7/17/2019 Fraccionamiento celular

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INFORME - FRACCIONAMIENTO

OBTENCIÓN Y ANÁLIS DE FRACCIONES CELULARES

Objetivos.-

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1. Ideti!"#$%#s &$#""ioes "e%'%#$es # (#$ti$ de )*+#do de (o%%o.

,. Ded'"i$ e% $ediieto ('$e/# de "#d# &$#""i0.

. Coo"e$ %# t2"i"# de &$#""io#ieto "e%'%#$ (#$# e% est'dio de %#s o$+#e%#s"e%'%#$es.

3. Us#$ "o%o$#tes 4'e ideti!4'e o$+#e%#s es(e"*!"#s "e%'%#$es.

5. Disti+'i$ %os ti(os de i"$os"o(*# de "#(o "%#$o 6'o$es"e"i# e %#s 'est$#s($e(#$#d#s.

F'd#eto te0$i"o.-

¿De qué se trata el fraccionamiento celular?

El fraccionamiento subcelular es un conjunto de métodos y técnicasque tienen como objetivo obtener fracciones puras o enriquec  idas en undeterminado componente celular, ya sea éste un orgánulo(mitocondrias, núcleos, peroxisomas, etc.) una fraccin demembrana (membrana total, plasmática, dominio basolateral, dominioapical, etc.), complejos multiproteicos (citoesqueleto de actina,microtúbulos, poros nucleares, etc.).

Fases:

Pre-analítica: !btencin preparacin preliminar de la muestra "asta llegar al laboratorio

 #nal$tica% o de aplicacin de procedimientos. &oma y tratamiento de datos, recogida de resultados en un informe

Pos- analítica: 'alidacin técnica del informe anal$tico.

Todo proceso de fraccionamiento subcelular tiene dos etapas:

otura de las células o tejidos para obtener un lisado celular (o tisular) en el que la fraccin deseada seencuentre en condiciones adecuadas para su purificacin.

eparacin de la fraccin deseada del resto de componentes de la célula o del tejido mediante algún criteriocomo puede ser una diferencia de densidad (centrifugacin en gradientes o centrifugacin diferencial), lapresencia de algún ant$geno (cromatograf$a de inmunoafinidad, inmunoprecipitacin, etc.).

Técnicas de rotura de células y tejidos

El primer paso en la purificacin de la mayor$a de las prote$nas y estructurassubcelulares es la rotura de los tejidos o de las células para obtener un lisado celular en

el que la prote$na, el complejo multiproteico o la es  tructura subcelular seencuentre en condiciones que permitan su aislamiento. Esto se consigue

empleando procedimientos mecánicos suaves conocidos generalmente como"omogeni*acin. Estos métodos producen la rotura de las membranascelulares, suavemente, con lo que se libera el contenido celular.

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Los procedimientos de homogenización más comunes son:

+a purificacin de cada uno de los principales organelos subcelulares represent un gran logro en la iolog$acelular al "acer posible el estudio detallado de sus estructuras y funciones metablicas.

+a purificacin se inicia con la rotura de la pared celular, de la membrana plasmática, o de ambas. +as células

deben estar suspendidas en una solucin con p- y concentracin de sales apropiada. ormalmente se empleasacarosa isotnica (/,012) o una combinacin de sales similar a las de la célula.

El proceso de fraccionamiento consta principalmente de las siguientes etapas%

1. !"!#$%&'()&!%.3*.   e trata de romper las células con la ayuda de un émbolo rotatorio que se ajusta perfectamente a

las gruesas paredes de un tubo de cristal especial, el "omogenei*ador. 4élulas anexas% primero sedeben romper conexiones con otras células. 4élulas no anexas% pueden separarse teniendo en cuentaforma, densidad o caracter$sticas que puedan marcarse. Existen dispositivos de "omogeni*acin en losque está calibrada la separacin entre el émbolo y la pared de cristal para producir "omogeni*ados con

un tama5o de part$cula determinado. 4onsiste en el procesamiento del tejido y posteriormente de lascélulas con el fin de obtener una me*cla fluida en la cual estén todos los componentes celulares, paralo cual podemos recurrir a diversos métodos f$sicos.

1.*. "!+T$+! , "(%!.3

  E un método convencional de rompimiento por friccin. 6ueden emplearse materiales abrasivos comocuar*o, vidrio molido, arena, o materiales sil$ceos. +a masa celular contenida en un volumen de buffer seme*cla con un volumen de medio moledor (/.178).

