UNIVERSIDAD TÉCNICA PARTICULAR DE...
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i UNIVERSIDAD TÉCNICA PARTICULAR DE LOJA La Universidad Católica de Loja ÁREA BIOLÓGICA TITULACIÓN DE BIOQUÍMICO FARMACÉUTICO Estudio de los Recursos Fitoterapéuticos Ancestrales para su Conservación y Aprovechamiento Sostenible: “Aislamiento, caracterización y actividad biológica de metabolitos secundarios de Croton elegans Kunth” TRABAJO DE FIN DE TITULACIÓN AUTOR: Pérez Romero, Yanely Lucia DIRECTOR: Morocho Zaragocín, Segundo Vladimir Ph.D. LOJA-ECUADOR 2015
Transcript of UNIVERSIDAD TÉCNICA PARTICULAR DE...
i
UNIVERSIDAD TÉCNICA PARTICULAR DE LOJA
La Universidad Católica de Loja
ÁREA BIOLÓGICA
TITULACIÓN DE BIOQUÍMICO FARMACÉUTICO
Estudio de los Recursos Fitoterapéuticos Ancestrales para su Conservación y
Aprovechamiento Sostenible: “Aislamiento, caracterización y actividad biológica
de metabolitos secundarios de Croton elegans Kunth”
TRABAJO DE FIN DE TITULACIÓN
AUTOR: Pérez Romero, Yanely Lucia
DIRECTOR: Morocho Zaragocín, Segundo Vladimir Ph.D.
LOJA-ECUADOR
2015
ii
APROBACIÓN DEL DIRECTOR DEL TRABAJO DE FIN DE TITULACIÓN
Ph.D.
Segundo Vladimir Morocho Zaragocín
DIRECTOR DEL TRABAJO DE FIN DE TITULACIÓN
De mis consideraciones:
El presente trabajo de fin de titulación: ―Estudio de los Recursos Fitoterapéuticos Ancestrales
para su Conservación y Aprovechamiento Sostenible: Aislamiento, caracterización y actividad
biológica de metabolitos secundarios de Croton elegans Kunth‖ realizado por el profesional en
formación: Pérez Romero Yanely Lucia, ha sido orientado y revisado durante su ejecución, por
cuanto se aprueba la presentación del mismo.
Loja, Marzo de 2015
F) _____________________
Ph.D. Segundo Vladimir Morocho Zaragocín
CI: 110326907-0
iii
DIVULGACIÓN DE RESULTADOS
La presente investigación forma parte de los resultados del proyecto SENESCYT PIC-12-
INIAP-002, Convenio 20120315 ―Estudio de los Recursos Fitoterapeúticos Ancestrales para su
Conservación y Aprovechamiento Sostenible‖. Siendo la directora del proyecto la Ing. Beatriz
Brito del Departamento de Nutrición y Calidad. La tesis estuvo a cargo del Ph.D. Segundo
Vladimir Morocho Zaragocín, del Departamento de Química de la Universidad Técnica
Particular de Loja.
iv
DECLARACIÓN DE AUTORÍA Y CESIÓN DE DERECHOS
Yo, Yanely Lucía Pérez Romero declaro ser autora del presente trabajo de fin de titulación:
―Estudio de los Recursos Fitoterapéuticos Ancestrales para su Conservación y
Aprovechamiento Sostenible: Aislamiento, caracterización y actividad biológica de metabolitos
secundarios de Croton elegans Kunth‖, de la Titulación de Bioquímico Farmacéutico, siendo
Segundo Vladimir Morocho Zaragocín director del presente trabajo; y eximo expresamente a la
Universidad Técnica Particular de Loja y a sus representantes legales de posibles reclamos o
acciones legales. Además certifico que las ideas, conceptos, procedimientos y resultados
vertidos en el presente trabajo investigativo, son de mi exclusiva responsabilidad.
Adicionalmente declaro conocer y aceptar la disposición del Art. 88 del Estatuto Orgánico de la
Universidad Técnica Particular de Loja que en su parte pertinente textualmente dice: ―Forman
parte del patrimonio de la Universidad la propiedad intelectual de investigaciones, trabajos
científicos o técnicos y tesis de grado que se realicen a través, o con el apoyo financiero,
académico o institucional (operativo) de la Universidad‖
F) _____________________
Yanely Lucía Pérez Romero
C.I. 1104013667
v
DEDICATORIA
A Dios inagotable fuente de luz, sabiduría y amor.
A mi padre, mi mayor ejemplo a seguir, quien ha sido un gran apoyo durante toda mi vida,
brindándome sus sabios consejos, alentándome en cada paso y ensenarme a nunca rendirme
ante las adversidades.
A mi madre, quien con su amor y paciencia ha sido un apoyo incondicional toda mi vida,
inculcándome los mas altos valores, otorgándome su confianza y sobre todo por siempre creer
en mi.
A mi hermanas Dayanna, que siempre esta junto a mi, y a mi ángel Janina que me cuida desde
el cielo.
A Daniel, quien con su comprensión y apoyo ha sabido acompañarme en las buenas y más
aun en las malas.
vi
AGRADECIMIENTO
En primer lugar a Dios, pilar fundamental de mi vida, amigo fiel que nunca me ha abandonado,
brindándome salud, fortaleza e iluminación.
A mis padres, por quienes siento una inmensa gratitud por ser mi apoyo y por siempre creer en
mí.
Un sincero agradecimiento al PhD. Vladimir Morocho, director del presente trabajo, por su
dedicación, supervisión, críticas constructivas y orientación en el desarrollo del mismo.
Un profundo agradecimiento al PhD. Omar Malagón y al PhD. Gianluca Gilardoni quienes a
través de sus conocimientos realizaron aportes muy relevantes en la presente investigación.
Al Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias, por brindarme la oportunidad de
pertenecer a tan importante proyecto, mediante la ejecución del presente trabajo de fin de
titulación.
Y finalmente a la Universidad Técnica Particular de Loja, en especial a la titulación de
Bioquímica y Farmacia, por brindarme los conocimientos tanto académicos como éticos para el
desarrollo de mi profesión.
vii
INDICE DE CONTENIDO
APROBACIÓN DEL DIRECTOR DEL TRABAJO DE FIN DE TITULACIÓN ............................. ii
DIVULGACIÓN DE RESULTADOS ............................................................................................. iii
DECLARACIÓN DE AUTORÍA Y CESIÓN DE DERECHOS ...................................................... iv
DEDICATORIA ............................................................................................................................... v
AGRADECIMIENTO ...................................................................................................................... vi
INDICE DE CONTENIDO ............................................................................................................. vii
RESUMEN ...................................................................................................................................... 1
ABSTRACT .................................................................................................................................... 2
INTRODUCCIÓN ............................................................................................................................ 3
CAPITULO I .................................................................................................................................... 6
MARCO TEÓRICO ......................................................................................................................... 6
1.1. Medicina tradicional. ...................................................................................................... 7
1.1.1.Plantas medicinales ....................................................................................................... 8
1.2. Familia Euphorbiaceae................................................................................................... 9
1.3. Género Croton ............................................................................................................... 10
1.4. Taxonomía de Croton elegans .................................................................................... 11
1.5. Terpenos ........................................................................................................................ 11
1.5.1.Triterpenos. .................................................................................................................. 12
1.6. Ruta biosintética de los terpenos ............................................................................... 12
1.7. Cromatografía ............................................................................................................... 13
1.7.1. Cromatografía de capa fina ........................................................................................ 14
1.7.2. Cromatografía en columna ........................................................................................ 14
1.7.3. Cromatografía de gases acoplada a espectroscopía de masas. .............................. 14
1.8. Resonancia magnética nuclear (RMN) ....................................................................... 14
1.8.1.Principios de Espectroscopia RMN. ............................................................................ 15
1.9. Concentración mínima Inhibitoria (CMI) .................................................................... 16
1.10. Enfermedades infecciosas ........................................................................................ 17
1.10.1.Bacterias Gram positivas........................................................................................... 17
1.10.2.Bacterias Gram negativas. ........................................................................................ 17
viii
1.10.3.Dermatofitos............................................................................................................... 20
1.11. Actividad antioxidante ............................................................................................... 21
CAPITULO II ................................................................................................................................. 22
MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................................................ 22
2.1. Tamizaje fitoquímico .................................................................................................... 23
2.1.1.Ensayos. ...................................................................................................................... 24
2.2. Extracción de metabolitos secundarios de Croton elegans. .................................. 27
2.2.1.Esquema de metodología estudiada ........................................................................... 27
2.2.2.Recolección del material vegetal ................................................................................. 29
2.2.3. Selección del material vegetal. ................................................................................... 29
2.3. Obtención del Extracto Total....................................................................................... 29
2.4. Fraccionamiento en cromatografía en columna ....................................................... 30
2.4.1.Cromatografía de capa fina. ........................................................................................ 30
2.4.2.Purificación de compuestos......................................................................................... 30
2.5. Caracterización Estructural ......................................................................................... 30
2.5.1.Resonancia Magnética Nuclear. ................................................................................. 30
2.5.2.Cromatografía de gases acoplada a Espectroscopia de masas (CG-EM). ............... 30
2.6. Determinación de la actividad antimicrobiana y antifúngica .................................. 32
2.6.1.Preparación de las muestras. ...................................................................................... 32
2.6.2.Preparación del cultivo overnight. ............................................................................... 32
2.6.3.Preparación de la suspensión del inóculo para bacterias. ......................................... 33
2.6.4.Preparación de la suspensión del inóculo para hongos. ............................................ 33
2.6.5. Concentración mínima inhibitoria (CMI) antibacteriana. ............................................ 33
2.6.7.CMI antifúngico. ........................................................................................................... 34
2.7. Actividad antioxidante ................................................................................................. 34
2.7.1.Evaluación de fenoles totales. ..................................................................................... 34
2.7.2.Ensayo ABTS............................................................................................................... 36
2.7.3.Ensayo DPPH. ............................................................................................................. 37
CAPITULO III ................................................................................................................................ 38
RESULTADOS Y ANÁLISIS ........................................................................................................ 38
3.1.Tamizaje fitoquímico ........................................................................................................ 39
3.1.1 Tamizaje fitoquímico de Croton elegans. ................................................................. 39
ix
3.1.2 Tamizaje fitoquímico de Salvia hispanica. ................................................................ 40
3.1.3 Tamizaje fitoquímico de Bryophyllum pinnatum. ...................................................... 41
3.1.4 Tamizaje fitoquímico de Solanum sp. ....................................................................... 42
3.2 Extractos obtenidos de Croton elegans ..................................................................... 43
3.3 Compuestos aislados de Croton elegans .................................................................. 44
3.3.1 Fracción 15-21. ......................................................................................................... 45
3.3.2 Fracción 26-29. ......................................................................................................... 47
3.4 Determinación de actividad antimicrobiana............................................................... 49
3.4.1 Determinación de actividad antibacteriana ............................................................... 50
3.4.2 Determinación de actividad antifúngica. ................................................................... 50
3.5 Determinación de actividad antioxidante ................................................................... 51
CONCLUSIONES ......................................................................................................................... 52
BIBLIOGRAFIA ............................................................................................................................ 53
ANEXOS ....................................................................................................................................... 63
x
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estructura base de un éster de forbol. ......................................................................... 11
Figura 2. Síntesis de terpenos y su clasificación según las unidades de isopreno que poseen
....................................................................................................................................................... 13
Figura 3. A) Staphylococcus aureus, B) Enterococcus faecalis. ................................................ 17
Figura 4. Escherichia coli. ........................................................................................................... 18
Figura 5. Proteus vulgaris ............................................................................................................ 18
Figura 6. Klebsiella pneumoniae. ................................................................................................ 19
Figura 7. Pseudomonas aeruginosa ............................................................................................ 19
Figura 8. Salmonella typhimarium ............................................................................................... 20
Figura 9. A) Trichophytum rubrum, B) Trichophytum mentagrophytes ...................................... 21
Figura 10. Esquema de los ensayos realizados en extracto etéreo. .......................................... 23
Figura 11. Esquema de los ensayos realizados en extracto etanolico. ...................................... 23
Figura 12. Esquema de los ensayos realizados en extracto acuoso. ........................................ 24
Figura 13.Esquema de la metodología empleada en la extracción de metabolitos secundarios
de Croton elegans......................................................................................................................... 28
Figura 14. Materia vegetal recolectada Croton elegans. ............................................................ 29
Figura 15. Condiciones de operación del CG-EM en la columna DB-5MS para el análisis de los
compuestos. .................................................................................................................................. 31
Figura 16. Esquema de la metodología empleada en la determinación de fenoles totales. ...... 35
Figura 17. Esquema de la metodología empleada en el ensayo ABTS. .................................... 36
Figura 18. Esquema de la metodología empleada en el ensayo DPPH. ................................... 37
Figura 19. CCF revelada del fraccionamiento 15-21. ................................................................. 45
Figura 20. Estructura química friedelina. ..................................................................................... 46
Figura 21. Estructura química Cicloeucalenol ............................................................................. 47
Figura 22. CCF revelada del fraccionamiento 26-29. ................................................................. 47
xi
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Medios de cultivo y condiciones de incubación para bacterias .................................... 32
Tabla 2. Medios de cultivo y condiciones de incubación para las cepas de hongos utilizadas . 33
Tabla 3. Resultados obtenidos del tamizaje fitoquímico ............................................................. 39
Tabla 4. Resultados obtenidos del tamizaje fitoquímico. ............................................................ 40
Tabla 5. Resultados obtenidos del tamizaje fitoquímico. ............................................................ 41
Tabla 6. Resultados obtenidos del tamizaje fitoquímico. ............................................................ 42
Tabla 7. Peso y rendimiento de los extractos obtenidos de Croton elegans. ............................. 44
Tabla 8. Fraccionamiento cromatográfico del extracto total de Hexano. .................................... 44
Tabla 9. Actividad antimicrobiana de los extractos y de los compuestos aislados .................... 49
Tabla 10. Resultados de actividad antioxidante de los extractos y compuestos obtenidos de
Croton elegans. ............................................................................................................................. 51
1
RESUMEN
En el presente estudio se realizó un tamizaje fitoquímico de cuatro especies medicinales:
Salvia hispanica, Bryophyllum pinnatum, Croton elegans y Solanum sp. Además se realizó el
aislamiento de metabolitos secundarios, actividad antimicrobiana y antioxidante de los
extractos totales y moléculas de Croton elegans. Las hojas de Croton elegans
(Euphorbieaceae), conocida comúnmente como ―mosquera‖, son empleadas en infusión para
el tratamiento de inflamaciones vaginales y amigdalitis y como cicatrizante. Del extracto total
de hexano de las hojas de Croton elegans se identificaron mediante técnicas espectroscópicas
NMR y MS, dos compuestos, uno de naturaleza triterpénica pentacíclica conocido como
friedelina y el otro de origen cicloartano conocido como cicloeucalenol. De los extractos totales
y moléculas identificadas no mostraron actividad biológica frente a hongos y bacterias ni en
actividad antioxidante como ABTS, DPPH y Fenoles totales.
