PRACTICAS EN BIOQUIMICA: Precipitación Diálisis Ultra-centrifugación

PRACTICAS EN BIOQUIMICA: Precipitación

DiálisisUltra-centrifugación

PURIFICACION DE PROTEINAS

¿Por qué se necesita purificar a las proteínas?

• Es un paso básico para conocer su función:– Secuencia de AA– Relaciones evolutivas– Función bioquímica– Estudio de la estructura terciaria (formación de

cristales)

• Dicho bioquímico: “No desperdicies pensamientos puros en proteínas impuras”

Purificación de Proteínas

• Objetivo:– Lograr aislar la proteína de interés

• Una proteína de interés puede existir en muy pequeña proporción dentro de la muestra original


• Ensayo de actividad– Debe ser una prueba específica para la

proteína de interés– A más específico el ensayo, mejor calidad

de purificación

¿Cómo reconocer a la proteína que se busca?

• Es importante tener un punto de referencia: cantidad total de proteínas en la muestra– Métodos para la determinación de proteínas

• Actividad específica = actividad de la proteína de interés / cantidad total de proteína


• Extracción de las proteínas de las células

– Fraccionar las células en sus componentes• Determinar en dónde se encuentra en mayor

cantidad la proteína de interés• Centrifugación diferencial


• Estrategias de separación:– Por solubilidad

– Por tamaño

– Por carga

– Por afinidad de unión

• Generalmente la purificación involucra varios de estas estrategias en secuencia

• El objetivo es llegar a purificar varios miligramos de proteína:– Estructura tridimensional

– Mecanismo de acción

Métodos de Separación

• Métodos que separan la proteína entre 2 fases:– Generalmente (pero no siempre):

• Un sólido (precipitado)• Un líquido (sobrenadante)

• Métodos que separan proteínas a diferentes tasas de movimiento sobre algún material, como una columna de cromatografía o electroforesis

• Métodos que separan las proteínas por filtración:– Las proteínas pasan por orificios muy pequeños

• Filtros• Columnas

Métodos de Separación

• Los métodos de 2 fases separan las proteínas con menor eficiencia que los métodos de tasa de movimiento

• La ventaja es que son más fáciles de aplicar en grandes cantidades de material

• Por eso son utilizados en etapas iniciales de purificación, antes de aplicar métodos que son más difíciles de realizar con volúmenes grandes de muestra

PRECIPITACION DE PROTEINAS

Interacciones Moleculares en la Precipitación de Proteínas

• Durante la precipitación ocurre que las proteínas se “pegan” entre sí

• Fuerzas que intervienen en la estabilidad de una proteína en solución:– Fuerzas electrostáticas– Efecto hidrofóbico– Interacciones de Van der Waals– Puentes de hidrógeno

Precipitación de Proteínas

• En disolución acuosa, los residuos hidrofóbicos de las proteínas se acumulan en el interior de la estructura, mientras que en la superficie aparecen diversos grupos con carga eléctrica, en función del pH del medio.

• En torno a los grupos cargados, los dipolos del agua se orientan conforme a la carga eléctrica de cada grupo, de tal manera que la proteína presenta una capa de solvatación formada por el agua de hidratación, que es el agua retenida por las cargas eléctricas de la superficie de las proteínas.

• Los AA polares sin carga también se disponen en la superficie, donde interaccionan con el agua mediante puentes de hidrógeno.


• Cualquier factor que modifique la interacción de la proteína con el disolvente disminuirá su estabilidad en disolución y provocará la precipitación. – desaparición total o parcial de la envoltura acuosa– neutralización de las cargas eléctricas de tipo repulsivo– ruptura de los puentes de hidrógeno

• Esto ocurre porque se facilita la agregación intermolecular


• La precipitación suele ser consecuencia del fenómeno llamado desnaturalización.


• Se llama desnaturalización de las proteínas a la pérdida de las estructuras de orden superior (secundaria, terciaria y cuaternaria), quedando la cadena polipeptídica reducida a un polímero estadístico sin ninguna estructura tridimensional fija.

Estado nativo Estado desnaturalizado


• Cuando la proteína no ha sufrido ningún cambio en su interacción con el disolvente, se dice que presenta una estructura nativa.

• Cualquier alteración de la estructura nativa que modifique su interacción con el disolvente y que provoque su precipitación dará lugar a una estructura desnaturalizada.

