TECNICAS DE INMUNO-PEROXIDASA EN LA DETECCION DE … · 2019. 5. 9. · BlOMEDlCA Vol. 2, No. 3 -...

BlOMEDlCA Vol. 2, No. 3 - 1982

REVISIONES

TECNICAS DE INMUNO-PEROXIDASA EN LA DETECCION DE MARCADORES TUMORALES Y ANTIGENOS VIRALES

GENARINA ESCOVAR V..* HENRY HANSSEN V.. " GONZALO URlBE BOTERO. "'

En las dos últimas décadas ha habido un notable desarrollo de la metodología diag- nóstica por medios inmuno-histoquímicos. La introducción de estos métodos en la investi- gación biomédica ha contribuído a resolver numerosos problemas de diagnóstico en histopatología. Además han contribuído considerablemente al diagnóstico rápido y preciso de varias enfermedades infecciosas de importancia médica. El método inmuno- citoquímico se basa esencialmente en explo- tar la exquisita especificidad de los anticuerpos como reactivos de diagnóstico en la visualización y localización de una gran variedad de antígenos presentes en los tejidos y en las células.

APLICACION DE LOS METODOS INMUNOCITOQUIMICOS

En esencia la aplicación de los métodos inmunocitoquímicos permite una expansión de las observaciones morfológicas en su correloción con los potronev bioquímicos y fisiolónicos. Como elementos de diannóstico. han sido ampliamente emplead& en 1; clasificación y el diagnóstico de enfermedades del intersticio y del glomérulo renal, así como también en enfermedades mediadas

inmunológicamente (1, 2) y en un númer considerable de infecciones virales [3). Más recientemente han sido empleados en el diagnóstico y clasificación de una variedad amplia de condiciones neoplásicas y preneo- plásicas con base en la presencia o ausencia de una serie de marcadores tumorales [4).

MARCADORES TUMORALES

Los marcadores tumorales representan un grupo heterogéneo de sustancias que están presentes en los extractos de tejidos o en el plasma de pacientes con diferentes neoplasias 15).

Las áreas de mayor interés en el diagnós- tico inmunocitoquímico incluyen las varias clases de inmunoglobulinas en los tumores de origen linfo-reticular y en los procesos linfo-proliferativos atípicos, la identificación específica de polipéptidos y hormonas esteroides, así como receptores específicos en tumores endocrinos y no endocrinos y el estudio de antígenos carcinoembrionarios en lesiones neoplásicas y preneopltísicas en el colon y otros tejidos. Desde un punto de vista clínico, por la aplicación de estos procedimientos se espera una ayuda en el diagnós-

+ Profesora asistente, Departamento d e Morfología. Facultad de Medicina, Universidad de Antioquia, Mcdellín, Colombia.

Actualmente en entrenamiento: Department o f Pathology M.O. Anderson Hospital and Tumor Research Institute. 'Sexas Medical Center, Housfon Tenas 77030 . U.S.A.

'* Profesor asociado, Departamento de Microbiologia y Pararitología, Sección Virologia. Facultad de Medicina, Universidad de Antioquia, Medellin, Colombia.

Actualmente en entrenamiento: Department o f Virology Raylor College o f Medicine. Texas Medical Center. Houston Texas 77030 , U.S.A.

* * S Profesor Asistente, Deparlment o f Pathology Baylor College o f Medicine. Texas Medical Center and Staff Pathologist Veterans Administration Hospital Medical Center Houston Texas 7721 1, U.S.A.

SOLICITUD DE SEPARATAS AL DR. HENRY HANSSEN.

TECNICAS O E INMUNO-PEROXIOASA EN LA DETECCION DE MARCADORES ....

tic0 temprano de las neoplasias, la predic- 3. Tercero close de morcodores tumorales ción de l pronóst ico y l a predicción a la respuesta de varias formas de terapia. Este grupo incluye los llamados antígenos

específicos d e tumor o antígenos asociados a En la tabla 1 se presenta un resumen de los tumores, los cuales son únicos pa ra un

los principales marcadores tumorales y de tipo particular de neoplasma ( ~ j . : mela- los principales antígenos virales demostra- noma, sarcoma), ~~t~~ tumores, que en bles por métodos inmunocitoquímicos y su su mayoría son definidos desde un punto de aplicación diagnóstica (5. 6, 7). vista bioquímico, p u e d e n d e s p e r t a r u n a

respuesta humoral o celular en el huésped Basados esenc ia lmente e n reacc iones inmunocitoquímicas de radio-inmunoensayo (6). (Ver figura No. 7).

y e n p rop iedades fisiológicas, e s posible ANTIGENOS VIRALES realizar una clasificación de los marcadores

tumorales, dividiéndolos en varias clases: Mediante la aplicación de los métodos de inmunoperoxidasa ha sido posible demostrar

