Ubicación Subcelular, purificación, caracterización y ...

UNIVERSIDAD DE LOS ANDESFACULTAD DE CIENCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIALABORATORIO DE ENZIMOLOGIA DE PARASITOS

Ubicación Subcelular, purificación, caracterización yestudios de interacción proteína-proteína de la

enolasa de epimastigotes de Trypanosoma cruzi

Trabajo especial de grado presentado porMaría Rosa Domingo Sananes

Como requisito parcial para optar al título deLicenciada en Biología

Tutor Dr. Juan Luis Concepción

Mérida, Julio 2004

ii

Para mis padres

Para todas aquellas personas alrededor del mundo que padecen de la

enfermedad de Chagas y otras enfermedades parasitárias

iii

AGRADECIMIENTOS

A Juan Luis Concepción, por su dirección, su ayuda, su enseñanza y su

amistad.

A Luisana Avilán por su inspiración, sus consejos, su amistad y por todo lo que

aprendí en sus clases.

A la Dra. Andreína Pacheco, al Dr. Ananías Escalante, la técnico Amy Martin y

al Dr. Robert Wohlhueter del Biotechnology Core Facility Branch del National

Center for Infectious Diseases en Atlanta, GA, USA, por la obtención de mapas

peptídicos por MALDI-TOF MS y a Andreína y José David Rosales por su ayuda

en el análisis de los resultados.

Al Dr. Enrique Arsiniegas por su generoso regalo del anticuerpo anti-tubulina.

Al Dr. Cesare Olinto Colasante y al laboratorio de Fisiología de la Conducta en

la Facultad de Medicina de la Universidad de Los Andes por permitirnos el uso

del microscopio de láser confocal y por su asistencia en la obtención de las

fotografías.

Al CDCHT-ULA y ERVIC-CEE, por financiar este trabajo.

A Priscila Peña, Luisana Avilán, Wilfredo Quiñones, William Quintero, Carlos

Sanz, Guido Nuñez, grupo de técnicas analíticas del B-2003 y Tibisay Ruiz, por

su colaboración directa en este trabajo.

A la Universidad de Los Andes por permitirme realizar mi carrera y todos los

demás profesores que me inspiraron a mejorar y a amar lo que hago, en

especial a Juan Puig, Marina Calcagno, Wilfredo Quiñones y muchos más.

A Sioly Márquez, por su ayuda con la burocracia.

iv

A mis compañeros y amigos del Laboratorio de Enzimología de Parásitos, Ana

Cáceres, Priscila, Carlos, Jorge, Melisa, Marco, Elizabeth, David, José, Guido y

más recientemente Ximena y Anelvi, por su apoyo, su enseñanza y los buenos

y malos ratos compartidos.

A todos mis demás amigos y compañeros durante la carrera, Andrea, Marielis,

Diego, Francisco, Luis, Kike, Marisé, Jessica, Alejandra y a todos los que

estudiaron conmigo, porque aprendí mucho más que biología.

A mis amigos, Manuela, Eylin, Yuma, Priscila, Manuela (mi hermana), Marco,

Pablo, Jamie, Rafael, Jacobo, César, porque sin ustedes no hubiese logrado

nada.

A Dorys y a Lisbeth, por su apoyo y ayuda, por ser parte de mi familia.

A Carlos, por ayudarme en todo y por quererme tal como soy.

A mis padres, Marta Sananes y Carlos Domingo, por darme todo.

A la música y a la ciencia...

v

RESUMEN

La enolasa es una enzima de la ruta glicolítica que cataliza la deshidratación

reversible del 2-fosfoglicerato para producir fosfoenolpiruvato en una reacción

dependiente de cationes divalentes, siendo el magnesio el cofactor natural. La

reacción inversa ocurre en la gluconeogénesis. Esta enzima es un potencial

blanco quimioterapéutico para el tratamiento de la enfermedad de Chagas,

causada por Trypanosoma cruzi, así como para el tratamiento de

enfermedades causadas por otros tipanosomátides. En este trabajo se estudió

la ubicación subcelular de la enolasa en epimastigotes de T. cruzi utilizando

centrifugación diferencial e isopícnica, permeabilización selectiva de

epimastigotes con digitonina e inmunomicroscopía de láser confocal. La

actividad de la enzima se encontró exclusivamente en el citosol, sin embargo,

por Western blot se detectaron posibles isoformas inactivas localizadas en

fracciones membranales poco densas (microsomas), una forma de peso

molecular similar al de la enolasa del citosol y dos de menor peso molecular.

Por inmunomicroscopía de láser confocal se detectó la presencia de enolasa en

la superficie externa de epimastigotes intactos de T. cruzi. Esta enolasa de

superficie podría interactuar con plasminógeno y estar involucrada en procesos

invasivos en el hospedador vertebrado, como se ha visto en otros organismos.

La enolasa activa fue purificada a homogeneidad a partir de citosol mediante

cromatografía en DEAE, cromatografía en Cibacron Blue, precipitación con

sulfato de amonio y cromatografía en fenil Sefarosa, con un peso molecular

entre 49 y 51 kDa aproximadamente, y una actividad específica de 182.1

U/mg. El rendimiento de la purificación fue de 8%. Con la enzima pura y/o

fracciones parcialmente purificadas se realizaron varios ensayos para

caracterizar la enolasa de T. cruzi: el pH óptimo de la enzima fue entre 8 y 8.5,

su óptimo de Mg++ fue de 2 mM y otros cationes divalentes produjeron

inactivación de la enzima en presencia de Mg++, además, su actividad

específica aumenta a medida que se diluye. Se determinaron las constantes

cinéticas de la enzima pura para la reacción en ambos sentidos: el Km fue de

55 µM para el 2-fosfoglicerato y de 147 µM para el fosfoenolpiruvato y la kcat

vi

fue de 4766 min-1 en el sentido glicolítico y de 2038 min-1 en el sentido

gluconeogénico. Para una fracción parcialmente purificada se obtuvieron

resultados similares, aunque el Km para fosfoenolpiruvato fue un poco mayor.

El fluoruro y el fluoruro en presencia de fosfato (1 mM), inhibieron a la enzima

de manera competitiva, siendo los Ki 2570 µM y 45 µM respectivamente. El

pirofosfato también inhibió a la enzima con un Ki entre 200 y 500 µM, lo que

abre la posibilidad del uso de bisfosfonatos como inhibidores de esta enzima

para ser utilizados como agentes quimioterpéuticos. Mediante cromatografía de

filtración, electroforesis en condiciones nativas, electroforesis bidimensional

(condiciones nativas versus desnaturalizantes) y ligand blotting, se realizaron

estudios de interacción de la enolasa con otras proteínas del parásito,

utilizando fracciones parcialmente purificadas de la enzima. Estos

experimentos, junto con observaciones realizadas durante la purificación de la

enolasa, indican que esta enzima interactúa con varias proteínas y podría estar

formando algún tipo de complejo multiprotéico. Con cinco de las proteínas que

posiblemente interactúan con la enolasa de epimastigotes de T. cruzi se

realizaron mapas peptídicos por espectrometría de masas de tiempo de vuelo

con ionización/desorción por láser asistida por matrices para tratar de

establecer su identidad. Aunque no se logró la identificación inequívoca de

ninguna, se cuenta con espectros que pueden ser utilizados para análisis

posteriores, cuando sea publicado el genoma de Trypanosoma cruzi.

Palabras clave: Trypanosoma cruzi, metabolismo, glicólisis.

vii

ABSTRACT

Enolase is a glycolytic enzyme that catalyzes the reversible dehydration of 2-

phosphoglycerate to yield phosphoenolpyruvate in a divalent cation-dependent

reaction, where magnesium is the natural cofactor. The inverse reaction takes

place in gluconeogenesis. This enzyme is a potential drug target for the

treatment of Chagas’ disease, caused by Trypanosoma cruzi, and diseases

caused by other trypanosomatid species. In this work the subcellular

localization of the enolase from T. cruzi was studied by differential and

isopicnic centrifugation, selective digitonin permeabilization and confocal laser

immunomicroscopy. Enzyme activity was exclusively located in the cytosol. By

Western blot however, possible inactive isoforms were detected in low-density

membrane fractions (microsomes). One form has a molecular weight similar to

cytosol enolase, and two other forms have lower molecular weights. Enolase

was detected on the external surface of intact T. cruzi epimastigotes using

confocal laser immunomicroscopy. This surface enolase, as in other organisms,

could interact with plasminogen and might be involved in invasive processes

within the vertebrate host. Active enolase was purified to homogeneity by

DEAE chromatography, Cibacron Blue chromatography, ammonium sulfate

fractionation and phenyl Sepharose chromatography, with an approximate

molecular weight between 49 and 51 kDa and a specific activity of 182.1

U/mg. The purification procedure had an 8% yield. Several assays where

carried out with pure and/or partially purified enolase in order to characterize

the T. cruzi enzyme: the pH optimum was found between 8 and 8.5, the Mg++

optimum was 2 mM and in the presence of this ion, other divalent cations

inactivated the enzyme, also, the specific activity of T. cruzi enolase increased

with dilution. The kinetic constants were determined for the pure enzyme: Km

was 55 µM for 2-phosphoglycerate and 147 µM for phosphoenolpyruvate; kcat

was 4766 min-1 for the glycolytic reaction and 2038 min-1 for the gluconeogenic

reaction. Similar values were obtained for a partially purified fraction, although

the Km for phosphoenolpyruvate was relatively greater. Fluoride both in

absence and presence of phosphate (1mM) competitively inhibited the enzyme,

viii

with Ki of 2570 µM and 45µM respectively. Pyrophosphate also inhibited the

enzyme with a Ki value between 200 and 500 µM. This opens the possibility of

using bisphosphonates as chemotherapeutic agents. Filtration chromatography,

native electrophoresis, bidimentional (native versus denaturizing)

electrophoresis and ligand blotting were used to study the interaction of T.

cruzi enolase with other parasite proteins in partially purified fractions. The

results of these experiments, together with observations made during

purification of the enzyme, indicate that enolase does interact with other T.

cruzi proteins, and could be forming some sort of multiprotein complex. In

order to identify some of these proteins, matrix assisted laser

desortion/ionization time-of-flight mass spectrometry peptide mass

fingerprinting was carried out with 5 proteins. Although the identity of none of

these proteins was firmly established, the spectra obtained may be used for

later analysis, after publication of the Trypanosoma cruzi genome.

