TEMA 41. CONTEXTUALIZACIÓNCONTEXTUALIZACIÓN.Técnica que engloba un gran número de disciplinas y...
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TEMA 41TEMA 41
CONTEXTUALIZACIÓNCONTEXTUALIZACIÓNCONTEXTUALIZACIÓNCONTEXTUALIZACIÓN Técnica que engloba un gran número de disciplinas y áreas de investigación:
biología molecular bioquímica biología celular virología medicina…
Hace disminuir el número necesario de animales de experimentación
Tecnología de máxima actualidad y controversia
Proporciona modelos extrapolables válidos de patologías humanas
INTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓN Un organismo transgénico es aquel que porta en su genoma
genes “nuevos”
En animales se consigue normalmente por microinyección de DNA purificado en el pronúcleo de huevos fertilizados
En plantas, el DNA exógeno se transfiere desde la bacteria A.tumefaciens
Se requiere la integración en el genoma del organismo manipulado
DATOS HISTÓRICOSDATOS HISTÓRICOSDATOS HISTÓRICOSDATOS HISTÓRICOS 1891. El grupo de Heape describe los primeros éxitos de
transferencia de embriones
1977. Gurdon transfiere mRNA y DNA en huevos de Xenopus y estudian la síntesis proteica
1981. Gordon y Ruddle acuñan la palabra transgénico: variante animal originada tras la introducción de genes nuevo en su genoma
1986. Brinster y Palmiter describen la introducción de genes dentro de la línea germinal de animales
LEGISLACIÓN EN ESPAÑALEGISLACIÓN EN ESPAÑALEGISLACIÓN EN ESPAÑALEGISLACIÓN EN ESPAÑA
Legislación sobre Organismos Modificados
Genéticamente. Real Decreto 951/1997 que
establece el régimen jurídico de la utilización
confinada, liberación voluntaria y comercialización
de organismos modificados genéticamente, con el
fin de prevenir el riesgo para la salud humana y el
medio ambiente (B.O.E. 150, 24 de junio de 1997).
APLICACIONES DE LA APLICACIONES DE LA TRANSGENIZACIÓNTRANSGENIZACIÓN
APLICACIONES DE LA APLICACIONES DE LA TRANSGENIZACIÓNTRANSGENIZACIÓN
Bases genéticas de enfermedades y diseños de terapia
Modelos para investigación de infecciones y terapia génica
Modelos como banco de pruebas de diferentes drogas y medicamentos
Diseños biotecnológicos en industrias agropecuarias
Modelos de animales para analizar los efectos de la modulación, activación o supresión de la expresión génica
ASPECTOS A CONSIDERAR EN ASPECTOS A CONSIDERAR EN LA TRANSGENIZACIÓNLA TRANSGENIZACIÓN
ASPECTOS A CONSIDERAR EN ASPECTOS A CONSIDERAR EN LA TRANSGENIZACIÓNLA TRANSGENIZACIÓN
Impacto medioambiental
Aceptación pública
Consideraciones éticas
Legislación
Seguridad en el caso de alimentos transgénicos
Aspectos de patente, economía y uniformidad del producto
REFLEXIONES...REFLEXIONES...REFLEXIONES...REFLEXIONES...¿Podrían aparecer nuevas enfermedades o producirse un
salto interespecífico de alguna enfermedad concreta?
¿Podrían crearse organismos altamente patógenos artificialmente?
¿Cuál sería el verdadero impacto medioambiental de algunos productos transgénicos si se liberaran en la naturaleza?.
PRODUCCIÓN DE PRODUCCIÓN DE ANIMALES TRANSGÉNICOSANIMALES TRANSGÉNICOS
PRODUCCIÓN DE PRODUCCIÓN DE ANIMALES TRANSGÉNICOSANIMALES TRANSGÉNICOS
1º Determinar, caracterizar y purificar el material genético a transferir
2º Superovulación
3º Transferencia génica
4º Transferencia de embriones
5º Caracterización de la progenie
PREPARACION Y PREPARACION Y PURIFICACION DEL DNAPURIFICACION DEL DNA
PREPARACION Y PREPARACION Y PURIFICACION DEL DNAPURIFICACION DEL DNA
DNA sin nicks o roturas de secuencia
Tampones de microinyección de baja fuerza iónica
Concentraciones de DNA entre 1 y 2 ng/l.
