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INMUNOLOGÍA BÁSICA – CURSADA 2013

La Inmunología estudia un sistema sumamente interrelacionado y dinámico, pero la metodología de estudio por temas, obliga a separar contenidos íntimamente relacionados que deben ser finalmente integrados. Es importante considerar esta característica desde el primer día de clases para encarar su estudio intentando incorporar paulatinamente los temas y alcanzar la comprensión global. Nuestro objetivo es que puedan comprender el funcionamiento del Sistema Inmune y utilizarlo como herramienta de decisión en el diagnóstico, profilaxis y solución de problemas de la práctica profesional. En la cursada 2013 hemos decidido abordar los contenidos de Inmunología Básica a través de diferentes metodologías de Trabajos Prácticos:

Durante las clases teórico-prácticas se analizarán y resolverán preguntas y problemas en forma grupal. El objetivo de estas preguntas es utilizarlas como eje temático, para que guíen al alumno en el estudio de cada tema. Se espera que los alumnos sean capaces de contestar éstas u otras preguntas similares después de haber estudiado el tema.

Algunas clases consistirán en la discusión de trabajos científicos relacionados con los temas tratados durante el curso. Nuestro objetivo es que comprendan la metodología de trabajo y de investigación en Inmunología y que a través de esta discusión puedan integrar contenidos de la materia.

Los trabajos prácticos de laboratorio serán realizados en forma directa por los alumnos y supervisados por los docentes. Los alumnos, formarán grupos de trabajo y presentarán un informe por cada trabajo práctico realizado en el laboratorio.

La presente guía de Inmunología está destinada a facilitar el abordaje de los contenidos que se tratarán en las clases prácticas, por lo que es complementaria y de ninguna manera reemplaza a la bibliografía recomendada.

Esperamos que la información presentada en esta guía les sea útil. Si tienen dudas o dificultades, acerquen sus inquietudes a los docentes participantes del curso y responsables de la redacción de la presente guía.

La Sra. Viviana Chevaga, secretaria del área, los orientará administrativamente en el horario de 13.30 a 19.30 en forma telefónica (4524-8450) o por mail a inmuno@fvet.uba.ar.

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Docentes del curso 2013

Dra. Med. Vet. Silvia L. Mundo Profesora Adjunta a cargo

Dra. Lic. Silvia Colavecchia J.T.P.

MS. Méd. Vet. Adriana M. Fontanals J.T.P.

Dra. Méd. Vet. Ana M. Jar J.T.P.

MS.Vet. Ana Jolly J.T.P.

Vet. Laura Bass Ayudante de 1era.

Vet. Bárbara Fernández Ayudante de 1era.

Med. Vet Liliana Gilardoni Ayudante de 1era.

Vet. Lucas Goldman Ayudante de 1era.

MS. Méd. Vet. Federico Hoffman Ayudante de 1era.

Med. Vet. Liliana Ramayo Ayudante de 1era.

Vet. Pablo Regner Ayudante de 1era.

Vet. Ana Stempler Ayudante de 1era.

Med. Vet. Adriana Suraniti Ayudante de 1era.

Alumna María Laura Fortuny Ayudante de 2da

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INDICE

Sistema de evaluación 4

Condiciones para promocionar 4

Condiciones para regularizar 4

Condiciones para quedar en condición de asistencia cumplida 4

Bibliografía fundamental 5

Bliografía ampliatoria 5

Programa analítico 5

Conceptos básicos de bioseguridad 8

Toma de muestras para la evaluación del sistema inmune 12

Técnicas de evaluación de inmunidad innata 16

Complemento 23

Anticuerpos 25

Purificación y fraccionamiento de anticuerpos 27

Proteínas del plasma y suero 36

Electroforesis 37

Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) 42

Introducción a las técnicas serológicas 48

Diliciones 48

Conversión serológica o seroconversión 50

Sensibilidad y especificidad 52

ELISA 53

RIA (radioinmunoensayo) 62

Inmunoblot 63

Inmunocromatografía 66

Inmunohistoquímica 67

Inmunofluorescencia 69

Citometría de Flujo 73

Técnicas de interacción secundaria: precipitación y aglutinación 79

Grupos sanguíneos 90

Linfoproliferación 94

Técnica de seroneutralización 98

Inhibición de la hemoaglutinación 104

Técnica de fijación de complemento 106

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Técnica de polarización fluorescente 109

Citotoxicidad 112

Técnicas para la detección de anticuerpos maternales 117

Inmunoelectroforesis 120

Ejercicos y problemas de aplicación 124

Guía de Lectura para un trabajo científico modelo 142

El cronograma de las clases se encuentra en el diarito y aparacerán en cartelera web. Los días de laboratorio, consulte con su docente dónde y en qué horario debe concurrir. No olvide traer el guardapolvo.

