Técnicas en bioquímica, HOMOGENIZACION Y FRACCIONAMIENTO SUBCELULAR, CENTRIFUGACION
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Universidad de Carabobo Facultad de Ciencias de la Salud Escuela de Medicina “Dr. Witremundo Torrealba” Departamento de Bioquímica y Fisiología Núcleo Aragua Exponentes : Cesar Rivero María G. Rocha Lesbis Rodríguez
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Universidad de Carabobo
Facultad de Ciencias de la Salud
Escuela de Medicina “Dr. Witremundo Torrealba”
Departamento de Bioquímica y Fisiología
Núcleo Aragua
Exponentes :
Cesar Rivero
María G. Rocha
Lesbis Rodríguez
Durante años se creyó que la responsable de la
demora en la llegada de un hijo era la mujer…
CAPACITACIÓN
ESPERMÁTICA
Swim-up
Gradientes
de
densidad
Explicar en que consiste la homogenización y el fraccionamiento subcelular
Analizar los fundamentos teóricos de la centrifugación y su utilidad
Homogenización y fraccionamiento subcelular
Fuerza centrifuga relativa ,Centrifugas de baja y alta velocidad
Coeficiente de sedimentación
Centrifuga por velocidad de sedimentación
Centrifuga por equilibrio de sedimentación , fraccionamiento en gradiente utilidad
DOS (2) FASES:
El fraccionamiento subcelular es un conjunto de
métodos y técnicas que tienen como objetivo
obtener fracciones puras o enriquecidas en un
determinado componente celular, ya sea éste un
orgánulo (mitocondrias, núcleos, peroxisomas,
etc.) una fracción de membrana, complejos
multiproteicos (citoesqueleto de actina,
microtúbulos, poros nucleares, etc.).
1) Rotura de las células o tejidos para obtener un lisado celular (o tisular)
en el que la fracción deseada se encuentre en condiciones adecuadas
para su purificación. (HOMOGENIZACION)
2) Separación de la fracción deseada del resto de
componentes de la célula o del tejido
Esto se consigue empleando procedimientos mecánicos suaves
conocidos generalmente como HOMOGENIZACIÓN. Estos métodos
producen la rotura de las membranas celulares, suavemente, con lo que
se libera el contenido celular.
HOMOGENIZACIONSe refiere al rompimiento de la celula o el tejido
del cual se pretende extraer la organela o la
molecula de interes biologico.
Células anexas: primero se deben romper conexiones
con otras células.
Células no anexas: pueden separarse teniendo en cuenta
forma, densidad o características que puedan marcarse.
Homogenizador de Esferas Homogenizador de émbolo y tubo
Homogenizador Rotor/Stator Blenders (Licuado
ra)
SHOCK OSMOTICO
MORTERO Y MANO
SONICACION
COMPRESION -
DESCOMPRESION. Picador /
prensa de sólidos
CONGELAMIENTO -
DESCONGELAMIENTO
La separación puede ser llevada a cabo empleando la
centrifugación. Manejando las variables fuerza centrifuga y
tiempo podemos separar primero los organelos de mayor
tamaño como el núcleo. En centrifugaciones sucesivas de
mayor fuerza gravitacional y mayor tiempo obtendremos las
diferentes fracciones de nuestro interés.
La centrífuga es el equipo que nos proporciona la técnica de
separación basada en el movimiento de partículas por rotación y
aceleración centrífuga de modo que, sometidas a altas velocidades
durante cortos períodos de tiempo, permiten la sedimentación de los
componentes de una solución homogénea según sus diferentes
densidades. finalmente separada en dos fracciones, la fracción
sobrenadante y la fracción sedimentada
Son muy útiles para precipitar células y moléculas.
Este aparato somete la muestra a fuerzas de aceleración.
Obligan a las moléculas a concentrarse en el fondo del envase
utilizado.
Dentro del mismo tubo, se van separando distintas moléculas a
distintos niveles o fases dentro del tubo.
Con ayuda de jeringas, se puede perforar la pared del tubo y extraer del
mismo sólo aquella fase donde se encuentren las moléculas de interés.
MOTOR
ROTO
R
CAMARA DE
VACIO
CONTROL DE VELOCIDAD,
TIEMPO Y TEMPERATURATIPOS DE
ROTORES
Rotores Flotantes Rotores de ángulo fijo o
angularesRotores verticales
Aumentar el efecto de la gravedad
Fuerza centrifug
a
Fuerza centrípeta
Movimiento circular
uniforme
1•g
Fuerza requerida para que se produzca la separación.
Las unidades de esta fuerza se expresan en número
de veces el valor de la gravedad (X•g) y se calcula
mediante la siguiente formula
F.C.R= 1,118x10-5•r•n2
Ejemplo: 500 g indica que se aplica una fuerza
centrifuga 500 veces mayor a la fuerza
gravitacional
La velocidad a la que una partícula sedimenta en una
ultracentrífuga esta relacionada con su masa .