Palabras claves: ABTS, Croton elegans, DPPH , Euphorbiaceae, Cicloeucalenol, Friedelina.
2
ABSTRACT
In the present study a phytochemical screening was performed of four medicinal species:
Salvia hispanica, Bryophyllum pinnatum, Croton elegans and Solanum sp. Moreover the Croton
elegans isolation, antimicrobial and antioxidant activity of secondary metabolites and total
extracts was performed. Croton elegans ( Euphorbieaceae ) leaves, commonly known as
"mosquera" , are used in infusion for the treatment of vaginal inflammation and tonsillitis. From
the Croton elegans hexane extract were isolated two compounds, one of pentacyclic triterpene
nature known as friedelin and the other known as cycloartanes origin cicloeucalenol, both were
identified by NMR and MS spectroscopic techniques. Extracts and identified molecules showed
no biological activity against fungi and bacteria or antioxidant activity as ABTS , DPPH and total
phenols .
Keywords: ABTS, Croton elegans, DPPH , Euphorbiaceae, Cicloeucalenol, Friedelina.
3
INTRODUCCIÓN
En el Ecuador coexisten dos sistemas de salud, uno de ellos es la medicina tradicional que
combina elementos del sistema indígena, modificaciones traídas por los Incas y elementos
tanto de la teoría como de la práctica médica europea medieval. El otro sistema es el oficial
que compromete tanto a instituciones públicas como privadas, y es inaccesible para una gran
parte de la población debido a la escasez de mano de obra, materiales y altos costos por los
servicios. El sistema oficial tiende a dirigirse principalmente a la población urbana con un buen
nivel económico, sin embargo el sistema tradicional provee el cuidado de la salud para la
mayoría de la población rural e indígena, en donde la medicina convencional no está al
alcance (Torri, 2012).
La medicina tradicional está basada en la creencia de que cada persona tiene su propia
constitución y circunstancias sociales que dan como resultado distintas reacciones para las
―causas de la enfermedad‖ y el ―tratamiento‖ (OMS, 2002.)
La OMS (2014) reconoce la medicina tradicional como accesible, asequible y una forma
culturalmente aceptada para el cuidado de la salud por un gran número de personas, que
destaca como una manera de hacer frente a la incesante aumento de las enfermedades
crónicas no transmisibles en medio de los crecientes costos de atención de salud y la
austeridad casi universal.
En las últimas décadas, han existido algunos estudios para entender el uso de plantas
medicinales en el Ecuador, la mayoría de estas investigaciones adoptan un enfoque
descriptivo y farmacológico (Torri, 2012). En relación con los últimos estudios incluyendo el
presente, constituyen un avance en el conocimiento de las especies utilizadas en la medicina
tradicional y aporta detalles descriptivos en cuanto a las propiedades e ingredientes
fitoquímicos activos presentes en las plantas medicinales.
El uso de las plantas medicinales para el tratamiento de enfermedades es extenso, y ha sido
documentado desde el tiempo en que la gente del viejo continente conoció a los indígenas
americanos (Ferreira et al.2012). Algunos de estos documentos incluyen catálogos de plantas
medicinales respaldados con sus respectivas colecciones botánicas y referencias
bibliográficas, revisiones de uso medicinal a nivel mundial y también puede encontrarse como
4
parte de obras o tratados más generales u obras de carácter hoy en día tradicional (Cerón,
2006).
La información sobre plantas medicinales de los Andes ecuatorianos se ha difundido de
diferentes maneras, desde la conquista española y su influencia en nuestras culturas, parte de
la influencia de esta cultura colonizadora ha incluido también el uso de especies vegetales
ampliamente cultivadas en Europa y en el resto del continente americano como es el caso de
la manzanilla, el toronjil, romero, entre otras (Cerón, 2006).
El Ecuador es considerado como uno de los países más ricos en diversidad de especies y
ecosistemas en todo el mundo, donde se encuentra una extensa variabilidad de plantas
medicinales nativas e introducidas (Barrera, 2002). La posición geográfica y la presencia de la
cordillera de los Andes determinan la existencia de una enorme variedad de bosques y
microclimas desde los húmedos de la Amazonia y noroccidente, a los ecosistemas secos del
sur; desde las cálidas playas del Pacífico hasta las nieves eternas de los volcanes (Vallejo et
al., 2007).
La extensa diversidad de la flora ecuatoriana ha sido identificada y estudiada desde hace
mucho tiempo por ser infinitamente rica en plantas útiles por esta razón se han registrado más
de 17000 plantas vasculares, de las cuales 5172 han sido reportadas como útiles, de las
cuales el 60% son de carácter medicinal (Jorgensen & León, 1999).
La familia Euphorbiaceae consta de unos 300 géneros y 7500 especies de distribución
cosmopolita, mejor desarrollada en las regiones tropicales y subtropicales. En el Ecuador están
representados unos 40 géneros (Ulloa & Jorgensen, 1993 ).
El género Croton cuenta con 800 especies principalmente distribuidas en regiones tropicales y
subtropicales del mundo. La especie que más se destaca en este género es Croton lechleri,
por su resina roja o ―sangre‖, la cual junto con su corteza tienen una gran trayectoria en el uso
por los indígenas en América del Sur, siendo empleada internamente y externamente como
cicatrizante de heridas, leucorrea y fracturas (Rossi et al.2003).
Croton elegans (mosquera) es usada en la medicina tradicional en infusión para tratar
inflamaciones vaginales, amigdalitis y como cicatrizante. (Ulloa & Jorgensen, 1993).
El Departamento de Química Aplicada de la Universidad Técnica Particular de Loja en
5
colaboración con el Departamento de Nutrición y Calidad del INIAP en su proyecto
denominado ―Estudio de los Recursos Fitoterapéuticos Ancestrales para su Conservación y
Aprovechamiento Sostenible‖ desarrolló el presente estudio que tiene como fin contribuir a la
mejora de la calidad de vida de las poblaciones rurales más vulnerables del Ecuador, mediante
la conservación y revalorización de las plantas medicinales, en un contexto de respeto por el
ambiente, el conocimiento ancestral y la cultura local, para lo cual es indispensable estudiar los
recursos fitogenéticos ancestrales de las plantas para su conservación y aprovechamiento
sostenible, lo que conlleva a realizar un tamizaje fitoquímico preliminar de cuatro especies
medicinales, posteriormente a evaluar la actividad biológica de los extractos totales y
finalmente a aislar e identificar los metabolitos secundarios de Croton elegans.
6
CAPITULO I
MARCO TEÓRICO
7
1.1. Medicina tradicional.
La OMS (2005) define la medicina tradicional como ―prácticas, enfoques, conocimientos y
creencias sanitarias diversas que incorporan medicinas basadas en plantas, animales y/o
minerales, terapias espirituales, técnicas manuales y ejercicios aplicados de forma individual o
en combinación para mantener el bienestar, además de tratar, diagnosticar y prevenir las
enfermedades‖.
La medicina tradicional se utiliza ampliamente y es un sistema sanitario que está creciendo
rápidamente y de gran importancia económica. En África hasta un 80% de la población la
utiliza para ayudar a satisfacer sus necesidades sanitarias. En Asia y en Latinoamérica, las
poblaciones siguen utilizando la medicina tradicional como resultado de circunstancias
históricas y creencias culturales. En China, la medicina tradicional contabiliza alrededor de un
40% de la atención sanitaria. Es también muy popular en muchos países en vías de desarrollo
puesto que está firmemente arraigada en los sistemas de creencias (OMS, 2005).
Desde la edad antigua se denota la utilización de plantas y algunos de sus derivados con fines
medicinales con el objetivo de mejorar los males que aquejaban al hombre de aquella época
en, China, Babilonia y Egipto. El primer texto escrito en relación con la medicina a base de
plantas se reporta en arcilla, el cual estaba agrupado en una serie de tabletas grabadas con
caracteres cuneiformes sobre las plantas, autores y sus notas redactadas 3000 años A.C.
Desde los sabios del Alto Egipto hasta los sacerdotes místicos de los bosques galos, desde los
médicos orientales de hace 5000 años hasta los grandes científicos del siglo XVIII, no se ha
dejado nunca de lado la búsqueda hacia el conocimiento de las plantas y sus virtudes
terapéuticas (Díaz & Rodriguez,1999).
En varios países se ha comprobado que la población está optando por este tipo de medicina,
tales como Bélgica en un 74%, Alemania y Austria en un 60%, y más de un tercio de la
población de EE.UU. y se apela por la introducción de estas técnicas en los Sistemas
Nacionales de Salud. Las plantas a través del tiempo se han convertido han en una fuente
importante de medicamentos (Díaz & Rodriguez,1999).