Key words: Trypanosoma cruzi, metabolism, glycolysis

ix

LISTA DE ABREVIATURAS

2PGA 2-Fosfoglicerato

A.E. Actividad específica

ADP Adenosin difosfato

AENO35 Banda de 35 kDa reconocida por anticuerpo anti-enolasa

AENO26 Banda de 26 kDa reconocida por anticuerpo anti-enolasa

AEP 2-aminoetilfosfonato

AMP Adenosin monofosfato

ATP Adenosin trifosfato

BSA Albúmina de suero bovino

C Citosol

CM Carboximetil

CoA Coenzima A

Cy3 Indocarbocianina

DABCO 1,4-diazabiciclo-[2,2,2]-octano

DEAE Dietilaminoetil. Fracción de purificación por DEAE-52

whatman

DHAP Dihidroxiacetona fosfato

DNA Ácido desoxirribonucléico

DTT Ditiotreitol

E. coli Escherichia coli

EP Cepa Elpidio Padrón de Trypanosoma cruzi

FGG Fracción granular gruesa

FITC Fluoresceína

FM Fracción microsomal

FN Fracción nuclear

F.P. Factor de purificación

FRD Fumarato reductasa

FRG Fracción rica en glicosomas

FS Fenil Sefarosa, fracción de purificación

G6PDH Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa

x

G3P Glicerol-3-fosfato

GPI Glicosilfosfatidilinositol

GRAVY Índice de hidropaticidad

H Homogenato

HK Hexokinasa

IDH Isocitrato deshidrogenasa

IPTG Isopropil-β-D-tiogalactopiranósido

ki Constante de inhibición

Km Constante de Michaelis-Menten

kcat Constante catalítica

L. major Leishmania major

L. mexicana Leishmania mexicana

MALDI-TOF MS Espectrometría de masas de tiempo de vuelo, con

ionización/desorción por laser asistida por matrices

MES Ácido 2-[N-morfolino]propanosulfónico

MDH Malato deshidrogenasa

MOPS Ácido 3-[N-morfolino]etanosulfónico

mRNA RNA mensajero

NAD+ Nicotin adenin dinucleótido oxidado

NADH Nicotin adenin dinucleótido reducido

NADP+ Nicotin adenin dinucleótido fosfato oxidado

NADPH Nicotin adenin dinucleótido fosfato reducido

Na2EDTA Ácido etiilendiamina tetra-acético

Na2EGTA Ácido etilenglicol-bis-(β-aminoetil eter) N,N’-tetra-acético

P43 Proteína de 43 kDa que co-purifica con la enolasa de

epimastigotes de Trypanosoma cruzi







xi







P75 Proteína asociada a la membrana de los glicosomas de

Trypanosoma cruzi

P80% Precipitado entre 40 y 80% de sulfato de amonio, fracción

de purificación

PEP Fosfoenolpiruvato

PEPCK Fosfoenolpiruvato carboxikinasa

PEPM Fosfoenolpiruvato mutasa

PGK Fosfoglicerato kinasa

Pi Fosfato inorgánico

PK Piruvato kinasa

Plg Plasminógeno

PMSF Fenil metil sulfonil fluoruro

PPDK Piruvato fosfato dikinasa

PPi Pirofosfato

RNA Ácido ribonucléico

SDH Succinato deshidrogenasa

SDS Dodecil sulfato de sodio

SDS-PAGE Electroforesis en geles de acrilamida en presencia de SDS

T. brucei Trypanosoma cruzi

T. cruzi Trypanosoma brucei

TAO Oxidasa alternativa de tripanosomas

TCA Ácido ticloroacético

TEMED N,N,N’,N’-tetrametiletilendiamina

TIM Triosa-fosfato isomerasa

TLCK Tosyl-leucin-clorometil cetona

tRNA RNA de transferencia

xii

TX-100 Tritón X-100

U Unidades enzimáticas

Vmax Velocidad máxima

xiii

INDICE GENERAL

Pg

I. Introducción 1

Trypanosoma cruzi y la enfermedad de Chagas 1

Trypanosoma cruzi 1

Taxonomía y características 1

Ciclo de vida y transmisión 5

Enfermedad de Chagas 7

Descripción 7

Diagnóstico y tratamiento 9

Búsqueda de nuevos tratamientos 11

Metabolismo de Trypanosoma cruzi 16

Características generales 16

Glicólisis y el glicosoma 21

Modelo del metabolismo intermediario 23

Enolasa (2-fosfo-D-glicerato hidrolasa, EC 4.2.1.11) 28

Características generales 28

Enolasa en tripanosomátides 38

Interacciones proteína-proteína 42

II. Hipótesis 49

III. Objetivos 49

IV. Metodología 50

Material biológico 50

Determinación de concentración de proteínas 50

Ensayos enzimáticos 51

xiv

Electroforesis en geles de acrilamida en presencia de SDS (SDS-

PAGE, electroforesis en condiciones desnaturalizantes) 53

Western Blotting 54

Ubicación subcelular 55

Centrifugación diferencial 55

Centrifugación isopícnica 56

Permeabilización selectiva de epimastigotes con digitonina 57

Inmmunomicroscopía de láser confocal 58

Preparación de Sefarosa CL4B-Cibacron Blue 58

Purificación de la enolasa de epimastigotes de T. cruzi 59

Método A 59

Método B 60

Caracterización de la enolasa de epimastigotes de T. cruzi 61

Actividad enolasa respecto al pH 61

Actividad enolasa en presencia de varios cationes divalentes 61

Actividad enolasa respecto a la concentración de enzima 61

Caracterización cinética de la enolasa de epimastigotes de T. cruzi 62

Inhibición de la enolasa de epimastigotes de T. cruzi 63

Estudios de Interacción Proteína-Proteína 64

Cromatografía de filtración 64

Electroforesis en condiciones nativas y Western blotting nativo 64

Electroforesis bidimensional (condiciones nativas versus

desnaturalizantes)

65

Ligand blotting 65

Determinación de cantidades relativas de varias proteínas en

SDS-PAGE por análisis de imagen 66

Obtención de mapas peptídicos por espectrometría de masas de

tiempo de vuelo con ionización/desorción por laser, asistida por

matrices (MALDI-TOF MS) 67

Análisis de los resultados de MALDI-TOF MS 67

Inducción y purificación de la enolasa recombinante de L. mexicana 69

xv

V. Resultados 70

Ubicación subcelular de la enolasa de epimastigotes de T. cruzi 70

Centrifugación diferencial 70

Centrifugación isopícnica 74

Permeabilización selectiva de epimastigotes con digitonina 78

Inmunomicroscopía de láser confocal 84


Método A 87

Método B 91

Purificación 1 91

Purificación 2 96


Actividad enolasa respecto al pH 100

Actividad en presencia de varios cationes divalentes 101

Actividad respecto a la concentración de enzima 103

Caracterización cinética de la enolasa de epimastigotes de T. cruzi 106

Inhibición de la enolasa de epimastigotes de T. cruzi 108

Inhibición por fluoruro 109

Inhibición por fluoruro en presencia de fosfato 110

Inhibición por pirofosfato 112

Estudios de interacción proteína-proteína 116

Proteínas que co-purifican con la enolasa de T. cruzi 116

Cromatografía de filtración 118

Electroforesis en condiciones nativas 124

Electroforesis Bidimensional (Nativa vs. desnaturalizante) 126

Ligand-blot 130

Determinación de cantidades relativas de varias proteínas en

SDS-PAGE por análisis de imagen 132

Análisis de mapas peptídicos obtenidos mediante MALDI-TOF MS.

Identificación preliminar de varias proteínas que co-purifican con

la enolasa de epimastigotes de T. cruzi 134

xvi

VI. Discusión 145

Ubicación Subcelular de la enolasa de epimastigotes de T. cruzi 146



Estudios de interacción proteína-proteína 163

Consideraciones finales 167

VII. Conclusiones 169

VIII. Referencias 170

IX. Anexos 190

Mapas de masas peptídicas 189

xvii

INDICE DE FIGURAS

Pg

Figura 1. Distribución geográfica de la Enfermedad de Chagas en

América. Zonas endémicas se muestran en negro. Tomada y

modificada de Parasite and Parasitological Resources

(http://www.biosci.ohio-state.edu/~parasite/home.html). 2

Figura 2. Morfología de Trypanosoma cruzi. (a). Dibujo esquemático de

la forma epimastigote, tomado y modificado de: de Souza, 1999. (b).

Esquemas de los distintos estadíos morfológicos. 5

Figura 3. Esquema del ciclo de vida de Trypanosoma cruzi. Tomada y

modificada de Expert Reviews in Molecular Medicine. 6

Figura 4. Esquema del metabolismo de Trypanosoma cruzi 26

Figura 5. Reacción catalizada por la enolasa 30

Figura 6. Estructura de la enolasa de levadura. Figura realizada con el

programa Cn3d, a partir de la estructura de levadura (Número de

acceso en el Protein Data Bank: 1ONE) 32

Figura 7. Alineamiento de secuencias de proteínas de las enolasas de

tripanosomatides y humanos. Realizado con el programa ClustalW. 40

Figura 8. Distribución de la actividad enolasa y actividades de

marcadores enzimáticos en fracciones obtenidas mediante

centrifugación diferencial en epimastigotes de T. cruzi. 71

Figura 9. Distribución de enolasa y proteínas marcadores en fracciones

obtenidas mediante centrifugación diferencial, detectadas por Western

blot en epimastigotes de T. cruzi. 73

Figura 10. Distribución de la actividad enolasa y actividades de los

distintos marcadores enzimáticos en las fracciones obtenidas mediante

centrifugación isopícnica. 75

Figura 11. Distribución de enolasa y proteínas marcadoras en

fracciones obtenidas mediante centrifugación isopícnica, detectadas por

Western blot en epimastigotes de T. cruzi. 77

xviii

Figura 12. Liberación de la actividad enolasa y de marcadores

enzimáticos de epimastigotes de T. cruzi permeabilizados con

digitonina 80

Figura 13. Detección de enolasa y proteínas marcadoras en las

fracciones obtenidas mediante permeabilización con digitonina en

epimastigotes de T. cruzi 82

Figura 14. Detección de enolasa y α-tubulina en epimastigotes de T.

cruzi permeabilizados y no permeabilizados, mediante microscopía de

laser confocal. 86

Figura 15. SDS-PAGE y Western blot de las fracciones de purificación

de la enolasa citosólica de epimastigotes de Trypanosoma cruzi por el

método A 88

Figura 16. Perfil de elusión de la columna de fenil Sefarosa con el

método A. 89

Figura 17. SDS-PAGE y Western blot de las fracciones de purificación

de la enolasa citosólica de epimastigotes de Trypanosoma cruzi por el

método B, purificación 1. 92



Figura 19. SDS-PAGE y Western blot de fracciones obtenidas por

cromatografía en fenil Sefarosa mediante el método B, purificación 1. 95

Figura 20. SDS-PAGE de las fracciones de purificación de la enolasa

citosólica de epimastigotes de Trypanosoma cruzi por el método B,

purificación 2. 96



Figura 22. SDS-PAGE de fracciones obtenidas por cromatografía en

fenil Sefarosa mediante el método B, purificación 2. 99

Figura 23. Curva de actividad de la enolasa de epimastigotes de T.

cruzi en función del pH. 100

Figura 24. Actividad de la enolasa de epimastigotes de T. cruzi a

distintas concentraciones de Mg2+. 101

xix

Figura 25. Actividad de la enolasa de epimastigotes de T. cruzi en

presencia de varios cationes divalentes 102

Figura 26. Dependencia de la actividad de la enolasa de epimastigotes

de T. cruzi respecto a la concentración de enzima bajo distintas

condiciones. 105

Figura 27. Determinación de constantes cinéticas para la enolasa de

epimastigotes de T. cruzi. 107

Figura 28. Inhibición de la enolasa de epimastigotes de T. cruzi por

fluoruro. 110


fluoruro en presencia de fosfato inorgánico (1mM). 111


pirofosfato. 113

Figura 31. Perfiles de elusión de la actividad enolasa en cromatografía

de filtración de fracciones de enolasa de epimastigotes de T. cruzi

parcialmente purificadas, bajo distintas condiciones. 119

Figura 32. SDS-PAGE (a.) y Western blots (b.) de fracciones obtenidas

mediante cromatografía de filtración de fracciones de enolasa de

epimastigotes de T. cruzi parcialmente purificadas. 121

Figura 33. Perfiles de elusión de la actividad enolasa en cromatografía

de filtración de enolasa de epimastigotes de T. cruzi parcialmente

purificada, en presencia de TX-100. 123

Figura 34. SDS-PAGE (a.) y Western blot (b.) de fracciones obtenidas

mediante cromatografía de filtración de enolasa de epimastigotes de T.