1. Primero close de morcodores tumoroles antígenos en el citoplasma o en el Esta clase incluye substancias tales como núcleo de las células infectadas. Entre los

hormonas, enzimas e inmunoglobulinas, que principales se pueden señalar los antígenos son producidas en células adultas normales d e B., H e r p e s s i m ~ l e x Y CitOm.9- Y que se encuentran incrementadas en e l galovirus (Tabla No. 1). (Ver f i g u r a No. s u e r o y e n los tejidos d e pac ien tes con '1. tumores derivados de este grupo específico de células. El incremento en la producción EMPLEO DE LAS TECNICAS DE de hormonas adenohi~ofisiarias en tumores INMUNOPEROXIDASA de la pituitaria, de hormonas pancreáticas en tumores pancreáticos, de enzimas como de los mayores avances en campo la fosfatasa ácida potásica en neoplasmas de la inmunocitoquímica ha sido el desarrollo de la y la presencia d e inmune- de las técnicas de inmunoperoxidasa apli- glohulinas monoclonales en el suero de c a d a s a l a demos t rac ión específ ica d e pacientes con mieloma y otras enfermedades ant ígenos i n t r a c e l u l a r e s Y t i s u l a r e s (8). linfoproliferativas, representan ejemplos de Estas técnicas comparten varios principios la de esta ,-lase de marca- con l a s y a e s t a b l e c i d a s Y ampl iamente dores tumorales u 7 ) , (Ver figuras 3, 4, utilizadas técnicas de inmunofluorescencia 51 (9); sin embargo, ofrecen mavores ventajas,

2. Segundo close de morcodores tumoroles

Una segunda c lase d e m a r c a d o r e s tumorales incluye los llamados antígenos oncofetales, presentes en altas concentraciones e n los embriones , e n e l feto y e n la placenta y que no son detectables o están presentes en muy bajas concentraciones en el adulto. Este segundo grupo incluye una variedad de isoenzimas fetales o embriona- rias como la fosfatasa alcalina placentaria [Isozima de Regan), el antígeno carcinoembrionario, la alfafetoproteína, la alfa-1-anti-- tripsina, la hormona gonadotropina corió- nica y una variedad amplia de hormonas e iso-hormonas que pueden ser sintetizadas por los tumores endocrinos y no endocrinos (Ver figura No. 6).

como el uso de tejidos embebidos en para- f i n a , la e s tab i l idad d e l p roduc to d e la reacc ión , l a obtención d e p r e p a r a c i o n e s permanentes y la utilización de microscopía de luz o electrónica. Tales factores, además de su extraordinaria sensibilidad y especifi- c idad h a n inc rementado r á p i d a m e n t e l a popularidad de su uso como ayuda diagnós- tica en patología quirúrgica, de autopsias y en enfermedades infecciosas de importancia clínica.

LA ENZIMA PEROXIDASA COMO MARCADOR INMUNOCITOQUIMICO

Los ref inamientos t a n t o concep tua les como técnicos sucedidos en las últimas dos d é c a d a s h a n permitido e l desa r ro l lo d e métodos más sensibles, tales como el uso de

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TABLA No. 1

A P L l C A C l O N D I A G N O S T I C A D E L O S M E T O D O S I N M U N O C I T O Q U I M I C O S E N P A T O L O G I A T U M O R A L

M A R C A D O R T U M O R A L

Tumores de la pituitaria anterior (hormonas adre- nocorticotrópica, hormona prolactina. del crecimiento. estimulante de la tiroides, luteinizante foliculo-estimulante.

Hormonas de los islotes pancreáticos (insulina, glucagón, somatostatina) además, polipéptido pancreático, gastrina. colecistoquinina.

Fosfatasa ácida

Alfa-lacto-albúmina

Calcitonina

Antigeno carcinoembrionario

Gonadotro~ina Coriónica

Factor V l l l

Cadenas pesadas y livianas de lnmunoglobulinas

Lisozima o Muramidasa

Mioglobina-Miosina

Lactógeno placentario

Testosterona

Estradiol

Tiroglobulina

MARCADORES VIRALES

Antigeno de Hepatitis B.

Antigeno de Herpes Simplex

A P L l C A C l O N D I A G N O S T I C A

Clasificación de tumores de la pituitaria anterior (23, 24, 25, 26).

Clasificación de las células de los islotes pancreáticos y sus tumores y diagnóstico de tumores carcinoides (27. 28, 29. 30, 31).

Identificación del carconoma prostático y sus metástasis (32)

Carcinoma hepatocelular. Tumores de origen endodérmico (33).

Carcinoma hepatocelular. Diagnóstico diferencial de tumores del ovario y tumores testiculares de la l inea germina1 (34, 35).

Carcinoma del seno (36. 37, 38)

Carcinoma medular de la tiroides. Hiperplasia de células C. (39. 40, 41 1.

Adenocarcinoma del cólon. Diferenciación de mesoteliomas de los carcinomas metastásicos (42, 43. 44).

Neoplasmas del trofoblasto. Diferenciación de tumores ováricos y testiculares de la linea germina1 (45, 46, 47).

Tumores derivados de células endoteliales (481

Identificación de linfomas de t ipo B. Diferenciación de Linfomas de carcinomas indiferenciados. Diferenciación de linfomas malignos de hiperplasias atipicas. Caracterización de Mieloma múltiple y macroglobulinemia de Waldenstrom (49, 50. 51, 52, 53).

Linfoma histiocitico. Leucemia Monocit ica (54)

Tumores derivados de músculo esquelético y músculo liso (55).

Neoplasmas de trofoblasto (561.

Tumores de células de Leydig y Sertoli (57).

Tumores ováricos de la granulosa y de la teca (58)

Nódulos tiroides adenomatosos adenomas y carcinomas (59).

Carcinoma hepatocelular. Infección Viral (60, 61).

Carcinoma de c e ~ i x y vulva sospechosos de origen viral (62).