En la actualidad existe una tendencia hacia el retorno a lo natural, debido al descubrimiento de
efectos adversos de fármacos sintéticos, y de la misma manera un mejor conocimiento tanto
químico, farmacológico y clínico de las drogas vegetales, así como al desarrollo de formas
8
farmacéuticas y administración de medicamentos fitoterapéuticos. Los fines de la ciencia actual
llevan a la transformación del conocimiento tradicional en científico, los hábitos y costumbres
en terapias comprobadas y los preparados, remedios, infusiones y cocimientos en
suplementos nutricionales y productos farmacéuticos (Ramos et al. 2011).
El Ecuador es considerado uno de los países con mayor diversidad biológica en el mundo, y en
el cual la población mantiene sus tradiciones ancestrales con respecto al uso de remedios
naturales, ya que el 30% de la población pertenece a diferentes grupos indígenas y los
conocimientos etnobotánicos son transmitidos de generación en generación. En la medicina
tradicional, se ven involucrados dos ámbitos como son el del mundo real y el mágico poblado
de espíritus, dioses y demonios, ambos campos se complementan y se argumentan
mutuamente. Bajo este precepto, las enfermedades no son producto de la fallas anatómicas o
fisiológicas, ni la existencia de microorganismos patógenos, si no es el resultado de influencias
sobrenaturales de seres y fuerzas inexplicables para el mundo real, que se hacen presente
como un premio o castigo (De la Torre et al. 2008)
1.1.1.Plantas medicinales
Las plantas medicinales y aromáticas han sido un importante recurso para los cuidados de
salud humana desde tiempos prehistóricos hasta hoy en día. La mayoría de la población
mundial, especialmente en los países en desarrollo, dependen de la medicina tradicional
basada en plantas medicinales y aromáticas. Se conocen entre 50000 y 70000 especies de
plantas utilizadas en sistemas médicos tradicionales y modernos a través del mundo. Cerca de
3000 especies son comercializadas internacionalmente mientras un número aún mayor son
comercializadas a nivel local, nacional y regional (ISSC-MAP, 2007).
Las plantas medicinales son aquellos vegetales que elaboran sustancias que ejercen una
acción farmacológica beneficiosa o perjudicial para el organismo vivo (Quesada, 2008).
Según la OMS el 80% de la población hace uso de remedios naturales y medicina tradicional.
El consumo y manejo de plantas silvestres como medicina forma parte del conocimiento
tradicional de distintas poblaciones humanas en la actualidad la coexistencia de diversos
sistemas de salud es una realidad en casi la totalidad de las sociedades actuales. Estos
sistemas ofrecen una amplia gama de enfoques, recursos, costos y beneficios para la salud
individual y colectiva, y es la demanda y utilización de estos recursos la que ha determinado la
9
naturaleza múltiple de la atención de la salud.
Según De la Torre et al.(2008) en el Ecuador existen alrededor 5172 especies útiles,
pertenecientes a 206 familias de plantas usadas con fines medicinales. El 75% de estas
especies son plantas nativas, el 5% endémicas, mientras que el 11% son introducidas. De las
plantas medicinales antes mencionadas con mayor número de especies son las familias
Asteraceae, Fabaceae, Rubiaceae, Solanaceae y Araceae. De las cuales las partes de la
planta más utilizadas son las hojas (30%), la planta entera (10%) y las flores (6%).
1.2. Familia Euphorbiaceae
La familia Euphorbiaceae ha sido reconocida como una de las más extensas y controvertidas
de las Angiospermas, siendo esta familia poseedora de 218 géneros distribuidos en 5735
especies, ubicándose la mayoría de ellas en América y África tropical (Bittner et al. 2001).
Son árboles, arbustos, hierbas o bejucos, generalmente con látex lechoso o coloreado; plantas
monoicas o dioicas con hojas alternas, simples; estípulas generalmente presentes.
Inflorescencia cimosa, racimosa, espigada o un ciatio (Ulloa & Jorgensen, 1993).
En la familia Euphorbiaceae se distinguen varios géneros entre los cuales Cerón (2006),
menciona Acalypha, Acidoton, Adelia, Alchornea, Alcherneopsis, Amanoa, Aparisthmium,
Caperonia, Caryodendron, Chamaesyce, Cnidoscolus, Conceveiba, Croizatia, Croton,
Dalechampia, Drypetes, Euphorbia, Glycydendron, Hevea, Hippomane, Hyeronima, Jatropha,
Mabea, Manihot, Maprounea, Margaritaria, Nealchornea, Omphalea, Pausandra, Pera,
Phyllanthus, Plukenetia, Richeria, Ricinus, Sagotia, Sapium, Senefeldera, Tetrorchidium.
En el Ecuador están representados unos 40 géneros distribuidos en 7500 especies. De
importancia económica son la yuca (Manihot esculenta Crantz) y la higuerilla (Ricinus comunis
L.), ambas especies cultivadas en las regiones calientes (Ulloa & Jorgensen, 1993).
Varias especies del género Croton han sido tradicionalmente usadas en América Latina como
remedios locales para una gran variedad de enfermedades y dolores. Siendo estas plantas
empleadas por curanderos, homeópatas e inclusive médicos. Sus aplicaciones específicas
forman parte del acervo cultural de cada región. Entre los muchos beneficios atribuidos a esta
familia destacan el uso para el tratamiento de problemas de la próstata, congestión nasal,
fiebre, reumatismo, dolor de estómago, enfermedades de la piel, sífilis, neumonía,
10
hemorroides, diarrea crónica, dolores reumáticos y molestias menstruales. También se utiliza
como expectorante, cicatrizante, tónico y antipirético. Tal variedad de propiedades
farmacológicas se atribuye, entre otras cosas, a la presencia de alcaloides (Bittner et al. 2001).
Estudios realizados a especies pertenecientes a esta familia han revelado la presencia de
diterpenos, floroacetofenonas, flavonoides, compuestos alifáticos, quinonas y terpenos;
presentando una moderada actividad biológica, e importante actividad antiviral y
anticancerígena (Bittner et al. 2001).
Se generaliza como aspecto químico característico de la familia que los triterpenos seguidos
de flavonoides y alcaloides son los principales metabolitos identificados (Payo et al. 2001)
1.3. Género Croton
El género Croton es el segundo más grande la familia Euphorbiaceae, albergando
aproximadamente 800 especies. La mayoría de sus especies crecen en alturas menores a
2000m en ambientes con distinto grado de intervención (Murillo, 1999).
Croton engloba desde hierbas a árboles, con formas muy variadas de hojas, exudado
generalmente coloreado, presencia de lepidotos en toda la planta, generalmente con glándulas
en la base de la lámina y/o sobre el peciolo, flores femeninas generalmente con pétalos
reducidos o ausentes (Webster, 1993).
Este género ha sido motivo de estudios fitoquímicos debido principalmente a las posibilidades
terapéuticas que han podido ser identificadas en estas plantas (Fuentes el al. 2004).
Según Farnsworth et al. (1986), el género Croton posee una extensa gama de alcaloides,
terpenos y otros compuestos químicos, también ha demostrado poseer propiedades
medicinales, toxicas y carcinógenas.
De los compuestos presentes en el género, con actividad promotora de tumores, se
encuentran los ésteres de forbol.(figura 1.) (Fuentes et al. 2004).
11
Los ésteres de fórbol se encuentran generalmente en forma de diésteres 12, 13. Los triésteres
son conocidos como irritantes crípticos, debido a que no exhiben actividad a menos que ocurra
la hidrólisis del éster en C-20 (R3 ). Croton tiglium es la planta de la cual se han aislado la
mayor cantidad de este tipo de compuestos (Hecker & Schmidt, 1974).
Algunas especies de este género han sido de gran importancia y han aportado grandes
beneficios al campo de la medicina ancestral, como Croton lechleri (Sangre de Drago), que es
muy popular en el Ecuador por las propiedades cicatrizantes que posee. Dentro de los
compuestos reportados para esta especie están el alcaloide Taspine, lignan 3′,4-O-dimethyl-
cedrusin, y varios diterpenos, las proantocianidinas y otros taninos condensados que son
responsables de la actividad protectora para diversas patologías incluyendo el cáncer. El latex
que produce esta especie ha sido administrado tópicamente para el tratamiento de heridas y
oralmente para tratar úlceras gastrointestinales. (Rossi et al. 2003).
1.4. Taxonomía de Croton elegans
Reino: Plantae
División: Magnoliophyta
Clase: Magnoliopsida
Orden: Malpighiales
Familia: Euphorbiaceae
Género: Croton
Nombre científico: Croton elegans
1.5. Terpenos
Constituyen el más amplio grupo de metabolitos secundarios de los vegetales. Son específicos
del reino vegetal, pero también pueden estar presentes en animales. Al igual que los
Figura 1. Estructura base de un éster de forbol.
Fuente: Fuentes et al, 2004.
12
triterpenos son únicos del reino vegetal. La diversidad de metabolitos terpénicos se clasifican
por el número de unidades de isopreno (C5) que poseen en su estructura: los terpenos son de
10 C contienen dos unidades C5 y se conocen como monoterpenos; los de 15 C contienen tres
unidades de isopreno y se llaman sesquiterpenos, y los de 20 C tienen cuatro unidades C5 y
se denominan diterpenos. Los triterpenos tienen 30 C, los tetraterpenos 40 C y se habla de
politerpenos cuando contienen más de 8 unidades de isopreno. (Bruneton, 2001).
1.5.1.Triterpenos.
Los triterpenos son aquellos compuestos de 30 átomos de carbono producidos por ciclación
del escualeno. Sus rasgos estructurales son muy parecidos a los de los terpenos más
elementales, presentando un esqueleto policíclico formado por condensación de 6 unidades de
isopreno activo con bajo grado de instauración, se pueden presentar anillos aromáticos de
manera poco frecuente (Villar, 1999).
1.6. Ruta biosintética de los terpenos
Los ladrillos biosinteticos de los terpenos son unidades de isopreno. Las llamadas unidades
biosintéticas de isopreno son isopentil pirofosfato y dimetilalil pirofosfato, compuestos que
surgen de la vía del acetato y mevalonato. El geranil pirofosfato es el precursor de los terpenos
y se cree que juega un rol importante en la formación de monoterpenos. Es formado por la
condensación de una unidad de isopentil pirofosfato y dimetilalil pirofosfato (Tyler et al., 1981)
Los precursores de los principales tipos de terpenos, formados mediante reacciones
catalizadas por enzimas son los esteres pirofosfóricos de alcoholes en (C5)n, formados por la
adición secuencial de una unidad en C5, el pirofosfato de isopentenilo (IPP) sobre una
molécula iniciadora, un pirofosfato de prenil alílico, siendo el primer término de la serie el
pirofosfato de dimetilalilo (DMAPP)(Figura 2.) (Bruneton, 2001).
13
1.7. Cromatografía
La cromatografía se define como una técnica que separa una mezcla de solutos basada en la
velocidad de desplazamiento diferencial de los mismos que se establece al ser arrastrados por
una fase móvil (líquida o gaseosa) a través de un lecho cromatográfico que contiene la fase
estacionaria, la cual puede ser liquida o solida (Valcárcel & Gómez, 1994)
Las aplicaciones de esta técnica son: análisis para examinar una mezcla, sus compuestos y la
relación entre ellos; identificación para determinar la identidad de una mezcla o compuestos
basándose en compuestos conocidos, purificación para aislar componentes de interés para
Figura 2. Síntesis de terpenos y su clasificación según las unidades de isopreno que poseen.
Fuente: Avalos & Perez,2009.
14
estudios posteriores y cuantificación para determinar la cantidad de uno o más compuestos
encontrados en la muestra.(Sampietro et al.2009).
Las separaciones cromatográficas se consiguen mediante la introducción de compuestos
orgánicos en una fase estacionaria y permitiendo que una fase móvil fluya a través de la
mezcla. Cada componente interactúa con la fase estacionaria y se disuelve en la fase móvil en
diferente medida. Los compuestos unidos con menos fuerza a la fase estacionaria y más
solubles en la fase móvil recorren una distancia mayor que los demás componentes (Fox &
Whitesell, 2000).
