Tema: Cromatografía en Capa Delgada. Aplicaciones ...

Tema: Cromatografía en Capa

Delgada. Aplicaciones

Farmacéuticas

Garantía de Calidad de Medicamentos

Área Análisis de Medicamentos - FCByF-UNR

Preparado por el Dr. Dario A. Bianchi

~ ~ Año 2021 ~ ~

Cromatografía en Capa Delgada.

Aplicaciones Farmacéuticas

A BFM

FM

Tapa de la cámara o cuba. Sistema cerrado.

Papel de filtro embebido con la fase móvil.

Permite saturar la cámara con FM.

Nivel de la fase móvil. Debe estar por debajo

del nivel de siembra de la placa.

Soporte solido: Placa

rígida de un material

inerte:

-vidrio

-Plástico

-Metal

Fase Estacionaria:

Capa uniforme y

relativamente

delgada (0,25 mm)

de un material

adsorbente

finamente

pulverizado

Una cámara de vidrio cilíndrica o rectangular

provista de una tapa el mismo material que

permita el cierre hermético para saturarla con

los vapores de la fase móvil. Además,

permite seguir y controlar el desarrollo

cromatográfico.

La fase móvil (FM) se

mueve

en dirección ascendente

a través de la fase

estacionaria

mediante fuerzas

capilares.

Rf = 0,37

Rf = 0,72

Rf = 0,37

Rf = 0,72

Rf = 0,37

Rf = 0,72

Rf = 0,37

Rf = 0,72

Mx M1 STMx + M1 ST

Frente del solvente de elución o fase móvil (FM)

Línea de siembra

Fase Móvil (FM)

FM

FM

FM

Soporte sólidode la placa

cromatográfica

Fase estacionariade la placa

cromatográfica

SoporteSólido

Fase Estacionaria


Aplicaciones Farmacéuticas Componentes de una placa cromatográfica:

SOPORTE SÓLIDO

- Vidrio

- Plástico

- Metálico

FASE ESTACIONARIA MECANISMO DE SEPARACIÓN

- Sílica-gel (activado) Adsorción

- Alumina (Óxido de aluminio) (activado) Adsorción

- Celulosa y derivados, Sílica gel (sin activar) Partición

- Fase silica modificada Partición – Fase reversa

- Resinas de cambio iónico Intercambio Iónico

FASE MOVIL

- Uno o varios disolventes según la polaridad deseada.

- La muestra bajo análisis debe ser totalmente soluble en la fase móvil y los disolventes miscibles entre sí.

Soporte solido: Placa

rígida de un material

inerte:

-vidrio

-Plástico

-Metal

Fase

Estacionaria:

Capa uniforme y

relativamente

delgada

de un material

adsorbente

finamente

pulverizado

SoporteSólido

Fase Estacionaria



-Industria farmacéutica

Control de calidad

Controles de identidad y pureza

Uniformidad

Estabilidad

-Medioambiente

Análisis de aguas, de suelos y de residuos

-Análisis de alimentos

Control de calidad

Aditivos (vitaminas)

-Pesticidas

Controles de estabilidad

Aplicación y ventajas de la cromatografía en capa delgada (CCD)

Ventajas del método:

*Rápido

*Económico

*Sencillo

- Medicina forense

Detección de documentos falsificados

Investigación en envenenamientos

- Aplicaciones clínicas

Estudios de metabolismo

Control de dopaje

Procedimiento general:

1) Elección de la Fase estacionaria

2) Elección de la Fase móvil

3) Acondicionamiento de la placa - ¿Requiere activación?

4) Aplicación de la muestra

5) Acondicionamiento de la cámara de desarrollo

6) Desarrollo del cromatograma

7) Secado de la Placa

8) Visualización de las manchas - Revelado

9) Interpretación de los resultados – Evaluación de las

manchas visualizadas: Observar:

1) Rf, 2) Forma, 3) Tamaño 4) Intensidad de las mismas.