Figura No. 3. Reacción de Peroxi- dasa anti-peroxidasa (PAP) positiva en ladetección lnsulina en un Islote de Leangerhans (25 X).

Figura No. 4. Fosfatasa ácida de- mostrada en un tejido prostátiw hiperplásico, utilizando el método inmunocitoquímico (PAP) (10 X).

Figura No. 5. Linfoma de tipo monoclonal productor de cadenas livianas tipo kappa detectado por el método de Peroxidasa anti-peroxi. dasa (40 X).

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Figura No. 6. Fuerte reacción positiva de PAP en la detección de la detección de la enzima alfa-lanti- tripsina en un caso de cirrosis hepática.

Figura No. 8. Reacción positiva de PAP en la detección de antigeno superficial de Hepatitis B (H Bs Ag) en el citoplasma de células hepáti- cas (10 X).

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enzimas conjugadas a anticuerpos y procedimientos enzimáticos sin anticuerpos conjugados. La enzima peroxidasa. glicoproteína extraída de las raíces del rábano, con peso molecular de 40.000 daltones y compuesta por mQs de 20 iso-enzimas con rango de actividad enzimática entre los pH 5.5 a 7.6, ha demostrado ser un excelente marcador inmunocitoquímico, cuando se la conjuga con inmunoglobulinas del tipo G (IgG] (10).

METODOS DE INMUNOPEROXIDASA

1 . Métodos de Inmunoperoxidasa con onticuerpos conjugados o marcodos

En 1968Nakane ( I I ) , describió el uso de la enzima peroxidasa conjugada a anticuerpos IgG, como marcador inmunocitoquímico aplicado a la demostración de hormonas adenohipofisiarias. La inmuno reacción es fácilmente reconocida a nivel t isular mediante el empleo de un substrato cromó- geno donador de electrones, la 3,3' diaminobenzidina. Este procedimiento permite la utilización de dos métodos: el directo y el indirecto.

a . Método directo de inmunoperoxidasa con anticuerpos. conjugados o marcados: Consiste en la utilización de un solo antisuero constituído por moléculas de IgG conjugadas con moléculas de peroxidasa y dirieido esoecíficamente a la demostración u ~ .~~~ ~~

~ ~

del antígeno tisular en estudio. (Figura 1A1).

b. Método indirecto de inmunoperoxidasa con anticuerpos conjugados o marcados. En este método se utilizan consecutiva- mente un primer antisuero constituído por anticuerpos específicos contra el antígeno en estudio y un segundo antisuero conjugado con la enzima peroxidasa y dirigido contra la especie animal en el cua l el primer antisuero ha sido preparado (Figura 1A2J

Aún cuando el grado de especificidad y sensibilidad de ambas métodos es mayor que el obtenido con las técnicas de inmunofluorescencia, este tipo de reacciones por lo general exhiben un grado considerablemente alto de reacción inespecífica de fondo en el

tejido, lo cua l dificulta algunas veces la interpretación y lectura de las áreas positivas.

METODO DE ENLACE INMUNOGLOBULINA-ENZIMA

Mason et a1 (121, desarrollaron un método que no requiere de la conjugación directa de la enzima peroxidasa a moléculas de IgG, sino que depende de una reacción de enlace de los anticuerpos con moléculas libres de la enzima. La reacción se verifica en cuatro etapas sucesivas. En la primera. los anticuerpos específicos reaccionan con determinantes antigdnicos e n el tejido. En la segunda etapa se utilizan anticuerpos (IgG) contra l a especie animal en l a cual fue preparado el primer antisuero. En una te rcera e tapa se adicionan anticuerpos anti-peroxidasa. Finalmente. en la cuarta etapa. se adicionan moléculas libres de la enzima peroxidasa las cuales son captadas por los anticuerpos de la t e r ce ra e t apa . [Figura 1B). Este método también presenta el problema de reacción inespecífica de fondo en e l tejido debido principalmente a la posibilidad de unión de las moléculas libres de peroxidasa con anticuerpos inespecíficos en el sistema.

METODO DE PEROXIDASA ANTI-PEROXIDASA (PAP)

En 1970 Sternberger (13) modificó el método anterior, substituyendo las etapas tercera y cuarta del mismo, con el uso de un antisuero conformado por un complejo inmune de 2 moléculas IgG anti-peroxidasa. unidas a 3 moléculas de la enzima peroxidasa . De esta forma, la posibilidad de reacciones de la enzima libre. con anticuerpos inespecíficos en el sistema fue virtual- mente eliminada. Le obtención de reacciones limpias, sin problemas de reacciones inespe- cíficas de fondo, facilitó la lectura e inter- pretación de las Qreas positivas en el tejido (Figura 1C).

SISTEMA INMUNO-ENZIMATICO AVIDINA-BIOTINA

Recientemente, Guesdon, e t a l (141, describieron un método para la demostra-

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ción de antígenos tisulares, basado esencialmente en la interacción del sistema avidina- biotina.

La biotina o vitamina H, con peso molecu- la r de 244.3 daltones presenta una gran avidez y afinidad para reaccionar en forma rápida y estable con moléculas de avidina.

La molécula de biotina puede ser conjugada covalentemente con el residuo amino. carboxilo, sulfihidrilo o tirosilo de grupos protéicos, sin alterarse su capacidad de reacción con la molécula de avidina. Debido a esta propiedad ha sido posible su conjugación con moléculas de inmunoglobulinas (IgG) y también con enzimas como la peroxidasa (15).

