Técnicas de Centrifugación

FundamentosTipos de centrifugación

Técnicas de rotura de células y tejidos

• El primer paso en la purificación de la mayoría de las proteínas y estructuras subcelulares es la rotura de los tejidos o de las células para obtener un lisado celular.Los procedimientos de homogenización más comunes son :

• sonicación. consiste en la aplicación de ultrasonidos a una suspensión celular. La intensa agitación producida destruye las membranas celulares.

• Detergentes que solubilicen las membranas celulares.• Homogenizadores. Se trata de romper las células con la

ayuda de un émbolo rotatorio que se ajusta perfectamente a las gruesas paredes de un tubo de cristal especial, el homogenizador.

Centrifugación

• Una vez obtenido el lisado o homogenizado celular se ha de proceder a su fraccionamiento.

• Una de las técnicas más empleadas es la centrifugación. Se basa en hacer girar el tubo a gran velocidad de forma que se produzca la acumulación en el fondo del mismo de las partículas que tienden a hundirse por tener una densidad menor que la del medio en que se encuentran.

• Así, después de la centrifugación la muestra, homogénea, se habrá separado en dos fracciones : sobrenadante ('supernatant'), fracción homogénea que no ha sedimentado, y el sedimento ('pellet') que ha quedado adherida al fondo del tubo.

Centrifugación

Centrifuga

• Las centrífugas son instrumentos que permiten someter a las muestras a intensas fuerzas que producen la sedimentación en poco tiempo de las partículas que tienen una densidad mayor que la del medio que las rodea.

• En general se diferencian en función de los márgenes de aceleración a que someten a las muestras en:centrífugas (de pocas g a aprox. 3000xg)super-centrífugas (o centrífugas de alta velocidad, rango de 2000 xg a 20000 xg)ultracentrífugas (de 15000 xg a 600000xg). En las centrífugas se suele controlar la temperatura de la cámara para evitar sobrecalentamiento de las muestras debido a la fricción.

Partes de una centrifuga

• En una centrífuga el elemento determinante es el rotor, dispositivo que gira y en el que se colocan los tubos. Existen varios tipos :

• rotor basculante. Los tubos se colocan en un dispositivos (cestilla) que, al girar el rotor, se coloca en disposición perpendicular al eje de giro. Así pues los tubos siempre giran situados perpendicularmente al eje de giro.

• rotor de ángulo fijo. Los tubos se insertan en orificios

en el interior de rotores macizos. El caso extremo es el de los rotores verticales en los que el tubo se sitúa paralelo al eje de giro. Este tipo de rotores es típico de ultra centrífugas

Parámetros en cualquier centrifugación

Los parámetros a tener presentes en cualquier centrifugación son:

• volumen de solución a centrifugar, que determinará el tipo de tubos y rotores a emplear.

• naturaleza química de la solución, que determinará la naturaleza del tubo a emplear

• diferencia de densidad entre la partícula a sedimentar y la densidad del medio en el que se encuentra. En general cuanto mayor sea esa diferencia antes (menor tiempo y menor fuerza de aceleración) sedimentará.

Fundamentos

• Las técnicas de centrifugación se basan en el comportamiento de las partículas ante un campo centrifugo aplicado.

• Las partículas que difieren en densidad, en tamaño o en forma sedimentan con diferentes velocidades cuando se someten a un campo centrifugo.

• La velocidad de sedimentación depende del campo centrifugo (G) aplicado, dirigido radialmente hacia fuera.

Fundamentos

G = ω2 r

G: Campo centrifugoω2 Velocidad angular del rotor (radianes/seg)r: Distancia radial de la partícula al eje de

rotación (en cm)

Fundamentos

G = ω2 r

Dado que una revolución del rotor es 2π radianes, la velocidad angular del rotor en revoluciones por minuto (rpm)

2π (r.p.m) ω = ---------------- 60 seg 4π2 (r.p.m) 2 r G = ------------------ 3600

ω = θ/t

Fundamentos

El campo centrifugo generalmente se expresa como Campo Centrifugo relativo (CCR) en múltiplos de g, la constante gravitatoria es (980 cm/s)

4π2 (r.p.m) 2 r CCR = ----------------

(3600)(980)