Rf = 0,37

Rf = 0,72

Rf = 0,37

Rf = 0,72

Rf = 0,37

Rf = 0,72

Rf = 0,37

Rf = 0,72

Mx M1 STMx + M1 ST


Línea de siembra

Fase Móvil (FM)

FM

FM

FM

Soporte sólidode la placa

cromatográfica

Fase estacionariade la placa

cromatográfica

1) Elección de la Fase estacionaria. - Materiales adsorbentes finamente divididos que pueden ser divididos según su origen:

1) origen mineral (gel de sílice, alúmina, etc.)

2) orgánico (celulosa, poliamidas, etc.)

- Tamano de la partícula: normalmente de 5 a 40 μm de diámetro.

- Algunos ejemplos de fases estacionarias empleadas en las farmacopeas:

-Gel de sílice 60 de 0,25 mm de espesor.

-Gel de sílice 60 de 0,25 mm de espesor con indicador de fluorescencia.

-Gel de sílice para cromatografía, de 0,25 mm de espesor con un tamaño de poro promedio de 6 nm.

-Gel de sílice octilsalinizado con indicador de fluorescencia de 0,25 mm de espesor.

-Gel de sílice octadecilsalinizado con indicador de fluorescencia de 0,25 mm de espesor.

-Cromatografía en capa delgada recubierta con una mezcla para cromatografía de fase reversa de C18 con

indicador de fluorescencia de 0,25 mm de espesor.



Fase Estacionaria:

Capa uniforme y

relativamente

delgada (0,25 mm)

de un material

adsorbente

finamente

pulverizado

SoporteSólido

Fase Estacionaria



Serie elutrópica

Disolvente Fórmula P*

Hexano

Tolueno

Dietileter

Diclorometano

Butanol

Cloroformo

Acetato de etilo

Acetona

Metanol

Etanol

Acetonitrilo

Ácido acético

Agua

C6H14

C7H8

C4H10O

CH2Cl2

C4H9OH

CHCl3

C2H5COOEt

(CH3)2CO

CH3OH

C2H5OH

CH3CN

CH3COOH

H2O

0

2,4

2,8

3,1

3,9

4,1

4,4

5,1

5,1

5,2

5,8

6,2

9,0

Solvente o mezcla de

solventes de elución

muy poco polar para

las sustancias

analizadas



muy polar para

las sustancias

analizadas

Rf = 0,10

Rf = 0,02

A B

Rf = 0,94

Rf = 0,86

A B

Rf = 0,72

Rf = 0,37

A B



adecuado para

las sustancias

analizadas P*= Polaridad del disolvente

El frente del solvente tiene que recorrer aproximadamente

las tres cuartas partes de la longitud de la placa.

2) Elección de la Fase móvil

Frente

del

Solvente

de la

Fase móvil

Frente

del

Solvente

de la

Fase móvil


Aplicaciones Farmacéuticas 3) Acondicionamiento de la placa - ¿Requiere activación?

4) Aplicación de las muestras sobre la línea de siembra en CCD:

- Capilares

- Jeringas

- Dispositivos de

alta precisión

- Micropipetas

Farmacopea Argentina (pág. 133): Aplicar por separado sobre la línea trazada anteriormente y a no menos de

2 cm entre cada aplicación la solución muestra y la solución estándar empleando una micropipeta para obtener

una mancha lo más pequeña posible (preferentemente con un diámetro no mayor de 5 mm o bien en una

banda perpendicular al sentido del desarrollo del cromatograma, de 10 a 20 mm de largo y 2 a 6 mm de ancho).

La aplicación puede realizarse en porciones sucesivas que permitan acumular la cantidad de material requerido,

dejando secar cada vez, antes de efectuar la siguiente aplicación. Dejar secar las aplicaciones, ubicar la placa

en el soporte y colocarla dentro de la cámara, de modo que la fase móvil llegue al borde inferior de la placa.

Rf = 0,37

Rf = 0,72

Rf = 0,37

Rf = 0,72

A B

dFMdB

dA0,25

0,50

0,75

1,0

0,0

A B

dFMdB

dA0,25

0,50

0,75

1,0

0,0

Aplicación de la muestra

en forma de banda Aplicación de la muestra

en forma de mancha



Cámaras de CCD de desarrollo

ascendente

Rf = 0,37

Rf = 0,72

A B

- Adherir hojas de papel de filtro embebidas

en la fase móvil a las paredes de la cámara,

para facilitar la saturación de la misma con

el vapor del líquido, a menos que se especifique

de otro modo en la monografía correspondiente.