+a friccin sobre las células genera calor que puede afectar la actividad que se desea estudiar. #ctualmente sedispone de "omogenei*adores más sofisticados que emplean el mismo principio, peroque permiten controlar el nivel de friccin y la temperatura del proceso, son conocidoscomo plotters. +os principales problemas de esta técnica son% la eficiencia bajacuando se usan peque5as cantidades de medio moledor cuando es baja la concentracincelular9 la friccin genera calor y pueden presentarse alteracin en las prote$nas

1.. !%&)()&!% .-

  4onsiste en la aplicacin de ultrasonidos a una suspensin celular. +a intensa agitacin producida destruyelas membranas celulares. :ependiendo de la frecuencia, intensidad y energ$a aplicada se pueden destruir asimismo las estructuras subcelulares e incluso solubili*ar complejos proteicos. e suele aplicar en frio paraevitar el sobrecalentamiento de las muestras que podr$a provocar la desnaturali*acin de las prote$nas.

e transmite una corriente eléctrica a un sistema mecánico que la convertirá en vibraciones de alta intensidadgenerándose ondas de ultrasonido que generan millones de burbujas microscpicas, las cuales se expanden y

colapsan contra las células causando la ruptura de su membrana. Este fenmenollamado cavitacin puede incrementarse adicionando al medio fin$simas esferas de vidrio.

FILTRADO.-

e denomina filtración al proceso unitario de separacin de slidosen suspensin en un l$quido mediante un medio poroso, que retiene los slidos y permite el pasaje del l$quido.

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+as aplicaciones de los procesos de filtracin son muy extensas, encontrándose en

muc"os ámbitos de la actividad "umana, tanto en la vida doméstica como de

la industria general, donde son particularmente importantes aquellos procesos

industriales que requieren de las técnicas qu$micas. 

+a filtracin se "a desarrollado tradicionalmente desde un estudio de arte práctico,

recibiendo una mayor atencin terica desde el siglo ;;. +a clasificacin de los procesos de

filtracin y los equipos es diversa y en general, las categor$as de clasificacin no se excluyen

unas de otras.

+a variedad de dispositivos de filtracin o filtros es tan extensa como las variedades de materiales porosos

disponibles como medios filtrantes y las condiciones particulares de cada aplicacin% desde sencillos dispositivos,

como los filtros domésticos de café o los embudos de filtracin para separaciones de laboratorio, "asta grandes

sistemas complejos de elevada automati*acin como los empleados en las industrias petroqu$micas y de refino.

CENTRIFU7ADO 89URIFICACIÓN:.-

+a centrifugación es un método por el cual se pueden separar slidos de l$quidos de difer  ente densidad por medio

de una fuer*a giratoria. +a fuer*a centr$fuga es provista por una máquina

llamada centrifugadora, la cual imprime a la me*cla un movimiento de rotacin que

origina una fuer*a que produce la sedimentacin de los slidos o de las part$culas de

mayor densidad.

+os componentes más densos de la me*cla se despla*an fuera del eje de rotacin de la

centr$fuga, mientras que los componentes menos densos de la me*cla se despla*an

"acia el eje de rotacin. :e esta manera los qu$micos y bilogos pueden aumentar la

fuer*a de gravedad efectiva en un tubo de ensayo para producir una  precipitacin del

sedimento en la base del tubo de ensayo de manera más rápida y completa.

 ;i+#do de (o%%o.-

 Es la más voluminosa de las v$sceras y una de las más importantes por su actividad metablica. Es un rgano

glandular al que se adjudica funciones muy importantes, tales

como la s$ntesis de prote$nas plasmáticas, funcin desintoxicante,

almacenaje de vitaminas y glucgeno, además de secrecin de bilis,

entre otras. &ambién es el responsable de eliminar de la sangre las

sustancias que pu  edan resultar nocivas para el organismo,

convirtiéndolas en inocuas9 está presente en el ser "umano y se le

puede "allar en vertebrados y algunas otras especies del reino animal.

Materiales.-

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MATERIALES DEL LABORATORIO

1.Mo$te$o2. 7#s#3. T'bos de e(edo$& de 1<5%

4. , be#=e$ de 1>>%5. ?e$de de j#'s C'bet#s "o )ie%o6. 1 BEA@ER de 5>%7. B'e$ t$is 1> M (; <58. Co%o$#te ;oe")st ,59.Mtot$#"=e$10. Li#s %#ii%%#s11. Mi"$os"o(io de "#(o "%#$o 6'o$es"e"i#12. 1> +$. De )*+#do de (o%%o.

Procedimientos:

8. e coloc el "$gado en el mortero, se moli llegando a tener una pasta de forma uniforme, luego sele adiciono 0/ ml de tris, 8/n< p- =,1, y al final con una gasa filtrarlo a un beac>er peque5o

0. 4on ayuda de la micro3pipeta pasamos a dos tubos eppendorf 0/ ?l, luego se agreg 1// ?l de lasolucin de buffer &ris 8/ m< p- =,1. En los tubos rotulados con la palabra núcleo, se lo llevo a lamáquina de centrifugado y se lo centrifugo por @ min.

