21.03.2018

1

Cromatografía. Aspectos generales, técnicas involucradas. FPLC, HPLC. Electroforesis. Conceptos generales y aplicaciones. Geles de poliacrilamida y agarosa. Isoelectroenfoque.

Separación de biomoléculas

Voet • Voet • PrattFundamentos de Bioquímica La vida a nivel molecular 2ª edición Ed. Panamericana

Lubert Stryer • Jeremy M. Berg • John L. TymoczkoBioquimica (5. ed) Ed. Reverte

Cox, M.M. • Nelson, D.L. • Lehinger A.Principios De Bioquímica 4ta o 5ta EdiciónEditorial Omega

Bibliografía

Métodos de ruptura celular(lisis)

Métodos físico – químicosShock osmóticoDetergentesSolventesEnzimas (lisozima)

Métodos físicosMolinoFrench PressVibraciones ultrasónicas

21.03.2018

2

generador de ultrasonido

punta

suspensión celular

Sonicador

bolitas

células

collar

Molino Licuadora

French Press

PolytronMortero y

pilón

Homogeneizador (Potter)

Métodos de ruptura celular

Estrategias de purificación(se basan en propiedades diferenciales)

Solubilidad     Fraccionamiento con sulfato de amonioFraccionamiento con solventesFraccionamiento con polietilenglicolPrecipitación isoeléctrica

Tamaño Molecular Diálisis Electroforesis en gelCromatografía de filtración por gelesUltracentrifugación

Carga Iónica Cromatografía de Intercambio IónicoElectroforesisIsoelectroenfoque

Polaridad Cromatografía de adsorciónCromatografía en papelCromatografía de interacción hidrofóbica

Especificidad de unión Cromatografía de afinidad

21.03.2018

3

Cromatografía

Los componentes a separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales está en reposo (FASE ESTACIONARIA ) mientras que la otra (FASE MÓVIL) se mueve en una dirección definida.

La mezcla de sustancias a separar se disuelven en la  FASE MÓVIL

La solución resultante atraviesa una matriz sólida porosa, la  FASE ESTACIONARIA

La fase móvil puede ser líquida      CROMATOGRAFÍA LÍQUIDAo gaseosa  CROMATOGRAFÍA  GASEOSA

La fase estacionaria   puede estar dispuestos      CROMATOGRAFÍA PLANAen forma plana             CROMATOGRAFÍA  en COLUMNA

Cromatografía en columna

21.03.2018

4

1 La muestra es depositada sobre el lecho cromatográfico2 La muestra penetra en el lecho3 Se añade fase móvil4 Comienza la separación de los componentes de la muestra5 Eluye el primer componente6 Eluye el segundo componente 

Cromatografía en columna

SoportesSon muy variados, sobre ellos se da la interacción que resulta en la separación ( grupos unidos ‐ su misma estructura) 

Celulosa : fácilmente hidratable, es compresible (no permite flujos elevados, es incompatible con algunos solventes (álcalis)

Derivados de polisacáridos: Microesferas porosas que se presentan con distinto tamaño y poro

Sephadex : dextranos entrecruzados, sensible a pHs extremos

Sepharosa : agarosa

Sephacryl : resistentes a la compresión y a pH extremos

Cromatografía en columna

21.03.2018

5

Detección

Los componentes de la muestra separados se detectan en el eluyentemediante su análisis continuo o mediante el análisis de las fracciones una vez recogidas

Métodosmidiendo absorbancia a 280 nm (para proteínas)midiendo absorbancia a 260 nm (para ácidos nucleicos)midiendo radioactividadensayo enzimático (específicos)ensayo biológicoreacciones coloreadas (Bradford, Lowry)reacciones fluorescentesreacciones inmunoquímicas (western, ELISA, RIA)Etc, etc…..

Cromatografía en columna

Cromatografía plana

ascendentedescendente

21.03.2018

6

La migración es proporcional a su densidad de cargafricción        tamaño

forma

Electroforesis

Técnica mediante la cual se separan las biomoléculas en disolución cuando se ven sometidas a un campo eléctrico. 