La avidina es una glicoproteína aislada de la clara del huevo, tiene un peso molecular de 67.000 daltones, está conformada por 4 subunidades cada una de las cuales presenta un sitio reactivo pa ra una molécula de biotina. Cada molécula de avidina reacciona con cuat ro moléculas de biotina, lo cua l permite una amplificación de la inmuno- reacción incrementándose la visualización, sensibilidad y especificidad en el sitio de localización del antígeno.

El método inmunoenzim4tico avidina- biotina consiste esencialmente en un tratamiento secuencia1 de los tejidos con los siguientes reactivos:

a. Incubación con un antisuero específico contra el antígeno en estudio.

FIGURAS 1A , 1A , 1B . I D

METODOS DE IMMUNOPEROXIOASA

X X X X XX XX

O Peroxidara X Determinante antig&ico en tejido & ~ o l & u l a de biotina

TECNICAS DE INMUNO-PEROXIDASA EN LA DETECCION DE MARCADORES

b. Incubación con un ontisuero consistente ETAPAS DE LA REACCION DE PEROXIDASA en moléculas IgG conjugadas con hiotina y ANTI-PEROXIDASA (PAP) preparado contra la especie animal en la c u a l el p r imer a n t i s u e r o f u e obtenido. PREPARACION DEL ESPECIMEN O TEJIDO

c. Incubac ión con moléculas d e avidina . Uno d e l o s p r inc ipa les p rob lemas q u e enfrenta un inmunocitoquímico es la pre-

d . ~ ~ ~ ~ b ~ ~ i ó ~ con moléculas de biotina paración de los tejidos de manera tal que los conjugadas a la enzima peroxidasa. procesos de fijación e inclusión e n parafina

no a l t e r e n a l ant ígeno e n es tudio . La

e. Desarrollo de la reacción cromógena con peróxido d e hidrógeno y 3.3'-diaminobenzidina (Figura ID).

Warnke et a1 (15) también describieron el sistema inmunoenzimático Avidina-Biotina- Conjugado; e n e s t e procedimiento l a s moléculas IgG se conjugan a la biotina y la enzima peroxidasa a la avidina. A pesar de que varias publicaciones señalan que este método e s m á s sensible q u e e l s is tema d e Peroxidasa-Anti-peroxidasa, su uso es muy limitado aún debido quizás e n gran par te a lo muy reciente de su desarrollo.

Esencialmente los cuatro métodos descri- tos anteriormente representan variaciones de uumismo principio, e s d e c i r , el uso d e anticuerpos específicos en la detección de antígenos tisulares y la incorporación de la enzima peroxidasa al sistema como marcador inmunocitoquímico. Al c o m p a r a r e l g rado d e especif ic idad lograda con es tos métodos se debe anotar que los que utilizan moléculas IgG marcadas con la enzima peroxidasa, por lo general son menos específicos q u e aquel los q u e uti l izan inmuno-complejos tales como los de peroxidasa anti-peroxidasa y el sistema inmuno- enzimático avidina-biotina. La decisión de escoger e n t r e ellos e n u n a investigación dada, depende de variables como la posibilidad de obtención de los antisueros utilizados e n la inmunorreacción. ya s e a comercia l - mente o preparados en el laboratorio. Otros fac to res q u e d e b e n c o n s i d e r a r s e son l a na tu ra leza de l ant ígeno e n es tudio y l a concen t rac ión d e l mismo e n los tej idos. Debido a q u e e l método d e perox idasa anti-peroxidasa ha sido el más ampliamente utilizado en los últimos años, consideramos de utilidad la descripción y discusión deta- llada de su procedimiento.

conservación de las características físico- químicas de los determinantes antigénicos en los tejidos es un factor clave e n el éxito de la reacción, ya que cuando esto no se logra, o t ros f a c t o r e s i m p o r t a n t e s , como e l d e l a especificidad, pierden totalmente su valor.

1. Proceso de fijoción

En el método PAP los siguientes fijadores han brindado excelentes resultados: formalina neutra, Bouin, solución d e Bicloruro- Formalina-Mercurio, B-5 formaldehído.

A pesar de que la mayoría de determinan- t e s ant igénicos e n c u a l q u i e r tej ido son destruídos por los anteriores fijadores y por los procedimientos de inclusión en parafina, el método de PAP e s extremadamente sensible como para permitir la vizualización del antígeno en estudio porque los anticuerpos en dilución son capaces de reaccionar con los pocos determinantes antigénicos que no han sido destruídos por tales procedimientos (16).

2. Inclusión en Parafina

Después d e l a f i jac ión, los tej idos son incluidos en parafina utilizando los procesos estandares de rutina. En la demostración d e lípidos o antígenos asociados a materiales r icos e n l ípidos, s e recomienda e l uso d e cortes de tejidos obtenidos con vibrotomo (171, pues el tratamiento con parafina y sus solventes, extraen los lípidos presentes en el tejido.

3. Cortes en Parafina

Se recomienda la obtención de cortes de 4 micras de espesor. con un micrótomo con- vencional . Se recogen e n l á m i n a s p o r t a - objetos l impias y p r e - t r a t a d a s con u n a

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solución acuosa de gelatina o albúmina para asegurar buena adherencia de los tejidos a la superficie del vidrio. Por lo general 1 cucharadita de gelatina o albúmina añadida a l agua en donde se recogen los cortes , brinda buena adherencia de los tejidos a las láminas. Inmediatamente antes de realizar el proceso de PAP, los cortes deben ser incubados durante 2 a 3 horas a 60°C., lo cual asegura una mayor adherencia.