1.7.1. Cromatografía de capa fina
El método consiste en utilizar una fase móvil para la separación de compuestos en una capa
fina cubierta con un polvo absorbente que es la fase sólida, usualmente sobre una superficie
de vidrio. Dependiendo de la naturaleza de absorción, todos los principios de la separación
cromatográfica pueden ser operativos, también por separado o en combinación (Mikes, 1979).
1.7.2. Cromatografía en columna
Esta técnica se lleva a cabo empacando la fase estacionaria (sílica gel) en forma de una
suspensión en una columna de vidrio con una restricción y llave de paso en un extremo, se
aplica una solución concentrada de la mezcla de compuestos a separar en la parte superior de
la fase sólida, a continuación se agrega la fase móvil o eluyente, y se permite que fluya hacia
el fondo por efecto de la gravedad. Los componente que se adhieren con más fuerza a la fase
solida descienden por la columna más despacio y requieren un volumen mayor de eluyente
para alcanzar el fondo, así a medida que la cromatografía se forman una serie de bandas y la
mezcla de compuestos se separa en sus componentes (Fox & Whitesell, 2000).
1.7.3. Cromatografía de gases acoplada a espectroscopía de masas.
La cromatografía de gases es una técnica muy útil para la separación y determinación de
compuestos orgánicos volátiles y semi volátiles que sean térmicamente estables y acoplada a
la espectrometría de masas, permite una identificación inequívoca de los distintos
componentes separados (Gutiérrez & Droguet, 2002).
1.8. Resonancia magnética nuclear (RMN)
La resonancia magnética nuclear (RMN) es el método analítico mayormente empleado para
15
elucidar la estructura de un compuesto. Se basa en medir la absorción de la radiación
electromagnética en la región de radiofrecuencias, de alrededor de 4 a 900 MHz. En contraste
con la absorción ultravioleta, visible e infrarroja , los núcleos de los átomos son los que
participan en el proceso de absorción en vez de los electrones exteriores. Además para que
en los núcleos se formen los estados de energía que hagan posible la absorción, es necesario
colocar el analito en un intenso campo magnético (Skoog et al.2008).
1.8.1.Principios de Espectroscopia RMN.
Al igual que los electrones, protones y neutrones tienen un espín. Un núcleo que contiene un
número impar de protones o de neutrones (o de ambos) tiene espín y es magnéticamente
activo. El núcleo más pequeño que satisface este requisito es 1H, pero también lo satisfacen
13C, 17O, 19F, 31P. Estos núcleos se comportan como si giraran en torno a un eje, y por lo tanto
tienen un momento angular. En el caso de núcleos con espín de ½, como 1H y 13C, son
posibles dos orientaciones: la alineación a favor del campo externo o en contra del mismo. La
alineación del espín nuclear a favor del campo magnético es ligeramente más favorable que la
alineación en contra del campo, de modo que estas dos alineaciones son de distinta energía.
En consecuencia, el número de moléculas cuyos núcleos tienen una alineación paralela es
ligeramente mayor que el de las que tienen núcleos con alineación antiparalela. Como pronto
se hará evidente, la observación de las transacciones entre estos dos estados de espín
proporciona abundante información acerca del ambiente que rodea a los núcleos de las
moléculas. El espín que da origen a ambos estados es una propiedad del núcleo del átomo, y
la técnica se conoce como espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) (Fox y
Whitesell, 2000).
A continuación se hace una breve descripción de los tipos de espectros más utilizados y de la
información estructural que proporcionan:
1H-RMN: las señales de protones en los espectros de RMN de 1H, como las de los carbonos
en la RMN de 13C, se registran como máximos de absorción individuales correspondientes a
los núcleos no equivalentes. El espectro correspondiente proporciona cuatro elementos de
información importantes: el número de señales distintas, el desplazamiento químico, el patrón
de desdoblamiento y la integración de la intensidad de señales (Klein, 2008).
13C-RMN: Este espectro proporciona dos elementos básicos de información: el número de
señales distintas, que corresponden al número de tipos diferentes de átomos de carbono, y el
16
desplazamiento químico de cada señal, que está determinado por el entorno molecular de
cada carbono (Klein, 2008).
COSY: espectroscopia de correlación homonuclear bidimensional que permite la identificación
de resonancias relacionadas con el acoplamiento mediante enlace, con interacciones
espaciales o con intercambio químico (Skoog et al. 2008).
HSQC: método bidimensional heteronuclear que indican qué hidrógenos están unidos a qué
carbonos (Koskela et al. 2010).
HMBC: experimento bidimensional que permite determinar relaciones entre protones y
carbonos a mayor distancia (2 o 3 enlaces) (Skoog et al. 2008).
1.9. Concentración mínima Inhibitoria (CMI)
La concentración mínima inhibitoria puede cuantificarse determinando la actividad de un
antimicrobiano sobre un microorganismo, que se define como la mínima cantidad de antibiótico
por unidad de volumen del medio de cultivo, que inhibe el crecimiento bacteriano y se expresa
en microgramos de antibiótico por mililitro de medio de cultivo. Constituye un parámetro de
actividad, ya que lógicamente, cuanto menor es la cantidad de un antibiótico necesaria para
inhibir a un microorganismo mayor es su actividad frente a él y viceversa (Prats, 2012).
La actividad antibacteriana exige una normalización o cuantificación, que se consigue
mediante los métodos utilizados in vitro para comprobar la susceptibilidad del microorganismo
en relación con el antibiótico. Con estos métodos se define:
La concentración mínima inhibitoria (CMI): Es la menor concentración de antibiótico
capaz de inhibir el crecimiento de 105 bacterias en 1ml de medio de cultivo, tras 18- 24
horas de incubación.
La concentración mínima bactericida (CMB): Es la menor concentración capaz de
eliminar 105 bacterias en 1 ml de medio de cultivo, transcurridas 18-24 horas de incubación.
El punto de corte de sensibilidad: Es la concentración de antibiótico por debajo de la
cual se considera sensible una determinada especie bacteriana (Franklin & Snow, 1981).
17
1.10. Enfermedades infecciosas
La enfermedad infecciosa es un estado patológico, que surge como consecuencia de una
agresión de patógenos al organismo humano y la respuesta inmune del mismo
fundamentalmente relacionada con las características genéticas, propias del sujeto y del
agente (Vaque & Dominguez ,2001). Las enfermedades infecciosas causada por bacterias y
hongos patógenos representan un desafío serio para la farmacología actual, pues así lo
evidencian los millones de muertes prematuras que causan en el mundo (OMS, 2002).
1.10.1.Bacterias Gram positivas.
Staphylococcus aureus Es un coco Gram positivo no móvil, agente etiológico de diversas
patologías incluyendo infecciones de piel y tejidos blandos, bacteriemia, endocarditis, infección
del SNC y del tracto genitourinario.(figura 3A) (Gil, 2000).
Enterococcus faecalis Los enterococos son cocos Gram positivos que forman parte de la
flora normal del tracto gastrointestinal tanto humano como animal y del tracto genitourinario
femenino humano. En la última década, estos organismos han adquirido cada vez más
importancia como patógenos nosocomiales, a pesar de su baja virulencia (Figura 3B)
(D’azevedo et al. 2008).
1.10.2.Bacterias Gram negativas.
Escherichia coli Es la especie predominante de la microbiota aerobia y facultativa del tracto
gastrointestinal de los animales de sangre caliente y se elimina por las heces al exterior. A
pesar de ser el microorganismo facultativo predominante representa una muy pequeña
proporción del contenido total de bacterias en este sitio anatómico. El intestino humano es
Figura 3. A) Staphylococcus aureus, B) Enterococcus faecalis.
Fuente: (Centers for Disease Control and Prevention’s Public Health Image Library, 2004).
18
colonizado por E. coli en las primeras 40 horas tras el nacimiento, siendo la bacteria ingerida
en agua y alimentos u obtenida directamente de otros individuos en contacto con el recién
nacido (Figura 4) (Prescott et al. 2002).
Proteus vulgaris Bacilo Gram negativo aerobio facultativo, habitante del tracto intestinal del
hombre y varios animales, produce infecciones en humanos al abandonar el intestino.
Causante de infecciones en el aparato urinario, producen bacteriemia, neumonía e infecciones
focales en pacientes debilitados. Importante patógeno en infecciones nosocomiales (Figura 5)
(Brooks et al. 2007).
Klebsiella pneumoniae Se encuentra en el aparato respiratorio y en las heces de casi 5% de
las personas sanas, es responsable de un porcentaje de neumonías bacterianas, puede
causar condensación necrosante hemorrágica extensa del pulmón y en ocasiones provoca
infección del aparato urinario y bacteremia (Figura 6.) (Brooks et al. 2007).
Figura 4. Escherichia coli.
Fuente:(National Institutes of Health, 2005)
Figura 5. Proteus vulgaris
Fuente: Microbe World, 2009.
19
Pseudomonas aeruginosa Bacilo Gram negativo aerobio obligado, dotado de motilidad. Se
encuentra ampliamente distribuido en el suelo, agua, plantas y animales, siendo común en
ambientes húmedos de los hospitales. Se observa en escaso número en la flora intestinal
normal y sobre la piel de los humanos. Únicamente es patógena cuando de introduce en
regiones desprovistas de defensas normales, como mucosas y piel lesionada por daño tisular
(Figura 7.)(Brooks et al. 2007).
Salmonella typhimurium Es un bacilo Gram negativo que se comporta como patógeno
intracelular facultativo. Su hábitat es el aparato gastrointestinal de los animales y el hombre. Se
encuentra asociada a problemas gastrointestinales, septicémicos y aborto debido a su
capacidad de invasión celular y sobrevivencia intrafagocítica (Figura 8.) (Aabo et al. 2000).
Figura 6. Klebsiella pneumoniae.
Fuente: (Forbes et al. 2002).
Figura 7. Pseudomonas aeruginosa
Fuente: Centers for Disease Control and Prevention’s
Public Health Image Library, 2008.
20
1.10.3.Dermatofitos.
Los dermatofitos son un grupo de hongos hialinos, filamentosos, septados y queratinolíticos,
capaces de producir infecciones en la piel, el pelo y las unas, tanto del ser humano como de
los animales. Las dermatofitosis, producidas por estos hongos y comúnmente llamadas
tiñas, suelen estar restringidas al estrato córneo de la piel y sus apéndices, aunque también
pueden afectar la dermis y el tejido subcutáneo, causando granulomas (Diaz et al. 2014).
Trichophytum rubrum: es un hongo filamentoso con microconidios piriformes, sésiles sobre
las hifas formando racimos. Posee macroconidios muy escasos, con varios tabiques, de
formas irregulares, de pared fina y lisa, al final de la hifa. Abundan las clamidosporas
intercalares, presentan hifas en raqueta, pero no filamentos espirales. Es el agente más común
de dermatofitosis (tinea pedís, tinea corporis y onicomicosis) con lesiones eritematosas, poco
inflamatorias, pruriginosas que pueden ser resistentes a los tratamientos convencionales
(Figura 9A)(Crespo, 2008).
Trichophytum mentagrophytes es el segundo agente causal de dermatofitosis. Posee dos
variedades T. mentagrophytes var. mentagrophytes es un organismo zoofílico y T.
mentagrophytes var. interdigital que es antropofílico. La variedad antropofílica produce mínima
reacción inflamatoria usualmente en la piel interdigital de los pies, y la variedad zoofílica
produce considerable inflamación y ampollas y se asocia con dermatofitos. Puede producir
Tinea capitis, Tinea pedis, Tinea corporis, Tinea barbae y Tinea unguium. Un rasgo
característico de esta especie es su capacidad de perforar pelo in vitro (Figura 9B)(Rueda,
2002).
Figura 8. Salmonella typhimarium
Fuente: (Public Library of Science, 2005.)
