Técnicas en bioquímica Centrifuga

Universidad de CaraboboFacultad de Ciencias de la Salud

Escuela de Medicina “Dr. Witremundo Torrealba”

Departamento de Bioquímica y Fisiología Núcleo Aragua

Exponentes :Cesar Rivero María G. Rocha Lesbis Rodríguez

INFERTILIDAD MASCULINA, UNA MIRADA DESDE EL LABORATORIO

Durante años se creyó que la responsable de la demora en la llegada de un hijo era la mujer…

CAPACITACIÓN ESPERMÁTICA

Swim-up

Gradientes de densidad

Explicar en que consiste la homogenización y el fraccionamiento subcelular

Analizar los fundamentos teóricos de la centrifugación y su utilidad

Objetivos generales

Homogenización y fraccionamiento subcelular

Fuerza centrifuga relativa ,Centrifugas de baja y alta velocidad Coeficiente de sedimentación

Centrifuga por velocidad de sedimentación Centrifuga por equilibrio de sedimentación , fraccionamiento en gradiente utilidad

Objetivos específicos

DOS (2) FASES:

El fraccionamiento subcelular es un conjunto de métodos y técnicas que tienen como objetivo obtener fracciones puras o enriquecidas en un determinado componente celular, ya sea éste un orgánulo (mitocondrias, núcleos, peroxisomas, etc.) una fracción de membrana, complejos multiproteicos (citoesqueleto de actina, microtúbulos, poros nucleares, etc.).

1) Rotura de las células o tejidos para obtener un lisado celular (o tisular) en el que la fracción deseada se encuentre en condiciones adecuadas para su purificación. (HOMOGENIZACION)

2) Separación de la fracción deseada del resto de componentes de la célula o del tejido

FRACCIONAMIENTO SUBCELULAR

Esto se consigue empleando procedimientos mecánicos suaves conocidos generalmente como HOMOGENIZACIÓN. Estos métodos producen la rotura de las membranas celulares, suavemente, con lo que se libera el contenido celular.

HOMOGENIZACIONSe refiere al rompimiento de la celula o el tejido del cual se pretende extraer la organela o la molecula de interes biologico.

 Células anexas: primero se deben romper conexiones con otras células. 

Células no anexas: pueden separarse teniendo en cuenta forma, densidad o características que puedan marcarse.

I) TÉCNICAS DE ROTURA DE CÉLULAS Y TEJIDOS

Homogenizador de Esferas  Homogenizador de émbolo y tubo  

Homogenizador Rotor/Stator  Blenders   (Licuadora) 

SHOCK OSMOTICO

MORTERO Y MANO

SONICACION

CONGELAMIENTO - DESCONGELAMIENTO 

METODOS FISICOS EMPLEADOS PARA HOMOGENIZAR UNA MUESTRA

La separación puede ser llevada a cabo empleando la centrifugación. Manejando las variables  fuerza centrifuga y tiempo podemos separar primero los organelos de mayor tamaño como el núcleo. En centrifugaciones sucesivas de mayor fuerza gravitacional y mayor tiempo obtendremos las diferentes fracciones de nuestro interés.

II) SEPARACION DE LOS ORGANELOS

LA CENTRIFUGA

La centrífuga es el equipo que nos proporciona la técnica de separación basada en el movimiento de partículas por rotación y aceleración centrífuga de modo que, sometidas a altas velocidades durante cortos períodos de tiempo, permiten la sedimentación de los componentes de una solución homogénea según sus diferentes densidades. finalmente separada en dos fracciones, la fracción sobrenadante y la fracción sedimentada

Son muy útiles para precipitar células y moléculas.

Este aparato somete la muestra a fuerzas de aceleración.

Obligan a las moléculas a concentrarse en el fondo del envase utilizado.

Dentro del mismo tubo, se van separando distintas moléculas a distintos niveles o fases dentro del tubo.

Con ayuda de jeringas, se puede perforar la pared del tubo y extraer del mismo sólo aquella fase donde se encuentren las moléculas de interés.

USOS DE LA CENTRIFUGA

MOTOR

ROTOR

CAMARA DE VACIO

CONTROL DE VELOCIDAD, TIEMPO Y TEMPERATURATIPOS DE

ROTORESRotores Flotantes

Rotores de ángulo fijo o angulares

Rotores verticales

PARTES DE LA CENTRIFUGA

FUNDAMENTOS TEÓRICOS

Aumentar el efecto de la gravedad

Fuerza centrifuga

Fuerza centrípeta

Movimiento circular

uniforme

1•g

Fuerza requerida para que se produzca la separación. Las unidades de esta fuerza se expresan en número de veces el valor de la gravedad (X•g) y se calcula mediante la siguiente formula

  F.C.R= 1,118x10-5•r•n2

FUERZA CENTRIFUGA RELATIVA

Ejemplo: 500 g indica que se aplica una fuerza centrifuga 500 veces mayor a la fuerza gravitacional

SEDIMENTACIÓN

La velocidad a la que una partícula sedimenta en una ultracentrífuga esta relacionada con su masa .