DNA con extremos no romos se integran mejor
Microinyección en el pronúcleo masculino
PROCESOS DE BIOLOGÍA PROCESOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR FRECUENTESMOLECULAR FRECUENTES
PROCESOS DE BIOLOGÍA PROCESOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR FRECUENTESMOLECULAR FRECUENTES
Construcción de librerías génicas
PCR
Secuenciación nucleotídica
Inserción en vectores
Extracción, purificación y concentración
SUPEROVULACIÓNSUPEROVULACIÓNSUPEROVULACIÓNSUPEROVULACIÓN
Mediante las siguientes hormonas:1ª: - PMSG (Pregnant Mare´s Serum
Gonadotropin) - FSH (Follicle-Stimulating Hormone)
2ª: - HCG (Human Chorionic Gonadotropin) - LH (Luteinizing Hormone)
Hasta 35 óvulos por hembra
MODELOS DE MODELOS DE TRANSFERENCIA GÉNICATRANSFERENCIA GÉNICA
MODELOS DE MODELOS DE TRANSFERENCIA GÉNICATRANSFERENCIA GÉNICA
Microinyección
Infección viral (retrovirus normalmente)
Transfección de células Embrionarias (ES)
Segmento T-DNA del plásmido Ti (plantas)
MICROINYECCIÓNMICROINYECCIÓNMICROINYECCIÓNMICROINYECCIÓN
Transgén introducido directamente en el pronúcleo masculino (mayor tamaño)
El tamaño del fragmento a microinyectar no es muy relevante, incluso
Cromosomas artificiales de levadura (Yeast Artificial Chromosomes, YAC)
Inserción en el genoma al azar
ELEMENTOS DE LA MICROINYECCIÓNELEMENTOS DE LA MICROINYECCIÓN ELEMENTOS DE LA MICROINYECCIÓNELEMENTOS DE LA MICROINYECCIÓN
Embriones en estadio 1 (2 pronúcleos)
DNA a transferir purificado
Microscopio de microinyección
Micropipeta de sujección
Pipeta de microinyección
REIMPLANTACION DE LOS REIMPLANTACION DE LOS EMBRIONES MICROINYECTADOSEMBRIONES MICROINYECTADOS
REIMPLANTACION DE LOS REIMPLANTACION DE LOS EMBRIONES MICROINYECTADOSEMBRIONES MICROINYECTADOS
Transferencia al oviducto de una hembra pseudopreñada. Para ello,
Cruce con ratones vasectomizados
Los embriones se pueden congelar con un agente crioprotector (DMSO)
ANÁLISIS DE LA PROGENIEANÁLISIS DE LA PROGENIEANÁLISIS DE LA PROGENIEANÁLISIS DE LA PROGENIE Técnicas de Biología Molecular:
Southern blot Slot o Dot blot Northern blot PCR...
Técnicas Inmunobioquímicas Inmunoprecipitación Inmunohistoquímica Inmofluorescencia Western blot...
Otras: Desarrollo del animal Conducta...
CÉLULAS EMBRIÓNICAS CÉLULAS EMBRIÓNICAS PLURIPOTENCIALES (ES) IPLURIPOTENCIALES (ES) I
Suelen derivar de la masa interna del blastocisto
Pueden originar “en cultivos” células de diferentes tejidos (epiteliales, musculares…)
ES reinyectadas en el blastocisto constituirán parte del tejido adulto
CÉLULAS EMBRIÓNICAS CÉLULAS EMBRIÓNICAS PLURIPOTENCIALES (ES) IIPLURIPOTENCIALES (ES) II
CÉLULAS EMBRIÓNICAS CÉLULAS EMBRIÓNICAS PLURIPOTENCIALES (ES) IIPLURIPOTENCIALES (ES) II
Permite recombinación homóloga del transgén con el genoma celular:
Introducir un gen nuevo Sustituir uno ya existente por otro mutado, consiguiendo la
pérdida funcional de dicho gen: “Knock-out”
Las ES manipuladas se introducen en el útero de la hembra pseudopreñada
Suelen producir Quimeras
TRANSFERENCIA GÉNICA EN TRANSFERENCIA GÉNICA EN “ES”“ES” Transfección:
Precipitación con fosfato cálcico
Lipofección
Electroporación
Infecciones virales: Retrovirus
Adenovirus
Herpesvirus
TRANSFERENCIA GÉNICA TRANSFERENCIA GÉNICA MEDIADA POR RETROVIRUSMEDIADA POR RETROVIRUS
TRANSFERENCIA GÉNICA TRANSFERENCIA GÉNICA MEDIADA POR RETROVIRUSMEDIADA POR RETROVIRUS
Retrovirus alcanza una eficiencia de transferencia próxima al 100%
Uno de los retrovirus más utilizados es el de la leucemia murina (MuLV).
Embriones de 4-16 células pueden ser infectados con retrovirus recombinante
Tras la infección, el embrión se reimplanta en el útero de la hembra pseudopreñada
El virus solo puede integrar, al azar, una copia de DNA por célula.
DNA vector
Introducción delDNA
Estadio embrionario
Transferencia delembrión
Nº de copias de DNAintegradas
Porcentaje de éxito
Integración
Desventajas
Microinyección
Cualquier tipo deDNA clonado
Microinyección
Monocelular
Oviducto
1-200
10-30
Al azar
a) Daño físicodurantemicroinyección
b) Integraciónmuticopia
c) No se producerecombinaciónhomóloga
Infección retroviral
Retrovirusrecombinante o no
Infección tras removerla zona pelúcida
4-16 células
Útero
1
5-40
Normalmente al azar através de las LTRs
a) Bajo nivel deexpresión
Células ES
DNA clonado oretrovirus
Electroporación oinfección retroviral
ES Totipotentes
En el blastocisto y deaquí al útero
Varía según métodode introducir DNA
Hasta el 100
Depende del métodode introducir el DNA
a) Dificultad deconseguirbuenos cultivoscelulares
RESUMEN DE LARESUMEN DE LATRANSFERENCIATRANSFERENCIAGÉNICAGÉNICA
RESUMEN DE LARESUMEN DE LATRANSFERENCIATRANSFERENCIAGÉNICAGÉNICA
Colonias ESColonias ES Cultivos ESCultivos ES
QuimerasQuimeras
TRANSGENIZACIÓN POR CÉLULAS TRANSGENIZACIÓN POR CÉLULAS ESES