21
1.11. Actividad antioxidante
Existen distintos métodos para evaluar la actividad antioxidante, ya sea in vitro o in vivo y las
determinaciones de la capacidad antioxidante realizadas in vitro nos dan tan sólo una idea
aproximada de lo que ocurre in vivo. La capacidad antioxidante de una mezcla no viene dada
solo por la suma de las capacidades antioxidantes de sus componentes; también depende del
microambiente en que se encuentra el compuesto (Kuskoski et al. 2005). Entre los métodos
utilizados se encuentran:
ABTS: llamado así por el reactivo 2,2-azinobis (3-ethilbenzotiazolina-6- ácido
sulfonicoic), mide la capacidad de los antioxidantes naturales de eliminar radicales
libres (Floegel et al. 2011).
DPPH: llamado así por el reactivo 2,2-difenil-1-picrylhydrazyl. Es un método rápido y
sencillo, se basa en la medición de eliminación de radicales libres de los compuestos
antioxidantes con DPPH. Es adecuado para medir la actividad antioxidante en
alimentos y extractos vegetales (Sharma y Bhat, 2008).
Fenoles totales: no es un método de actividad antioxidante, pero nos permiten conocer
la cantidad de fenoles de una forma general, el reactivo utilizado durante muchos años
es el Folin-Ciocalteu como una medida del contenido en compuestos fenólicos totales
en productos naturales (Prior et al. 2005).
A B
Figura 9. A) Trichophytum rubrum, B) Trichophytum mentagrophytes
Fuente: A. Centers for Disease Control and Prevention’s Public Health Image Library, 1973.
B. Mycology online. The University of Adelaide. 2014.
22
CAPITULO II
MATERIALES Y MÉTODOS
23
2.1. Tamizaje fitoquímico
De las 20 especies seleccionadas y cultivadas bajo condiciones controladas en los jardines de
la Estación Experimental Santa Catalina del INIAP, fueron remitidas al Departamento de
Química de la UTPL las muestras vegetales previamente sometidas a procesos de secado y
determinación de humedad. A partir de 20g de muestra vegetal se realizó el tamizaje fitoquímico
de cada uno de los extractos obtenidos en éter etílico (Figura 10), etanol (Figura 11) y agua
destilada. (Figura 12.), según la metodología de Miranda (2002) y Ordoñez et al. (2005).
EXTRACTO ALCOHÓLICO
DIVIDIR EN FRACCIONES
1mLENSAYO DECATEQUINAS
2 mLENSAYO DE
RESINAS
2 mLENSAYO DE
FEHLING(AZ. REDUCTORES)
2 mLENSAYO DE BALJET
(LACTONAS)
2 mLENSAYO DE
LIEBERMAN-BUCHARD(TRITERPENOS-ESTEROIDES)
2 mLENSAYO ESPUMA
(SAPONINAS)
2 mLENSAYO DE
Cl3Fe
(FENOLES Y TANINOS)
2 mLENSAYO DENINHIDRINA
(AMINOÁCIDOS)
2 mLENSAYO DEBORNTRAGER
(QUINONAS)
2 mL
ENSAYO DESHINODA
(FLAVONOIDES)
2 mLENSAYO DE
KEDDE(CARDENÓLIDOS)
2 mLENSAYO DE
ANTOCIANIDINA
(ALCALOIDES)MAYER Y WAGNER
ENSAYOS DE DRAGENDORFF6 ML en 3 porciones
(TRITERPENOS-ESTEROIDES)ENSAYO DE LIEBERMANN-BUCHARD
5 mL
(LACTONAS Y COUMARINAS)ENSAYO DE BALJET
5 mL
(ALCALOIDES)MAYER Y WAGNER
ENSAYOS DE DRAGENDORFF15 mL (dividir en 3 porciones)
(ACEITES Y GRASAS)ENSAYO DE SUDAN
5 mL
DIVIDIR EN FRACCIONES
EXTRACTO ETÉREO
Figura 10. Esquema de los ensayos realizados en extracto etéreo.
Fuente: Miranda, 2002; Ordoñez et al. 2005.
Figura 11. Esquema de los ensayos realizados en extracto etanolico.
Fuente: Miranda, 2002; Ordoñez et al. 2005.
24
2.1.1.Ensayos.
Los ensayos están basados de acuerdo a los protocolos de Miranda (2002) y Ordoñez et al.
(2005)..
a. Ensayo de Fehling: Permite reconocer en un extracto la presencia de azúcares
reductores. Se coloca 2 ml del extracto en un tubo de ensayo y se agrega 2 ml del
reactivo, finalmente se calienta en baño de agua de 5-10 minutos. El ensayo se
considera positivo si la solución se colorea de rojo o presenta precipitado del mismo
color.
b. Ensayo de Sudan: Útil para reconocer la presencia de grasas y aceites. Para ello se
coloca en un tubo de ensayo 5 ml del extracto, se añade 1 ml de la solución diluida en
agua del colorante Sudan III o Sudan IV. Se calienta en baño de agua hasta la
evaporación del disolvente. Si en las paredes del tubo de ensayo se observa a
presencia de grasa o aceite se considera positivo el ensayo.
c. Ensayo de Baljet: Utilizado para reconocer la presencia de compuestos con
agrupamiento lactónico, en particular Cumarinas.
Para lo cual se colocan 5 ml de extracto en un tubo de ensayo, si la alícuota del
extracto no se encuentra en alcohol, debe evaporarse el disolvente en baño de agua y
redisolver en la menor cantidad de alcohol (1 ml). En estas condiciones se adiciona 1
EXTRACTO ACUOSO
6 ML en 3 porcionesENSAYOS DE DRAGENDORFF
MAYER Y WAGNER(ALCALOIDES)
2 mLENSAYO DE CLORURO
FÉRRICO(TANINOS)
2 mLENSAYO DE SHINODA
(FLAVONOIDES)
2 mLENSAYO DE FEHLING
(AZ. REDUCTORES)
2 mLENSAYO DE ESPUMA
(SAPONINAS)
10 mLENSAYO DEMUCÍLAGOS
1 Ó 2 GOTASENSAYO DE
PRINCIPIOS AMARGOS
DIVIDIR EN FRACCIONES
Figura 12. Esquema de los ensayos realizados en extracto acuoso.
Fuente: Miranda, 2002; Ordoñez et al. 2005.
25
ml del reactivo, considerándose un ensayo positivo la aparición de coloración o
precipitado rojo (++ y +++) respectivamente.
d. Ensayo de Liebermann-Burchard: Empleado para reconocer en un extracto
la presencia de triterpenos y/o esteroides. Para ello, si la alícuota del extracto no se
encuentra en cloroformo, debe evaporarse el disolvente en baño maría, y el residuo
redisolverse en 1ml de cloroformo. Se adiciona 1ml de anhídrido acético y se mezcla
bien. Por la pared del tubo de ensayo se deja resbalar 2-3 gotas de ácido sulfúrico
concentrado sin agitar. Un ensayo positivo se tiene por un cambio rápido de
coloración:
1. Rosado-azul, muy rápido
2. Verde-intenso, visible aunque rápido.
3. Verde oscuro-negro, al final de la reacción.
e. Ensayo de Dragendorff: Permite reconocer en un extracto la presencia de alcaloides.
Para lo cual se coloca en un tubo de ensayo 5 ml del extracto y se adiciona una gota
de ácido clorhídrico concentrado (calentar suavemente y dejar enfriar). Con la solución
ácida se realiza el ensayo añadiendo tres gotas del reactivo de Dragendorff, si hay
opalescencia se considera (+), turbidez definida (++), precipitado (+++).
f. Ensayo de Mayer: se procede de la misma manera que para el ensayo
Dragendorff hasta obtener la solución ácida. Posteriormente se adiciona una pizca de
cloruro de sodio en polvo, se agita y se filtra. Se agregar 2 ó 3 gotas de la solución
reactivo de Mayer, si se observa opalescencia (+), turbidez definida (++), precipitado
coposo (+++).
g. Ensayo de Wagner: Se parte al igual que en los casos anteriores de la solución
ácida, añadiendo 2 ó 3 gotas del reactivo, clasificando los resultados de la misma
forma.
h. Ensayo de Espuma: Permite reconocer la presencia de saponinas, tanto del tipo
esteroidal como triterpénico. Se coloca 2 ml del extracto en un tubo de ensayo y se
diluye con 5 veces su volumen en agua, se agita la mezcla fuertemente durante 5-10
minutos.
26
El ensayo se considera positivo si hay la presencia espuma en la superficie del líquido
de más de 2 mm de altura y persiste por más de 2 minutos.
i. Ensayo de cloruro férrico: Reconoce la presencia de compuestos fenólicos y/o
taninos para ello a una alícuota del extracto se añade acetato de sodio con el fin de
neutralizar y 3 gotas de una solución de tricloruro férrico al 5 % en solución salina
fisiológica, un ensayo positivo puede dar la siguiente información general:
o Desarrollo de una coloración rojo-vino, compuestos fenólicos en general.
o Desarrollo de una coloración verde intensa, taninos del tipo pirocatecólicos.
o Desarrollo de una coloración azul, taninos del tipo pirogalotánicos.
j. Ensayo de Shinoda: Permite reconocer la presencia de flavonoides, se coloca 2 ml
en un tubo de ensayo, se diluye con 1 ml de ácido clorhídrico concentrado y una
pequeña porción de cinta de magnesio metálico. Después de la reacción se espera 5
minutos, se añade 1 ml de alcohol amílico, se mezclan las fases y se deja reposar
hasta que se separen.
El ensayo se considera positivo, cuando el alcohol amílico se colorea de amarillo,
naranja, carmelita o rojo (intensos en todos los casos).
k. Ensayo de mucílagos: Permite reconocer la presencia de estructuras tipo
polisacáridos, que forma un coloide hidrófilo de alto índice de masa que aumenta la
densidad del agua donde se extrae. Para ello, se coloca 10 ml del extracto en un tubo
de ensayo, se enfría a 0-5oC, si la solución toma una consistencia gelatinosa el
ensayo es positivo.
l. Ensayo de principios amargos y astringentes: El ensayo se lleva a cabo
saboreando una gota del extracto acuoso o del vegetal y reconociendo el sabor de
cada uno de estos principios, bien diferenciados al paladar.
m. Ensayo de resinas: Para detectar este tipo de compuesto, se adiciona a 2 ml de la
solución alcohólica, 10 ml de agua destilada. La presencia de un precipitado, indica un
ensayo positivo.
27
n. Ensayo de ninhidrina: Útil para reconocer en los extractos vegetales la presencia de
aminoácidos libres o de las aminas en general. Se toman 2 ml del extracto en alcohol,
si el extracto se encuentra en otro disolvente orgánico, se mezcla con 2 ml de solución
al 2% de ninhidrina en agua. La mezcla se calienta 5-10 minutos en baño de agua.
Este ensayo se considera positivo cuando se desarrolla un color azul violáceo.
o. Ensayo de antocianidinas: Permite reconocer en los extractos vegetales la
presencia de estructuras de secuencia C6-C3-C6 del grupo de los flavonoides. Se
calientan 2 ml de extracto etanólico por 10 minutos con 1 ml de ácido clorhídrico
concentrado. Se deja enfriar y se adicionan 1 ml de agua y 2 ml de alcohol amílico. Se
agita y se dejan separar las dos fases. La aparición de color rojo a marrón en la fase
amílica, es indicativa de un ensayo positivo.
p. Ensayo de Kedde: Permite reconocer en un extracto la presencia de glicósidos
cardiotónicos. Se colocan 2 ml del extracto en un tubo de ensayo, se mezcla con 1 ml
del reactivo y deja reposar durante 5-10 minutos. Un ensayo positivo es cuando
aparece una coloración violáceo, persistente durante 1 y 2 horas.
2.2. Extracción de metabolitos secundarios de Croton elegans.
2.2.1.Esquema de metodología estudiada
En la figura 13 se esquematiza la metodologia de trabajo seguida para el analisis fitoquimico y
de actividad biológica de Croton elegans.