Las matrices más comunes son:agarosapoliacrilamida

µ = =qf

VE

La solubilidad de las proteínas depende de la concentración de sales disueltas, la polaridad del solvente, el pH y la temperatura 

Métodos de separación que se basan en diferencias de solubilidad

Fraccionamiento con sulfato de amonio

Fraccionamiento con solventes

Fraccionamiento con polietilenglicol

Precipitación isoeléctrica

21.03.2018

7

Salting in – Salting out

21.03.2018

8

sulfato deamonio +

sulfato deamonio

+

sulfato deamonio

0 al 40%

40 al 70% 70 al 100%

Fracción0 al 40%

Fracción 40% al 70%

Fracción 70% al 100%

Fraccionamiento con sulfato de amonio

Diálisis

Cromatografía de filtración por geles

Electroforesis en gel

Ultracentrifugación

Métodos de separación  basados en el Tamaño Molecular

21.03.2018

9

Diálisis

Cromatografía de exclusión molecularFiltración Molecular

La separación se basa en diferencia de tamaño

Matriz porosa – distintos tamaños de poros

No hay interacción química o física entre los analitos y la fase estacionaria.  

Columnas esbeltas, volumen de siembra 10 % del volumen de columna

Proteínas, ácidos nucleícos, hidratos de carbono

21.03.2018

10

Cromatografía de exclusión molecular

Cromatografía de exclusión molecular

21.03.2018

11

Kav = Ve – Vo

Vt - Vo

Ve volumen de eluciónVt volumen totalVo volumen vacío

Se puede usar como método de determinación de PM

Cromatografía de exclusión molecular

Cromatograma

Electroforesis en condiciones desnaturalizantes (SDS‐PAGE)

21.03.2018

12

dodecil sulfato de sodio (SDS)

Na H-(CH2)12-SO4−+ Na+

SDS‐PAGE

BME o DTT

SDS‐PAGE

21.03.2018

13

SDS‐PAGE

SDS‐PAGE

21.03.2018

14

Tinción conCoomassie Blue

SDS‐PAGE

Tinción con Plata

SDS‐PAGE

Variando la concentración de poliacrilamida se puede obtener distinto grado de separación

21.03.2018

15

X

Xf

R=X

Xf

Relación de frente o migración relativa

SDS‐PAGE

SDS‐PAGE

21.03.2018

16

Electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosa

Se emplea para ácidos nucleicos

Electroforesis en geles de agarosa

21.03.2018

17

ADN, ARNTinción: Bromuro etidio (UV)

SYBR green

Electroforesis en geles de agarosa

Cuba de electroforesis

Se emplea  para separar partículas o macromoléculas: CélulasComponentes sub‐celulares ProteínasÁcidos nucleicos

Bases de separaciónTamaño FormaDensidad 

Metodología: Empleo de gradientes de densidad (viscocidad del medio)

Velocidad del rotor (centrifugación – ultracentrifugación)

Centrifugación

21.03.2018

18

Centrifugación Diferencial

El tubo se llena con muestraTécnica poco resolutivaLa velocidad de sedimentación depende principalmente del tamaño y formaNo emplea gradiente de densidadSe obtienen dos fracciones: sobrenadante y sedimento (pellet)

Centrifugación Zonal Centrifugación Isopícnica

Gradiente de sacarosa preformado

Se siembra la muestra en la parte sup.

Baja velocidad

Velocidad de sedimentación(no se logra la sedimentación completa, se detiene)

Muestras: densidad semejante, distinto peso molecular

ácidos nucleicos y organelas

Gradiente de Cloruro de Cesio

Muestra disuelta en ClCs

Alta velocidad

Equilibrio de sedimentación(se logra la sedimentación completa, tiempos largos)

Muestras: peso molecular semejante, distinta densidad

proteínas

CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE

21.03.2018

19

CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE

Cromatografía de Intercambio Iónico

Electroforesis (nativa)

Isoelectroenfoque

Métodos de separación basados en laCarga Iónica

21.03.2018

20

Cromatografía de intercambio iónico

La separación ocurre en base de interacciones iónicas entre la superficie de la proteína y grupos de la fase estacionaria

Intercambio aniónico: La matriz cargada positivamente se une a proteínas cargadas negativamenteIntercambio catiónico: La matriz cargada negativamente se une a proteínas cargadas positivamente

Los grupos más comunes son:

Elución: con fuerza iónica

Cromatografía de intercambio iónico

21.03.2018

21

Cromatografía de intercambio iónico

Cromatograma

Cromatografía de intercambio iónico

21.03.2018

22

Electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones nativas

No se usan agentes desnaturalizantes (SDS, BME, DTT)