• En una proteína cualquiera, la estructura nativa y la desnaturalizada tan sólo tienen en común la estructura primaria, es decir, la secuencia de AA que la componen.

• Los demás niveles de organización estructural desaparecen en la estructura desnaturalizada.


• La desnaturalización provoca diversos efectos en la proteína:

– cambios en las propiedades hidrodinámicas de la proteína: aumenta la viscosidad y disminuye el coeficiente de difusión

– disminución de su solubilidad, ya que los residuos hidrofóbicos del interior aparecen en la superficie

– pérdida de las propiedades biológicas


• Una proteína desnaturalizada cuenta únicamente con su estructura primaria. – Por este motivo, en muchos casos, la desnaturalización es reversible.

• El proceso mediante el cual la proteína desnaturalizada recupera su estructura nativa se llama renaturalización.

– Esta propiedad es de gran utilidad durante los procesos de aislamiento y purificación de proteínas, ya que no todas la proteínas reaccionan de igual forma ante un cambio en el medio donde se encuentra disuelta.

• En algunos casos, la desnaturalización conduce a la pérdida total de la solubilidad, con lo que la proteína precipita.

– La formación de agregados fuertemente hidrofóbicos impide su renaturalización, y hacen que el proceso sea irreversible.


• Los agentes que provocan la desnaturalización de una proteína se llaman agentes desnaturalizantes

– agentes físicos: temperatura– agentes químicos: detergentes, disolventes orgánicos, pH, fuerza iónica

• Como en algunos casos el fenómeno de la desnaturalización es reversible, es posible precipitar proteínas de manera selectiva mediante cambios en:

– la polaridad del disolvente– la fuerza iónica – el pH– la temperatura

Efecto de la Polaridad del Solvente

• La polaridad del disolvente disminuye cuando se le añaden sustancias menos polares que el agua como el etanol o la acetona

• Con ello disminuye el grado de hidratación de los grupos iónicos superficiales de la molécula proteica, provocando la agregación y precipitación

• Los disolventes orgánicos interaccionan con el interior hidrofóbico de las proteínas y desorganizan la estructura terciaria, provocando su desnaturalización y precipitación. – La acción de los detergentes es similar a la de los disolventes

orgánicos.

Efecto de la Fuerza Iónica

• Un aumento de la fuerza iónica del medio (por adición de sulfato de amonio, urea o hidrocloruro de guanidinio, por ejemplo) también provoca una disminución en el grado de hidratación de los grupos iónicos superficiales de la proteína, ya que estos solutos (1) compiten por el agua y (2) rompen los puentes de hidrógeno o las interacciones electrostáticas, de forma que las moléculas proteicas se agregan y precipitan.

• En muchos casos, la precipitación provocada por el aumento de la fuerza iónica es reversible

• Mediante una simple diálisis se puede eliminar el exceso de soluto y recuperar tanto la estructura como la función original.

• A veces es una disminución en la fuerza iónica la que provoca la precipitación. – Así, las proteínas que se disuelven en medios salinos pueden desnaturalizarse al

dializarlas frente a agua destilada, y se renaturalizan cuando se restaura la fuerza iónica original.

Efecto del pH

• Los iones H+ y OH- del agua provocan efectos parecidos a la fuerza iónica

• Además de afectar a la envoltura acuosa de las proteínas también afectan a la carga eléctrica de los grupos ácidos y básicos de las cadenas laterales de los aminoácidos– Esta alteración de la carga superficial de las proteínas elimina las

interacciones electrostáticas que estabilizan la estructura terciaria y a menudo provoca su precipitación

– La solubilidad de una proteína es mínima en su punto isoeléctrico, ya que su carga neta es cero y desaparece cualquier fuerza de repulsión electrostática que pudiera dificultar la formación de agregados.