28
Croton elegans
Recolección
Obtención de extractos totales
Separación cromatográfica
Elucidación de compuestos
Actividad
antimicrobiana Actividad
antioxidante
Actividad antioxidante Actividad
antimicrobiana
Figura 13.Esquema de la metodología empleada en la
extracción de metabolitos secundarios de Croton elegans.
Fuente: La autora.
29
2.2.2.Recolección del material vegetal
Se recolectaron las hojas de Croton elegans (Mosquera), en Enero de 2014 en la estación
experimental Santa Catalina del INIAP Sector Cutuglagua, Cantón Mejía, provincia de
Pichincha a una Altitud de 2400 - 3500m, con voucher MT-JA116.(Figura 14.)
2.2.3. Selección del material vegetal.
El material vegetal fue seleccionado por técnicos del INIAP y enviado desde su lugar de
recolección hasta el laboratorio de Ingeniería de Procesos del Departamento de Química para
continuar con el proceso de secado y manejo post cosecha.
2.3. Obtención del Extracto Total
A partir de 500 gramos de hojas secas de Croton elegans (mosquera), se realizó una
extracción sucesiva mediante maceración dinámica con disolventes de polaridad creciente
usando hexano, acetato de etilo (AcOEt) y metanol (MeOH), durante 3 horas con cada
disolvente a temperatura ambiente en proporción planta : disolvente (1:10). El proceso se
realizó por triplicado con cada disolvente.
Posteriormente se filtró al vacío cada extracción y mediante rotaevaporación a presión
reducida 50mbar y a 30 °C se obtuvieron tres extractos.
Una vez obtenidos los tres extractos en Hexano, AcOEt y MeOH, se realizó CCF a diferente
polaridad, usando placas de sílica gel 60 F254, con la finalidad de determinar cuál de los tres
extractos presentaba mayor riqueza y mejor separación de los compuestos.
Figura 14. Materia vegetal recolectada Croton elegans.
Fuente: INIAP, 2014.
30
2.4. Fraccionamiento en cromatografía en columna
Del extracto total en hexano (2g) se realizó un fraccionamiento en columna utilizando sílica gel
fase directa relación 1:100 (extracto:silica), eluyendo con un gradiente de polaridad creciente
iniciando con Hexano 100% hasta Hex:AcOEt (6:4).
2.4.1.Cromatografía de capa fina.
Mediante la técnica de cromatografía de capa fina (CCF) de las fracciones obtenidas de la
columna del extracto de hexano, se emplearon láminas de sílica gel 60 F254 (fase directa). Los
disolventes utilizados para la fase móvil fueron Hex-AcOEt 9:1(v/v), posteriormente se la
visualizo en una lámpara de luz ultravioleta de 254 y 365nm.
2.4.2.Purificación de compuestos.
Para la purificación de compuestos, se realizó fraccionamiento en microcolumna con sílica gel
60 (Merck 0.0015-0040mm), eluyendo en un gradiente de polaridad creciente iniciando con
hexano 100% a Hex-AcOEt (8:2).
2.5. Caracterización Estructural
2.5.1.Resonancia Magnética Nuclear.
Para obtener un espectro de RMN, se introduce una pequeña cantidad del compuesto disuelto
en un disolvente deuterado en este caso CDCI3 en un tubo de vidrio que se localiza dentro del
campo magnético del equipo.
El tubo que contiene muestra se hace girar alrededor de su eje vertical, el ordenador recoge la
intensidad respecto al tiempo y convierte dichos datos en intensidad respecto a frecuencia,
generando finalmente las respectivas gráficas (James, 1998).
Los espectros de RMN fueron obtenidos en un equipo Varian No. de serie 21953 operando a
400 MHz para 1H y 100 MHz para 13C
usando CDCl3. Se realizaron los experimentos mono y
bidimensionales.
2.5.2.Cromatografía de gases acoplada a Espectroscopia de masas (CG-EM).
El equipo empleado para obtener el peso molecular de los compuestos aislados, fue un
cromatógrafo de gases Agilent serie 6890N acoplado a un espectrómetro de masas Agilent
31
serie 5973 inert, dotado con un sistema de datos MSD-Chemstation D.01.00 SP1, que cuenta
con un inyector automático split/splitless serie 7683.
Las características de la columna capilar utilizada en el presente estudio y los parámetros
operacionales bajo los cuales se inyectaron las muestras para su posterior análisis se detallan
en la Figura 15.
Inyecctor (Split/Splitless)
Modo: Split
Temperatura inicial: 50°C (On)
Presión: 111.1 pka (Off) Gas: Helio
Columna
Columna capilar DB-5MS 0,25mm * 30m *0,25μm
Temperatura máxima: 350°C
Flujo constante
Flujo inicial: 0,9mL/min Presión inicial: 48.6 kpa Velocidad promedio: 35cm/sec
Presión de salida: vacío
Horno
Temperatura inicial: 60°C (On) Temperatura final: 300°C
Detector
Espectrómetro de masas Temperatura: 250°C (Off) Modo: Flujo constante Gas: Helio
Figura 15. Condiciones de operación del CG-EM en la columna DB-5MS para el análisis de los compuestos.
Fuente: (Aligent).
32
2.6. Determinación de la actividad antimicrobiana y antifúngica
La concentración mínima inhibitoria (CMI) se determinó mediante la técnica de microdilución
en caldo.
2.6.1.Preparación de las muestras.
Se realizó una dilución de 50μg de los extractos de hexano, AcOEt y MeOH en 980μL de
dimetilsulfóxido (DMSO), esta dilución se la utilizó tanto para CMI antibacteriano como
antifúngico.
Para determinar la actividad antimicrobiana de compuestos puros se emplean cantidades
mínimas, alrededor de 1mg.
2.6.2.Preparación del cultivo overnight.
Los microorganismos utilizados se encuentran en reserva criogénica a -80°C. Los medios de
cultivo y las condiciones de incubación para cada microorganismo se detallan en la tabla 1.
Tabla 1. Medios de cultivo y condiciones de incubación para bacterias
Microorganismos Medio de cultivo Condiciones de incubación
Klebsiella pneumoniae ATCC
® 9997
Caldo Tripticasa Soya 37°C por 14-16 horas
Pseudomonas aeruginosa ATCC
® 27853
Caldo Tripticasa Soya 37°C por 14-16 horas
Salmonella tiphymurium LT2
Caldo Nutritivo Oxoid 37°C por 14-16 horas
Escherichia coli ATCC
®25922
Caldo Tripticasa Soya 37°C por 14-16 horas
Proteus vulgaris ATCC
® 8427
Caldo Mueller Hinton 37°C por 14-16 horas
Enterococcus faecalis ATCC
® 29212
Caldo Infusión Cerebro-Corazón
37°C por 14-16 horas
Staphylococcus aureus ATCC
® 25923
Caldo Tripticasa Soya 37°C por 14-16 horas
Fuente: La autora.
33
Una vez preparados los medios se los esterilizó y se procedió a realizar el inóculo de cada
bacteria.
2.6.3.Preparación de la suspensión del inóculo para bacterias.
Del cultivo overnight preparado 24 horas antes de iniciar los ensayos, se tomaron 150-300μL
en 7mL de suero fisiológico estéril, ajustando el inóculo a una concentración de 0,5 en la
escala de McFarland, de ésta dilución se tomó 140μL y se inoculó en 7mL de Caldo Mueller
Hinton ajustando a una población bacteriana de 2x106 UFC/mL. Se tomaron 100μL de ésta
suspensión los cuales se usan para completar los 200μL del volumen final de la placa de
cultivo, ajustando la población bacteriana a 5x105 UFC/mL.
2.6.4.Preparación de la suspensión del inóculo para hongos.
Se preparó la suspensión de las cepas en reserva criogénica mantenidas a -80°C,cuya
concentración es conocida (esporas/mL). A partir de cada cultivo se toma una alícuota en una
cantidad suficiente de medio Saboraud, para ajustar la población fúngica a 1x105 esporas/mL.
consecutivamente se tomaron 100μL de ésta dilución los cuales se utilizaron para completar el
volumen final de la placa de cultivo (200μL), ajustando a la población fúngica a 5x104
esporas/mL. Las condiciones de cultivo de las cepas empleadas se detallan en la tabla 2.
Fuente: (La autora).
2.6.5. Concentración mínima inhibitoria (CMI) antibacteriana.
Para la ejecución de las pruebas se utilizaron placas estériles de 96 pocillos, colocando la
dilución de 180μL de caldo Mueller Hinton en la primera fila de pocillos, excepto en la columna
10, y 100μL a los pocillos restantes; posteriormente se agrega 20μL del extracto diluido
(20mg/mL), en los pocillos de la fila A y se mezcla. Seguidamente se realiza diluciones
seriadas tomando 100μL de los pocillos de la fila A y se diluye en los pocillos de la fila B,
continuando con ésta dilución hasta llegar a los pocillos de la fila H y desechamos los 100μL
sobrantes.
Tabla 2. Medios de cultivo y condiciones de incubación para las cepas de hongos utilizadas
Hongos esporulados Medios de cultivo Condiciones de incubación
T. mentagrophytes Caldo Sabouraud 28°C por 24-72h
T. rubrum Caldo Sabouraud 28°C por 24-72h
34
Se realiza las mismas diluciones en los pocillos de control de esterilidad (columna 3, 6, 9)
(180μL de caldo + 20μL del extracto diluido), control negativo (columna 11) (180μL de caldo +
20μL de DMSO) y control positivo (columna 12) (180μL de caldo + 20μL de Gentamicina para
Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Proteus vulgaris,
Staphylococcus aureus; y 20μL de Ampicilina para Salmonella tiphymurium y Enterococcus
faecalis a 1000ppm).
Preparadas las placas se inoculan con 100μL de la suspensión del inóculo completando a su
volumen final de 200μL, excepto los controles de esterilidad que se completan con 100μL de
Caldo Mueller Hinton, ajustando así a la población bacteriana a 5x105 UFC/mL, y la
concentración final del extracto de 1000 a 8μg/mL.
Finalmente se incuban las placas a 37°C por un periodo de tiempo 18-24 horas.
2.6.7.CMI antifúngico.
Se llevó a cabo el mismo procedimiento de diluciones seriadas que en la CMI antibacteriana,
modificando algunos parámetros tales como: el medio de cultivo que fue Caldo sabouraud, la
concentración final del inoculo es de 5x104 esporas/mL, el control positivo que es itraconazol
de 1mg/mL. Se incuban las placas a 28°C por 72-96 horas.
2.7. Actividad antioxidante
2.7.1.Evaluación de fenoles totales.
El esquema de la metodología empleada se presenta a continuación en la figura 16.
35
Curva estándar de ácido
gálico
Lectura de muestras
fenoles totales
Incubar por 2 horas protegido de la luz
50 mg de ácido gálico Aforar a 25 mL de metanol
Agregar 300 µL de Na2CO3 y mezclar
Mezclar y dejar reaccionar por 3 minutos
Agregar 2400 µL de H2O destilada +
150 µL de folin 0.25N
Tomar alícuotas de 0, 50, 100, 200, 300, 400 y 500 µL Aforar a 10 mL con metanol
Leer a 725 nm
Tomar 150 µL de cada alícuota
Pesar 0.0015 g de extracto y
aforar a 1.5 mL (1000 ppm)
Tomar 150 µL de extracto diluido
Agregar 2400 µL de H2O destilada +
150 µL de folin 0.25N
Mezclar y dejar reaccionar por 3 minutos
Agregar 300 µL de Na2CO3 y mezclar
Incubar por 2 horas protegido de la luz
Leer a 725 nm
Na2CO3: 2.64 g de Na2CO3 aforar a 25
mL con agua destilada
Folin 0.25 N: 3.125 mL de folin aforar a
25 mL con agua destilada
Figura 16. Esquema de la metodología empleada en la determinación de fenoles totales.
Fuente: La autora.
36
2.7.2.Ensayo ABTS.