cruzi parcialmente purificada. 123

Figura 35. Electroforesis en condiciones nativas de una fracción de

enolasa de epimastigotes de T. cruzi parcialmente purificada en varias

condiciones 125

Figura 36. Electroforesis bidimensional (nativa versus desnaturalizante)

de una fracción de enolasa de epimastigotes de T. cruzi parcialmente

purificada, bajo distintas condiciones. 127

xx

Figura 37. Electroforesis bidimensional (nativa versus desnaturalizante)

de una fracción de enolasa de epimastigotes de T. cruzi parcialmente

purificada, en buffer E. Cada banda señalada en el recuadro del gel

nativo se cortó y se corrió por separado en el gel desnaturalizante 129

Figura 38. Ligand blot de una fracción de enolasa de epimastigotes de

T. cruzi con enolasa recombinante de L. mexicana. 131

Figura 39. Análisis de superficie del gel del perfil de elusión en fenil

Sefarosa de la purificación 1 por el método B, fracción 49 (figura 18),

utilizando el programa ImageJ. 133

xxi

INDICE DE TABLAS

Pg

Tabla 1. Características de enolasas de distintos organismos 36

Tabla 2. Purificación de la enolasa de Trypanosoma cruzi por el método

A 87


B, purificación 1 92


B, purificación 2 96

Tabla 5. Resumen de características cinéticas de la enolasa de

Trypanosoma cruzi 115

Tabla 6. Proteínas presentes en las preparaciones de enolasa de

epimastigotes de T. cruzi parcialmente purificada, obtenidas en

purificaciones independientes. 117

Tabla 7. Relación molar entre las proteínas que co-purifican en la

fracción 49 de la cromatografía en fenil Sefarosa en la purificación 1,

por el método B, de la enolasa de epimastigotes de T. cruzi. 133

Tabla 8. Resultados del mapa de masas peptídicas de p45 con el

programa GeneDB eMowse. 140









1

I. INTRODUCCION

Trypanosoma cruzi y la enfermedad de Chagas

Trypanosoma cruzi es el agente causante de la Enfermedad de Chagas o

tripanosomiasis americana, un importante problema de salud pública en

América Latina, y una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en

el continente, un orden de magnitud mayor que otras enfermedades

parasitarias como malaria, schistosomiasis o leishmaniasis (Urbina y Docampo,

2003).

La enfermedad se encuentra distribuida desde México hasta el sur de América,

encontrándose en 18 países (Figura 1). Aproximadamente 120 millones de

personas (25% de la población de América Latina) se encuentran bajo riesgo

de infección. Se cree que esta cifra ha bajado en los últimos años a unos 40

millones gracias a programas de control de transmisión vectorial,

principalmente a través de la Iniciativa del Cono Sur, que involucra a Brasil,

Argentina, Paraguay y Uruguay, sin embargo, en otras zonas del continente el

progreso no ha sido tan marcado. Actualmente se calcula que entre 13 y 20

millones de personas están infectadas, de los cuales unos 3 millones presentan

síntomas de la enfermedad. Cada año se presentan 200000 casos nuevos y

unas 21000 muertes. (Anónimo, 2002; Anónimo 2003; Urbina, 1999; Urbina y

Docampo, 2003).

Trypanosoma cruzi

• Taxonomía y características

Trypanosoma cruzi es un parásito protozoario hemoflagelado, perteneciente al

grupo Euglenozoa, orden Kinetoplástida, suborden Trypanosomatina, Familia

Trypanosomatidae y al subgénero Schizotrypanum (Hannaert y col., 2003b;

Coura y de Castro, 2002; Maslov y Simpson, 1995). A la familia

2

Figura 1. Distribución geográfica de la Enfermedad de Chagas en América. Zonas

endémicas se muestran en negro.

Trypanosomatidae también pertenecen otros importantes patógenos de

humanos: Leishmania sp, causante de diversos tipos de leishmaniasis, y

Trypanosoma brucei (subespecies T.b. gambiense y T.b. rhodesiense), agente

causal de la enfermedad del sueño o tripanosomiasis africana (Beverly, 2002;

Verlinde y col., 2001).

Los miembros del suborden Trypanosomatina son parásitos obligados y

muchos, incluyendo a T. cruzi y otras especies de los géneros Trypanosoma,

Leishmania y Endotrypanum poseen ciclos de vida digenéticos, que involucran

un vector invertebrado y un hospedador vertebrado (Maslov y Simpson, 1995).

Los organismos pertenecientes al orden Kinetoplástida se caracterizan por la

presencia del kinetoplasto, una estructura densa que se encuentra dentro de la

única mitocondria ramificada. El kinetoplasto está compuesto por una red de

3

moléculas circulares de DNA: maxicírculos y minicírculos, que se encuentran

concatenadas. La red contiene varias docenas de copias idénticas de los

maxicírculos, de 20 a 40kb, en los cuales están codificados, de forma

encriptada, los genes mitocondriales típicos. Los minicírculos, están presentes

en varios miles de copias con secuencias parecidas pero no idénticas y

codifican RNAs guías para la edición de los mRNAs de los genes mitocondriales,

lo que permite obtener los productos funcionales de estos últimos. Este

proceso de edición es también particular y característico de los kinetoplastides

(de Souza, 1999; Lukes y col., 2002; Hannaert y col. 2003b).

Otras características distintivas son la trascripción de genes nucleares como

RNAs policistrónicos que son posteriormente procesados por trans-splicing, la

ausencia de promotores para la DNA polimerasa II y la presencia de

glicosomas, organelas similares a los peroxisomas donde se encuentra

compartamentalizada parte de la ruta glicolítica (las primeras 6-7 enzimas de

la ruta), junto con otras rutas catabólicas y anabólicas (Hannaert y col.,

2003b).

Además, los tripanosomatides presentan otros organelos peculiares, como los

acidocalcisomas y los reservosomas. Los acidocalcisomas se encuentran en

varios grupos de microorganismos, aunque fueron descritas por primera vez en

tripanosomatides. Son organelas electrón densas y acídicas, que poseen altas

concentraciones de calcio, magnesio y polifosfatos, incluyendo pirofosfato. A

los acidocalcisomas se le han adjudicado funciones de reserva de energía (los

polifosfatos), además, el calcio y pirofosfato, que pueden ser liberados a través

de distintas vías, podrían tener funciones reguladoras (Docampo y Moreno,

2001). Los reservosomas se encuentran en la región posterior del parásito, y

parecen corresponder a vesículas pre-lisosomales, donde se almacenan

macromoléculas ingeridas por la vía endocítica, incluyendo proteínas. Estos

podrían estar involucrados en la transformación entre las formas epimastigote

y tripomastigote de T. cruzi. (de Souza, 1999; Soares, 1999; Urbina, 1994).

4

Otra peculiaridad es la presencia de una red de microtúbulos bajo la

membrana plasmática, el esqueleto subpelicular o microtúbulos subpeliculares.

La asociación de estos microtúbulos entre ellos y con la membrana

posiblemente contribuye a la rigidez de la célula. (de Souza, 1999; de Souza,

2002; Hill, 2003).

El flagelo de los tripanosomas es el responsable del movimiento de los

kinetoplástides y también posee ciertas peculiaridades. Al igual que en otros

organismos está recubierto por una membrana particular pero contigua con la

membrana plasmática. Emerge del cuerpo basal, cerca de la parte

posterior/lateral de la célula, de una invaginación denominada bolsa flagelar.

En tripanosomatides, el flagelo permanece unido a la membrana a lo largo del

cuerpo celular a través de una estructura que une la membrana flagelar con el

citoesqueleto, la zona de unión del flagelo. Por lo tanto, cuando el flagelo se

mueve, desde la punta libre en la parte anterior de la célula, da la apariencia

de que estos parásitos poseen una membrana ondulante, mientras avanzan

hacia adelante. En la estructura del flagelo también se encuentra, dentro de la

membrana flagelar, el cuerpo o bastón paraflagelar, un filamento protéico que

empieza justo antes de la bolsa flagelar y es paralelo al axonema (estructura

típica de “9+2” microtúbulos del flagelo). Este cuerpo paraflagelar está

presente en kinetoplastides, euglenoides y dinoflagelados (Hill, 2003; de Souza

1999; de Souza, 2002).

En la Figura 2a, se muestra un esquema de la forma epimastigote de T. cruzi

donde se señalan algunas de las características descritas anteriormente.

T. cruzi presenta distintos estadíos morfológicos durante su ciclo de vida, que

será explicado más adelante. Estas formas se muestran en la figura 2b y son:

(a) Amastigotes: formas replicativas, intracelulares, que se encuentran dentro

del hospedador vertebrado. Tienen forma redondeada y un flagelo muy corto.

(b) Trypomastigotes: formas infectivas, extracelulares, encontradas tanto en el

vector invertebrado (trypomastigotes metacíclicos), como en el hospedador

5

vertebrado (trypomastigotes sanguíneos). Tienen forma alargada, el

kinetoplasto y la bolsa flagelar (y por lo tanto el punto de emergencia del

flagelo) están en posición posterior al núcleo. (c) Epimastigotes: formas

replicativas, extracelulares, en el vector invertebrado. También poseen forma

alargada, pero en este caso el kinetoplasto y la bolsa flagelar se encuentran en

posición anterior al núcleo (de Souza, 2002; Tanowitz y col., 1992; McConville

y col., 2002).

Figura 2. Morfología de Trypanosoma cruzi. (a.) Dibujo esquemático de la forma

epimastigote. (b.) Esquemas de los distintos estadíos morfológicos.

• Ciclo de vida y transmisión

Como se mencionó anteriormente T. cruzi posee un ciclo de vida digenético. El

parásito infecta una gran variedad de mamíferos en las zonas endémicas, y es

transmitido entre estos hospedadores vertebrados a través de varias especies

de vectores invertebrados: insectos hematófagos pertenecientes a la familia

Reduviidae, subfamilia Triatominiae. Los humanos pueden ser contaminados a

6

través de los vectores cuando entran en contacto en ambientes naturales o

cuando los invertebrados se establecen en las viviendas (Urbina y Docampo,

2003; Sherlock, 2000). Un esquema del ciclo de vida del parásito se muestra

en la figura 3.

Figura 3. Esquema del ciclo de vida de Trypanosoma cruzi.

Cuando el insecto ingiere sangre de un animal o persona infectada, los

trypomastigotes sanguíneos se diferencian en epimastigotes en la parte media

del tracto digestivo, donde se adhieren al epitelio intestinal y se dividen por

fisión binaria. Algunos epimastigotes se diferencian en trypomastigotes

metacíclicos en el recto del insecto, y son liberados con las heces. La infección

del vertebrado puede ocurrir cuando el insecto ingiere sangre nuevamente y

deposita trypomastigotes que pueden entrar por la herida causada por el

reduvido, sin embargo, el parásito también puede entrar por mucosas, como la

ocular. Dentro del organismo, los trypomastigotes metacíclicos pueden ser

internalizados por una gran variedad de células (como macrófagos, células

musculares y del sistema nervioso), quedando encerrados en una estructura

denominada vacuola parasitofora. Los parásitos escapan al citosol al secretar

7

una hemolisina que perfora la vacuola parasitofora. Una vez allí, los

trypomastigotes se diferencian en amastigotes, que se dividen y

posteriormente se transforman en trypomastigotes. La célula finalmente se lisa

y libera trypomastigotes y amastigotes, que son capaces de infectar células

adyacentes y/o llegar al torrente sanguíneo donde pueden invadir nuevas

células en tejidos distantes o ser tomados nuevamente por un insecto

hematófago, para completar el ciclo (de Souza, 2002; Tanowitz y col., 1992;

McConville y col., 2002; Coura y de Castro, 2002).