Efecto de la Temperatura

• Cuando la temperatura es elevada aumenta la energía cinética de las moléculas con lo que se desorganiza la envoltura acuosa de las proteínas, y se desnaturalizan

• Un aumento de la temperatura destruye las interacciones débiles y desorganiza la estructura de la proteína, de forma que el interior hidrofóbico interacciona con el medio acuoso y se produce la agregación y precipitación de la proteína desnaturalizada

DIALISIS

Filtración Molecular

• Filtración convencional:– separa partículas suspendidas en fluidos– las suspensiones pasan a través de un material

poroso, en el cual las partículas quedan retenidas y pueden ser separadas del fluido

• Filtración molecular:– Uso de membranas semipermeables– Permite separar moléculas disueltas en función de

su tamaño

Diálisis

• La diálisis es uno de los métodos de filtración molecular más utilizados• Se coloca una solución acuosa que contiene moléculas de distintos tamaños

dentro de una bolsa de diálisis que se encuentra a su vez sumergida en un gran volumen de un buffer determinado

• Las moléculas pequeñas del soluto (excepto aquellas que se encuentran fuertemente cargadas) pasan libremente a través de la membrana, hasta alcanzar el equilibrio.

• Reemplazando la solución externa repetidas veces, puede lograrse reducir la concentración de las moléculas pequeñas a valores prácticamente despreciables.

• El agua pasa también libremente a través de la bolsa, ocasionando así concentración o dilución, dependiendo de si la solución interna se encuentra más o menos concentrada que la externa (efecto osmótico).

Diálisis

• Diálisis inversa:– concentración de material dentro de la membrana de diálisis

– la membrana de diálisis llena es enterrada en un polímero seco y soluble en agua que no pueda penetrar en la membrana, por ejemplo, polietilenglicol o carboximetilcelulosa

– el agua abandona la bolsa para equilibrarse con la fase externa

– también puede utilizarse sacarosa, pero debido a que ésta es una sustancia dializable, puede entrar en la bolsa de diálisis cuando el agua es eliminada

•

Protocolos de diálisis para disminuir la concentración de sales de 1 M a menos de 1 mM

Muestra inicial: 50 ml de una solución de proteína en buffer que contiene sulfato de amonio 1 M

PROCEDIMIENTO 1

Diálisis contra 1 L de agua Se llega a equilibrio la bolsa se hincha hasta 100 ml en 3 y 5 h.

[sulfato de amonio] en el equilibrio = 95 mM

Reemplazar el dializado por agua pura

la bolsa se hincha hasta 110 ml

[sulfato de amonio] en el equilibrio = 9.3 mM

Reemplazar el dializado por agua pura

no hay hinchamiento de la bolsa


PROCEDIMIENTO 2

Dializar contra 5 litros de agua

la bolsa se hincha hasta 110 ml

[sulfato de amonio] = 20 mM

Dializar contra 5 litros de agua

no hay hinchamiento de la bolsa


Ultrafiltración

• Una modificación importante de la membrana de diálisis es el Diaflo (Amicon). • Esta membrana está formada por un polímero muy fino con un tamaño de poro

que varía entre 0.2 y 10 nm, montado sobre una capa de soporte gruesa (.05-.25 mm de espesor), con poros muy grandes.

• Estas membranas pueden utilizarse para procesos de concentración (empleando una membrana a través de la cual sólo pase agua), y de eliminación de sales en preparaciones para cromatografía, y fraccionamiento por tamaño molecular.

• La velocidad de flujo a través de estas membranas es tan baja que debe aplicarse presión (aire comprimido o nitrógeno, hasta a 5 atmósferas). Por lo general, para utilizar estas membranas se necesitan soportes especiales.

• Con este método se pueden concentrar volúmenes de 50 ml a 5 ml o de 200 ml a 10 ml en una hora o menos, especialmente si la concentración final es aún relativamente baja (la velocidad de filtración cae rápidamente a medida que la concentración de la sustancia que se quiere concentrar crece).

http://www.millipore.com/images/large/MB4100-06%5B1006-ALL%5D.jpg

Ultrafiltración

• Otra forma de ultrafiltración consiste en aplicar vacío o fuerza centrífuga al recipiente en que se encuentra la membrana semipermeable cargada con la muestra.

http://www.millipore.com/images/large/MB4041-06%5B1003-ALL%5D.jpg

Datos para Trabajar con Membranas de Diálisis

• Las membranas vienen tratadas con glicerol y un agente plastificante, para evitar el desecamiento y mantenerlas flexibles. Para mantener las membranas en buen estado, es conveniente almacenarlas en refrigeración.