4. Uso de cortes por congelación en lo prueba PAP

Existen varios problemas cuando se emplean cortes por congelación en el método de PAP y por lo tanto la recomendación de su uso debe ser limitada a aquellos casos en los cuales no se puedan obtener cortes de parafina. Entre los principales problemas se señalan los siguientes:

a.Poca adherencia de los tejidos a las láminas. En un proceso con numerosas etapas como lo es el método de PAP, los cortes por congelación tienden a flotar cuando la fijación de los mismos no e s total.

b. Formación de reacción inespecífica de fondo, debida a la presencia de gran número de determinantes antigénicos específicos y no específicos, conservados en el tejido [21).

c. El uso de una dilución baja [o alta concen- t ración) del antisuero primario, usualmente conduce a la obtención de resultados negativos (18).

en xilol, dos veces durante 10 minutos e bidratados en un gradiente descendente de etanol (lOOO/o, 95%, 75%. 50010, 15%) y agua durante 5 minutos re~pectivarnente~en cada solución.

DESTRUCCION DE LA PEROXIDASA TISULAR ENDOGENA

Con el objeto de evitar falsos positivos, es deseable destruir la ueroxidasa endónena existente en los tejidos antes de la realiza- ción del método de PAP. Los eritrocito?. y gran~~oci tos poseen niveles altos de peroxidasa endógena que aparentemente no e s destruída durante los procesos de inclusión en paraf ina. En tejidos ricos en células sanguíneas, en cortes hemorrágicos, en reacciones inflamatorias y en material de biopsia o autopsia, se recomienda la destrucción de l a peroxidasa endógena exponiendo los cortes histológicos. después de que han sido desparafinados e bidratados, a la acción de una solución consistente en 100 ml. de metano1 absoluto con 1 ml. de peróxido de hidrógeno al 30°/o, durante 30 minutos. En los cortes muy hemorrágicos el tiempo de exposición puede ser prolongado hasta 45 minutos, sin afectar la morfología bistológica (19).

BLOQUEO DE DETERMINANTES ANTIGENICOS NO ESPECIFICOS EN EL EN EL TEJIDO

El bloqueo de determinantes antigénicos no específicos en los tejidos se logra tratando los cortes durante 20 minutos con suero normal (200101. de la misma e s ~ e c i e animal en la cual se preparó el antisuero secunda-

En casos en 10s cuales se haga impres- r io , Este t ra tamiento reduce en fo rma cindible el uso de cortes por congelación, se apreciable las reacciones inespecíficas de recomienda fijar los tejidos en etanol al 95% fondo en el tejido. durante 30 minutos para lograr una buena adherencia. Además es aconsejable el uso I N ~ U N O - R ~ ~ ~ ~ ~ ~ N PAP de diluciones altas del urimer antisuero luor Ejem: 1:1,000) con él objeto de eviiar 1. ~ ~ ~ ~ i d ~ ~ ~ ~ i ~ ~ ~ ~ ~~~~~~l~~ reacciones inespecíficas de fondo en el tejido. Se obtienen resultados excelentes en la

inmuno-reacción de PAP cuando se observan DESPARAFINIZACION E HIDRATACION cuidadosamente las siguientes recomenda- DE LOS TEJIDOS ciones:

Inmediatamente an tes de real izar el a. Con el objeto de evitar que las soluciones método PAP los tejidos son desparafinadoa expuestas al tejido se extravasen de

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su área, dibuje una línea con un lápiz de diamante siguiendo el contorno de los tejidos en estudio.

b.Todas las soluciones utilizadas e n la inmuno-reacción son aplicadas en gotas sobre el tejido. Usualmente 0.2 ml. de la solución son suficientes pa ra cubrir completamente el área.

c. Después de cada período de incubación con el respectivo antisuero y con el objeto de remover el exceso de anticuerpos en el tejido, las láminas se sumergen en un lavado con solución tamponada Tris (0.05 M , pH 7.6) [Schwarz/Mann Inc., Spring Valley N.Y.U.S.A.), durante 10 a 15 minutos.

La óptima dilución de trabajo del primer antisuero se averigua haciendo una titula- ción (varias diluciones del mismo). contra un tejido que se sospeche contenga altas concentraciones del autígeno en estudio. Este método permite escoger la mejor dilución del primer antisuero en la cual la concentración de anticuerpos presentes reacciona con una concentración desconocida del antígeno en el tejido: de manera que la reacción positiva está altamente expresada y la reacción inespecífica de fondo e s mínima. Por lo general el método PAP trabaja con diluciones altas del primer antisuero; el rango para encontrar una dilución de trabajo determi- nada puede estar comprendido entre diluciones desde 1:50 a 1:50,000, dependiendo de la concentración de ant icuerpos en el antisuero (20).