@. e coloc el sobrenadante del proceso de los núcleos en 0 tubos eppendorf nuevos, rotulados con

la palabra mitocondria, al igual que en el procedimiento anterior se lo llevo a la máquina decentrifugado, centrifugando este por A min. a 8//// rpm. e elimin el sobrenadante quedando lafraccin mitocondrial y resuspendi el pellet en 0// ?l de buffer &ris 8/ m< p- =,1.

B. 6## !E'# C4+E!% e coloc 8/ ?l del resuspendido del tubo marcado como núcleo, enuna lámina porta objeto con ayuda de una gota de Da*ul de metileno la cual se cubri con una láminacubre objeto.

En otra lámina adicion 8/ ?l del colorante -oec"st @@01A y se cubri con una lámina cubreobjeto yesta se dej reposar por 0 min.

1. 6## !E'# <F&!4!:F#% e tom el tubo marcado como mitocondrias y en uneppendorf de /,1 ml adicion 1 ?l del resuspendido y 1 ?l del colorante mytotracker el que se dejincubar por 8/ min a @=G4. En otro eppendorf de /,1 ?l reali*o la misma operacin y adicion 1 ?l delcolorante verde de Hanus. e reali* un frotis y observo en B//x

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ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS.-1. A% oeto de %# e(e$iet#"i0< "'#do e")#os #+'# &$*# # 'est$# e/"%#

es e"es#$io 4'e este &$*# G9o$ 4'2H Lo 4'e (#s# e 4'e %# est$'"t'$# de)*+#do de (o%%o tiee e/i#s 4'e ('ede #&e"t#$ %# 'est$# dete$io$#$%# #%oeto de e")#$ #+'# &$*# %o 4'e )#"eos es e't$#%i/#$ est#s e/i#s (#$#4'e o "#'se i+ e&e"to.

,. G9o$ 4'2 es e"es#$io 4'e j't#$ "ie$tos "o%o$#tes "o "ie$t#s est$'"t'$#s<eje(%o< 4'e$eos e#i#$ %os "%eos de% )*+#do de (o%%o < (e$o o (odeos(oe$ "'#%4'ie$ "o%o$#te < tiee 4'e se$ 'o "o "#$"te$ bsi"o < # 4'e< %os

"%eos (o$t# ADN %o 4'e )#"e 4'e se# #"ido es e% +$'(o &os&#to #% e")#$ '

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"o%o$#te bsi"o "oo e% #/'% de eti%eo %o e't$#%i/# )#"iedo 4'e %# 'est$#se# s visib%e.

. Es e"es#$io )#"e$ todo e% ($o"eso de &$#""io#ieto "e%'%#$J # 4'e< e este"#so e% )*+#do tiee '")#s est$'"t'$#s 4'e o 4'e$eos vis'#%i/#$ e"esit#os "et$#$os e %o 4'e $e#%ete 4'e$eos (o$ eso teeos 4'e

)oo+ei/#$< !%t$#$ ('$i!"#$ 'est$# 'est$# (#$# se(#$#$ todo %o 4'e o osite$es#.3. E ' i"$os"o(io de 6'o$es"e"i# se ('ede #($e"i#$ %#s est$'"t'$#s ejo$< #

4'e< este se "et$# e %#s est$'"t'$#s ite$#s es(e"*!"#s.

Co"%'sioes.-

 

En esta práctica de laboratorio aprendimos que el procedimiento debe "acerse en temperatura fr$a para

mantener el buffer tris y este a su ve* nos ayuda a limpiar unas encimas de la célula para que sea másfácil observarla.

 

 #prendimos que algunos colorantes como es el a*ul de metileno o el verde de Hanus le da un color a lacélula pero por ser una solucin base esta puede ser absorbida mejor por algunas organelos parareconocerlas de mejor manera.

  e de buscar el equilibrio del p- para que las muestras reaccionen mejor, que sean de carácter básico o

alcalino con ácido.+as técnicas de fraccionamiento se deben seguir al pie de la letra, pues los resultados no pueden ser favorables para elaborar el informe.

Re"oed#"ioes.-1. A% oeto de% "et$i&'+#do %#s 'est$#s tiee 4'e est#$ '# &$ete # %# ot$#

(#$# 4'e #%% e4'i%ib$io %os $es'%t#dos se# s &#vo$#b%es.2. Es"'")#$ o #ot#$ todos %os (#sos 4'e ($o('so %# ($o&eso$# < (o$4'e es '#e(e$iet#"i0 $eb's"#d# %os $es'%t#dos (od$*# v#$i#$

Linkografía.-

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