El esquema de la metodología empleada se presenta en la figura 17.
Elaboración de la solución de trabajo
101.5 mg ABTS aforar a 25 mL con H2O
Mezclar y dejar reaccionar por 12 horas
17.57 mg K2S2O8 aforar a 25 con H2O
Tomar 1 mL + 60 mL de metanol
Medir absorbancia a 734 nm y ajustar hasta obtener una
lectura de 1.1 ± 0.02
Lectura de muestras ABTS
E. Medir absorbancia a 734 nm
D. Dejar reaccionar 2 horas en la oscuridad
C. Adicionar 2850 µL de la solución de trabajo ABTS
A. Pesar 0.0015 g de extracto y aforar a 1.5 mL
(1000 ppm)
B.150 µL de extracto diluído
Curva estándar de Trólox para ABTS
Seguir procedimiento de las muestras desde el paso C.
H. Tomar 150 µL de cada estándar
F. 25 mg de Trólox Aforar a 100 mL con metanol
G. Tomar alícuotas de 0.25, 1.5, 3, 4.5, y 8 ml
Aforar a 10 mL con metanol
Figura 17. Esquema de la metodología empleada en el ensayo ABTS.
Fuente: La Autora, 2015.
37
2.7.3.Ensayo DPPH.
El esquema de la metodología utilizada se presenta en la figura 18.
24 mg DPPH + 100 mL metanol
Tomar 10 mL + 45 mL metanol
Medir absorbancia a 515 nm ajustando hasta obtener una
lectura de 1.1 ± 0.02
Curva estándar de Trólox para DPPH
Seguir procedimiento de las muestras desde el paso C
H. Tomar 150 µL de cada estándar
F.25 mg de Trólox Aforar a 100 mL con metanol
G. Tomar alícuotas de 0.25, 1.5, 3, 4.5, y 8 ml
Aforar a 10 mL con metanol
Lectura de muestras DPPH
E. Medir absorbancia a 734 nm
D. Dejar reaccionar 24 horas en la oscuridad
C. Adicionar 2850 µL de la solución de trabajo DPPH
A. Pesar 0.0015 g de extracto y aforar a 1.5 mL
(1000 ppm)
B. Tomar 150 µL de extracto diluido
Figura 18. Esquema de la metodología empleada en el ensayo DPPH.
Fuente: La Autora.
38
CAPITULO III
RESULTADOS Y ANÁLISIS
39
3.1.Tamizaje fitoquímico
3.1.1 Tamizaje fitoquímico de Croton elegans.
En la Tabla 3 se muestran los resultados del tamizaje fitoquímico de Croton elegans.
Tabla 3. Resultados obtenidos del tamizaje fitoquímico
Especie Extracto Ensayo Resultado
Croton elegans
Etéreo
Sudan +
Dragendorff ++
Mayer -
Wagner ++
Baljet +++
Liebermann- burchard
+
Etanolico
Catequinas +
Resinas -
Fheling -
Dragendorff +++
Mayer ++
Wagner ++
Baljet -
Liebermann-burchard
-
Espuma -
Cloruro férrico -
Ninhidrina -
Shinoda -
Antocianidinas -
Kedde -
Acuoso
Fheling -
Dragendorff +++
Mayer +
Wagner ++
Espuma +
Cloruro Férrico Verde
Shinoda -
Mucílagos -
P. amargos y astringentes
amargo
(+) = Opalescencia
(++) = Turbidez
(+++) = Precipitado
Fuente: La Autora.
40
Los resultados obtenidos son similares a los reportados en literatura, la cual indica que las
principales sustancias que contienen las especies del género Croton son los triterpenos,
flavonoides y alcaloides, sin embargo, también se ha registrado la presencia de otros
metabolitos secundarios como las cumarinas, glicósidos cianogénicos y taninos. (Suárez,
2006).
3.1.2 Tamizaje fitoquímico de Salvia hispanica.
En la tabla 4 se indican los resultados obtenidos de Salvia hispanica en el tamizaje fitoquímico.
Tabla 4. Resultados obtenidos del tamizaje fitoquímico.
Especie Extracto Ensayo Resultado
Salvia hispanica
Etéreo
Sudan +
Dragendorff -
Mayer ++
Wagner +
Baljet -
Liebermann- burchard
+
Etanolico
Catequinas +
Resinas -
Fheling -
Dragendorff ++
Mayer +
Wagner ++
Baljet -
Liebermann-burchard
-
Espuma +
Cloruro férrico Verde
Ninhidrina -
Shinoda -
Antocianidinas +
Kedde -
Acuoso
Fheling +
Dragendorff +++
Mayer ++
Wagner ++
Espuma +
Cloruro Férrico Verde
Shinoda +
Mucílagos -
P. amargos y Insípido
41
Los resultados obtenidos indican la presencia de alcaloides, grasas, triterpenos y/o esteroides,
flavonoides, saponinas y azucares reductores, sin embargo no existen reportes comparables
con los presentes resultados, ya que únicamente se registran datos en semillas, por lo que Da
Silva et al.(2014), reporta la presencia de ácidos grasos y compuestos fenólicos, que
concuerdan con el ensayo de sudan positivo para las hojas de Salvia hispánica, y difieren en
cuanto a la presencia de compuestos fenólicos, ya que no se observó la coloración respectiva
en el ensayo de cloruro férrico.
3.1.3 Tamizaje fitoquímico de Bryophyllum pinnatum.
En la tabla 5 se detallan los resultados obtenidos del tamizaje fitoquímicos de Bryophyllum pinnatum.
Tabla 5. Resultados obtenidos del tamizaje fitoquímico.
Especie Extracto Ensayo Resultado
Bryophyllum pinnatum
Etéreo
Sudan +
Dragendorff -
Mayer -
Wagner -
Baljet -
Liebermann- burchard
+
Etanolico
Catequinas -
Resinas -
Fheling -
Dragendorff -
Mayer -
Wagner -
Baljet -
Liebermann-burchard
-
astringentes
(+) = Opalescencia
(++) = Turbidez
(+++) = Precipitado
Fuente: La Autora.
42
Espuma -
Cloruro férrico -
Ninhidrina -
Shinoda -
Antocianidinas -
Kedde -
Acuoso
Fheling -
Dragendorff -
Mayer -
Wagner -
Espuma -
Cloruro férrico -
Shinoda -
Mucílagos -
P. amargos y astringentes
Amargo
(+) = Opalescencia
(++) = Turbidez
(+++) = Precipitado
Fuente: La Autora.
A partir del análisis confirmamos la presencia de algunos grupos como ácidos grasos, terpenos
y esteroides, datos comparables a los obtenidos por Anjoo & Kumar (2010), donde además de
los encontrados reportó la presencia de saponinas, compuestos fenólicos, taninos y
flavonoides.
3.1.4 Tamizaje fitoquímico de Solanum sp.
En la tabla 6 se presentan los resultados obtenidos del tamizaje fitoquímico de Solanum sp.
Tabla 6. Resultados obtenidos del tamizaje fitoquímico.
Especie Extracto Ensayo Resultado
Solanum sp. Etéreo
Sudan +
Dragendorff -
Mayer ++
Wagner +
Baljet -
Liebermann- burchard
+
43
Etanolico
Catequinas +
Resinas -
Fheling -
Dragendorff ++
Mayer ++
Wagner +
Baljet -
Liebermann-burchard
-
Espuma +
Cloruro férrico Verde
Ninhidrina -
Shinoda +
Antocianidinas -
Kedde -
Acuoso
Fheling +
Dragendorff +++
Mayer ++
Wagner ++
Espuma +
Cloruro férrico Verde
Shinoda +
Mucílagos -
P. amargos y astringentes
Amargo
(+) = Opalescencia
(++) = Turbidez
(+++) = Precipitado
Fuente: La Autora.
Solanum sp. presenta compuestos fenólicos, taninos, flavonoides, alcaloides, esteroides,
triterpenos y saponinas, que son contrastados con los reportados por Araujo et al. (2010) en el
estudio realizado de Solanum lycocarpum, que además de los compuestos presentes en
Solanum sp. reporta la presencia de glicósidos cardiotónicos y resinas.
3.2 Extractos obtenidos de Croton elegans
A partir de 500 g de hojas secas de Croton elegans se obtuvieron los extractos de hexano,
acetato de etilo y metanol (Tabla 7).
44
Tabla 7. Peso y rendimiento de los extractos obtenidos de Croton elegans.
Extracto Peso inicial planta
seca (g) Peso final (g) Rendimiento(%)
Extracto total de hexano
500
20.64 4.12
Extracto total de Acetato de etilo
8.12 1.62
Extracto total de Metanol
37.58 7.51
Fuente: La Autora, 2015.
3.3 Compuestos aislados de Croton elegans
Del extracto total en hexano se realizó una columna en fase directa en polaridad creciente,
obteniéndose un total de 36 fracciones (Tabla 8), con un volumen aproximadamente de 50ml.
De estas se procedió a unirlas de acuerdo a las características presentadas en mediante CCF.
Tabla 8. Fraccionamiento cromatográfico del extracto total de Hexano.
Fracciones Proporción Mezcla de
disolventes
Peso(mg)
1-6 100% Hex 13.4
7-14 100% Hex 17.2
15-21 9:1 Hex-AcEOt 372
22-25 8:2 Hex-AcEOt 200
26-29 8:2 Hex-AcEOt 262.3
30-31 8:2 Hex-AcEOt 42.5
32-36 7:3 Hex-AcEOt 56.9
Fuente: La Autora.
45
3.3.1 Fracción 15-21.
La fracción fue obtenida en hexano - acetato de etilo, en proporción 9:1 v/v, con un peso de
372 mg. Posteriormente se purificó mediante cromatografía en columna en relación 1:100
compuesto: sílica, en polaridad creciente iniciando con hexano 100% hasta Hex-AcEOt 7:3. Se
eluyó un compuesto en polaridad 95:05 Hex-AcEOt con un peso de 30 mg, presentándose en
forma de cristales blanquecinos, siendo soluble en CH2Cl2 y CHCl3.
Se realizó cromatografía de capa fina empleando como eluyentes Hex-AcEOt en proporción
90:1 y una placa de sílica gel de fase directa de 5 cm de longitud.
El compuesto fue visible en luz UV de 254 nm. Al ser revelada con ácido sulfúrico y vainillina
al 5% se observó una mancha de color morado (Figura 23), tiene un factor de retención (RF)
de 0.5.
El compuesto fue identificado mediante técnicas espectroscópicas, en donde se observo las
siguientes señales:
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm: 2.39 (1H, ddd, H-2a), 2.25 (1H, q, H-4), 1.97 (1H, m, H-1a),
1.18 (3H, s, H-28), 1.04 (3H, s, H-27), 1.01 (3H, s, H-26), 1.00 (3H, s, H-29), 0.95 (3H, s, H-30),
0.88 (3H, d, H-23), 0.86 (3H, s, H -25), 0.72 (3H, s, H-24).
13CNMR (100 MHz, CDCl3) δ ppm: 213.4 (C-3, carbón cetónico), 59.6 (C-10), 58.3 (C-4), 53.2
(C-8), 42.9 (C-18), 42.2 (C-5), 41.6 (C-2), 41.4 (C-6), 39.8 (C-13), 39.4 (C-22), 38.4 (C-14),
37.5 (C-9), 36.1 (C-16), 35.7 (C-11), 35.4 (C-19), 35.1 (C-30), 32.9 (C-15), 32.5 (C-21), 32.2 (C-
28), 31.9 (C-29), 30.6 (C-12), 30.1 (C-17), 28.3 (C-20), 22.4 (C-1), 20.4 (C-26), 18.8 (C-27),
18.3(C-7), 18.1 (C-25), 14.8 (C-24), 6.9 (C-23).
Figura 19. CCF revelada del fraccionamiento 15-21.
Fuente: La Autora.
