Separación de célulasy

fraccionamiento subcelular

Métodos físicos de SEPARACION DE CELULAS

* Necesarios para estudiar: - Tejidos con diferentes tipos celulares- Células con diferente funcionalidad/ actividad biológica- Subpoblaciones celulares con diferentes marcadores moleculares- Alternativa a la clonación: + rápidos, + rendimiento, (- pureza)

* Los más empleados explotan diferencias en:

– Tamaño celular

– Densidad

– Carga/Química superficial

– Dispersión de la luz (light scatter)

– Emisión de Fluorescencia

b

Beckman J2-21M, centrífuga equipada con un rotor y sistema de elutriación

Rotor de elutriación (Beckman)

Cámara de separación del rotor de elutriación

Apariencia de las células aisladas de una fraccion de elutriación de células sanguíneas de la médula ósea humana cultivadas durante 8 días (a, b). Las células predominantes son de tipo fibroblastoide con un núcleo central, citoplasma difuso y pseudopodos aderentes y células grandes, redondas con un estrecho citoplasma y un núcleo central redondo. (tinción con hematoxilina). (a) x200; (b) x400. (c) Apariencia de las células aisladas de la misma fracción de elutriación y cultivadas en DMEM+20% FCS suplementado con dexametasona, ácido ascorbico y -glicerofosfato durante 8 días. En esas condiciones, las celulas presentan una morfologia redondeada o cuboidal con un núcleo central, x200.

Separacion de células por elutriación

Para ver esta película, debedisponer de QuickTime™ y de

un descompresor Photo - JPEG.

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Separación de células sanguíneas con Ficoll-Hypaque

Centrifugación

Separación inmunomagnética

Selecciónpositiva

Selecciónnegativa

Absorción de luz por un e- y la subsiguienteemisión de E como calor y fluorescencia

Esquema de un Citómetro de Flujo (FACS)

Funcionamiento de la boquilla vibradora de un citómetro de flujo

Green fluorescence

Representación de los datos en citometría de flujo

Esquema de un Citómetrode Flujo clasificador (“sorter”)

Puede seleccionar 1/1000células y clasificar miles/s

Microdisección con láser

Sperm Tail Removal Biopsy at the Single Cell Level

Fraccionamiento de componentes subcelulares

• Diseñados inicialmente para comprender el papel bioquímico de cada orgánulo en la célula

• La lisis (rotura) celular se suele realizar por: Potter, homogeneizador mecánico de tejidos, sonicación, cavitación, soluciones hipotónicas

• La separación de los componentes subcelulares se realiza generalmente por centrifugación

Homogeneizaciónde la muestra

Centrífuga de alta velocidad

Potter

1000 x g, 10 min

20.000 x g, 20 min

80.000 x g, 1 h (ultracentrífuga)

150.000 x g, 3 h

Fraccionamiento subcelular por centrifugación diferencial

citosol

Comparación dela sedimentaciónpor velocidad (A)y por equilibriode sedimentación(isopícnica, B)

5-20%

Purificación de orgánulos por centrifugación en gradiente de densidad

Núcleos Microsomas (RER)

Peroxisomas

Control de calidad del fraccionamiento: TEM