5) Acondicionamiento de la cámara de desarrollo

6) Desarrollo del cromatograma

Cámaras de CCD de desarrollo horizontal



Específicos

- Reacciones de coloración

Inespecíficos

- Adición de yodo

- Fluorescencia

- Calentamiento

7) SECADO DE LA PLACA

8) VISUALIZACIÓN DE LAS MANCHAS - REVELADO

http://en.wikipedia.org/wiki/Image:TLC-Essential-Oils.jpg



- Azul de Bromotimol al 0,1% en NaOH 0,01M (ácidos carboxílicos)

- K2Cr2O7 en H2SO4 al 4% (compuestos orgánicos no volátiles)

- Cl3Sb al 50% en ácido acético (Esteroides, vitaminas, carotenoides)

- Ninhidrina al 0,3% en n-butanol (Aminoácidos y aminas)

- Visualización fotodensitométrica

- Una vez visibles las manchas, puede ser determinado el valor de Rf de cada una de ellas

8) VISUALIZACIÓN DE LAS MANCHAS - REVELADO



Rf (Relación de Frente)= distancia recorrida por una sustancia determinada (dX) dividida por

la distancia recorrida por el frente del solvente o fase móvil (dFM). Ambas distancias se miden

desde el punto de siembra (aproximadamente entre 1 a 2 cm del extremo inferior de la placa).

La distancia para la sustancia X se mide al centro de la mancha.

9) Interpretación de los resultados – Evaluación de las manchas visualizadas

distancia recorrida por

la sustancia (dX)

Rf(X)=

distancia recorrida por

el frente de la fase móvil (dFM)

A B DC

x xx x

Frente del Solvente o Fase Móvil

Línea de Siembra

Distance solvent migrated = 5.0 cm

Distance A migrated = 3.0 cm

Distance B y E migrated = 2.0 cm

2.8 cm

3.0 cm

Rf ( A) =

Rf ( B) =

Rf ( D) =

Rf ( C1) =

Rf ( C2) =

2.0 cm5.0 cm = 0.40

= 0.60

= 0.56

= 0.60

= 0.56

3.0 cm5.0 cm

0.8 cm5.0 cm

3.0 cm5.0 cm

2.8 cm5.0 cm

Ex

Rf ( E) = = 0.402.0 cm5.0 cm

Siembra C= Mezcla B + D



Factores que afectan el valor de Rf y su reproducibilidad:

Fase estacionaria: calidad del adsorbente, espesor de la capa, activación de la

placa, distribución y tamaño de las partículas.

Fase móvil: calidad y pureza de los solventes. Se recomienda preparar antes de cada

corrida debido a que los solventes pueden ser muy volátiles o higroscópicos.

Cámara de desarrollo: saturación de la misma (mínimo 30 minutos antes de la

corrida). Asegurar que este bien cerrada.

Temperatura: la cámara de desarrollo no debe colocarse cerca de fuentes de

calor, ni luz solar directa, ya que un aumento de temperatura aumenta la

volatilidad de solventes y puede cambiar la composición de la fase móvil.

Cantidad de siembra: aumentar la cantidad de masa sembrada frecuentemente

produce un cambio de los valores de Rf especialmente por efecto de la

cola de las manchas. En este caso la distancia de la mancha a la línea de siembra se mide al

centro del área de más intensidad si la mancha tiene cola.

Para mejorar la reproducibilidad del Rf, es necesario cromatografiar en la

misma placa la muestra problema y la sustancia de referencia.

9) Interpretación de los resultados – Evaluación de las manchas visualizadas



1) Aplicación de CCD en Pruebas de Identidad:

2) Aplicación de CCD en Ensayos de Pureza:

2) Caso I: Ensayo límite de impurezas

por CCD. Impureza conocida y se dispone

de los respectivos patrones de referencia.