¿Qué ocurre si el liquido
es de la misma
composición?
Ley de Stokes
F = mω2 r - Vω r
La velocidad con que sedimenta
una partícula, está en relación
con su coeficiente de
sedimentación (s). de él
depende la velocidad con que
ésta sedimenta
Tiempo característico y constante de cada partícula coloidal en
recorrer una determinada distancia al ser ultracentrifugada.
Unidades de svedberg:
Depende tanto de la masa como de la forma de la molécula.
Una partícula formada por la unión de dos partículas 5 S no tiene
un coeficiente de sedimentación de 10 S.
1 S = 10-13seg
El coeficiente de sedimentación, (s), se define como la
razón entre la velocidad V a la que sedimenta la molécula
(o partícula, en general) y la aceleración centrífuga
aplicada, C. Este coeficiente se relaciona con el radio r y la
densidad de la molécula, y con la densidad do y
viscosidad del medio, de acuerdo con la fórmula
siguiente:
Centrífugas de baja velocidad,
de sobremesa o clínicas.
-Pequeño tamaño.
-Sin refrigeración.
-Máxima velocidad: 6000 rpm.
-Útil para partículas grandes.
Micrófugas: variante de las
anteriores.
-Velocidades altas: más de
10000 rpm y tubos cortos.
-Volúmenes muy pequeños.
-Útiles en Biología Molecular.
Centrifuga de alta velocidad
-velocidades máximas entre 18.000 y
25.000 r.p.m.
-Son refrigeradas
-sistema de vacío
-Son útiles para la separación de
fracciones celulares
Ultracentrífugas.
• Velocidad: a partir de
50000 rpm.
• Presentan sistemas
auxiliares: sistemas de
refrigeración, sistemas
de alto vacío.
Analíticas: Obtención de
datos precisos de
propiedades de
sedimentación (s, PM).
Preparativas:
aislar partículas, células o
moléculas para su análisis o
utilización posterior.
se puede llevar a cabo
mediante
Centrifugación
analíticapermite determinar propiedades físicas como la
velocidad de sedimentación o el peso molecular.
Las moléculas se observan mediante
un sistema óptico durante la
centrifugación.
la preparativa
o
escala
analítica
Centrifugación preparativa
Objetivo
Separar partículas según la velocidad de sedimentación
(centrifugación diferencial), la masa (centrifugación zonal) o la
densidad (centrifugación isopícnica).En el primer caso se obtiene un
líquido sobrenadante y un
material sedimentado.
Centrifugación diferencial
mediante la aplicación al sobrenadante de
condiciones crecientes de centrifugación.
aislar partículas, células o moléculas
para su análisis o utilización posterior.
El método de gradiente de densidad permite la
completa separación de algunos o todos los
componentes de la mezcla
Los diferentes componentes se resolverán en
una serie de zonas o bandas, de ahí el
nombre de centrifugación zonal.
Hay dos métodos básicos de
centrifugación por gradiente de
densidad:
Durante la centrifugación,
las moléculas de la capa
superior sedimentan a
través del gradiente.
Centrifugación de 1 a 2 días para
que se alcance el equilibrio de
sedimentación .
la densidad del medio ha de ser mayor
que la del componente más denso.
En la separación isopícnica las partículas
son separadas en base a su densidad.
Además de la mayor resolución, lo interesante
de esta técnica es que separa exclusivamente
según la densidad de los componentes de la
muestra
Separar partículas similares en tamaño pero de
diferente densidad.
Aislamiento de proteínas, ácidos nucleicos y partículas subcelulares.
Con esta técnica se consigue, por ejemplo, separar todos los tipos celulares sanguíneos, purificar espermatozoides viables, separar células viables y no viables de tejidos desagregados y muestras con células en suspensión, etc.
separación de los distintos componentes de una célula, principalmente de los orgánulos.
Test de selección de espermatozoide mas viable.
Esto es utilizado para la purificación biológica de materiales como proteínas, ácidos nucleicos, organelos y tipos de células.
El índice hematocrito es el volumen que ocupan las
diferentes porciones que se forman al centrifugar un tubo
de sangre
Oxalato potásico o citrato sódico. La parte corpuscular
por ser más densa
queda en el fondo del
tubo, mientras que
sobrenada la fracción
plasmática
Valor o índice hematocrito
¿Cómo se realiza la medición?
Anemia (disminución)
Policitemia (aumento)
D) CENTRIFUGACION
DIFERENCIAL
A)
CENTRIFUGACION
ZONAL
B)ROTOR
ANGULAR
C) ROTOR
FLOTANTE
1
2
3
4