REQUISITOS PARA CURSAR

REGULARES: Parasitología Fisiología Microbiología APROBADAS: Quìmica biológica Histología

SISTEMA DE EVALUACIÓN

Los alumnos serán evaluados a través de:

a) El desempeño en los trabajos prácticos.

b) La aprobación de los informes de laboratorio.

c) Dos parciales obligatorios.

CONDICIONES PARA PROMOCIONAR

Haber cumplido con el 75% de asistencia a los teórico-prácticos.

Aprobar todos los informes (de carácter grupal) correspondientes a los trabajos prácticos de laboratorio.

Aprobar los parciales con por lo menos el 80% de los contenidos de cada uno.

Aprobar un coloquio integrador en fecha a convenir con los alumnos. CONDICIONES PARA REGULARIZAR

Haber cumplido con el 75% de asistencia a los teórico-prácticos Aprobar todos los informes (de carácter grupal) correspondientes a los trabajos prácticos de

laboratorio.

Aprobar los parciales con por lo menos el 60% de los contenidos. CONDICIONES PARA QUEDAR EN CONDICIÓN DE ASISTENCIA CUMPLIDA

Haber cumplido con el 75% de asistencia a los teórico-prácticos. Aprobar todos los informes (de carácter grupal) correspondientes a los trabajos prácticos de

laboratorio.

REQUISITOS PARA DAR EL FINAL

APROBADAS: Fisiología. Microbiología. Parasitología.

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BIBLIOGRAFÍA FUNDAMENTAL

FAINBOIM, L. y GEFFNER, J. “Introducción a la Inmunología Humana”. 5ta Edic. 2005

editorial Médica Panamericana.

TIZARD, I. “Inmunología Veterinaria”. 8Va. Edic. 2009. Editorial Harcourt Grade de España SA. 592PP.

Guía de Trabajos Prácticos. Área de Inmunología. 2010

BIBLIOGRAFÍA AMPLIATORIA

ABBAS, A; LICHTMAN, A; PILLAI, S. “Inmunología Celular y Molecular”, 6ta. Edic. 2008. Editorial Elsevier.

DAY M.J. “Clinical Immunology of the Dog and Cat” 2da. ed., Editorial Blackwell. 2008.

MURPHY K., TRAVERS P., WALPORT M. “Inmunobiología de Janeway”, 7ma. ed., Editorial Mc Graw Hill. 2010.

REGUEIRO GONZALEZ J., LOPEZ LARREA C., GONZALEZ RODRIGUEZ S., MARTINEZ NAVES E. “Inmunología: Biología y Patología del Sistema Inmunitario”, 4ta. ed., Editorial Panamericana. 2010

ROITT I., “inmunología. Fundamentos”, 11va. ed., Editorial Panamericana. 2008.

PARSLOW T., STITES D. “Inmunología Básica y Clínica”, 10ma ed., Editorial Manual Moderno. 2005.

PROGRAMA ANALÍTICO

Unidad 1: Mecanismos de Defensa ÓRGANOS Y TEJIDOS LINFOIDES Órganos linfáticos primarios y secundarios: Estructura. Diferencias en las especies domésticas: Bolsa de Fabricio. Ganglios linfáticos en cerdos. Glándulas de Harder. Patrones de migración celular: moléculas asociadas. SISTEMAS INMUNES Barreras naturales: piel y mucosas. Mecanismos humorales: vía alternativa del complemento; proteínas de fase aguda; interferones. Mecanismos celulares: fagocitosis y lisis. Citotoxicidad natural. Importancia de la respuesta T gama-delta y LB1 en las especies domésticas y de producción. SISTEMA INMUNE ESPECIFICO Propiedades: especificidad, adaptabilidad y memoria. Organización clonal. Moléculas de superficie: concepto de receptor. Células que reconocen al antígeno en forma específica: Linfocito B (LB), Linfocito T (LT). FILOGENIA DE LOS MECANISMOS DE DEFENSA ONTOGENIA DE LOS MECANISMOS DE DEFENSA EN LAS ESPECIES DOMESTICAS Y DE PRODUCCIÓN.