2) Caso II: Ensayo límite de impurezas por

CCD. Impurezas desconocidas o no

se dispone de los respectivos

patrones de referencia

Caso I: Procedimiento de dos siembras Caso II: Procedmiento de tres siembras

Rf = 0,37

Rf = 0,72

Rf = 0,37

Rf = 0,72

Rf = 0,37

Rf = 0,72

Rf = 0,37

Rf = 0,72

Mx M1 STMx + M1 ST


Línea de siembra

Rf = 0,37

Rf = 0,72

Rf = 0,37

Rf = 0,72

A B

dFMdB

dA0,25

0,50

0,75

1,0

0,0



1) Aplicación de CCD en Pruebas de Identidad

1) Caso I: Procedimiento de dos siembras

Procedimiento: Se realizan Dos siembras de igual volumen y concentración de la

muestra a analizar y el patrón de referencia del IFA en estudio.

Evaluación: Comparar la mancha principal de la muestra con la mancha principal

generada por el patrón de referencia. Se compara: Rf, apariencia, color y la intensidad.

Desventaja: la falta de especificidad hace que la NO IDENTIDAD entre dos

compuestos se fácil de determinar pero la identificación requiere de pruebas

adicionales para aumentar la presunción

Dos compuestos con

diferentes Rfs

en un mismo sistema

cromtográfico son DIFERENTES. No

Cumple con la Prueba

Rf = 0,37

Rf = 0,72

Rf = 0,37

Rf = 0,72

M ST IFA

dST

dM0,25

0,50

0,75

1,0

0,0

Rf = 0,72Rf = 0,72Rf = 0,72Rf = 0,72

M ST IFA

RfM=RfST

0,25

0,50

0,75

1,0

0,0

Caso donde

se obtiene

presunción de

identidad.

Cumple con

la Prueba



1) Aplicación de CCD en Pruebas de Identidad

1) Caso I: Procedimiento de tres siembras

Procedimiento: Se realizan tres siembras de igual volumen, dos de las cuales son de

igual volumen y concentración, que serían la muestra a analizar (M) y el patrón de

referencia del IFA en estudio (ST-IFA), y una tercer siembra que contiene la mitad de

la concentración de una mezcla de ambos (M+ST-IFA) en relación 1:1.

Evaluación: Comparar las manchas principales de la muestra y mezcla con la mancha

generada por el patrón de referencia. Se compara: Rf, apariencia y la intensidad. Si

coinciden hay presunción de identidad.

Dos compuestos con

diferentes Rfs

en un mismo sistema

cromtográfico son DIFERENTES . No

Cumple con la Prueba

Ejemplo donde

se obtiene

presunción de

identidad.

Cumple con la

Prueba

Rf = 0,37

Rf = 0,72

Rf = 0,37

Rf = 0,72

Rf = 0,37

Rf = 0,72

Rf = 0,37

Rf = 0,72

M ST IFAM + ST-IFA10uL 10uL5ul + 5uL

Rf = 0,72 Rf = 0,72 Rf = 0,72Rf = 0,72Rf = 0,72Rf = 0,72

M ST IFAM + ST-IFA10uL 10uL5ul + 5uL



Identificación - Diazepam Se verificó la identidad de tres lotes de Diazepam (A, B y C) utilizando

el método de tres siembras para los lotes A y B y de dos siembras para el lote C.

Los análisis fueron realizados aplicando la siguiente técnica cromatográfica:

Fase estacionaria - Emplear una placa para cromatografía en capa delgada recubierta

con gel de sílice para cromatografía con indicador de fluorescencia, de 0,25 mm de espesor.

Fase móvil - Acetato de etilo y n-heptano (1:1).

Solución estándar - Preparar una solución de Diazepam SR-FA en acetona con una concentración de

aproximadamente 5 mg por ml.

Solución muestra – Preparar una solución de Diazepam en acetona con una concentración de aproximadamente 5

mg por ml.

Procedimiento - Aplicar por separado sobre la placa 10 μl de la Solución muestra y 10 μl de la Solución estándar.

Dejar secar las aplicaciones y desarrollar los cromatogramas, en una cámara no saturada, hasta que el frente del

solvente haya recorrido aproximadamente tres cuartas partes de la longitud de la placa. Retirar la placa de la cámara,

marcar el frente del solvente y dejar evaporar el solvente. Examinar la placa bajo luz ultravioleta a 254 nm. El valor de

Rf de la mancha principal en el cromatograma obtenido a partir de la Solución muestra se debe corresponder con el

obtenido con la Solución estándar.