46
Por lo tanto el compuesto aislado fue identificado como un triterpeno pentacíclico. La
confirmación de esta estructura fue apoyada por HMBC y HSQC y comparada con literatura
(Quintans et al.2013; Zhong-Zhao et al.2011; Gunatilaka, Nanayakkara & Wazeer, 1983).
Esta molécula es conocida como friedelina (figura 22.) con una formula molecular C30H50O y
una masa de 426.72 g/mol.
La friedelina está presente en muchas familias de plantas (Kuete et al. 2007). Para el género
Croton no existen reportes hasta el momento, pero si en la familia Euphorbiaceae, Castaneda
et al. (1992) lo ha reportado en su estudio realizado de la especie Celaenodendron
mexicanum, otro reporte existente para esta familia es el de Ganwar, Goel & Nath (2014) en la
especie Mallotus philippinensis Muell. Arg. Además Kuete et al. (2007) la ha reportado como
uno de los triterpenos presentes en su estudio de la especie Thecacoris annobonae, y de la
misma manera para la especie Jatropha curcas (Abdelgadir & Van Staden, 2013).
La friedelina ha sido descrita por tener varios efectos, entre ellos acción alelopática (Santos et
al., 2008), actividades antiinflamatorias y antimicrobianas (Queiroga et al.,2000; Tamokou et
al., 2009; Kuete et al., 2007; Tchakam et al.,2012). Algunos estudios han demostrado que la
Friedelina puede actuar como indicador y biomarcador para plantaciones en los sedimentos en
sistemas acuáticos. (Hanischa et al., 2003; Simoneit et al., 2009; Pisani et al., 2013). En cuanto
a su actividad citotóxica Utami et al. (2013) la ha reportado como prometedora frente a dos
líneas celulares cancerígenas HeLa y CEM-SS.
Figura 20. Estructura química friedelina.
Fuente: La Autora.
47
3.3.2 Fracción 26-29.
La fracción fue obtenida en Hex-AcEOt, en proporción 8:2 v/v, con un peso de 262.3 mg.
Posteriormente se purificó mediante cromatografía en columna en relación 1:100 compuesto
sílica, en polaridad creciente iniciando con Hex-AceOt 9:1 hasta Hex-AcEOt 6:4, el compuesto
eluyó en polaridad 8:2 Hex-AcEOt con un peso de 16 mg. el compuesto se presentó en forma
de cristales blanquecinos, siendo soluble en CH2Cl2 y CHCl3.
El compuesto fue visible en luz UV de 254 nm. Al ser revelada con ácido sulfúrico y vainillina al
5% se observó una mancha de celeste (Figura 24), posteriormente se calculó el factor de
retención (RF) que fue 0,3 en 9:1.
Figura 21. Estructura química Cicloeucalenol
Fuente: La Autora
Figura 22. CCF revelada del fraccionamiento 26-29.
Fuente: La Autora
48
El compuesto presenta como principales características un protón olefínico como doble doblete
en δ 4.71 ppm, protón ciclropropílico como dobletes en δ 0.17 y 0.38 ppm, protones metilo en
0.91-1.60 ppm, protones metino seguido de un grupo hidroxilo como un multiplete en 3.20-3.28
ppm (Kongkathip et al.2002).
El compuesto fue identificado mediante técnicas espectroscópicas, en donde se observó las
siguientes señales:
1HNMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 4.72 (1H, brs, H-28), 4.67 (1H, brd, H-28), 3.22 (1H,ddd, H-3) ,
1.03 (6H, d, H26, 27), 0.98 (3H, d, H-30), 0.97 (3H, s, H-18), 0.91 (3H, d, H-21), 0.89 (3H, s, H-
32), 0.39 (1H, brd, H-19b), 0.14 (1H, d, H-19a);
13CNMR (CDCl3, 100 MHz) δ: 30.9 (C-1), 34.9 (C-2), 76.7 (C-3), 44.7 (C-4), 43.4 (C-5), 24.8 (C-
6), 25.3 (C-7), 47.0 (C-8), 23.7 (C-9), 29.6 (C-10), 27.1 (C-11), 33.0 (C-12), 45.5 (C-13), 49.0
(C-14), 35.5 (C-15), 28.2 (C-16), 52.3 (C-17), 17.9 (C-18), 27.4 (C-19), 36.2 (C-20), 18.4 (C-
21), 35.1 (C-22), 31.4 (C-23), 157.0 (C-24), 33.9 (C-25), 22.1 (C-26), 22.0 (C-27), 106.0 (C-28),
19.2 (C-32), 14.5 (C-30).
Los datos espectroscópicos fueron apoyados con HMBC, COSY y HSQC, y contrastados con
los reportados por Kikuchi, Kadota & Tsubono, 1986; Kongkathip et al. 2002; YuBo et al. 2011.
Esta molécula es conocida como cicloeucalenol (figura 22.) con una formula molecular C30H50O
y una masa de 426.72 g/mol. (Figura 23).
El cicloeucalenol es un triterpeno del tipo cicloartano, no existen reportes al momento del
aislamiento e identificación del cicloeucalenol para el género Croton, sin embargo se reporta
para la familia Euphorbiaceae, como es el caso de Aichour et al. (2014) que lo ha reportado
en la especie Euphorbia bupleuroides. Haba et al. (2007) menciona su presencia en la especie
Euphorbia guyoniana. Gewali et al.(1990) hace referencia de este compuesto en Euphorbia
antiquorum.
El cicloeucalenol ha sido reportado por mostrar efectos antiinflamatorios, cardiotónicos y
espasmolíticos. (Kongkathip et al. 2002). En el estudio realizado por Adekanmi et al.(2013) se
demostró que el cicloeucalenol posee baja toxicidad con respecto al neuroblastoma humano.
Según Kumari et al.(2011) tanto la friedelina como el cicloeucalenol han sido aislados en la
49
especie Commiphora berryi, perteneciente a la familia Burseraceae.
3.4 Determinación de actividad antimicrobiana
La actividad antimicrobiana tanto de los extractos como de los compuestos aislados fue
realizada mediante la técnica de microdilución en caldo, los resultados se indican en la tabla 9.
Se considera que si una muestra presenta una CMI <100μg/ml la actividad antimicrobiana es
buena, de 100 a 500μg/ml es moderada, de 800 a 1000μg/ml es mala y >1000μg/ml es nula.
(Holetz, et al, 2002).
Tabla 9. Actividad antimicrobiana de los extractos y de los compuestos aislados
Concentración mínima inhibitoria(ug/mL)
Extracto/compuesto
Bacterias Hongos
Kp Pa St Ec Pv Ef Sa Tr Tm
Hexano NA NA NA NA NA NA NA NA NA
Acetato NA NA NA NA NA NA NA NA NA
Metanol NA NA NA NA NA NA NA NA NA
Friedelina NA NA NA NA NA NA NA 4000 NA
Cicloeucalenol NA NA NA NA NA NA NA NA NA
Kp: Klebsiella pneumoniae Pa: Pseudomona aeruginosa St: Salmonella tiphymarium Ec: Escherichia coli Pv: Proteus vulgaris Ef: Enterococcus faecalis Sa: Staphylococcus aureus Tr: Trichophytum rubrum Tm: Trichophytum mentagrophytes
Fuente: La Autora.
50
3.4.1 Determinación de actividad antibacteriana
Tanto los extractos obtenidos como los compuestos aislados no presentaron actividad
antibacteriana para ninguno de los microorganismos de prueba. Sin embargo Tamokou et al,
(2009) identificó en la friedelina una buena actividad antimicrobiana frente a Salmonella typhi
(25 ug/ml), mientras que Kuete et al. (2007) reportó similar CMI frente al mismo
microorganismo, además de Pseudomonas aeruginosa y Staphyloccoccus aureus. En un
estudio diferente de Kuete (2007), se reporta buena actividad antimicrobiana de la friedelina
frente a Proteus vulgaris. Cowan (1999) sugiere que uno de los posibles mecanismos de
acción podría ser la disrupción de membrana.
Por otro lado el cicloeucalenol mostró ser inactivo frente a todos los microorganismos de
prueba, lo que confirma los resultados reportados por Santos et al. (2010), ya que de igual
manera se reporta inactivo para Staphyloccoccus aureus, Escherichia coli y Pseudomona
aeruginosa.
3.4.2 Determinación de actividad antifúngica.
Tanto los extractos obtenidos como los compuestos aislados no presentaron actividad
antifúngica frente a Trichophyton rubrum y Trichophyton mentagrophytes. Sin embargo la
friedelina tiene buena actividad antifúngica contra Candida albicans y Candida gabatra, (Kuete
et al. 2007), mientras que Tamakou et al. (2009) reporta inactividad frente a distintas especies
de Candida como C. tropicalis, C. parapsilosis y C. neoformans.
Por otra parte el cicloeucalenol no presenta actividad antifúngica para Candida albicans
(Santos et al. 2010).
Para Croton elegans no existe ningún reporte en cuanto a su actividad antifúngica, sin
embargo Gurgel et al. (2005), reporta buena actividad antifúngica de una destacada especie de
este género como es Croton urucurana contra varios organismos como Trichophyton rubrum
Trichophyton mentagrophytes Trichophyton tonsurans Microsporum canis y Epidermophyton
floccossum, siendo esta una especia perteneciente al mismo género.
51
3.5 Determinación de actividad antioxidante
Los resultados de los extractos y compuestos obtenidos de Croton elegans se detallan en la
tabla 10.
Tabla 10. Resultados de actividad antioxidante de los extractos y compuestos obtenidos de Croton
elegans.
MUESTRA
FENOLES ABTS DPPH
µMAcG/mg ext.
desviación
µMT/mg ext
desviación
µMT/mg ext
desviación
Hexano 0.000 0.002 0.002 0.000 0.001 0.000
Acetato 0.000 0.006 0.002 0.000 0.002 0.000
Metanol 0.000 0.001 0.005 0.000 0.003 0.000
Cicloeucalenol
0.000 0.009 0.001 0.000 0.000 0.000
Friedelina 0.000 0.001 0.001 0.000 0.001 0.000
Tanto los extractos como la friedelina y cicloeucalenol no presentaron actividad antioxidante.
En cuanto al resultado presentado por la friedelina para DPPH es apoyado por Utami et al.
2013. Por otro lado el cicloeucalenol mostró no poseer actividad antioxidante, sin embargo
Wang et al. 2014 lo reporto como un potente antioxidante en los métodos de DPPH Y ABTS.
Para Croton elegans no existen reportes de actividad antioxidante al momento, sin embrago
especies comunes a su género lo registran como es el caso de Croton celtidifolius, que posee
actividad antioxidante significativa (Nardi et al.2003), de igual manera Divya et al. (2011),
reporta actividad antioxidante para la especie Croton bonplandianum.
Fuente: La Autora.
52
CONCLUSIONES
Del extracto total de hexano de C.elegans mediante técnicas cromatográficas se
identificaron dos triterpenos, uno de origen pentacíclico, friedelina y el otro de origen
cicloartano, Cicloeucalenol.
La friedelina y el cicloeucalenol son compuestos de naturaleza triterpénica de fórmula
molecular C30H50O con una masa de 426.7174 g/mol.
Los dos compuestos identificados en Croton elegans son el primer reporte para éste
especie.
Los compuestos aislados no presentaron actividad antioxidante y actividad antimicrobiana.
53
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0190−0192.
63
ANEXOS
Espectros de Resonancia Magnética Nuclear de Friedelina
Anexo 1. Espectro de 1HNMR (400 MHz, CDCL3).
64
Anexo 2. Espectro de 13CNMR (100 MHz, CDCL3).
65
Anexo 3. Espectro COSY
66
Anexo 4. Espectro HMBC
67
Anexo 5. Espectro HSQC
68
Espectros de Resonancia Magnética Nuclear de Cicloeucalenol
Anexo 6. Espectro de 1HNMR (400 MHz, CDCL3).
69
Anexo 7. Espectro de 13CNMR (100 MHz, CDCL3).
70
Anexo 8. Espectro HMBC
71
Anexo 9. Espectro HSQC