Las leminas expuestas a diferentes 3. Uso del segundo antisuero antisueros deben ser lavadas todo el tiempo' separadamente con el objeto de evitar contaminación de un antisuero con otro. El método es t an sensible que una momentánea exposicióu de los tejidos con altas diluciones de otro antisuero durante el lavado, puede resultar en una reacción positiva. Por la misma razón se recomienda mantener las láminas en cajas separa- das y cubiertas durante todo el proceso.

d. Con e l objeto de evitar que se seque el tejido durante la inmunorreacción. las láminas deben ser colocadas en cámaras húmedas. El uso de cajas de Petri con gasa húmeda en el fondo y envueltas en papel de aluminio, proporciona un ambiente óptimo de humedad para la incubación de las mismas. El resecamiento del tejido debe ser evitado pues altera la estructura terciaria de las inmunoelobulinas imoi- - diendo la inmuno-reacción.

2. Uso del antisuero primario

Los cortes se incuban con 0.1-0.2 ml. de la dilución de trabajo del primer antisuero. por lo general durante 24 horas a 4°C. Este antisuero consiste en moléculas de IgG específicamente dirigidas contra el antígeno en estudio. Se deben preferir antisueros que contengan la molécula total de IgG, a fracciones de la misma.

El segundo antisuero consiste enmoléculas de IgG contra la IgG de la especie animal en la cua l se obtuvo e l primero. La dilución utilizada debe ser baja, por lo general con diluciones de 1:lOa 1:50 con el objeto de asegurar una buena concentración de anticuerpos ligantes de la inmunorreacción. La incubación de los tejidos se realiza durante media hora a 37°C.

4. Uso del tercer antisuero

El tercer antisuero o complejo inmune de Peroxidasa anti-peroxidasa usualmente se utiliza diluído en un rango de 1:50 a 1:ZOO. La titulación del antisuero se puede verificar utilizando un primer y un segundo antisuero de títulos conocidos. La incubación de los tejidos se realiza durante media hora a 37°C.

DESARROLLO DE LA REACCION CROMOGENA

1. Principios Generales

La reacción cromógena se desarrolla por la presencia de t r e s substancias . Una de ellas es la enzima peroxidasa contenida en el tercer antisuero (Figura 2, etapa III), la cual reacciona con su subs t ra to específico, e l peróxido de hidrógeno [Figura 2. etapa IV), para formar un complejo enzima-substrato

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(peroxidasa-peróxido de hidrógeno) (Figura 2, etapa VI. En presencia de una sustancia donadora de electrones (3.31-diaminobenzidina o 3-amino-9-etilcarbazol) (Figura 2. etapa VI), ocurre un segundo complejo a través de la oxidación y polimerización de los mismos, (Figura 2, etapa VII), formándose un precipitado café o rojo (Figura 2, etapa VIII), el cual, por ser bastante insoluble, se mantiene pegado a l sitio de la inmuno- rreacción siendo fácilmente reconocido por microscopía de luz.

PRFCIPTTAX C-POLIIWO *#SOLUBLE PRECIPITW ROJO

4 mnarrn* 4

recomienda el uso de soluciones frescas y filtradas. La actividad oxidativa de la diaminobenzidina u otro donador de electrones varía de lote y de acuerdo con la casa comercial donde se obtiene. Por lo tanto. su titulación (uso de varias concentraciones). contra tejidos positivos es lo más indicado. con el fin de escoger la concentración ideal.

La solución de diaminobenzidina más peróxido de hidrógeno debe ser incolora, antes de sumergir los tejidos en elia. El pH. 7.6 no es el óptimo para la actividad de la enzima peroxidasa, pero se escoge porque la oxidación es~ontánea de la diaminobenzidina es mínima en el tiempo de incubación fijado, lo cual evita la formación de precipi- tados muy gruesos sobre el tejido.

El tiempo de incubación por lo general este en los límites de 3 a 8 minutos; sin embargo se recomienda observar, por

I micro~copía de luz y en poco aumento-los

. tejidos, pa ra escoger la incubación que ermita una tinción fuerte de l a s á r e a s

1 1 ( Dositivas v una mínima de los teiidos

I 4 - conejo. I

2. Procedimiento

Como donador de electrones se emplea una solución al 0.05% de diaminobenzidina y peróxido de hidrógeno al O.OiO/o disueltos en solución tamponada de Tris 0.05 M, pH 7.6 y en él se sumergen los cortes histológicos. Se

Cuando se utilizan substancias tales como el 3-amino-Q-etilcarbazol y otros donadores de electrones como e l 4-cloro-1-naftol, se debe tener en cuenta que sus productos de polimerización no son completamente inso- lubles y que se verifica una difusión de productos desde el sitio de liberación. En estos casos se sugiere fotografíar las áreas positivas inmediatamente después de la reacción. Además, estas sustancias difieren de la diaminobenzidina en que son lipo- solubles. por lo tanto se debe evitar el uso de alcoholes y xilol, para la deshidratación y clarificación de los tejidos (20).

CONTRATINCION, DESHIDRATACION Y MONTAJE

Después de la incubación con la diaminobenzidina, las láminas son sumergidas durante 5 minutos en solución Tris.

1. Contratinción

La contratinción con hematoxilina de Harris durante 5 minutos elimina significa- tivamente la reacción inespecífica de fondo.

TECNICAS DE INMUNO-PEROXIOASA EN LA DETECCION DE MARCADORES.

Para tratar trabajos con cultivos celulares, está indicado el uso de colorantes más fuertes como la hematoxilina de Gil1 No. 3. Además se logra un mayor contraste del color azul, incubando los tejidos en solución saturada de carbonato de litio durante un minuto.