La transmisión de T. cruzi actualmente, ocurre principalmente a través del

vector (80-90%), aunque otras vías importantes de transmisión son por

transfusiones de sangre (5 a 20%) y transmisión congénita (0.5 a 8%). Vías

raras de transmisión son los accidentes de laboratorio, transplante de órganos,

vía oral y transmisión sexual. La transmisión por transfusión sanguínea ha

llegado a ser muy importante y ha llevado la enfermedad a zonas urbanas (y

potencialmente a países no endémicos), aunque controles en los bancos de

sangre en los últimos años han disminuido la incidencia (Coura y de Castro,

2002; Dias, 2000; Dias, 1992). Sin embargo, estos controles no son

obligatorios en países no endémicos, donde la enfermedad podría convertirse

en un problema de salud pública (Urbina, 2003).

Enfermedad de Chagas

• Descripción

La enfermedad de Chagas, en humanos, se desarrolla en tres fases:

Luego de la infección y un período de incubación de 1 a 2 semanas se

desarrolla la fase aguda de la enfermedad, durante la cual se encuentran

trypomastigotes en la sangre y en fluido cerebroespinal. Se puede formar una

lesión inflamatoria conocida como chagoma, en el sitio de entrada del parásito

8

junto con otros síntomas más o menos severos. Estos incluyen edema

periorbital unilateral (signo de Romaña), fiebre, lifoadenopatía,

hepatoesplenomegalia, nauseas, vómitos, diarrea, anorexia, cansancio,

erupciones, miocarditis e irritación de la meninges. Sin embargo, es

importante resaltar que estos síntomas suelen presentarse solo en niños y

algunos adultos, y en la mayoría de los casos esta fase pasa desapercibida y/o

se resuelve espontáneamente en 3 a 4 meses (Coura y de Castro, 2002;

Tanowitz y col. 1992). La mortalidad en esta fase es baja, (menor o igual al

10%) y ocurre principalmente debido a complicaciones asociadas con

miocarditis aguda o meningoencefalitis (Urbina y Docampo, 2003; Tanowitz y

col. 1992).

La resolución de la fase aguda da lugar a la fase indeterminada de la

Enfermedad de Chagas. Esta última se caracteriza por el control de la infección

por parte del sistema inmune (inmunidad elevada, control de la

hipersensibilidad y reducción de la respuesta inflamatoria) y en consecuencia,

la disminución de la cantidad de parásitos en sangre. Sin embargo, la persona

sigue infectada y es posible detectar parásitos en tejidos y lesiones

inflamatorias (Coura y de Castro, 2002). Esta fase puede durar varias décadas.

La siguiente fase de la enfermedad de Chagas, la fase crónica, se desarrolla en

20-50% de los casos, dependiendo del área endémica. Durante esta fase

tampoco es fácil detectar parásitos en sangre, sin embargo, se desarrollan los

síntomas característicos de la enfermedad: problemas cardíacos, digestivos o

neuronales (Coura y de Castro, 2002), como arritmias, defectos de conducción,

aneurismas cardíacos, hipertrofia miocelular, inflamación del corazón,

disfunción del sistema nervioso autónomo (que suele asociarse a algunos de

los problemas cardíacos y digestivos), daños al sistema nervioso central,

megaesófago, megacolon, problemas estomacales y de la vesícula, entre otros

(Tanowitz y col. 1992). Las consecuencias de estos problemas suelen ser

mortales.

9

Todavía existen controversias sobre como se origina la patología de la

enfermedad de Chagas, principalmente en la fase crónica. Existen evidencias

que dan un carácter autoinmune a la enfermedad, como la presencia de

anticuerpos que reconocen tejidos humanos en personas enfermas (que

podrían originarse como consecuencia de semejanzas moleculares entre los

dos organismos) y el hecho de que células del sistema inmune tomadas en

organismos infectados son capaces de causar lesiones en tejidos normales,

entre otras (Urbina, 1999; Tanowitz, 1992). Sin embargo, evidencias más

recientes contradicen la hipótesis de autoinmunidad, por ejemplo, pruebas de

la persistencia de parásitos en lesiones inflamatorias, obtenidas a través de

inmunihistoquímica y reacción en cadena de la polimerasa (métodos más

sensibles que los utilizados comúnmente); evidencias de que la quimioterapia

antiparasitaria tiene efectos contra el desarrollo de la enfermedad; el hecho de

que la inmunosupresión, ya sea por quimioterapia o enfermedades, produce en

muchos casos reactivación o recrudecimiento de la enfermedad de Chagas,

entre otras. Por lo tanto, se cree que la persistencia del parásito, aunque en

bajos números, y una respuesta inmune desbalanceada juegan el papel más

importante en el desarrollo de la fase crónica de la enfermedad de Chagas

(Urbina y Docampo, 2003).

• Diagnóstico y Tratamiento

El diagnóstico de la enfermedad de Chagas durante la fase aguda suele

hacerse mediante la visualización del parásito en sangre por microscopía de

luz, cultivo en medio líquido, infección de animales de laboratorio o

xenodiagnóstico (Tanowitz y col. 1992).

Aunque algunas de estas pruebas (como xenodiagnóstico y cultivos) pueden

ser positivas durante la fase crónica (Coura y de Castro, 2002), el diagnóstico

durante esta fase (y en la fase indeterminada) suele basarse en pruebas

serológicas, como inmunofluorescencia indirecta, fijación de complemento y

ELISA. Sin embargo, un problema con estas técnicas son el gran número de

10

falsos positivos, por lo que actualmente se están haciendo esfuerzos para

caracterizar antígenos del parásito que sean más específicos para el

serodiagnóstico (Tanowitz y col. 1992).

Otro método altamente sensible y específico para la detección de los parásitos,

es la reacción en cadena de la polimerasa de ciertos marcadores del DNA del

parásito (Tanowitz y col., 1992), que de hecho ha sido utilizado para probar la

persistencia del parásito durante la fase crónica (Urbina y Docampo, 2003).

Sin embargo, existen problemas para la aplicación de esta técnica como

método de diagnóstico generalizado: la dificultad del procesamiento de

muestras al comparar con métodos de serodiagnóstico, y la posibilidad de

contaminación de estas, dando lugar a falsos positivos (Tanowitz y col., 1992)

además de los altos costos.

El tratamiento de la enfermedad de Chagas tradicionalmente se ha basado en

dos drogas: nifurtimox (un nitrofuran, comercializado bajo el nombre de

Lampit®, Bayer) y benznidazole (un derivado de nitroimidazol, comercializado

como Rochagan®, Roche). Las actividades antiparasitarias de ambos fueron

descubiertas de forma empírica hace varias décadas (Urbina y Docampo,

2003). El nifurtimox, que actualmente está descontinuado, actúa a través de

su modificación por nitroreductasas a un nitroanión inestable que reacciona

para producir intermediarios reactivos del oxígeno (como anión superóxido y

peróxido de hidrógeno). Su actividad contra T. cruzi se basa en que este

organismo es deficiente en mecanismos de detoxificación de intermediarios

reactivos, comparado con células humanas (Coura y de Castro, 2002; Urbina y

Docampo, 2003). El benznidazole parece actuar a través de la modificación

covalente de diversos tipos de macromoléculas por intermediarios de

nitroreducción (Urbina y Docampo, 2003).

Ambos compuestos tienen una significativa actividad anti-T. cruzi durante la

fase aguda o infecciones crónicas recientes, produciendo cura parasitológica en

50-80% de las personas tratadas (Urbina y Docampo, 2003, Anónimo, 2002).

11

Sin embargo, la eficacia del tratamiento parece depender de la susceptibilidad

de las cepas de T. cruzi a estas drogas, ya que hay diferencias entre distintas

zonas endémicas. Además, estos medicamentos deben ser tomados por largos

períodos de tiempo y producen efectos secundarios severos (posiblemente

debido a daños en los tejidos) como anorexia, vómitos, polineuropatía

periférica y dermopatía alérgica, que en muchos casos puede llevar al

abandono del tratamiento (Urbina y Docampo, 2003; Tanowitz y col. 1992).

El tratamiento durante la fase crónica de la enfermedad de Chagas se basa en

controlar la sintomatología, y las drogas utilizadas en la infección temprana

producen cura parasitológica en menos de 80% de los pacientes tratados. La

demostración de que la enfermedad en esta fase está relacionada con la

persistencia del parásito hace que el tratamiento de la fase crónica sea un

problema por resolver (Urbina y Docampo, 2003).

• Búsqueda de nuevos tratamientos

A pesar de los avances realizados en materia de transmisión de la enfermedad,

el hecho de que los compuestos actualmente utilizados no producen cura en

100% de los pacientes en fase aguda y que prácticamente no tienen efecto

para la fase crónica, plantea la necesidad de buscar nuevos tratamientos para

la enfermedad de Chagas.

Lamentablemente, el hecho de que la enfermedad Chagas junto con el resto de

las enfermedades causadas por tripanosomátides, sean problemas de países

pobres, trae como consecuencia que el desarrollo de nuevas terapias por parte

de la industria farmacéutica no sea de alta prioridad, debido a la limitada

ganancia que generarían. Sin embargo, las investigaciones continúan (aunque

de manera limitada), gracias al apoyo de ciertas organizaciones

internacionales, a iniciativas de los países afectados y a la investigación básica

de las interesantes características de la biología de los tripanosomátides

(Verlinde y col., 2001; Barret y col., 1999).

12

En los últimos tiempos, la búsqueda de nuevos tratamientos se ha basado en

un enfoque racional, que incluye en primer lugar la validación de blancos

quimioterapeúticos y posteriormente la validación de posibles drogas. Un buen

blanco debe ser un paso esencial del metabolismo del parásito para el cual sea

posible la inhibición potente y selectiva, ya sea por la no existencia de dicho

paso en el hospedador (explotar diferencias metabólicas entre el parásito y el

hospedador) o por la existencia de diferencias significativas en este paso entre

el parásito y el hospedador (diferencias en estructuras tridimensionales de

enzimas o existencia de residuos reactivos en el sitio activo de enzimas del

parásito) (Verlinde y col., 2001; Urbina , 1999). Comúnmente, la validación de

blancos quimioterapeúticos se hace comparando características bioquímicas del

parásito con las del hospedador (Barret y col., 1999).

Varios métodos se pueden utilizar para saber si un paso del metabolismo,

como por ejemplo una ruta metabólica o una reacción catalizada por una

enzima, es esencial. Se suelen emplear métodos bioquímicos, como inhibición

por drogas que se sabe actúan en dicho paso y actualmente también se

emplean métodos genéticos, como la eliminación de genes, por recombinación

homologa (Barret y col., 1999) o el silenciamiento de su expresión, utilizando

RNA de interferencia, que ha sido ampliamente utilizado con T. brucei.

Lamentablemente, este último método no ha sido aún estandarizado para su

uso en T. cruzi (Beverly, 2003).

Ahora, el hecho de que un paso sea esencial, tampoco implica que es un buen

blanco. Por ejemplo, es difícil que una droga inhiba completamente una

enzima, y la actividad restante puede ser suficiente para permitir la

subsistencia del patógeno. Además es usual que los pasos esenciales del

metabolismo sean altamente conservados durante la evolución y por lo tanto

similares entre el parásito y humanos, lo que hace difícil el desarrollo de

agentes quimioterapéuticos. No obstante, genes no esenciales también pueden

ser blanco quimioterapeúticos. (Barret y col., 1999).

13

Como se menciona anteriormente, el otro punto importante para la validación

de un blanco quimioterapeútico, es que existan diferencias suficientes entre

humanos y el parásito que permitan el diseño de drogas específicas para el

blanco del parásito. Esto va desde rutas exclusivas en el parásito hasta

enzimas conservadas con suficientes diferencias estructurales, que pueden ser

encontradas mediante el estudio de el metabolismo del parásito por métodos

bioquímicos.