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Unidad 2: Inmunoquímica ANTÍGENOS Antigenicidad e Inmunogenicidad. Estructura físico-química de los antígenos. Haptenos. Carriers. Concepto y tipos de determinantes antigénicos. Tipos de Antígenos: propios (de órgano; de grupos sanguíneos; de género H-Y) y extraños (de patógenos, de tumores, de transplantes). ANTICUERPOS Inmunoglobulinas (Igs) de membrana y secretadas. Estructura físico-química: cadenas pesadas y livianas, dominios constantes y variables. Clases y subclases. Características de las Igs en las diferentes especies domésticas y de producción: IgT en equinos, IgY en aves e Igs en camélidos. La Ig como antígeno: isotipo, alotipo e idiotipo. Funciones biológicas de las diferentes clases de Igs. Distribución en el organismo. RESULTADO DE LA UNION DEL ANTICUERPO CON EL AG. Neutralización. Opsonización. Activación del Complemento. Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). PASAJE DE IGS MATERNO FETAL. Incidencia de los diferentes tipos de placentación en el pasaje de Igs. de la madre al feto en las especies domésticas. Composición en Igs. del calostro y leche. Importancia de la ingestión de calostro. Técnicas de determinación de la ingestión de calostro. Unidad 3: Moléculas de membranas relacionadas con el reconocimiento antigénico MADURACION DE LOS LINFOCITOS B Generación de diversidad de las Igs: Recombinación somática, hipermutación, conversión génica, diversidad N-Terminal. Mecanismos característicos en las diferentes especies. Ontogenia del linfocito B. Exclusión alélica, exclusión isotípica. Splicing alternativo. MOLECULAS DE HISTOCOMPATIBILIDAD Moléculas de histocompatibilidad clase I y clase II: Estructura. Localización. Función. Complejo mayor de histocompatibilidad: nomeclatura y herencia. Mapa genético en las especies domésticas y de producción. Moléculas de histocompatibilidad no clásicas. RECEPTOR ANTIGENICO DEL LT Estructura, moléculas asociadas (CD3, CD4, CD8) y otras moléculas de adhesión. MADURACION DE LOS LINFOCITOS T Generación de diversidad de los receptores T. Educación tímica de los LT. MECANISMOS DE AUTOTOLERANCIA PROCESAMIENTO Y PRESENTACION ANTIGENICA Vía endocítica y vía biosintética.

Unidad 4: Respuesta Inmune COLABORACIÓN CELULAR Activación de los LT, Interleuquinas. Influencia del antígeno y el microambiente en la cooperación celular: Perfiles Th 1 y Th 2. Colaboración T-B: Activación de LB y producción de Igs: Switch isotípico. Antígenos timo-dependientes y timo-independientes. Colaboración T-T: Citotoxicidad ejercida por LT citotóxicos. Colaboración T-Macrófagos: Macrófagos activados. Memoria inmune.