Las proteínas migran de acuerdo a su relación q/m

Las interacciones entre subunidades de  las proteinasoligoméricas se conservan: se puede obtener informaciónacerca de  al estructura cuaternaria

Se pueden hacer determinaciones de actividad en gel

Isoelectroenfoque

21.03.2018

23

Isoelectroenfoque

Electroforesis bidimensional

Separación basada enPI y tamaño

21.03.2018

24

Electroforesis bidimensional

Cromatografía de interacción hidrofóbica

Cromatografía en papel y de capa fina  (plana)

Cromatografía de adsorción

Métodos de separación basados en la polaridad

21.03.2018

25

Cromatografía de interacción hidrofóbica

Se basa en interacciones hidrofóbicas entre la fase estacionaria y las moléculas a separar.Salting out

La fase estacionaria consiste en un grupo no polar pequeño unido a una matriz

La muestra se siembra disuelta en un buffer que contiene alta concentración de una sal (sulfato de amonio, cloruro de sodio) 

La elución se realiza bajando la concentración de la sal. Las proteínas eluyen en orden creciente de hidrofobicidad

Cromatografía de interacción hidrofóbica

SepharosaSephadex

Soporte

21.03.2018

26

Cromatografía de interacción hidrofóbica

Cromatografía de interacción hidrofóbica

Cromatograma

21.03.2018

27

1: aplicación de la muestra 2: se sumerge el extremo inferior en la fase móvil 3 a 5: la fase móvil asciende por capilaridad y se va produciendo la separación de los componentes 6: se marca el frente de avance del disolvente y se deja secar la placa7: revelado de los componentes ya separados y medida de su avance 

Cromatogafía en papel y silica‐gel

Soporte : papel,  silca gel (TLC)

1 2 3              4                5              6              7 

Cromatogafía en silicagel ‐ TLC

Usos: lípidos, aminoácidos, pigmentos, etc

21.03.2018

28

Cromatogafía de adsorción

La separación se basa en diferencias de adsorción a la superficie de la fase estacionaria 

La fase estacionaria es polar

La fase móvil  es apolar

Soporte: alúmina, sílica‐gel

Cromatografía de afinidad

Se basa en la interacción reversible entre la proteína a purificar y un ligando inmovilizado sobre la matriz

Es muy específica

Ligandos: anticuerpos, inhibidores, sustratos, cofactores

La elución se realiza con el ligando o un análogo, cambio de fuerza iónica o pH

21.03.2018

29

Cromatografía de afinidad

Cromatografía de afinidad

21.03.2018

30

Cromatografía de afinidad

Cromatografia de líquidos de alta resolución (HPLC)

El material de las columnas está muy finamente dividido (2,5 a 5 

micrones) lo que incrementa la posibilidad de interacción y el 

poder resolutivo. Para obtener flujos adecuados es necesario 

emplear presiones elevadas. 

Posee alta resolución por lo que se emplea para 

determinaciones cuantitativas exactas

Se emplea en la industria y en la ciencia para la determinación 

de plaguicidas, hidrocarburos, aminoácidos, proteínas, ácidos 

nucleicos, azucares, drogas, terpenoides

UPLC   (partícula menor de 2 micrones – mayor presión)

FPLC  se emplea para biomoléculas de varios kDa. Se usan otras 

matrices y menor presión

21.03.2018

31

HPLC

pH                                                                                   buffers

Temperatura                                                                 lo más baja  posible , 0 ºC

Enzimas degradativasProteasas,                                                                      inhibidoresDNasas y Rnasas guantes

Desnaturalización por                                                 glicerol, ABSelevada  actividad de agua

Almacenamiento por  largos períodos (crecimiento de microorganismos y oxidación)

Cuando las biomoléculas  no se hallan e su entorno  natural  se vuelven inestables y es necesario controlar:

bajas temperaturas (-80 ºC, -196 ºC)

21.03.2018

32

Pasos generales empleados para realizar una purificación

EXTRACTO CRUDO

PURIFICACIÓN DE LA MOLÉCULA DE INTERÉS

FUENTE NATURAL

FraccionamientoCromatografíasElectroforesis

PRODUCTO PURIFICADO

RendimiemtoPurificaciónActividad Biológica

Ruptura celularCentrifugación

Tabla de Purificación