Luego de llevar a cabo el análisis se obtuvieron los siguientes resultados:

-El lote A cumple y el B No cumple con la prueba de identificación.

-El lote C cumple con el ensayo.

1) Dibuje estos resultados en tres placas cromatográficas indicando que contiene cada siembra.

Datos: Rfdiazepam= 0,5

Cl N

NO

H3C

Aplicación de CCD como criterio de Identidad



Identificación - Paracetamol Se llevó a cabo el ensayo de identidad en un lote de

paracetamol (A y B) por CCD aplicando la siguiente técnica

cromatográfica:

Fase estacionaria - Emplear una placa para cromatografía en capa delgada recubierta con gel de sílice para

cromatografía con indicador de fluorescencia, de 0,25 mm de espesor.

Fase móvil - Cloruro de metileno y metanol (4:1).

Solución estándar - Preparar una solución de Paracetamol SR-FA en metanol de aproximadamente 1 mg por ml.

Solución muestra - Preparar una solución de Paracetamol en metanol de aproximadamente 1 mg por ml.

Procedimiento - Aplicar por separado sobre la placa 10 μl de la Solución muestra y 10 μl de la

Solución estándar. Dejar secar las aplicaciones y desarrollar los cromatogramas hasta que el frente del solvente

haya recorrido aproximadamente tres cuartas partes de la longitud de la placa. Retirar la

placa de la cámara, marcar el frente del solvente y dejar secar. Examinar la placa bajo luz ultravioleta a 254 nm.

El valor de Rf de la mancha principal en el cromatograma obtenido a partir de la Solución muestra debe ser

similar al obtenido con la Solución estándar.

Se observó que el lote cumple con el ensayo de identificación para el IFA en estudio.

1) Dibuje una placa cromatográfica indicando dicho resultado.

Datos: Rfparacetamol= 0,6

N CH3

HOO

H

Paracetamol

Aplicación de CCD como criterio de Identidad

Para cada IFA elaborado bajo un determinado proceso de producción se establece un perfil de

impurezas describiendo aquellas IMPUREZAS que son CONOCIDAS O NO en un lote típico.

Generalmente, el perfil de impurezas está estrechamente relacionado al proceso de elaboración o

degradación del IFA.

El perfil de impurezas no suele ser necesario para los IFAs de origen vegetal o provenientes de

tejidos animales.

Las IMPUREZAS DESCONOCIDAS determinadas por Cromatografía en Capa Delgada (CCD) o

por Cromatografía Líquida de Alta Eficacia (CLAE) no deberán exceder individualmente, el 0,2 %

de la intensidad de la mancha o del área de la sustancia principal (IFA), respectivamente, y su

sumatoria no deberá exceder el 1 % de los mismos valores.

De no cumplimentarse estos requerimientos, deberán presentarse estudios toxicológicos que

garanticen la inocuidad de las impurezas presentes.



Aplicación de CCD como criterio de Pureza



Caso I: Ensayo límite de impurezas por CCD. Impureza conocida y

se dispone de los respectivos patrones de referencia.

Ensayo límite de impurezas por CCD

Fundamento del ensayo:

Las sustancias químicas diferentes presentan generalmente valores diferentes de Rf en

un determinado sistema cromatográfico. Por lo tanto, se espera que los valores de Rf de

las impurezas sean distintos a los valores de los productos principales o IFAs.

Ventajas: Rapidez. Sencillez. Sensible. Económico

Caso II: Ensayo límite de impurezas por CCD. Impurezas desconocidas

o no se dispone de los respectivos patrones de referencia


Aplicaciones Farmacéuticas Ensayo límite de impurezas por CCD

CASO I: Las IMPUREZAS O CONTAMINANTES SON CONOCIDAS y se dispone de los respectivos

patrones de referencia.

Evaluación del cromatograma:

Se compara la intensidad de color o fluorescencia proveniente de la mancha de la impureza que se

investiga con la producida por el patrón de referencia a la concentración del límite tolerado.

CASO II: LAS IMPUREZAS O CONTAMINANTES SON DESCONOCIDAS o no se dispone de los

respectivos patrones de referencia.