• Lavar la membrana de diálisis (hervir en una solución de EDTA-NaHCO3) antes de poner la muestra para evitar contaminación. Existe mayor probabilidad de contaminación cuando la muestra es muy diluida, porque la relación [superficie de membrana de diálisis]/[molécula de interés] es elevada. Las soluciones con 10 mg/ml de muestra o más son difícilmente contaminadas, por lo que en estos casos se suele utilizar la membrana de diálisis sin lavar.

• Llenar la bolsa de diálisis dejando espacio para un posible incremento de volumen si es que la muestra es muy concentrada. De otra forma, la bolsa se hincharía produciendo presión, pudiendo reventarse.

• Las membranas de diálisis se clasifican por su tamaño de paso máximo (molecular weight cutoff, MWCO). Los valores que vienen especificados de fábrica son nominales; dependen de las sustancias usadas para la caracterización, entre otros factores. Por ello es recomendable que las membranas sean caracterizadas para los requerimientos específicos de cada investigación.

• Es posible usar una autoclave para esterilizar las membranas de diálisis, siempre y cuando se mantengan húmedas durante el proceso. Sin embargo, el someter las membranas a elevadas temperaturas puede alterar su tamaño de paso máximo o su permeabilidad al solvente; por ello, es recomendable no hervir ni usar la autoclave cuando esta característica es crítica para el proceso, o en todo caso, se sugiere "recaracterizar" la membrana para el sistema de interés.

Caracterización de las Membranas de Diálisis

• Con una concentración de soluto conocida, temperatura y composición de buffer constantes, es posible medir la diálisis en función del tiempo.

• Medición de la tasa de diálisis y el tiempo de escape medio– Se pone la solución con concentración de soluto conocida dentro de la membrana de

diálisis y el solvente puro afuera. Se mantiene agitando con una pastilla magnética, y el solvente externo es cambiado con la frecuencia suficiente como para que la difusión a través de la membrana ocurra contra una concentración muy cercana a cero.

– En este sistema, a una temperatura dada y para un soluto idealmente puro, la tasa de difusión seguirá una cinética de primer orden. Una gráfica del logaritmo de la concentración de soluto dentro de la membrana vs. tiempo dará una línea recta.

– Las porosidades relativas pueden extrapolarse de las diferencias en las pendientes (tasa de diálisis) de las rectas obtenidas para solutos de tamaños distintos o, de manera más sencilla, comparando los tiempos a los cuales la concentración del soluto dentro de la bolsa de diálisis se ha reducido a la mitad, es decir, el tiempo de escape medio.

CENTRIFUGACION

Centrifugación

• La centrifugación es un método que permite separar las partículas presentes en un medio líquido o semilíquido, utilizando una fuerza de aceleración, que imprime a las partículas una velocidad y un movimiento diseccionado, aprovechando de su densidad característica

• Cada partícula, cuerpo o molécula tiene un tamaño (volumen), y tiene una masa; ambas confieren a dicha sustancia una densidad.

• ρ (Densidad) = Masa/Volumen

Centrifugación

• Se basa en hacer girar un tubo a gran velocidad de forma que se produzca la acumulación en el fondo del mismo de las partículas que tienden a hundirse por tener una densidad menor que la del medio en que se encuentran.

• Así, después de la centrifugación la muestra, homogénea, se habrá separado en dos fracciones : sobrenadante, fracción homogénea que no ha sedimentado, y el sedimento (pellet) que ha quedado adherida al fondo del tubo.

• La fuerza centrífuga es aplicada a cada partícula de la muestra la cual será sedimentada en un índice que es proporcional a la fuerza centrífuga aplicada.

Centrifuga• Las centrífugas son instrumentos que permiten someter a las muestras a intensas

fuerzas que producen la sedimentación en poco tiempo de las partículas que tienen una densidad mayor que la del medio que las rodea

• Cada partícula de la muestra la cual será sedimentada en un índice que es proporcional a la fuerza centrífuga aplicada

• En general se diferencian en función de los márgenes de aceleración a que someten a las muestras en : centrífugas (de pocas g a aprox. 3000 g), super-centrífugas (o centrífugas de alta velocidad, rango de 2000 g a 20000 g) y ultracentrífugas (de 15000 g a 600000 g)

• En las centrífugas se suele controlar la temperatura de la cámara para evitar sobrecalentamiento de las muestras debido a la fricción. En las ultracentrífugas, la velocidad extrema (más de 100000 rpm), hace que sea necesario hacer un intenso vacío en la cámara de la centrífuga para evitar el calentamiento de rotor y muestra.