Una nueva posibilidad para la búsqueda de estas diferencias en el análisis de

secuencias en bases de datos y la identificación de proteínas por técnicas de

proteómica, mediante las cuales se pueden detectar posibles blancos de una

manera más rápida y eficiente. Por ejemplo, se pueden detectar secuencias

conservadas entre varias especies de parásitos pero ausentes en humanos,

que tienen una posibilidad alta de ser esenciales, o secuencias exclusivas del

parásito (Ashton y col. 2001; Tarleton y Kissinger, 2001). Por proteómica, se

pueden identificar proteínas que tienen expresión diferencial bajo ciertas

condiciones (distintas formas morfológicas, como en el trabajo realizado por

Paba y col (2004), bajo la influencia de drogas y otras) u otras propiedades

interesantes, que permiten un mejor entendimiento de la biología de estos

organismos patógenos. De todas formas es necesaria la caracterización

bioquímica posterior para la validación del blanco.

Actualmente, el proyecto de secuenciamiento y anotación del genoma de

Trypanosoma cruzi (El Proyecto Genoma de T. cruzi), específicamente de la

cepa CL-Brener, esta siendo llevado a cabo por el TIGR-Seattle Biomedical

Research Institute-Karolinska Institute T. cruzi Sequencing Consortium (TSK-

TSC) (http://www.tigr.org/tdb/e2k1/tca1/). Para otros tripanosomatides, como

Trypanosoma brucei y Leishmania mayor también existen proyectos de

secuenciación en progreso. En la base de datos del NCBI

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) están depositadas alrededor de 1600

secuencias de proteínas de T. cruzi. Sin embargo, estos valores son

subestimados, ya que hay un retardo considerable entre las secuencias que

14

están en las bases de datos de los proyectos y las que son depositadas en

GenBank (Tarleton y Kissinger, 2001). De hecho, para T. cruzi, numerosas

secuencias preliminares obtenidas por el proyecto genoma, se encuentran en

las bases de datos GeneDB (http://www.genedb.org/) y TcruziDB

(http://tcruzidb.org/). En la primera, actualmente existen más de 25000

marcos de lectura predichos.

El siguiente paso en el desarrollo de nuevos tratamientos es la búsqueda y

validación de agentes quimioterapeúticos. Un buen candidato debe ser capaz

de entrar al organismo patógeno y poseer características farmacocinéticas y

farmacodinámicas adecuadas, como grandes volúmenes de distribución en

tejidos, vida media larga y posibilidad de introducción por vía oral, en el caso

específico de la Enfermedad de Chagas (Urbina, 1999).

Basándose en lo anterior, hasta ahora varios blancos han sido validados en

tripanosomatides y en T. cruzi en particular. Actualmente se están

desarrollando drogas que pudieran actuar sobre estos blancos, algunas de las

cuales parecen prometedoras. Muchas de estas drogas, o la alteración del

posible blanco, impiden el crecimiento, metaciclogénesis y/o disminuyen la

infectividad del parásito; por ejemplo, inhibidores de la vía de incorporación de

purinas, específicamente de la hipoxantina-guanina fosforibosil transferasa

(HGPRT); inhibición de enzimas del metabolismo de tripanotión, principal

metabolito redox en tripanosomátides; inhibición de la síntesis de nucleótidos;

inhibidores de la DNA topoisomerasa II, necesaria para la replicación del

kinetoplasto; inhibidores de la neuroaminadasa de T. cruzi, que incorpora ácido

siálico proveniente del hospedador a la membrana del parásito; inhibidores del

intercambiador de Na+/H+ del acidocalcisoma y drogas relacionadas con el

metabolismo de pirofosfato (Urbina y Docampo, 2003; Barret y col. 1999;

Urbina, 2003)

Algunas pocas han sido probadas en modelos animales, en los que inducen

cura parasitológica. Por ejemplo: inhibidores de la cruzipaina, la proteasa

15

principal del parásito (Urbina y Docampo, 2003) e inhibidores de la síntesis de

ergoesterol. Entre estos últimos, algunas drogas se encuentran en pruebas

clínicas (Urbina, 2003).

Las enzimas de la glicólisis (y enzimas relacionadas) han sido consideradas

como un blanco ideal en tripanosomátides, ya que su conmpartamentalización

en los glicosomas es una característica única de estos organismos (Barret y

col, 1999; Verlinde y col., 2001). Dicha compartamentalización ha otorgado

propiedades únicas a las enzimas de la ruta glicolítica. Se han realizado

numerosos estudios relacionados con la caracterización de las enzimas de la

glicólisis, principalmente con las primeras seis o siete (dependiendo de la

especie) que se encuentran en el glicosoma y se han desarrollado inhibidores

específicos para varias de estas, por ejemplo, para fosfofructokinasa, aldolasa

y gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa y la oxidasa alternativa mitocondrial,

(Verlinde y col, 2001).

A pesar de estos avances, todavía no hay una quimioterapia adecuada para el

tratamiento de la enfermedad de Chagas y la búsqueda aún continúa. Por lo

tanto, el estudio del metabolismo de T. cruzi es importante para la

identificación de nuevos blancos, y la posterior caracterización de estos,

además de ser un peculiar e interesante modelo de estudio.

16

Metabolismo de Trypanosoma cruzi

El metabolismo de los tripanosomátides es variado; las distintas especies

poseen características particulares y existen esquemas metabólicos muy

diferentes entre los distintos estadíos morfológicos de una misma especie.

Probablemente, los trypomastigotes sanguíneos de T. brucei son los que

poseen el metabolismo más sencillo (y más estudiado): obtienen toda su

energía por la vía glicolítica, no poseen ciclo de Krebs y son posiblemente

deficientes en algunas rutas anabólicas. Sin embargo, el resto de los

tripanosomátides, incluyendo los trypomastigotes procíclicos de T. brucei (que

se encuentran en el vector invertebrado), Leishmania sp y las diversas formas

de T. cruzi poseen un esquema metabólico más complejo (Michels y col., 2000;

Hannaert y col., 2003b).

Existen diferencias entre los distintos estadíos de T. cruzi, por ejemplo, los

amastigotes, en contraste con los epimastigotes son resistentes a la lisis por

complemento y se han realizado diversos estudios que muestran expresión

diferencial de proteínas y de mRNA (Paba y col., 2004; Minning y col., 2003).

Sin embargo, otros autores señalan que todas las formas poseen un

metabolismo similar, por lo menos en cuanto a consumo de glucosa y

productos de excreción (Rogerson y Gutteridge, 1980, citado en Engel y col.,

1987). En todo caso, la mayoría de los estudios sobre esta especie son

realizados con epimastigotes, ya que estos son fácilmente crecidos en medios

de cultivo axénicos por numerosas generaciones (Engel y col., 1987) y

constituyen un modelo para el estudio del metabolismo de T. cruzi y de los

tripanosomátides en general.

Características generales

T. cruzi es capaz de utilizar tanto glucosa como aminoácidos para obtener

energía. La glucosa parece ser el sustrato preferencial (a diferencia de

Leishmania sp), aunque también podría ocurrir la utilización simultanea de

17

ambos sustratos. Inclusive, un sustrato u otro podría ser preferido

dependiendo de la disposición de estos en el medio en que viven los parásitos

y de la composición enzimática de las distintas formas (Cazzulo y col., 1985;

Engel y col., 1987).

Las principales formas de T. cruzi parecen poseer un catabolismo de glucosa

similar al de los trypomastigotes procíclicos de T. brucei (Cazzulo, 1992). Esto

es, degradan la glucosa sólo parcialmente hasta CO2, inclusive bajo

condiciones aeróbicas, por lo que este catabolismo se ha denominado

“fermentación aeróbica”: parte del carbono proveniente de la glucosa es

excretado al medio como distintos catabolitos parcialmente oxidados,

principalmente succinato, acetato y L-alanina, aunque se han detectado otros

productos, en menor cantidad como piruvato, lactato y malato. El succinato es

siempre el producto principal para todas las formas (Cazzulo y col., 1985;

Engel y col., 1987; Cazzulo, 1992).

La ruta glicolítica no es regulada de la manera clásica (a nivel de la hexokinasa

(HK) y la fosfofructokinasa (PFK)) y se encuentra parcialmente

compartamentalizada en los glicosomas. Tampoco ocurre el efecto Pasteur

(disminución en el consumo de glucosa al pasar de anaerobiosis a aerobiosis),

por lo que se cree que esta ruta es en general poco regulada y los parásitos

consumen tanta glucosa como es capaz de entrar a la célula (Urbina, 1994;

Cazzulo, 1992)

Los tripanosomátides también consumen, hasta un 40% de la glucosa a través

de la vía de las pentosas fosfato (Besteiro y col., 2002), que produce NADPH,

utilizado en rutas de biosíntesis y ribosa para la síntesis de nucleótidos.

Los epimastigotes de T. cruzi son capaces de catabolizar prolina, leucina y

otros aminoácidos (posiblemente provenientes de proteínas del medio,

internalizadas y acumuladas en los reservosomas) completamente a CO2 y

productos para biosíntesis, junto con la excreción de grandes cantidades de

18

amonio (Urbina, 1994). La alanina que es excretada podría provenir de la

transaminación del piruvato catalizada por una alanina aminotransferasa

(Cazzulo, 1992), por lo tanto esto representaría una manera de excretar

amonio (proveniente del catabolismo de amino ácidos), junto con un producto

parcialmente oxidado de la glicólisis.

El catabolismo de aminoácidos conduce a la producción de intermediarios del

ciclo de Krebs, que podrían ser oxidados en la mitocondria, convertidos a

fosfoenolpiruvato (PEP), por la fosfoenolpiruvato carboxikinasa (PEPCK) para

ser utilizado en gluconeogénesis (aunque la existencia de esta ruta es

controversial en tripanosomatides), o a piruvato, a través de la PEPCK y la PK

o la enzima málica, lo que permitiría la producción acetil-coA (Urbina, 1994).

En todo caso, este proceso requiere de un ciclo de Krebs funcional (Cazzulo,

1992) y de una cadena transportadora de electrones acoplada a una

fosforilación oxidativa (ATPasa) para poder obtener energía.

El funcionamiento del ciclo de Krebs y de la cadena transportadora de

electrones en la mitocondria de los tripanosomátides ha sido puesta en duda

debido a la existencia de la fermentación aeróbica. De hecho, en los

trypomastigotes sanguíneos de T. brucei no son funcionales (Cazzulo, 1992).

Sin embargo, el resto de los tripanosomatides posee todas las enzimas del

ciclo de Krebs y una cadena transportadora de electrones (Urbina, 1994)

acoplada a una ATPasa para la producción de energía.

Posiblemente, la cadena transportadora de electrones posee algunas

peculiaridades (Cazzulo, 1992), por ejemplo, se ha propuesto que uno de los

principales donadores de electrones a la cadena es el succinato, en lugar del

NADH (Denicola-Seoane y col., 1992; Bochud-Allemann y Schneider, 2002),

aunque ahora se sabe que los tripanosomátides si poseen una NADH-

deshidrogenasa mitocondrial, el punto usual de entrada de los electrones a la

cadena transportadora (Tielens y Van Hellemond, 1998).

19

Recientemente, experimentos con trypomastigotes procíclicos de T. brucei han

indicado que estos no utilizan el ciclo de Krebs para generar energía (por lo

menos en un medio de cultivo que contiene tanto aminoácidos como glucosa,

en condiciones aeróbicas) aunque el funcionamiento de oxidasas terminales

sería esencial. Los autores proponen un modelo en que la prolina es

transformada a succinato, utilizando solo una parte del ciclo de Krebs,

produciendo NADH y ATP (van Weelden y col., 2002), pero no se considera el

consumo de otros aminoácidos ni el metabolismo en ausencia de glucosa.