Procedimiento para el caso II:

Se siembran una o varias diluciones de la muestra principal en estudio de manera que la intensidad

de la mancha producida equivalga a la que daría lugar el contaminante a la mayor concentración

permitida.

Supuesto:

Se supone que los contaminantes que se controlan y el producto principal (IFA) en estudio

mantienen una estrecha relación estructural y por lo tanto responden de igual forma al agente de

revelado o visualización.

Evaluación del cromatograma:

Se compara la/s mancha/s provenientes de las diluciones con las manchas de los contaminantes

provenientes de la muestra.



Caso I: Ensayo límite de impurezas por CCD. Impureza conocida y

se dispone de los respectivos patrones de referencia.



Aplicaciones Farmacéuticas Pureza Caso I. Se dispone patron de referencia de la impureza.

Límite de p-Cloroacetanilida en Paracetamol Se llevó a cabo el límite de p-Cloroacetanilida en un dos lotes de

paracetamol (A y B) por CCD según la siguiente técnica cromatográfica:

Fase estacionaria - Emplear una placa para cromatografía en capa

delgada recubierta con gel de sílice para cromatografía con indicador

de fluorescencia, de 0,25 mm de espesor.

Fase móvil - Éter de petróleo y acetona (75:25).

Solución estándar - Preparar una solución de p-cloroacetanilida en

éter de aproximadamente 10 μg por ml.

Solución muestra - Transferir 1,0 g de Paracetamol a un tubo de

centrífuga de 15 ml provisto de un tapón de vidrio y agregar 5,0 ml de

éter. Agitar mecánicamente durante 30 minutos y centrifugar a 1.000 rpm durante 15 minutos o hasta obtener una

separación neta, emplear la solución sobrenadante.

Procedimiento - Aplicar por separado sobre la placa 200 μl de la Solución muestra (en porciones de 40 μl, de

manera de obtener una única mancha de no más de 10 mm de diámetro) y X μl de la Solución estándar. Dejar

secar las aplicaciones y desarrollar los cromatogramas en una cámara no saturada hasta que el frente del solvente

haya recorrido aproximadamente tres cuartas partes de la longitud de la placa. Examinar bajo luz ultravioleta a 254

nm. La mancha obtenida en el cromatograma de la Solución muestra, con valor de Rf correspondiente a la mancha

principal obtenida con la Solución estándar, no debe ser mayor en tamaño o intensidad a la mancha principal

obtenida con la Solución estándar (0,001%).

Se observó que el lote A no cumple y el lote B cumple con el límite indicado en la técnica.

1) Dibuje dos placas cromatográficas indicando dichos resultados.

2) Indique que volumen de la solución estándar de p-cloroacetanilida debe sembrar?

Datos: Rfparacetamol= 0,6 y Rfp-cloroacetanilida= 0,8

N CH3

HOO

HParacetamol

(IFA)

N CH3

ClO

H

p-Cloroacetanilida.

Impureza



SULFAMETOXAZOL (IFA)

Se determinó la pureza de un lote de Sulfametoxazol aplicando el siguiente método cromatográfico:

Fase Estacionaria - Emplear una placa para cromatografía en capa delgada recubierta con gel de sílice para

cromatografía de 0,25 mm de espesor.

Fase móvil - Alcohol, n-heptano, cloroformo y ácido acético glacial (25:25:25:7).

Solución estándar - Disolver 100 mg de Sulfametoxazol SR-FA en 0,10 ml de hidróxido de amonio, diluir a 10,0 ml

con metanol y mezclar.

Solución de comparación - Disolver 20 mg de Sulfanilamida SR-FA y 20 mg de ácido sulfanílico en 10 ml de

hidróxido de amonio y diluir a 100 ml con metanol. Transferir 2,0 ml de esta solución a un matraz aforado de 50 ml,

agregar 10 ml de hidróxido de amonio, completar a volumen con metanol y mezclar.

Solución muestra - Disolver 100 mg de Sulfametoxazol en 0,10 ml de hidróxido de amonio, diluir a 10,0 ml con

metanol y mezclar.