Rotores

• En una centrífuga el elemento determinante es el rotor, dispositivo que gira y en el que se colocan los tubos. Existen varios tipos :

– Rotor basculante. Los tubos se colocan en un dispositivos (cestilla) que, al girar el rotor, se coloca en disposición perpendicular al eje de giro. Así pues los tubos siempre giran situados perpendicularmente al eje de giro.

– Rotor de ángulo fijo. Los tubos se insertan en orificios en el interior de rotores macizos. El caso extremo es el de los rotores verticales en los que el tubo se sitúa paralelo al eje de giro. Este tipo de rotores es típico de ultracentrífugas y se emplea en separaciones de moléculas en gradientes de densidad autogenerados (por ej. de cloruro de cesio).

•

Parámetros Importantes• Los parámetros a tener presentes en cualquier centrifugación, que

determinarán las condiciones son :

– Volumen de solución a centrifugar, que determinará el tipo de tubos y rotores a emplear.

– Naturaleza química de la solución, que determinará la naturaleza del tubo a emplear

– Diferencial de densidad entre la partícula a sedimentar y la densidad del medio en el que se encuentra. En general cuanto mayor sea esa diferencia antes (menor tiempo y menor fuerza de aceleración) sedimentará. Cuando el diferencial es muy pequeño se pueden aplicar centrifugaciones de cientos de miles de g durante horas.

Parámetros Importantes• Todo rotor tiene unas propiedades que determinan las condiciones en que

se podrá centrifugar la muestra.

• Son especialmente importantes el ángulo de giro, el radio mínimo, medio y máximo, y la velocidad máxima de giro.

• La relación entre la velocidad de giro, medida en revoluciones por minuto (rpm) y la fuerza de aceleración (fuerza centrífuga relativa, RCF : relative centrifuge force) a que se somete la muestra (g) se recoge en la expresión siguiente :

• RCF = 1.118 * 10-5 * r * (rpm)2

• Para conocer el valor en gravedades de las rpm, se aplica la fórmula de fuerza de centrifugación relativa:

Centrifugación Diferencial

• La centrifugación diferencial se basa en la existencia de diferentes partículas en la suspensión que difieren en su densidad de la del medio.

• Si se centrifuga en condiciones suaves (poco tiempo, poco fuerza de aceleración) sedimentarán las partículas mayores y/o más densas.

• Cuando el sobrenadante de la primera centrifugación es centrifugado de nuevo en condiciones de mas tiempo y más fuerza de aceleración sedimentan de nuevo las partículas más densas presentes y así sucesivamente.

• Se pueden aplicar condiciones crecientes de severidad en la centrifugación y obtener una colección de sedimentos que corresponden sucesivamente a fracciones de partículas de diferente tamaño y/o densidad.

Sedimentación

• La sedimentación es el transporte de partículas en un campo de fuerza de centrifugación. Permite determinar peso molecular, densidad y forma de macromoléculas y organelas celulares.

• Coeficiente de sedimentación Los principios básicos de la teoría de sedimentación, se originan de la ley de Stokes, la cual fue creada para medir la sedimentación de una esfera en un campo gravitacional, para así mostrar que la velocidad de la esfera alcanza un valor constante y la fuerza neta en esta es igual a la fuerza de resistencia de este movimiento a través del líquido.

• Coeficiente de sedimentación 1 dr S = ----- X ------ W2 r dt

• W : velocidad del rotor Dr/dt : índice de movimiento de dos partículas (cm/s)

Velocidad de Sedimentación

• Alternativamente es posible aprovechar esa diferencia en la velocidad necesaria para sedimentar las partículas para realizar una centrifugación en un medio en el que exista un gradiente de densidad, siendo menor en la parte superior y mayor en la inferior.

• Después de un tiempo las diferentes poblaciones de partículas se sitúan en diferentes profundidades del tubo.

• Haciendo un pequeño orificio en el fondo del mismo se pueden recoger diferentes fracciones que contengan a las distintas poblaciones separadas.

• Este es el fundamente de la ultracentrifugación preparativa, que permite determinar la velocidad de sedimentación de una partícula (medida en unidades Svedverg, S).