En todo caso, el hecho de que se excreten productos parcialmente oxidados

podría indicar que la mitocondria es incapaz de metabolizar los productos de la

glicólisis y/o del catabolismo de los aminoácidos de manera completa a CO2 y

H2O, no por falta de componentes enzimáticos, sino por la alta velocidad de

producción de los metabolitos que tendrían que ser oxidados, provenientes

principalmente de una glicólisis poco regulada (Urbina, 1994, Cazzulo, 1992).

De hecho, una de las explicaciones para la producción de acetato es la

deacilación del acetil-CoA cuando este se encuentra en exceso (Engel y col.,

1987, Cazzulo, 1992). Sin embargo, recientemente se ha propuesto que la

enzima acetato:succinato CoA-transferasa es la responsable de la secreción de

acetato en tripanosomátides. La subsiguiente eliminación de la CoA del

succinato por la succinato sintasa produciría ATP en la mitocondria (Van

Hellemond y col., 1998, Hannaert y col., 2003b). De acuerdo con esto,

Bochud-Allemann y Schneider (2002), muestran que la fosforilación a nivel de

sustrato, en la mitocondria, es una de las principales formas de generar

energía, siendo más importante, posiblemente, que la fosforilación oxidativa

que utiliza la cadena transportadora de electrones. Parte de esta producción de

ATP sería a través del ciclo acetato:succinato coA, y otra parte directamente a

través de la succinil-coA sintetasa. Esta última enzima sería posiblemente

esencial en las formas procíclicas de T. brucei, según experimentos con RNAi

(Bochud-Allemann y Schneider, 2002).

20

Engel y col. (1987) sugieren que los amastigotes de T. cruzi presentan un

metabolismo glicolítico, ya que poseen altos niveles de enzimas glicolíticas, un

rápido consumo de glucosa y deficiencia en algunas enzimas del ciclo de Krebs

y de la cadena transportadora de electrones, además de la falta de excreción

de amonio. Sin embargo, se debe tener en cuenta que estos experimentos

fueron llevados a cabo con formas similares a amastigotes, obtenidas in vitro,

por corto tiempo y en un medio que posiblemente no refleje las condiciones

bajo las que se encuentra esta forma, dentro de las células del hospedador

vertebrado.

Posiblemente, una de las características debatidas sobre el metabolismo en

tripanosomátides, es la existencia de la ruta gluconeogénica. En estos

organismos, se considera que no hay carbohidratos de reserva, excepto

posiblemente en Leishmania, donde se ha encontrado un polisacárido de

manosa (Blum, 1993). No obstante, las células son capaces de crecer en

medios pobres en glucosa (en los que continúan produciendo proteínas

glicosidadas, si bien en menores cantidades), y siguen creciendo cuando la

glucosa del medio se ha agotado (Urbina, 1994; Morris y col., 2002). Otros

experimentos muestran que los promastigotes de T. brucei crecen más rápido

en presencia de un exceso de aminoácidos, y bajo estas condiciones pareciera

disminuir el consumo de glucosa (ter Kuile, 1997). Este crecimiento

probablemente requiere de síntesis de nucleótidos, para lo cual es necesario el

funcionamiento de la vía de las pentosas fosfato, dependiente de glucosa-6-

fosfato.

Las actividades de las enzimas de la ruta gluconeogénica, fructosa bisfosfatasa

y glucosa 6-fosfatasa no han sido detectadas (Cronín y col., 1989), sin

embargo, recientemente se ha reportado las existencia de genes candidatos a

codificar estas enzimas (Michels y col., 2000; Morris y col., 2002; Hannaert y

col., 2003b). La otra enzima de esta ruta, la PEPCK, se encuentra localizada en

los glicosomas (Urbina, 1994, Besteiro y col., 2002; Hannaert y col., 2003b).

21

En Leishmania (aunque no en otros tripanosomátides), ciertos reportes indican

que las células incorporan acetato y el carbono proveniente del ácido graso

laureato en sus reservas de manan. Esto, implica la existencia del ciclo del

glioxilato. Además, se ha encontrado que las dos enzimas particulares de la

ruta, citrato liasa y malato sintasa están presentes (Keegan y Blum, 1993).

Esta síntesis de carbohidratos a partir de acetato o ácidos grasos implica,

además de la existencia del ciclo del glioxilato, la presencia de la ruta

gluconeogénica.

Glicólisis y el glicosoma

Como se ha mencionado antes, una de las peculiaridades de los

tripanosomátides es la compartamentalización de parte de la ruta glicolítica en

una organela, el glicosoma. Esta organela es similar a los peroxisomas de otros

organismos en diversos aspectos, como la maquinaria de importación de

proteínas, proceso de biogénesis y presencia de ciertas rutas metabólicas como

la β-oxidación de ácidos grasos y la biosíntesis de esteroles (Opperdoes y

Borst, 1977; Hannaert y col, 2003b).

Los glicosomas parecen ser esenciales, ya que la eliminación de las proteínas

de la maquinaria de importación de proteínas es letal, por lo menos para T.

brucei, tanto para los trypomastigotes sanguíneos como para las formas

procíclicas presentes en el insecto (Guerra-Giraldez y col.,2002).

Dependiendo de la especie y el estadío morfológico de los tripanosomátides,

distintas enzimas del metabolismo, y las primeras 6 o 7 enzimas de la ruta se

encuentran compartamentalizadas. Principalmente varía la presencia de la

fosfoglicerato kinasa (PGK) y posiblemente de rutas de biosíntesis (Hannaert y

col., 2003b; Michels y col., 2000).

Actualmente se considera que la membrana del glicosoma es poco permeable a

la mayoría de los intermediarios glicolíticos, adenin nucleótidos y nicotin adenin

22

nucleótidos. Por lo tanto, se cree que debe existir un balance entre estos

compuestos, por ejemplo, esto implica que se debe mantener la relación

ATP/ADP, y la relación NAD(P)H/NAD(P)+ (Bakker y col., 1997; Michels y col.,

2000; Hannaert y col., 2003b).

Durante los últimos años, se han propuesto diversas hipótesis sobre el por qué

de la existencia del glicosoma. Entre ellas se consideran el aumento del flujo

de la ruta, ya que se evita la difusión de los intermediarios (Aman y col., 1985,

Michels y col., 2000) y la separación de rutas que podrían competir con la

glicólisis, utilizando los mismos intermediarios, como la ruta de las pentosas

fosfato y la gluconeogénesis (Michels y col, 2000). Sin embargo, actualmente

estas dos hipótesis han sido puestas en duda, debido a que, según modelos

metabólicos, el flujo glicolítico parece estar limitado por las características de

las enzimas, al parecer, principalmente por el transportador de glucosa hacia la

célula, por lo menos en la forma sanguínea de T. brucei (Bakker y col., 1997;

Bakker y col., 1999; Michels y col., 2000; Hannaert y col., 2003b). Además

también se ha encontrado que enzimas de la ruta de las pentosas fosfato se

encuentran parcialmente compartamentalizadas en los glicosomas (Duffieux y

col., 2000; Heise y Opperdoes, 1999; Michels y col., 2000), así como enzimas

de la gluconeogénesis, como la PEPCK, y posiblemente la fructosa 1,6-

bisfosfatasa, cuyo gen posee una señal de importación al glicosoma (Michels y

col., 2000; Morris y col., 2002; Hannaert y col., 2003b).

Más recientemente se ha propuesto que la compartamentalización existe para

evitar la producción de altas concentraciones de hexosas-fosfato (Bakker y

col., 2000; Furuya y col., 2002), aunque esto último podría ser una

consecuencia de las propiedades de las enzimas de la glicólisis (principalmente

HK y PFK), relacionadas con la compartamentalización y no una causa directa

del fenómeno. También se cree que la presencia de glicosomas podría proveer

de flexibilidad metabólica a los tripanosomátides, lo que permitiría a estos

últimos adaptarse a condiciones ambientales (como disponibilidad de

sustratos) muy diferentes, de una manera exitosa (Hannaert y col., 2003b).

23

Modelo del metabolismo intermediario

La presencia de la ruta glicolítica en los glicosomas, le da ciertas peculiaridades

al metabolismo. En el modelo más sencillo, el del glicosoma de los

trypomastigotes sanguíneos de T. brucei, la ruta se encuentra

compartamentalizada hasta la PGK. Por lo tanto, el ATP consumido por la

hexokinasa y la fosfofructokinasa es regenerado por la PGK, manteniéndose el

balance de ATP/ADP dentro del glicosoma (Hannaert y col., 2003b; Michels y

col., 2000, Bakker y col., 1997).

El NAD+ reducido por la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa es reoxidado

por una glicerol-3-fosfato deshidrogenasa glicosomal, produciendo glicerol-3-

fosfato (G3P), que es transportado a la mitocondria, donde es transformado de

nuevo a dihidroxiacetona fosfato (DHAP) por una glicerol-3-fosfato oxidasa.

Los electrones son transferidos al oxígeno, en la mitocondria, a través de

ubiquinona y una oxidasa terminal denominada oxidasa alternativa de

trypanosoma (TAO). Este es un sistema lanzadera de DHAP y G3P entre

mitocondria y glicosoma. En condiciones de anaerobiosis, cuando la TAO no

puede funcionar, se acumula G3P dentro del glicosoma y se produce glicerol y

ATP, a través de una glicerol kinasa, manteniéndose el balance energético

dentro de la organela. No obstante, de esta manera sólo se obtiene un mol ATP

en el citosol por cada mol de glucosa, a través de la reacción catalizada por la

piruvato kinasa. El piruvato y el glicerol son excretados al medio (Hannaert y

col., 2003b; Michels y col., 2000, Bakker y col., 1997; Tielens y Van

Hellemond, 1998; Verlinde y col., 2002).

En el resto de los organismos, el modelo es más complicado: en los

trypomastigotes procíclicos de T. brucei la PGK se encuentra fuera del

glicosoma, por lo tanto, el balance de ATP/ADP no se mantiene a este nivel. Lo

que se propone es que el PEP, producido por la enolasa en el citosol, reentra al

glicosoma, donde es convertido en oxaloacetato por la PEPCK o en piruvato por

la piruvato-fosfato dikinasa (PPDK). Ambas reacciones producen ATP,

24

reestableciendo el balance energético (considerando que todo el PEP producido

entra de nuevo al glicosoma) con la particularidad de que la PPDK utiliza AMP y

pirofosfato para producir el ATP. El balance de NAD+/NADH puede ser

reestablecido de diversas formas: por la misma vía que en los trypomastigotes

sanguíneos (aunque algunos autores no lo consideran), o a través de la malato

deshidrogenasa glicosomal, que cataliza la reducción dependiente de NADH del

oxaloacetato a malato. El malato puede salir del glicosoma y ser convertido a

piruvato por la enzima málica en el citosol. El piruvato podría entonces ser

oxidado en la mitocondria para producir acetil-CoA (Hannaert y col., 2003b;

Besteiro y col., 2002; Coustou y col., 2003; Bringaud y col., 1998).

Además, en el glicosoma el malato puede ser convertido en fumarato por la

fumarasa y este es a su vez reducido a succinato por una fumarato reductasa

glicosomal dependiente de NADH. La actividad de esta última enzima explicaría

la excreción de succinato por parte de la mayoría de los tripanosomátides,

como producto final de la glicólisis (Besteiro y col., 2002). Esta enzima

ayudaría al mantenimiento del balance redox en caso de que no todo el PEP

reentre al glicosoma o de que parte de este sea convertido en piruvato por la

PPDK. Un esquema que resume el metabolismo energético de T. cruzi se

muestra en la figura 4.

Sin embargo, este modelo no considera varios factores: en el glicosoma

existen otras rutas además de la glicólisis. Por ejemplo, una proporción de la

actividad de la parte oxidativa de la ruta de las pentosas fosfato se encuentra

en el glicosoma. Esta ruta consumiría glucosa-6-fosfato producida por la HK,

sin embargo no regeneraría el ATP invertido y produciría NADPH. La biosíntesis

de ergoesterol y nucleótidos que ocurre en el glicosoma también requiere ATP.

