al (editors). ASM Press.
Castañeda, F. Buriticá, E. y Cruz L. (2012). Valores de referencia para hematocrito,
hemoglobina, glucosa y electrolitos. Universidad de Tolima. Fuente recuperada
12/10/2017 de: http://www.scielo.org.co/pdf/rori/v16n2/v16n2a08.pdf.
Pimienta, E. Rodríguez, C. Sarzo, M. y Plou, C. (2010). Producción de los antígenos
ESAT-6 y CFP-10 de Mycobacterium tuberculosis y evaluación de sus
potencialidades en el serodiagnóstico de tuberculosis activa en una población
cubana. Instituto de Farmacia y Alimentos. Universidad de la Habana. Cuba.
Fuente recuperada 12/10/2017 de:
http://www.redalyc.org/pdf/1812/181223782003.pdf
Bonachera J, y Bernal M. (2014). Tuberculosis. Diagnóstico y tratamiento. Fuente
recuperada 17/10/2017 de: https://www.neumosur.net/files/EB03-
43%20TBC%20dco%20tto.pdf
51
Yi L, Sasaki Y, Hideaki N, Satoru I. et al. (2016). Evaluation of QuatiFERON-TB Gold
Plus for detection of Mycobacterium tuberculosis infection in Japan.Scientific
Report.
Laynes, J. (2016). ¿Son necesarios tres Ziehl Neelsen para diagnosticar tuberculosis
pulmonar?. Revista de Medicina Interna. Guatemala.
LNRT. (2015). Laboratorio de referencia Nacional de Tuberculosis. Plataforma de
acceso a la Salud Pública. La Paz. Bolivia.
Lúcida. (2008). Costumbres y procesos del desarrollo de Tuberculosis. Laboratorio de
diagnóstico patológico celular. México.
IERM. (2010). Tuberculosis: Epidemiología de la Tuberculosis. Bacteriología de
Tuberculosis. Fuente recuperada 17/10/2017 de:
http://www.losmicrobios.com.ar/microbios/?p=428
Robles, F. (2015). Cálculo de la muestra. Estadística. Fuente recuperada 24/06/2017
de: http://kafer-estadistica.blogspot.com/2015/09/calculo-de-tamano-de-la-
muestra-tamano.html
Barcellini, L. Borroni, E. et al,. (2016). First evaluation of QuantiFERON.TB Gold
Plus performance in contact screening. Emerging Bacterial Pathogens Unit.
Division of Inmunology and Infectious Diseases. Italy.
52
ANEXOS
Anexo 1 Guía de recolección de Datos.
53
Anexo 2 Validación de la guía de recolección de datos
54
Anexo 3 Tablas de recolección de datos
Tabla 6 Exámenes de Laboratorio en Dx de Tuberculosis
VIH BK PPD (mm) CULTIVO IDENT.
MOLECULAR
INT GAMMA D.O.
CD4 CD8 CD4* CD8*
2+ 3+ 20 Positivo
1+ 1+ 0 Positivo
*Determinación de Interferón Gamma a los dos meses de tratamiento.
Fuente: Autor de la investigación.
Tabla 7 Criterios clínicos de la OMS en pacientes con Tuberculosis
TOS (>15
DIAS) FIEBRE
SUDORACIONES
NOCTURNAS
PERDIDA DE
PESO
PESO
INICIAL
PESO A LOS
DOS MESES
x x x x 73 46,3
x x x x 53 43
Fuente: Autor de la investigación.
Tabla 8 Resultados de exámenes hematológicos
HGB
(g/dL)
HCT
(%)
MCV
(fL)
RBC
(10^6/uL)
WBC
(10^3/uL)
11,9 37,2 76,7 4,85 12,5
Fuente: Autor de la investigación.
55
Tabla 9 Control de la Curva Estándar
Fuente: Autor de la investigación.
Tabla 10 Resultados QuantiFERON TB Gold Plus
Paciente Nill TB1 CD4 TB2 CD8 Resultado Interpretación
11,9 37,2 76,7 4,85 12,5
Fuente: Autor de la investigación
Ensayo Conc. Media %CV Resultado
S1 4,00
S2 1,00
S3 0,25
S4 0,00
56
Anexo 4 Árbol de problemas
57
Anexo 5 Diagrama de flujo procesamiento de muestras
58
Anexo 6 Consentimiento Informado
La respuesta de los linfocitos T CD4 y CD8 estimulados con antígenos ESAT6 y CFP10, en
base a la producción de Interferón gamma en pacientes con tuberculosis pulmonar activa y
tuberculosis latente
Diagnóstico de Tuberculosis por medio de aplicación intradérmica de Tuberculina PPD y la
Prueba de Interferón gama.
Yo, ________________________________C.I. ______________________ siendo mayor
de 18 años, en uso pleno de mis facultades mentales y sin que medie coacción ni violencia
alguna, en completo conocimiento naturaleza, forma, duración, propósito, relacionados con
el estudio, declaro mediante la presente:
1.- Haber sido informado de manera objetiva, clara y sencilla, de todos los aspectos
relacionados al proyecto de investigación.
2.- Tener conocimiento claro de que el objetivo del trabajo antes señalado es diagnosticar
Tuberculosis.
3.- Conocer bien el protocolo expuesto por el investigador; en el cual se establece que la
participación de mi persona en el trabajo consiste en interrogatorio y la toma de muestras de
esputo, dos muestras de sangre para exámenes de rutina y la prueba de PPD e interferón
gama.
4.- Que el equipo de investigadores me ha garantizado confidencialidad relacionada a mi
identidad.
5-. Que mi participación o la de mi Representado en dicho estudio no implica riesgo ni
inconveniente alguno para la salud y que la evaluación y toma de muestras se llevarán a cabo
por personal médico capacitado para dicha labor. Además, cualquier efecto adverso generado
por la aplicación de una de las pruebas antes mencionadas se traducirá en la suspensión de la
misma.
6.- Que cualquier pregunta que yo tenga en relación con este estudio, me será respondida
oportunamente por parte del equipo de investigadores.
7.- Que se efectuará una reevaluación clínica de mi en otra ocasión (a los 2 meses después
de la evaluación inicial), de la cuales se tomarán nuevamente muestras de sangre para
exámenes de rutina e interferón gamma y esputo para descartar la Tuberculosis.
8.- Que todos los resultados que arrojen las distintas pruebas me serán entregados
personalmente. Los resultados de la evaluación serán publicados en revistas nacionales e
internacionales donde mi identidad no será revelada (datos anónimos).
9.- Que bajo ningún concepto se me ha ofrecido, ni pretendo recibir ningún beneficio de tipo
económico producto de los hallazgos que puedan producirse en el referido proyecto de
investigación. Yo, ______________________________C.I. ______________, estoy de acuerdo con mi
participación en este proyecto.
______________________ ______________ ______________
Nombre del paciente firma/huella fecha
______________________ ______________ ______________
Nombre del testigo firma/huella fecha
______________________ ______________ ______________
Nombre del Investigador firma/huella fecha
CUALQUIER INFORMACION ADICIONAL COMUNICARSE CON EL DR. Jacobus H. de
Waard Tel: 0212-8383844 o 0416-8052488 [email protected]