• Los coeficientes de sedimentación son usualmente expresados en Sveldbergs (S) o 10-13s. De esta manera, una partícula cuyo coeficiente de sedimentación es medido en 10-12s.= 10x10-13s., es decir que tiene un valor de 10S.

• Una partícula en un campo gravitacional se comporta según la LEY DE STOKES d2 ( hP - hL )

V = ____________ x g 18 n

Donde: V = velocidad de sedimentación d = diámetro de la partícula hP = densidad de la partícula hL = densidad del líquido n = viscosidad del medio g = fuerza gravitacional

• Se cumple: - La velocidad de sedimentación es proporcional al tamaño de la partícula - La velocidad de sedimentación es proporcional a la diferencia entre la densidad del medio circundante y la densidad de la partícula - La velocidad de sedimentación es 0, cuando la densidad de la partícula e igual a la densidad del medio circundante - La velocidad de sedimentación disminuye al aumentar la viscosidad del medio - La velocidad de sedimentación aumenta al aumentar la fuerza del campo centrífugo El coeficiente de sedimentación es una constante caractéristica de cada organelo o macromolécula y sus unidades se dan en Svedvergs, tomando el nombre de su descubridor. El tiempo de centrifugación hasta la clarificación de una organela se define por:

• K T (horas) = --- S

• Donde: S= coeficiente de sedimentación de la organela K= constante del rotor. ( depende del ángulo de inclinación del tubo de centrifugación con respecto al eje de rotación)

Differential centrifugation separates a mixture of particles (macromolecules, cell organ-elles, and cells) that differ in mass or density. The most dense particles collect at the bottom of the tube as a pellet. The least dense particles remain in the liquid supernatant, which can be transferred to another tube. (

Two common centrifugation techniques for separating particles

Rate-zonal centrifugation separates particles or molecules that differ in mass but may be similar in shape and density (e.g., RNA molecules). Here two particles of different mass separate into two zones.

• Figure 4.15. Zonal Centrifugation. The steps are as follows: (A) form a density gradient, (B) layer the sample on top of the gradient, (C) place the tube in a swinging-bucket rotor and centrifuge it, and (D) collect the samples. [After D. Freifelder, Physical Biochemistry, 2d ed. (W. H. Freeman and Company, 1982), p. 397.]

• Repeated centrifugation at progressively higher speeds will fractionate homogenates of cells into their components.

• In general, the smaller the subcellular component, the greater is the centrifugal force required to sediment it.

• Typical values for the various centrifugation steps referred to in the figure are:

– low speed1000 times gravity for 10 minutes– medium speed20,000 times gravity for 20 minutes– high speed80,000 times gravity for 1 hour– very high speed150,000 times gravity for 3 hour

Cell fractionation by centrifugation

• .

Comparison of velocity sedimentation and equilibrium sedimentation.

Velocity Sedimentation

Equilibrium Sedimentation

Subcellular components sediment at different speeds according to their size and shape when layered over a dilute solution containing sucrose.

To stabilize the sedimenting bands against convective mixing caused by small differences in temperature or solute concentration, the tube contains a continuous shallow gradient of sucrose that increases in concentration toward the bottom of the tube (typically from 5% to 20% sucrose).

Following centrifugation, the different components can be collected individually, most simply by puncturing the plastic centrifuge tube and collecting drops from the bottom, as illustrated here

Subcellular components move up or down when centrifuged in a gradient until they reach a position where their density matches their surroundings.

Although a sucrose gradient is shown here, denser gradients, which are especially useful for protein and nucleic acid separation, can be formed from cesium chloride.

• Figure 9.4. Isolation of rough ER When cells are disrupted, the ER fragments into small vesicles called microsomes. The microsomes derived from the rough ER (rough microsomes) are lined with ribosomes on their outer surface. Because ribosomes contain large amounts of RNA, the rough microsomes are denser than smooth microsomes and can be isolated by equilibrium density-gradient centrifugation.

• Figure 4.7. Satellite DNA Equilibrium centrifugation of Drosophila DNA in a CsCl gradient separates satellite DNAs (designated I IV) with buoyant densities (in g/cm3) of 1.672, 1.687, and 1.705 from the main band of genomic DNA (buoyant density 1.701).

Hematocrito

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