Según el modelo presentado arriba, no hay producción neta de ATP en el

glicosoma, y de hecho, es necesario que todo el PEP reentre para que no haya

un déficit en el balance. Así, no habría producción neta de ATP en el citosol por

la piruvato kinasa (a pesar de que esta actividad se encuentra por lo menos en

las formas procíclicas de T. brucei).

25

En T. cruzi en particular, existe otra enzima, además de la PK que utiliza PEP,

la PEP-mutasa, que se encuentra localizada, por lo menos parcialmente en el

citosol. Esta enzima cataliza la conversión de PEP a fosfonopiruvato, que es

posteriormente convertido en 2-aminoetilfosfonato (AEP) y posteriormente

incorporado a macromoléculas, como fosfonolípidos y proteoglicanos. Además,

aparentemente, en T. cruzi, el AEP puede sustituir a la etanolamina en la unión

de proteínas a anclas de glicosilfosfatidilinositol (GPI), y parece sustituir a la

glucosamina en estas mismas anclas. La expresión de mucinas y otras

glicoproteínas asociadas a la superficie de los parásitos por anclas de GPI

posiblemente es importante para la supervivencia e invasión del parásito en el

hospedador vertebrado, por lo que esta ruta consumidora de PEP es

posiblemente muy importante para T. cruzi (Sarkar y col., 2003).

Parte de estos problemas (relacionados con el balance energético dentro del

glicosoma), se resuelven si se considera la evidencia de que en los

trypomastigotes procíclicos de T. brucei y por lo menos en los epimastigotes de

T. cruzi, existen isoenzimas de la PGK dentro del glicosoma. En T. cruzi,

existen tres tipos de PGK: la PGKB que se encuentra en el citosol, y según

mediciones in vitro contribuiría con la mayor parte de la actividad, y la PGKA y

PGKC dentro del glicosoma (Concepción y col., 2001a; Hannaert y col.,

2003b). Este hecho implica que al menos parte del balance energético se

mantendría a este nivel, por lo tanto no es necesario que todo el PEP reentre al

glicosoma y posibilita la producción neta de ATP dentro del glicosoma. Esto

último, explicaría la existencia de rutas de síntesis que consumen ATP y de la

vía de las pentosas fosfato dentro del glicosoma. Otro mecanismo de

suministrar ATP al glicosoma, sería a través de la PPDK y la adenilato kinasa

glicosoma (Besteiro y col., 2002; Bringaud y col., 1998)

26

Figura 4. Esquema del metabolismo intermediario de Trypanosoma cruzi.

27

El balance redox puede ser mantenido mediante los mecanismos ya explicados.

El sistema de la glicerol-3-fosfato oxidasa mitocondrial y la glicerol-3-fosfato

deshidrogenasa glicosomal, presente en T. cruzi (Concepción y col., 2001b)

junto con la malato deshidrogenasa y la fumarato reductasa podrían reoxidar

el NADH producido por la glicealdehido-3-fosfato deshidrogenasa. El NADPH

producido por la ruta de las pentosas fosfato y por la β-oxidación de ácidos

grasos posiblemente sería reoxidado durante reacciones de las rutas se

biosíntesis presentes dentro de los glicosomas.

En todo caso, es importante resaltar la relevancia del tráfico de PEP, el

producto de la enolasa, ya que este jugaría un rol determinante, junto con la

PGK, en el mantenimiento del balance energético dentro del glicosoma y en la

distribución de la producción neta de ATP, entre el citosol y el glicosoma.

Además, la producción de PEP sería absolutamente necesaria para la PEPM.

La posibilidad de que la enolasa contribuya de alguna manera a la distribución

de su producto la hace un punto de estudio sumamente interesante en el

metabolismo de los tripanosomátides.

Estas características de la distribución del PEP y la disposición de las rutas que

lo consumen, no presentes en mamíferos, podrían hacer pensar que la enolasa

posee propiedades regulatorias particulares e interesantes, e inclusive hacen

pensar en ella como un posible blanco quimioterapéutico para el tratamiento

de la enfermedad de Chagas y otras tripanosomiasis.

28

Enolasa (2-fosfo-D-glicerato hidrolasa, EC 4.2.1.11)

Características generales

La enolasa es una enzima que cataliza la deshidratación del 2-fosfoglicerato

(2PGA) para formar fosfoenolpiruvato (PEP), en la ruta glicolítica, y la reacción

inversa en gluconeogénesis (figura 5a). La reacción tiene un cambio de energía

libre pequeño, de aproximadamente 1Kcal/mol. La actividad catalítica es

dependiente de la presencia de cationes divalentes en el sitio activo de la

enzima, preferiblemente magnesio (Wold y Ballau, 1957a; Wold y Ballau,

1957b; Lee y Nowak, 1992a; Lebioda y Stec, 1991).

Prácticamente todas las enolasas caracterizadas hasta ahora tienen un peso

molecular de entre 40 y 50 kDa por subunidad. Estas normalmente se agregan

en dímeros, de peso molecular de 80 a 100 kDa, aunque enolasas octaméricas

(compuestas de tetrámeros de dímeros) han sido caracterizadas en procariotas

(Cárdenas y Wold, 1971; Schurig y col., 1995; da Silva y col. 2003, ver Tabla

1). A pesar de que existen reportes de monómeros activos de enolasa (Faller y

col., 1977; Zhang y col., 1997), lo más probable es que la estructura dimérica

sea esencial para la actividad catalítica (Kornblatt y col., 1997).

Varias estructuras cristalográficas de la enolasa bajo distintas condiciones y

para varios organismos han sido determinadas. Estas, junto con estudios de

características cinéticas y fisicoquímicas, y de mutagénesis sitio dirigida, han

ayudado a entender las propiedades estructurales y el mecanismo de acción de

la enolasa, si bien algunos puntos permanecen todavía sin esclarecerse del

todo (Poyner y col., 1997; da Silva y col., 2003).

La reacción de la enolasa es interesante, ya que involucra la substracción de

un protón poco acídico del carbono 2 del 2PGA y la eliminación de un grupo de

salida pobre, el hidroxilo del carbono 3. Diversos estudios, como los de

intercambio isotópico realizados por Dinovo y Boyer (1971), mostraron que la

29

reacción de la enolasa probablemente ocurre a través de un intermediario

carbanión, formado por la eliminación del protón del carbono 2 del 2PGA por

una base de la enzima. Posteriormente ocurre la eliminación del hidroxilo del

carbono 3, a través de un ácido de la enzima y la formación del doble enlace

entre los carbonos 2 y 3, para formar PEP (Lebioda y Stec, 1991; Duquerroy y

col., 1995; Poyner y col., 2001). Un esquema de este proceso se muestra en la

figura 5a.

Estudios cinéticos y algunas estructuras indican que existen por lo menos dos

sitios de unión a cationes divalentes en cada monómero de enolasa. Uno de

estos sitios se encuentra ocupado en ausencia de sustrato, y ha sido

denominado “sitio conformacional”. La unión de cationes a este sitio parece ser

importante para la estabilidad del dímero de enolasa. El sitio conformacional es

aparentemente poco selectivo, y diversidad de cationes divalentes se unen a él

(Lebioda y col., 1989; Lee y Nowak, 1992 a). El segundo sitio, denominado

“sitio catalítico”, es muy probablemente ocupado luego de la unión del

sustrato, lo que parece ser esencial para la actividad catalítica de la enolasa

(Poyner y col., 2001; Faller y col., 1977; Lebioda y Stec, 1991).

Es interesante el hecho de que a pesar de que la enolasa es una enzima que

posee un solo sustrato, se ha propuesto un mecanismo ordenado para su

actividad catalítica. La apoenzima, une un ión de Mg2+ por monómero, en el

sitio conformacional, posteriormente ocurre la unión del sustrato y luego

secuencialmente, se une el segundo ión al sitio catalítico, ocurre la reacción y

se libera el ión del sitio catalítico. Por último se disocia el producto, quedando

la enzima unida a Mg2+ en el sitio conformacional (Faller y col, 1977; Poyner y

col, 2001). Un esquema de este mecanismo, para una subunidad de enolasa,

se muestra en la figura 5b.

Hasta ahora, para todas las enolasas, la mayor activación se obtiene cuando el

catión divalente es Mg2+. Aunque otros cationes, como Zn2+, Mn2+,

Fe(II)2+,Cd2+, Co+2, y Ni2+ pueden activar a la enzima (en forma decreciente

30

según el orden presentado) para catalizar la reacción (e inclusive poseen

mayor afinidad por la enzima que el magnesio) en presencia de Mg+2 las

concentraciones crecientes de los primeros producen curvas hiperbólicas de

inactivación. En general para todos los cationes, incluyendo Mg+2, las curvas de

actividad versus log [catión] tienen forma de campana. Esto implica que a

concentraciones altas, los cationes divalentes tienen un efecto inhibitorio

(Cárdenas y Wold, 1971; Lee y Nowak, 1992 b; Kustrzeba-Wócicka y Golczak,

2000; Pancholi, 2001).

Figura 5. Reacción catalizada por la enolasa. (a.) mecanismo químico. (b.) mecanismo

enzimático, se muestra un monómero de enolasa.

Una de las explicaciones a este fenómeno, ha sido la proposición de un tercer

sitio de unión a metales que tendría un efecto inhibitorio sobre la actividad

enzimática (Faller y col., 1977; Brewer y col., 2003; Lee y Nowak, 1992a). La

evidencia de estudios de unión de Mg+2 es ambigua para probar esta hipótesis,

y este sitio no había aparecido en las estructuras cristalográficas (Poyner y

col., 2001), hasta hace poco. La estructura de la enolasa de T. brucei muestra

un tercer sitio de unión a metales que podría representar el hipotético tercer

sitio inhibitorio (da Silva y col., 2003).

31

Otra explicación para este fenómeno, es sencillamente la acción de masas en

el mecanismo ordenado propuesto para la reacción catalizada por la enolasa

(mostrado en la figura 6b). Un exceso de Mg+2 dificultaría la salida del

producto y por lo tanto provocaría un efecto de inhibición en la actividad

enzimática (Poyner y col., 2001).

Las primeras estructuras cristalográficas determinadas, para la enolasa de

levadura (Lebioda y col., 1989) y langosta (Duquerroy y col., 1995), son muy

parecidas y muestran, como es de esperarse según las mediciones de pesos

moleculares nativos, que la enolasa se encuentra como un dímero de

subunidades idénticas. Este dímero presenta simetría bilateral y cada

subunidad tiene dimensiones de 60x55x45 Å (para la enolasa de levadura).

Estos estudios también muestran que cada subunidad consta de dos dominios

y una corta cola C-terminal (aminoácidos 421-436 de la estructura de

levadura) (Lebioda y col., 1989).

El dominio principal, ubicado hacia el C-terminal (aminoácidos 143-420 en la

estructura de levadura), es un barril α+β con 8 hélices α y 8 hebras β. La

topología de este barril es distinta al del barril típico de la triosa fosfato

isomerasa (TIM), ya que en lugar de intercalarse las hebras β con las hélices α,

y de ser todas las hélices paralelas y todas las hebras paralelas entre sí (y

antiparalelas unas respecto a las otras), en el barril de enolasa, las primeras

dos hebras β están seguidas y son antiparalelas, al igual que las dos primeras

hélices. El patrón usual del barril de la TIM sigue después de esta diferencia,

por lo que la topología del barril de la enolasa se denomina ββαα(βα)6 en lugar

de (βα)8. En el fondo de este barril se encuentra el sitio activo de la enzima

(Lebioda y col., 1989).