Nomograma relacionado a CCR

Velocidad de sedimentación

• La velocidad de sedimentación de una partícula esférica depende no solo del campo centrifugo aplicado, si no también del radio, la densidad de la partícula y de la viscosidad del medio de suspensión.

d2 (ρp - ρl) vs = ---------------- x ω2r

18 μ

Velocidad de sedimentación

d2 (ρp - ρl) vs = ---------------- x ω2r

18 μ

Vs: Velocidad de sedimentaciónd : Diamentro de la particulaρp: Densidad de la particula

ρl: Densidad del liquido

μ : Viscosidad del medio

Tipos de Centrifugación

• Centrifugación Preparativa– Centrifugación diferencial– Centrifugación de sedimentación zonal– Centrifugación Isopicnica (de igual densidad)– Centrifugación Isopicnica de equilibrio

• Centrifugación en Gradientes– Técnica de gradiente de densidad discontinuo o en

estratos– Técnica de gradiente de densidad continuo

Centrifugación Preparativa

• Centrifugación Diferencial– Basado en las diferencias de sedimentación entre

partículas de distinto tamaño y densidad.– Útil para separar partículas uniformemente

distribuidos en el homogenizado– Se debe realizar varias centrifugaciones para obtener

pastillas relativamente puras– Es muy eficaz para separar partículas cuyo orden de

magnitud en tamaño y densidad difieran significativamente

• Centrifugación de sedimentación zonal.– La técnica de centrifugación zonal (s), implica la

formación de una capa de la muestra en un gradiente de densidad liquido continuo

– La muestra se somete a centrifugación hasta que se haya efectuada la separación deseada, esto es antes de su sedimentación completa

– Metodo utilizado en la separación de hibridos RNA-DNA, subunidades ribosomales y de otros componentes celulares.

Centrifugación Preparativa

• Centrifugación Isopicnica.– Se puede realizar con o sin el empleo una gradiente

de densidad.– En ausencia de una gradiente de densidad continuo

se centrifuga la muestra a una velocidad suficiente como para que sedimente las partículas mas pesadas y separarlas.

– La muestra ahora se suspende en un medio que tenga la misma densidad que la fracción que hay que aislar.

Centrifugación Preparativa

• Centrifugación Isopicnica de equilibrio.– Se hace uso generalmente de sales de metales

pesados (Cs y Rb), para la preparación de la gradiente, también puede emplearse sacarosa.

– La muestra se mezcla homogéneamente con la disolución concentrada de cloruro de Cesio, esta produce una gradiente de concentración de cloruro de Cesio, y por tanto una gradiente de densidad que se formo a la gran densidad del Cesio

Centrifugación Preparativa

CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE DE CsCl

<Tw

• Tecnica de gradiente de densidad discontinuo o en estratos.– Se depositan cuidadosamente disoluciones de

densidad decreciente formando capas unas sobre otras en el tubo de centrifuga, ayudado con una pipeta

– La muestra se colocara cuidadosamente en la parte superior

Centrifugación en gradientes

• Técnica de gradiente de densidad continuo.– Se utiliza un aparato especial formador de gradientes,

el cual consiste en dos cámaras cilíndricas de idéntico diámetro, conectadas por sus bases, permitiendo el mezclado

– Una de las cámaras contiene la solución mas densa y la otra contiene una solución menos densa, al abrir la llave que comunica ambos vasos se produce la mezcla de las soluciones de forma ascendente

– Mientras se forma la gradiente se coloca en un tubo de centrifuga, luego de terminado la gradiente se coloca la muestra en la parte superior

Centrifugación en gradientes

Gradiente de Sucrosa

– Su rango de densidad debe ser suficiente para permitir la separación de partículas de interés

– No debe afectar la actividad biológica ni la integridad de la muestra

– No debe ser hiper osmótica ni hipo osmótica (Cuando se trata de organelas)

– Debe ser removible del producto purificado– No debe absorber en el rango UV o visible– No debe ser corrosivo para el rotor– No debe ser inflamable o toxico

Consideraciones para seleccionar una gradiente

A) Iónicos:

• Cesio• Sales de Sodio y Potasio

B) No Iónicos:

• Sucrosa• Glicerol• Polisacaridos (Ficoll)• Silica coloidal (Percoll)

Medios de gradientes utilizados con mayor frecuencia