Revelador - Disolver 0,10 g de p-dimetilaminobenzaldehído en 1 ml de ácido clorhídrico y diluir a 100 ml con

alcohol.

Procedimiento - Aplicar por separado sobre la placa 10 μl de la Solución estándar, 25 μl de la Solución de

comparación y 10 μl de la Solución muestra. Dejar secar las aplicaciones y desarrollar los cromatogramas hasta

que el frente del solvente haya recorrido aproximadamente tres cuartas partes de la longitud de la placa. Retirar la

placa de la cámara, marcar el frente del solvente y dejar secar al aire. Pulverizar sobre la placa con Revelador: los

valores de Rf son aproximadamente 0,7 para sulfametoxazol, 0,5 para sulfanilamida y 0,1 para ácido sulfanílico.

Las manchas correspondientes a sulfanilamida y ácido sulfanílico en el cromatograma obtenido a partir de la

Solución muestra no deben ser mayores en tamaño o intensidad a las manchas, a los respectivos valores de Rf,

obtenidas para sulfanilamida y ácido sulfanílico con la Solución de comparación (0,2 %).

SULFANILAMIDA ACIDO SULFANILICO

SN

OOON

CH3

H2NH

SN

OO

H

H2NH

SOH

OO

H2N

H

NH3C

CH3

O

p-DIMETIL

AMINOBENZALDEHIDO

Pureza Caso I. Se dispone patrón de referencia de la impureza

1) Indique que observaría en una placa cromatográfica si se encuentra que la droga analizada no cumple con el

límite especificado para ácido sulfanílico y cumple con el límite de sulfanilamida.

2) Indique si estamos en presencia de una cromatografía en fase normal o reversa.

3) a) Calcular la concentración de Sulfametoxazol en la Solución estándar e indique que volumen aplica.

b) Calcular la concentración de Sulfanilamida y de ácido sulfanílico en la Solución de comparación e indique que

volumen aplica.

c) Calcular la concentración de Sulfametoxazol en la Solución muestra e indique que volumen aplica.

4) Determine cual es la concentración límite de ambos contaminantes en dicho ensayo.

5) Describa cual es la reacción química de color y los grupos funcionales involucrados.



SN

OOON

CH3

H2NH

SN

OO

H

H2NH

SOH

OO

H2N

H

NH3C

CH3

O

SULFANILAMIDA ACIDO SULFANILICO p-DIMETIL

AMINOBENZALDEHIDO SULFAMETOXAZOL (IFA)

Pureza Caso I. Se dispone patrón de referencia de la impureza



Caso II: Ensayo límite de impurezas por CCD. Impurezas desconocidas o

no se dispone de los respectivos patrones de referencia




Caso II. Impurezas desconocidas o no se dispone de patrones de referencia

Pureza cromatográfica

Fase estacionaria - Emplear una placa para cromatografía en capa delgada recubierta con gel de sílice para

cromatografía, de 0,25 mm de espesor.

Fase móvil – Alcohol absoluto, ciclohexano e hidróxido de amonio (72:30:6).

Solución muestra A - Preparar una solución de Codeína en alcohol absoluto de aproximadamente 40 mg por ml.

Solución muestra B - Diluir 2,0 ml de la Solución muestra A a 100 ml con alcohol absoluto.

Solución muestra C - Diluir 1,0 ml de la Solución muestra A a 100 ml con alcohol absoluto.

Revelador - Mezclar 3 ml de solución de ácido cloroplatínico al 10 % con 97 ml de agua y agregar 100 ml de

solución de ioduro de potasio al 6 %.

Procedimiento - Aplicar por separado sobre la placa 10 μl de las Soluciones muestra A, B y C. Dejar secar las

aplicaciones y desarrollar los cromatogramas hasta que el frente del solvente haya recorrido aproximadamente

tres cuartas partes de la longitud de la placa. Retirar la placa de la cámara, marcar el frente del solvente y dejar

evaporar. Pulverizar sobre la placa con Revelador: A excepción de la mancha principal y de cualquier otra mancha

observada en el origen, ninguna mancha en el cromatograma obtenido a partir de la Solución muestra A debe ser

más intensa que la obtenida con la Solución muestra B (2 %) y no más de una mancha con un valor de Rf mayor

que el de la mancha principal debe ser más intensa que la obtenida con la Solución muestra C (1 %).