2. Deshidratación y montaje

LIMITACIONES DE LA PRUEBA DE PAP

El método de PAP demuestra antígenos que conservan su estructura antigénica a través de los rigores de la muerte, procesos de fijación, inclusión en parafina, cortes histológicos y tinción. No se pueden esperar resultados satisfactorios en las siguientes situaciones: autolisis en material de autoo- sia, inadecuada fijación, soluciones con PH

La deshidratación de los tejidos se realiza ácidos o muy alcalinos y excesivo calor en un gradiente ascendente de etanO1 de durante los procesos de inclusión. E1 mate- 15%, 50%, 75%. 95%. 100% y la clarifica- rial necrótico o células en proceso de ción en xilol, durante 5 Y degeneración conllevan reacciones no espe- respectivamente en cada solución. Las cíficas; por ello, en la interpretación de láminas así tratadas se montan en Permount. resultados, solamente se deben estudiar Cuando se trabaja con substancias lipo- células intactas. solubles. después de la contratinción las láminas son sumergidas en agua y montadas CONTROLES DE ESPECIFICIDAD en glicerol. EN EL METODO PAP

INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS Con el fin de evaluar la especificidad de la L~ reacción PAP realizada con diamino- inmunorreacción de PAP se requiere de la

benzidina imparte un color café a las áreas utilización de rigurosos controles (22).

positivas. el amino-etil-carbazol da un color rojo, y el cloro naftol un color azul. Por lo CONTROLES PARA PROBAR LA general las reacciones intracitoplasmáticas MONOESPECIFICIDAD DEL positivas se ven a la microscopía de luz como PRIMER ANTISUERO granulares, ya que la mayoría de los antígenos se encuentran contenidos en Tres métodos se pueden utilizar para gránulos secretorio$. La intensidad del color probar la monoespecificidad primer guarda relación directa con la concentra- ción de antígeno celular. En la detección de antígenos intranucleares se sugiere evitar el uso de hematoxilina para favorecer la visualización de los mismos.

Las reacciones inespecíficas de fondo son homogéneas, difusas y por lo general poco intensas. Sitios comunes para este tipo de reacción son: el tejido colágeno. materiales acumulados en vacuolas citoplasmáticas, en el lumen de glándulas y en secreciones extracelulares.

FOTOGRAFIA

Con el uso de película Tungsteno Ektachro- me de Eastman-Kodak, se obtienen fotogra- fías casi similares en colorido a la reacción original. Cuando se trabaja con cultivos celulares o en caso de reacciones débiles. el uso de filtros puede ayudar a contrastar las áreas positivas.

1. Adsorción con antígeno específico

En este procedimiento, previa realización del método de PAP, el primer antisuero se adsorbe con su antígeno específico. Se utiliza el antígeno en exceso, en relación con la concentración de anticuerpos presentes en el antisuero. El antisuero así tratado se incuba durante 24 horas a 4°C y se centrifuga durante 10 minutos en centrífuga Eppendorf (15.000 r.p.m.1, conservándose el sobrenadante para la prueba de PAP. Si el antisuero es mono-específico. los resultados al realizar el método de PAP deben ser negativos.

2. Substitución por suero pre-inmune o no inmune

En este método se substituye el primer antisuero por suero pre-inmune o no inmune

GENARlNA ESCOVAR V.. HENRY HANSSEN V.. GONZALO URIBE BOTERO

del mismo animal o de la misma especie animal en el cual se obtuvo el primer antisuero. Se deben obtener resultados negativos al aplicar el método de PAP.

3. Substitución por antisuero no relacionado

El método consiste en la substitución del antisuero primario por un antisuero no relacionado con el antígeno en estudio. Además de comprobar la monoespecificidad, este método permite investigar problemas de inmunidad cruzada ent re antisueros primarios.

CONTROLES PARA EL SEGUNDO Y TERCER ANTISUERO

1. Supresión del segundo antisuero

La supresión del segundo antisuero en el método de PAP, permite determinar la especificidad de la reacción con los antisueros primero y tercero. Deben obtenerse resultados negativos.

2. Actividad de Peroxidosa en el tercer antisuero

Para determinar la actividad de la peroxidasa contenida en el tercer antisuero, se tratan cortes bistológicos con éste, diaminobenzidina y peróxido de hidrógeno siguiendo las recomendaciones del método de PAP. Se deben esperar reacciones inespecíficas en estructuras tales como cclágeno y fibras reticulares (21). Este tipo de reacciones son imposibles de eliminar en el sistema. Las presuntas áreas inmunorreactivas del tejido deben resultar negativas con el anterior tratamiento. Para la interpretación de los resultados, se advierte que solo deben utilizarse cortes histológicos en los cuales previamente se haya bloqueado la acciór, de la peroxidasa endógena.

REACCIONES INESPECIFICAS DE FONDO EN LOS TEJIDOS CON EL METODO DE PAP

Reacciones inespecíficas del tejido

Las reacciones inespecíficas de fondo por lo general interfieren con la interpretación

precisa de las inmunorreacciones. Una variedad de causas se pueden citar coma las productoras de estos problemas.

Causas y Acciones correctivas

1. Medio de inclusión residual

Los residuos de parafina en los cortes conducen a reacciones inespecíficas en el método de PAP. El problema se evita con calentamiento previo de los cortes durante 10 minutos, antes de ser expuestas al xilol o extendiendo el tiempo de tratamiento con xilol.