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REGULACIÓN DE LA RESPUESTA INMUNE Regulación intrínseca: Efecto de la desaparición del Ag., Niveles de Igs: retroalimentación. Regulación por linfocitos T (Th 3). Regulación extrínseca: neuroinmunoendocrinología. Regulación en sitios privilegiados: ojo, placenta, sistema nervioso central. CINÉTICA DE LA RESPUESTA INMUNE Respuesta inmune sistémica. Respuesta inmune en mucosas: características diferenciales en las especies domésticas. Unidad 5: Daños producidos por el Sistema inmune HIPERSENSIBILIDAD TIPO I Alergia. Shock anafiláctico: Órgano de choque en las diferentes especies. HIPERSENSIBILIDAD TIPO II Daños por anticuerpos en enfermedades autoinmunes y en reacciones alogeneicas. Anemia hemolítica en equinos y cerdos. HIPERSENSIBILIDAD TIPO III Daños por complejos inmunes en enfermedades autoinmunes y en enfermedades infecciosas crónicas. Piómetra en caninos. HIPERSENSIBILIDAD TIPO IV Bases celulares de la hipersensibilidad retardada. Granuloma tuberculoso. Dermatitis por pulgas en caninos. HIPERSENSIBILIDAD TIPO V Anticuerpos anti-receptores. FENÓMENOS DE AUTOINMUNIDAD Concepto. Ejemplos de enfermedades autoinmunes específicas de órgano y sistémicas. INMUNODEFICIENCIAS Inmunodeficiencias primarias y secundarias. Virus inmunosupresores que afectan las diferentes especies. TRANSPLANTES Mecanismos de rechazo del injerto. RESPUESTA INMUNE A TUMORES Unidad 6: Respuesta Inmune a Patógenos RESPUESTA INMUNE A BACTERIAS, VIRUS, PARÁSITOS Y HONGOS Antígenos involucrados. Mapeo de epitopes. Ciclo biológico del patógeno. Inmunidad innata. Inmunidad específica. Mecanismos de evasión. Consecuencias desfavorables. Unidad 7: Inmunoprofilaxis INMUNOPROFILAXIS PASIVA Ventajas e inconvenientes de su uso. ELABORACIÓN DE SUEROS HIPERINMUNES Uso de aves en la elaboración de sueros hiperinmunes. Producción de anticuerpos por biotecnología. INMUNOPROFILAXIS ACTIVA Tipos de vacunas. Ventajas e inconvenientes de su uso: Vacunas atenuadas. Vacunas inactivadas.

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Vacunas a subunidades. Vacunas a péptidos. Vacunas recombinantes (a vectores). Vacunas deleteadas. Vacunas a DNA desnudo. METODOLOGÍA DE PREPARACIÓN DE VACUNAS Proceso de producción de inmunógenos a escala industrial. Requisitos de bioseguridad. Controles durante las diferentes etapas de producción. Métodos de inactivación. Métodos de atenuación. Uso de adyuvantes. Aprobación de vacunas por organismos oficiales. Controles de inocuidad, esterilidad y potencia. ADMINISTRACIÓN DE VACUNAS Vías de inmunización. Esquemas de vacunación en las diferentes especies animales. Vacunas mixtas. Fracasos de la vacunación. Reacciones adversa a la vacunación. Unidad 8: Técnicas Inmunológicas de Diagnóstico TÉCNICAS DE IDENTIFICACIÓN DE IGS. Precipitación salina. Cromatografía. Electroforesis. Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE). TÉCNICAS DE INTERACCIÓN (AG-AC) PRIMARIA Técnicas inmunoenzimáticas: ELISA. Inmunoblot. Inmunohistoquímica. Inmunofluorescencia. Citometría de flujo. Radioinmunoensayo. TÉCNICAS DE INTERACCIÓN (AG-AC) SECUNDARIA Inmunodifusión. Inmunoelectroforesis. Aglutinación. Lisis por Complemento. TÉCNICAS DE INTERACCIÓN (AG-AC) TERCIARIA Inhibición de la hemoaglutinación. Seroneutralización. Seroprotección. Intradermorreacción. Fijación de Complemento. TÉCNICAS CELULARES Fagocitosis. Linfoproliferación. Intradermorreacción. Citotoxicidad. APLICACIÓN DE LAS TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS Evaluación del sistema inmune en un individuo. Detección de la respuesta inmune frente a patógenos. Diagnóstico de hipersensibilidades. Evaluación del resultado de la inmunoprofilaxis. HIBRIDOMAS Y ANTICUERPOS MONOCLONALES Hibridomas: Producción y selección. Anticuerpos monoclonales: Producción. Aplicaciones.

Conceptos Básicos de Bioseguridad

Cuando en un ambiente se manipulan agentes infecciosos se producen una serie de riesgos a los que están expuestas las personas, el medio ambiente e incluso toda la comunidad. Estos riesgos varían según el agente, su patogenia y otros factores como las maniobras o procedimientos empleados. Las Normas de Bioseguridad pretenden reducir a un nivel aceptable el riesgo inherente a la manipulación de material peligroso. Por ello, se efectúa una evaluación de los riesgos biológicos para darles a las personas una contención (instalaciones, equipo de protección y

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prácticas de trabajo) que reduzca la exposición hasta límites mínimos, de forma que estén expuestos al menor riesgo posible (aclarando que, el riesgo cero no existe). Clasificación de agentes biológicos