El otro dominio, formado por el N-terminal (aminoácidos 1-142 para la

estructura de la enolasa de levadura), envuelve al dominio principal. La

estructura puede describirse como β3α4, ya que consta de una lámina β de tres

hebras antiparalelas, seguidas de una vuelta que se extiende hacia la entrada

32

del sitio activo y de cuatro hélices α. (Lebioda y col., 1989, Duquerroy y col,

1995). Un esquema de la estructura de la enolasa de levadura donde se

señalan algunas de las características estructurales anteriormente

mencionadas se muestra en la figura 6.

Los contactos entre las dos subunidades ocurren principalmente entre átomos

de la cadena principal del dominio N-terminal de una subunidad y los residuos

de la última hélice α del barril de la otra subunidad. Existen varios contactos

iónicos y hay pocas interacciones hidrofóbicas entre las dos subunidades

(Lebioda y col., 1989)

Figura 6. Esquema de la estructura de la enolasa de levadura y algunas características.

En cuanto a los residuos involucrados en el sitio activo, todavía existen ciertas

controversias. Pruebas con agentes químicos han mostrado que, posiblemente,

33

grupos carboxilo y las cadenas laterales de los aminoácidos arginina, histidina

y tirosina estarían relacionados con el sitio activo. Todos estos aminoácidos se

encuentran cerca del sitio activo de la enolasa de levadura, excepto tirosina.

Adicionalmente, se encuentran cerca de este sitio dos residuos de lisina.

(Lebioda y col., 1989). El mecanismo propuesto hasta ahora, basado en

diversas estructuras cristalográficas (principalmente de la enolasa de levadura)

se resume a continuación.

El primer ión de Mg2+ se une a la apoenzima, al sitio catalítico (o sitio I),

aparentemente coordinado a tres residuos acídicos: Asp246, Glu295 y Asp320

(Larsen y col., 1996). Esta unión no parece inducir cambios conformacionales

importantes en la estructura de la proteína, que se encuentra en conformación

“abierta” (da Silva y col., 2003). Posteriormente se une el sustrato, el grupo

carboxilo de este interactúa con Gln167, Lys396 y el ión de Mg2+, mientras que

el grupo fosfato se une a Arg374. Aparentemente aquí ocurren ciertos cambios

conformacionales: una vuelta (o “loop”), formada entre los residuos Ser36-

His43 (loop 1) se mueve, produciendo una conformación intermedia entre la

“abierta y la “cerrada” que permitiría la unión del segundo ión de Mg2+ al sitio

catalítico o sitio II, formado posiblemente, por el grupo carboxilo y el grupo

fosfato del sustrato, junto con el hidroxilo de Ser39 (perteneciente al loop1).

Posteriormente, otros dos loops, Val153-Phe169 (loop 2) y Ser250-Gly277

(loop 3), se mueven produciendo la conformación “cerrada” de la enzima

(Larsen y col., 1996; Zhang y col., 1997; da Silva y col., 2003).

Aparentemente, His159 en la vuelta 2, dona un protón al grupo fosfato. Esto,

junto con la interacción con Arg374 y el Mg2+ unido al sitio catalítico,

probablemente hace que el grupo fosfato del 2PGA, quede sobreneutralizado,

facilitando la salida del protón del carbono 2 (Zhang y col., 1997; Brewer y

col., 2003).

La eliminación de la molécula de agua del 2PGA debe ser anti, esto es, el

protón del carbono 2 y el hidroxilo del carbono 3 deben salir de lados opuestos

respecto al plano de los átomos de carbono del 2PGA. De forma que los

34

residuos propuestos para la eliminación de estos grupos deberían estar en

lados opuestos del sustrato (Lebioda y Stec, 1991; Poyner y col., 2001).

Lys345 es posiblemente la base que abstrae el protón del carbono 2, mientras

que Glu211, o un protón compartido por Glu211 y Glu168, funcionan como el

ácido que promueve la eliminación del grupo hidroxilo del carbono 3 del 2PGA

(Zhang y col., 1997; Poyner y col., 2001). Otros pares base/ácido de residuos

propuestos, son His156/Lys396 e His159/His373 (Poyner y col., 2001; da Silva

y col., 2003).

Otra de las características generales de las enolasas es su inhibición por

fluoruro, y sobre todo, un efecto sinérgico en presencia de fosfato inorgánico

(Cárdenas y Wold, 1971). Los mecanismos propuestos para esta inhibición son

contradictorios en la literatura. En varios trabajos se propone que la inhibición

por fluoruro es competitiva en presencia de fosfato y no competitiva en

ausencia de fosfato (Pietkiewicz y col., 1983; Schurig y col., 1995), aunque

también se ha reportado un mecanismo no competitivo para la inhibición en

presencia de fosfato y mecanismo competitivo para la unión en ausencia de

fosfato (Kustrzeba-Wójcicka y Golckzak, 2000). Más aun, en algunos casos se

reporta que el fluoruro por sí solo no tiene efecto inhibitorio (Cárdenas y Wold,

1971). En todo caso, se determinó una estructura cristalina del complejo

enolasa-magnesio-fluoruro-fosfato, donde se observa una conformación

cerrada, que explicaría la inhibición por fluoruro en presencia de fosfato

(Lebioda y col., 1993).

Un estudio comparativo realizado con enolasas de distintos organismos

(Cárdenas y Wold, 1971), mostró que las propiedades catalíticas de las

enolasas son bastante similares. Los Km para 2PGA, se encuentran en un rango

entre 40 y 160 µM. Existen ciertas diferencias apreciables en las actividades

específicas de las distintas enzimas y en los pH óptimos. Comparaciones de

varios trabajos muestran diferencias substanciales entre las enolasas de

distintos organismos (ver Tabla 1) e inclusive entre las enolasas de un mismo

organismo. Esto puede deberse a variaciones en las metodologías

35

experimentales, o a verdaderas variaciones en las propiedades catalíticas de la

enolasa.

La enolasa es una de las proteínas más abundantemente expresadas en el

citosol de diversos organismos (Pancholi, 2001). No se ha encontrado que las

enolasas tengan propiedades regulatorias (Lebioda y col., 1898). Sin embargo,

los niveles de expresión de enolasa varían en distintos organismos y en

muchos de ellos existen diversas isoenzimas. En vertebrados, existen tres

genes que codifican a tres subunidades distintas de la enolasa: α, β, y γ. La α-

enolasa se encuentra en variedad de tejidos, la β es la principal forma en el

músculo, y la γ-enolasa suele encontrarse exclusivamente en tejido nervioso.

La isoenzima α puede formar heterodímeros con las formas β y γ, sin embargo,

el dímero βγ no se ha aislado (posiblemente debido a que estas isoenzimas no

se expresan en los mismos tejidos) aunque puede ser producido a partir de los

componentes purificados (Pancholi, 2001). La expresión de estas isoenzimas

también parece variar durante el desarrollo. Por lo menos, en el músculo de

ratón, la α-enolasa es la más expresada en el feto, y va siendo reemplazada

por la isoforma β (Merkulova y col, 1997).

En plantas, también hay evidencias de múltiples isoenzimas. En algunos casos

(junto con Euglena gracilis), se han encontrado, como para otras enzimas

glicolíticas, formas distintas en el citosol y dentro del cloroplasto. Además

existen varios genes de enolasa y otras evidencias de isoenzimas (Miernyc y

Dennis, 1984; Anderson y col., 1997, Hannaert y col., 2000). En levadura,

existen dos genes que codifican para enolasa, y se han aislado tres isoenzimas.

La expresión de estas parece depender de la fuente de carbono que utilizan las

células (Entian y col., 1983).

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También se ha observado que condiciones externas pueden modular la

expresión de la enolasa. De hecho, esta enzima ha sido caracterizada como

proteína de stress hipóxico (Aaronson y col., 1995) y de stress por calor, ya

que se identificó que la HSP48 de levadura es enolasa (Pancholi, 2001).

Además, existen diversos reportes de que la enolasa puede sufrir

modificaciones postraduccionales variadas que podrían modular su actividad

(Pancholi, 2001, Fratelli y col., 2001; Boël y col., 2004).

Estudios recientes han mostrado que varias enzimas glicolíticas tienen otras

funciones, además de su rol en el metabolismo energético. De hecho, la

enolasa es considerada actualmente como una proteína multifuncional

(Pancholi, 2001). Identificada como τ-cristalina, forma parte del lente ocular en

algunos vertebrados, una isoforma producida por traducción alternativa del

mRNA de enolasa está involucrada en la regulación transcripcional del oncogén

c-myc en humanos, se ha identificado como uno de los componentes del

degradosoma (complejo encargado de la degradación de los mRNAs) de E. coli,

y parece tener importancia en diversos procesos patológicos como cáncer,

enfermedades neurológicas, enfermedades autoinmunes e invasividad de

organismos patógenos y alergias e inmunosupresión causadas por estos

(Pancholi, 2001; Leroy y col., 2002).

La relación con procesos patológicos parece deberse al hecho de que la enolasa

se encuentra en la superficie de diversos organismos, como Streptococcus,

levadura, Candida, e inclusive humanos, entre otros. No es claro como es

transportada la enolasa a la superficie de estas células, ya que esta proteína

no posee ninguna de las señales típicas de exportación. En cualquier caso,

parece actuar como receptor de plasminógeno y/o plasmina (Pancholi y

Fischetti, 1998; Edwards y col., 1999; Pancholi, 2001; Jong y col., 2003; Miles

y col., 1990). El plasminógeno (Plg), una glicoproteína de 92 kDa, es el

zimógeno precursor de la plasmina, la principal proteasa del sistema

fibrinolítico (Castellino, 1981). La unión de Plg a la superficie de la célula

parece estar involucrada en procesos de invasión de tejidos de organismos

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patógenos y células cancerosas (Pancholi y Fischetti, 1998; Pancholi, 2001;

Jong y col., 2003; Miles y col., 1990).

Además de la principal ubicación citosólica de la enolasa y de la localización en

superficie en varios organismos, parecen existir otras ubicaciones posibles para

esta enzima. Se ha identificado el heterodímero αγ de enolasa en terminales

sinápticos en rata (Ueta y col., 2004), por lo menos la isoforma de enolasa que

regula la expresión de C-myc debe encontrarse en el núcleo (Pancholi, 2001),

y recientemente se ha descrito la asociación de varias enzimas de la ruta

glicolítica, incluyendo enolasa, a la superficie externa de las mitocondrias en

células de Arabidopsis (Giege y col., 2003).

Enolasa en tripanosomátides

Las enolasas de tripanosomátides habían sido muy poco estudiadas hasta hace

poco. Los primeros estudios de ubicación subcelular mostraron que la enolasa

se encontraba fuera del glicosoma, en el citosol, junto con la PGM y la PGK

(Opperdoes y Borst, 1977; Taylor y Gutteridge, 1987; Hannaert y col., 2003b).

Los modelos matemáticos de metabolismo de los trypomastigótes procíclicos

de T. brucei, consideran en equilibrio la reacción catalizada por la enolasa (y

por la PGM), y por lo tanto no consideran que esta pueda tener algún control

sobre el flujo de la ruta, excluyéndola como posible blanco quimioterapeútico

(Bakker y col., 1997; Bakker y col., 1999). Esto, posiblemente basado en

observaciones en otros organismos, ya que para esa fecha, no se había

determinado ningún parámetro cinético para la enolasa de ningún

tripanosomátide.

Las enzimas citosólicas de la ruta glicolítica en general, no han sido muy

estudiadas, posiblemente debido a que se consideraba que tenían pocas

particularidades que pudiesen ser explotadas para quimioterapia. Sin embargo,

se ha encontrado que estas proteínas citosólicas si poseen ciertas

particularidades, por ejemplo, la PGM de tripanosomátides es independiente

Ubicación Subcelular, purificación, caracterización y ...

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