O

OH

H3CO

N

CH3H

H

CODEÍNA



1) Indique si estamos en presencia de una cromatografía en fase normal o reversa.

2) a) Calcular la concentración de la muestra A e indique que volumen aplica.

b) Calcular la concentración de la muestra B e indique que volumen aplica.

c) Calcular la concentración de la muestra C e indique que volumen aplica.

3) Determine cual es la concentración límite para ambos contaminantes en dicho ensayo.

4) Indique que observaría en una placa cromatográfica si se encuentra que la droga analizada cumple con el límite

especificado para la impureza de menor valor de Rf y no cumple con la de mayor valor de Rf.

5) Indique que observaría en una placa cromatográfica si se encuentra que la droga analizada cumple con el límite

especificado para la impureza de mayor valor de Rf y no cumple con la de menor valor de Rf.

Datos: Rf impureza A= 0,75

Rf impureza B= 0,25

Rf mancha principal= 0,5

O

OH

H3CO

N

CH3H

H

CODEÍNA

Caso II. Impurezas desconocidas o no se dispone de patrones de referencia

Pureza Caso II. Ensayo de pureza sin disponer de las referencias

de los contaminantes

Se llevó a cabo un ensayo de pureza por CCD de un lote de Ibuprofeno

y no se dispone de las referencias de dos contaminantes A y B.

Dibujar en tres placas cromatográficas separadas los siguientes resultados:

1) El lote cumple el ensayo respecto a los dos contaminantes A (0,1%) y B (0,2%).

2) El lote cumple el ensayo límite de impurezas para el contaminantes A y no cumple para el B.

3) El lote no cumple con ninguno de los dos contaminantes.

Datos: Rfibuprofeno= 0,80

RfA= 0,50

RfB= 0,75



IBUPROFENO

C10H11N3O3S

PM: 206,3

15687-27-1

OH

OH3C

CH3

CH3


Aplicaciones Farmacéuticas - Colorantes de uso farmacéutico. Identificación por CCD. Ejemplos

Identificación cromatográfica • Sistema A- Emplear una fase móvil constituida por una mezcla de n-butano, etanol, agua y amoníaco

(50:25:25:10). Sembrar las soluciones sobre una placa para cromatografía en capa delgada recubierta con celulosa de 0,1 mm de espesor. Desarrollar los cromatogramas en una cámara sin revestimiento interno y sin saturar.

• Sistema B - Emplear una fase móvil constituida por una mezcla de metiletilcetona, acetona, agua y amoníaco (140:60:60:1). Sembrar las soluciones sobre una placa para cromatografía en capa delgada recubierta con gel de sílice 60 de 0,2 mm de espesor. Desarrollar los cromatogramas en una cámara revestida internamente con papel de filtro y saturada durante 2 horas.

• Procedimiento - Preparar una Solución muestra y una Solución estándar que contengan aproximadamente 1 mg por ml en metanol. Aplicar por separado 10 μl de cada una de las soluciones y desarrollar los cromatogramas.

AZUL BRILLANTE FCF (CI 42090) C37H34N2Na2O9S3 PM: 792, 84

• Definición - El Azul brillante FCF es esencialmente la Sal disódica de α-[4-(N-etil-3-

sulfonatobencilamino)-ciclohexa-2,5-dienililideno]-tolueno-2-sulfonato y sus isómeros y colorantes

subsidiarios, junto con cloruro y/o sulfato de sodio como principales componentes incoloros.

• Identificación cromatográfica - (ver Identificación cromatográfica en Métodos generales de análisis).

• Sistema A: Rf aproximadamente 0,72.

• Sistema B: Rf aproximadamente 0,31.


Aplicaciones Farmacéuticas. Problemas

Límite para F: 0,1% y J: 0,2%

b) La solución de la muestra tiene una concentración de 0,2 g/mL y se

sembró 200uL, la solución patrón de referencia de p-cloroacetanilida

Es de 10 ug/mL ¿Qué volumen de la solución de p-cloroacetanilida debe

sembrar?

Tema: Cromatografía en Capa Delgada. Aplicaciones ...

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