Método de separación en un bioproceso por CENTRIFUGACIÓN

UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DEL USUMACINTAING. EN PROCESOS BIOTECNOLÓGICOS

OPERACIONES UNITARIAS.

Centrifugación • La centrifugación se puede llevar a cabo a escala

preparativa o escala analítica. La primera se utiliza para aislar partículas para su aprovechamiento posterior y la segunda permite determinar propiedades físicas como la velocidad de sedimentación o el peso molecular.

Centrifugación • La centrifugación preparativa se utiliza para separar

partículas según la velocidad de sedimentación (centrifugación diferencial), la masa (centrifugación zonal) o la densidad (centrifugación isopícnica). En el primer caso se obtiene un líquido sobrenadante y un materioal sedimentado. En los otros dos casos las patículas se distribuyen en fracciones de diferentes densidades de un fluido líquido (centrifugación mediante un gradiente de densidades).

Centrifugación • Las partículas se pueden separar en función de la

velocidad de sedimentación (centrifugación diferencial), la masa (centrifugación zonal) o la densidad (centrifugación isopícnica). La centrifugación zonal y la centrifugación isopícnica constituyen ejemplos de centrifugación mediante un gradiente de densidades.

Hay diferentes tipos de centrífugas según el rango de

velocidades de giro:• A. Centrífugas de baja velocidad, de sobremesa o clínicas. De pequeño tamaño y

sin refrigeración. Alcanzan una velocidad máxima de 5000 rpm. Son Útiles para la separación de partículas grandes como células o precipitados de sales insolubles.

• Las centrífugas micrófugas son una variante de las anteriores que permiten llegar a velocidades de más de 10.000 rpm, Los volúmenes de trabajo son muy pequeños. Son útiles en el campo de la biología molecular.

• B. Centrífugas de alta velocidad. Alcanzan velocidades de entre 18.000 y 25.000 rpm. Son refrigeradas y algunas tienen sistema de vacío para evitar el calentamiento del rotor a causa del rozamiento con el aire. Son útiles en la separación de fracciones celulares, pero insuficientes para la separación de ribosomas, virus o macromoléculas en general.

• C. Ultracentrífugas. Superan las 50.000 rpm, por lo que tienen sistemas auxiliares de refrigeración i de alto vacío. Hay ultracentrífugas analíticas que permiten la obtención de datos precisos de propiedades de sedimentación (coeficientes de sedimentación, pesos moleculares), y preparativas, útiles para aislar partículas de bajo coeficiente de sedimentación (microsomas, virus, macromoléculas).

Centrifugación diferencial: • Se basa en la diferencia en la densidad de las moléculas. Esta

diferencia debe ser grande para que sea observada al centrifugar. Las partículas que posean densidades similares sedimentarán juntas. Este método es inespecífico, por lo que se usa como centrifugación preparativa para separar componentes en la mezcla (por ejemplo, para separar mitocondrias de núcleos y membrana) pero no es útil para separar moléculas.

Centrifugación isopícnica: • Partículas con el mismo coeficiente de sedimentación se separan al

usar medios de diferente densidad. Se usa para la separación de ADN con mucha frecuencia.

Centrifugación zonal:• Las partículas se separan por la diferencia

en la velocidad de sedimentación a causa de la diferencia de masa de cada una. La muestra se coloca encima de un gradiente de densidad preformado. Por la fuerza centrífuga las partículas sedimentan a distinta velocidad a través del gradiente de densidad según su masa. Se debe tener en cuenta el tiempo de centrifugación ya que si se excede, todas las moléculas podrían sedimentar en el fondo del tubo de ensayo.

Ultracentrifugación:• Permite estudiar las características de sedimentación de

estructuras subcelulares (lisosomas, ribosomas y microsomas) y biomoléculas. Utiliza rotores (fijos o de columpio) y sistemas de monitoreo. Existen diferentes maneras de monitorear la sedimentación de las partículas en la ultracentrifugación, el más común de ellos mediante luz ultravioleta o interferones.

Método de extracción de ADN• Para extraer los ácidos nucleicos del material biológico es preciso provocar una

lisis celular, inactivar las nucleasas celulares y separar los ácidos nucleicos de los restos de células. El procedimiento de lisis idóneo suele consistir en un equilibrio de técnicas y ha de ser suficientemente fuerte para romper el material inicial complejo (un tejido, por ejemplo), pero suficientemente suave para preservar el ácido nucleico diana. Entre los procedimientos usuales de lisis figuran los siguientes:

• rotura mecánica (trituración, lisis hipotónica, etc.);

• tratamiento químico (detergentes, agentes caotrópicos, reducción con tioles, etc.);

• digestión enzimática (Proteinasa K, etc.).

Rotura de la membrana celular y extracción del ADN genómico.

Métodos de purificación• Los métodos empleados para purificar los ácidos nucleicos de

extractos celulares suelen ser combinaciones de dos o más técnicas de las siguientes:

• extracción/precipitación;• cromatografía;• centrifugación;• separación por afinidad.

• Etapas de la extracción del ADN. La homogeneización y lisis celular son similares en ambos protocolos. Protocolo tradicional: separación de proteínas y lípidos con solventes orgánicos (1A); precipitación del ADN mediante etanol y sales (1B) y Redisolución del ADN (1C).

• 2. Protocolos comerciales (membrana de sílice y perlas magnéticas): unión del ADN a la matriz inorgánica (2A); separación de proteínas y lípidos mediante soluciones a pH básico (2B); recuperación del ADN de la matriz (2C). Las flechas circulares indican ciclos de centrifugación.