¿Qué ocurre si el liquido es

de la misma

composición?

Ley de

Stokes

F = mω2 r - Vω r

La velocidad con que sedimenta una partícula, está en relación con su coeficiente de sedimentación (s). de él depende la velocidad con que ésta sedimenta

COEFICIENTE DE SEDIMENTACIÓN

Tiempo característico y constante de cada partícula coloidal en recorrer una determinada distancia al ser ultracentrifugada.

Unidades de svedberg:

Depende tanto de la masa como de la forma de la molécula.

Una partícula formada por la unión de dos partículas 5 S no tiene un coeficiente de sedimentación de 10 S.

1 S = 10-13seg

El coeficiente de sedimentación, (s), se define como la razón entre la velocidad V a la que sedimenta la molécula (o partícula, en general) y la aceleración centrífuga aplicada, C. Este coeficiente se relaciona con el radio r y la densidad de la molécula, y con la densidad do y viscosidad del medio, de acuerdo con la fórmula siguiente:

COEFICIENTE DE SEDIMENTACIÓN

Centrífugas de baja velocidad, de sobremesa o clínicas. -Pequeño tamaño.-Sin refrigeración.-Máxima velocidad: 6000 rpm.

-Útil para partículas grandes.

Micrófugas: variante de las anteriores.-Velocidades altas: más de 10000 rpm y tubos cortos.-Volúmenes muy pequeños.-Útiles en Biología Molecular.

TIPOS DE CENTRIFUGAS

Centrifuga de alta velocidad -velocidades máximas entre 18.000 y 25.000 r.p.m.-Son refrigeradas -sistema de vacío -Son útiles para la separación de fracciones celulares

TIPOS DE CENTRIFUGAS

Ultracentrífugas.• Velocidad: a partir de

50000 rpm.• Presentan sistemas

auxiliares: sistemas de refrigeración, sistemas de alto vacío.

Analíticas: Obtención de datos precisos de propiedades de sedimentación (s, PM).

Preparativas: aislar partículas, células o moléculas para su análisis o utilización posterior.

TIPOS DE CENTRIFUGAS

se puede llevar a cabo mediante

Centrifugación analíticapermite determinar propiedades físicas como la

velocidad de sedimentación o el peso molecular.

Las moléculas se observan mediante un sistema óptico durante la centrifugación.

SEGÚN EL PROPÓSITOla preparativa o escala analítica

Centrifugación preparativa

Objetivo

Separar partículas según la velocidad de sedimentación (centrifugación diferencial), la masa (centrifugación zonal) o la densidad (centrifugación isopícnica).

En el primer caso se obtiene un líquido sobrenadante y un material sedimentado.

Centrifugación diferencial

mediante la aplicación al sobrenadante de condiciones crecientes de centrifugación.

aislar partículas, células o moléculas para su análisis o utilización posterior.

POR GRADIENTE DE DENSIDAD

El método de gradiente de densidad permite la completa separación de algunos o todos los componentes de la mezcla

Los diferentes componentes se resolverán en una serie de zonas o bandas, de ahí el nombre de centrifugación zonal.

Hay dos métodos básicos de centrifugación por gradiente de densidad:

Centrifugación zonal Durante la centrifugación, las moléculas de la capa superior sedimentan a través del gradiente.

Centrifugación isopícnica

Centrifugación de 1 a 2 días para que se alcance el equilibrio de sedimentación .

la densidad del medio ha de ser mayor que la del componente más denso.

En la separación isopícnica las partículas son separadas en base a su densidad.

Además de la mayor resolución, lo interesante de esta técnica es que separa exclusivamente según la densidad de los componentes de la muestra

Separar partículas similares en tamaño pero de diferente densidad.

Aplicaciones

Aislamiento de proteínas, ácidos nucleicos y partículas subcelulares.

Con esta técnica se consigue, por ejemplo, separar todos los tipos celulares sanguíneos, purificar espermatozoides viables, separar células viables y no viables de tejidos desagregados y muestras con células en suspensión, etc.

Separación de los distintos componentes de una célula, principalmente de los orgánulos.

Test de selección de espermatozoide mas viable.

Esto es utilizado para la purificación biológica de materiales como proteínas, ácidos nucleicos, organelos y tipos de células.

Índice Hematocrito El índice hematocrito es el volumen que ocupan las diferentes porciones que se forman al centrifugar un tubo de sangre

Oxalato potásico o citrato sódico. La parte corpuscular por ser más densa queda en el fondo del tubo, mientras que sobrenada la fracción plasmática

Valor o índice hematocrito

¿Cómo se realiza la medición?

Anemia (disminución)Policitemia (aumento)

SEGUN LO MENCIONADO, IDENTIFIQUE QUE FRASE PERTENECE CADA IMAGEN:

D) CENTRIFUGACION DIFERENCIAL

A) CENTRIFUGACION ZONAL

B)ROTOR ANGULAR

C) ROTOR FLOTANTE

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Gracias