2. Acción de la peroxidasa endógena

Ver el bloqueo de su actividad.

3. Inmunoglobulinas no específicas

La presencia de inmunoglobuliuas no específicas en los antisueros puede elimi- narse mediante tratamiento de los mismos con macerados de tejidos obtenibles comer- cialmente (por ej.: polvo de hígado de ratón). La incubación del antisuero con el macerado de tejido en proporción de 1 ml. de antisuero por 1 mg. de tejido durante 24 horas a 4°C y seguida de centrifugación (centrífuga Eppendorf) son suficiente para eliminar el problema.

4. Anticuerpos de especificidad no deseada

La presencia de anticuerpos de especificidad no deseada en un antisuero puede ser eliminada mediante adsorción de los mismos con antígenos específicos. El empleo de anticuerpos manoclonales (obtenidos de hibridomas). asegura totalmente la monoespecificidad de un antisuero, eliminando este tipo de problema.

5. Actividad del complemento

Los antisueros primarios utilizados en el método de PAP deben ser inactivados en su actividad de complemento durante 30 minutos a 56°C previa realización del método de PAP.

TECNICAS DE INMUNO-PEROXIDASA EN LA DETECCION DE MARCADORES

PRECAUCIONES AL TRABAJAR CON LOS METODOS DE 1NMUNOPEROXlDASA

Algunos de los reactivos utilizados en estai pruebas pueden ser tóxicos y por lo tanto se recomienda observar ciertas precauciones en su manipulación.

La 3.3'-diaminobenzidina (DAB), si se inhala o absorbe a través de la piel puede causar irritación severa; sus vapores pro- ducen irritación intensa en los ojos; por consiguiente debe manipularse en cámaras especiales con sistema de extracción y ventilación adecuadas, además del empleo de lentes protectores, máscaras faciales y guantes de vinilo o caucho. Aún cuando no se ha podido probar su actividad carcino- génica en ratas controles, este factor no puede ser descartado (63). Se sugiere que todo el material contaminado con DAB se sumerja durante 6 horas en una solución de 1:1 (agua y clorox), pues aparentemente el cloro inactiva la sustancia.

El peróxido de hidrógeno al 30% es un oxidante fuerte y deben tomarse precauciones para evitar el contacto con la piel.

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Dichos artículos deberán llenar los siguientes requisitos:

a ) Ser enviados al editor de la revista, Apartados 80334 y 80080, Zona 6, Bogotá, D.E., Colombia S.A.

b) Ser escritos a máquina, a doble espacio, en original y una copia, dejandomárgenes de 4 cms. a la izquierda y 2cms. a la derecha. El original en papel blanco, grueso, tamañocarta.

c! Ser escritos en español con resúmenes en español e inglés.

d) Tener un titulo conciso. Podrán tener, si fuere necesario, un subtitulo explicativo

e ) Llevar los nombres del autor 010s autores inmediatamente después, indicando con asteriscos, en el pié de página, su titulo acad6mico y l a institución en la cual se realizó e l trabajo.

f ) Incluir en el texto del trabajo: Introducción, Materiales y Metodos, Resultados, Discusión, Conclusiones y Referencias Bibliográficas.

g) Las citas bibliográficas s e harán en e l texto en forma consecutiva, utilizando números arábigos s deberán aparecer. en el mismo orden numérico de citación. La referencia se presenta asi: apellido del autor, seguido de las iniciales de su nombre, titulo del articulo, nombre abreviado de la revista. año de publicación, volumen, número y pagina. Ejemplo: Barrow CH. Criptococcosis inanimals. J.A. M.A. 1955,127: 125.

Para la citación de libros se seguirá un orden similar, asi: Pearse A., Texbook of Biochemistry. Saunders Edt., 1979; pp 49-50.

h) Los cuadros, gráficas y figuras deben numerarse en forma consecutiva con números arabigos y ser presentados en papel fotografico brillante. en blanco y negro. maniqniendo individualmrnte una proporcion de 2 x 3. Dicho material debe ser decalidad y presentación impecables. En hoja aparte s e incluirá la leyenda respectiva.

3. La revista también aceptará para publicación: actualizaciones, memorando, revisiones. comunicaciones breves. cartas al editor. revisión de resúmenes e informes técnicos

4. Todo material propuesto para publicación será revisado por el Comité Editorial. E l Editor informará a los autores, tanto sobre la recepción de los trabajos, como sobre la decisión final que se tome

5. La revista se reservará el derecho de aceptar o rechazar los articulos y podrá hacer sugerencias que tiendan a mejorar su presentación. Para un mejor cumplimiento de esta función el Comité Editorial podrá consultar a especialistas en la materia.

6. Los originales de los artículos publicados permanecerán en los archivos de la revista; aquellos no aceptados para publicación, serán devueltos a sus autores.

7. E l autor principal recibirá libre de costo 5 ejemplares de la revista. Los reimpresos deberán ser sufragados por el autor.

NOTA: Las personas interesadas en adquirir la revista podrán hacerlo en la biblioteca del Instituto Nacional de Salud, a un costo de ciento veinticinco pesos mlcte. ($125.00) cada ejemplar, o tomando una suscripción anual.

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TECNICAS DE INMUNO-PEROXIDASA EN LA DETECCION DE … · 2019. 5. 9. · BlOMEDlCA Vol. 2, No. 3 -...

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