BIO 368

ANALISIS INSTRUMENTAL

Métodos de centrifugación

CENTRIFUGACION ANALITICA: uso principal en el estudio depropiedades fisico-químicas de macromoléculas y complejossupramoleculares.

CENTRIFUGACION PREPARATIVA: uso en separación de estructuras subcelulares, vescículas de membranas, precipitadosproteicos, etc.

CENTRIFUGACION: aplicación de una fuerza superior a la de la gravedad (g = 981 cm/seg2).

TIPOS DE CENTRIFUGA

Características comunes:Un motor que hace girar un rotor donde se colocan los tubos

que contienen las muestras a centrifugar.

Diferencias:Velocidad que puede alcanzar la centrífugaPresencia o ausencia de refrigeraciónPresencia o ausencia de vacíoVolumen máximo de muestra

Tipos más usados en el laboratorio:Microfugas; utilizan tubos Eppendorf (hasta 10 000 x g)Centrífugas refrigeradas; volúmenes mayores (hasta

100 000 g)Ultracentrífugas preparativas (hasta 600 000 x g)

Tipos de rotores utilizados encentrifugación:

d) Rotor de ángulo fijo

f) Rotor de tubo vertical (menosusado).

c) Rotor “swinging bucket” (vasosbasculantes).

Como calcular la velocidad de sedimentación:

G = ω2 x r ω = 2π x (rev. x min-1)/60

G: campo centrífugo aplicado (aceleración; cm/seg2)

ω : velocidad angular (en radianes/seg)

r: distancia de la partícula al eje de rotación (cm)

G = 4 π2 (rev. x min –1)2 x r/ 3600

Fuerza centrífuga aplicada:

F = m x G = m x ω2 x r (m = masa de la partícula)

EL CAMPO CENTRIFUGO

Se expresa generalmente en en múltiplos del campo gravitacionalg (981 cm/seg2).

El campo centrífugo relativo (CCR) es la razón entre la aceleración centrífuga a un radio y velocidad especificados, y la aceleración de gravedad:

CCR = 4 π2 x (rpm)2 r/ 3600 x 981

Las unidades del CCR se expresan en “x G” y las “revoluciones porminuto” se abrevian como rpm.

Habitualmente estos cálculos se hacen con un nomograma.

VELOCIDAD DE SEDIMENTACION DE UNA ESFERA

La velocidad de sedimentación depende no sólo del campo centrífugoaplicado sino también de la densidad y radio de la partícula y de laviscosidad del medio. La relación entre estas variables está definidapor la ley de Stokes para una partícula esférica rígida:

donde: υ es la velocidad de sedimentación de la esfera 2/9 es una constante para la forma esférica r el radio de la partícula ρp la densidad de la partícula ρm la densidad del medio g el campo gravitacional η la viscosidad del medio

Así, dos partículas esféricas pueden separarse en función de su densidady/o su tamaño

EL COEFICIENTE DE SEDIMENTACION

La velocidad de sedimentación de una partícula puede tambiénexpresarse como su “coeficiente de sedimentación” s:

Estos valores se expresan habitualmente como unidades Svedberg.

Una unidad Svedberg equivale a 10-13 segundos.

Protein S value (Svedberg units) Molecular weight

 

Pancreatic trypsin inhibitor 1 6,520

Cytochrome c 1.83 12,310

Ribonuclease A 1.78 13,690

Myoglobin 1.97 17,800

Trypsin 2.5 23,200

Carbonic anhydrase 3.23 28,800

Concanavlin A 3.8 51,260

Malate dehydrogenase 5.76 74,900

Lactate dehydrogenase 7.54 146,200

Coeficiente de sedimentación y peso molecular de una serie de proteínas

DATOS NECESARIOS PARA DEFINIR UNA CENTRIFUGACION

- Velocidad del rotor- Distancia radial- Duración de la centrifugación

La velocidad de sedimentación de una partícula depende, ademásde la masa de la partícula, de la densidad y viscosidad del medio y elgrado de desviación de la partícula de una forma esférica.

Las partículas generan fricción, la que se opone a su movimiento, la que depende del tamaño, forma e hidratación de la partícula y de la viscosidad del medio.

Al centrifugar una partícula, pronto se llega a un equilibrio entre la fuerza centrífuga y la fuerza de fricción, con lo que la partícula avanzaa una velocidad constante.

Lo que define la separación de dos partículas diferentes es su diferencia de tamaño y de densidad. Estos son la base de la separación de macromoléculas biológicas o de organelos subcelulares. También influye la forma de las partículas. Todo esto puede expresarse matemáticamente.

La situación es aún más compleja, pues como la fuerza centrífuga depende de la distancia de la partícula al centro de rotación, a medida que avanza el proceso de centrifugación, la fuerza (y velocidad) se van haciendo mayores.

APLICACIONES DE LAS CENTRIFUGAS PREPARATIVAS

- Centrifugación diferencial. Utilizada en fraccionamiento celular ysubcelular. Se basa en la diferencia de velocidad de sedimentación departículas biológicas de diferente tamaño, forma y densidad. Se someteun homogeneizado a centrifugaciones repetidas aumentando cada vezla fuerza centrífuga. Se logra así obtener las siguientes fracciones:

NúcleosMitocondriasLisosomasMicrosomasFracción soluble

- Centrifugación en gradiente de densidad. Permite separar partículasde similar tamaño pero distinta densidad. Puede usarse sedimentación develocidad o de equilibrio. En el primer caso se utiliza un gradiente de sacarosa (separación de componentes en preparaciones de membrana).En el segundo, cloruro de cesio (purificación de DNA).

Densidad y coeficiente de sedimentación de diversos componentescelulares.

CENTRIFUGACION DIFERENCIAL

CENTRIFUGACION EN GRADIENTE DE DENSIDAD

CENTRIFUGACION ISOPICNICAY DENSIDAD DE FLOTACION

DEL DNA

Utilizado para la purificación de DNA,basado en la diferencia de densidad entreDNA, RNA y proteínas. También es útil para separar DNA de hebra simpledel de hebra doble.Se genera un gradiente de CsCl y el DNAse equilibra en el tubo según su densidadde flotación.

Esquema del fraccionamientode un homogeneizado demúsculo esquelético.

1000 g

Primero se utiliza centrifugacióndiferencial, seguido de centrifugación en gradientede densidad de sacarosa.