Los agentes biológicos se clasifican en grupos según su peligrosidad hacia el hombre: Grupo 1. Microorganismos que presentan poca probabilidad de causar enfermedad en el hombre. Ejemplos: Bacillus subtilis, Saccharomyces sp. Grupo 2. Aquéllos que pueden causar una enfermedad en el hombre y pueden suponer un peligro para las personas expuestas, siendo poco probable que se propaguen a la población. Generalmente existe profilaxis o tratamiento eficaz contra estos agentes. Ejemplos: Actinomyces sp, Bacteroides sp, Enterobacterias, Salmonella sp, Shigella sp, Candida sp, Cryptococcus neoformans. Grupo 3. Microorganismos que pueden causar enfermedades graves en el hombre y presentan un serio peligro para las personas expuestas, con riesgo de que se propaguen a la población. Generalmente existe generalmente profilaxis o tratamiento eficaz contra estos agentes. Ejemplos: Mycobacterium tuberculosis y bovis, Brucella sp, Histoplasma capsulatum, Neisseria meningitidis, Coccidioides inmitis, Chlamydia trachomatis, Virus de la encefalomielitis equina. Grupo 4. Agentes que, causan enfermedades graves en el hombre, y suponen un serio peligro para otras personas expuestas, con muchas probabilidades de que se propague a la población. Generalmente no se cuenta con profilaxis o tratamiento eficaz contra estos agentes. Ejemplos: Virus de Lassa, Machupo y Ebola. Niveles de contención

El primer principio de Bioseguridad es la contención. El término "contención" se emplea para describir los métodos que hacen seguro el manejo de materiales infecciosos en el laboratorio. El propósito de la contención es reducir al mínimo la exposición del personal de los laboratorios, de otras personas y del entorno, a agentes potencialmente peligrosos. Se suelen describir cuatro niveles de contención o de seguridad biológica, que consisten en la combinación, en menor o mayor grado, de tres elementos de seguridad biológica: la técnica microbiológica, el equipo de seguridad y el diseño de la instalación. Cada combinación está específicamente dirigida al tipo de operaciones que se realizan, las vías de transmisión de los agentes infecciosos y la función o actividad del laboratorio. a) Nivel de contención 1: Es el nivel de seguridad requerido para los agentes biológicos del grupo 1. Es el utilizado habitualmente en los laboratorios de prácticas de universidades o centros docentes donde se emplean cepas no patógenas (E. coli K12, B. Subtilis, Naegleria sp, Saccharomyces cerevisiae, etc.). Ejemplos típicos son todos los microorganismos que se utilizan en la industria de la alimentación para la elaboración de quesos, cerveza, embutidos, etc. b) Nivel de contención 2: Es el obligado para agentes del grupo 2 como algunos que, perteneciendo a la propia flora habitual del hombre, son capaces de originar patologías infecciosas humanas de gravedad moderada o limitada. Deben ser manipulados por personal especializado (técnicos de laboratorio, especialistas en Microbiología) y son los que con más frecuencia se estudian en el Laboratorio de Diagnóstico Veterinario (Ascaris sp, Estafilococos, Salmonella, Toxoplasma, Clostridium sp, etc.). c) Nivel de contención 3:

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Debe utilizarse cuando se manipulan agentes biológicos del grupo 3, microorganismos que cursan con patologías graves, de difícil y largo tratamiento, que pueden curar con secuelas y son capaces de producir la muerte. El mayor y más frecuente peligro que entrañan éstos es la infección adquirida a través de aerosoles y fluidos biológicos. Por ello, las principales medidas a tomar en este caso son la correcta manipulación y la utilización de cabinas de seguridad. En los Laboratorios de Diagnóstico Veterinario debe evitarse la contaminación ambiental y la infección del operador con patógenos como M. tuberculosis, Brucella sp, Virus de la encefalomielitis equina, etc. Estos microorganismos sólo pueden ser procesados por personal calificado y en una zona con la infraestructura apropiada para el Nivel de Contención 3, es decir, con aire acondicionado independiente, sin recirculación de aire, con gradiente de presión, cabinas de seguridad, etc. d) Nivel de contención 4: Es el nivel requerido cuando se trabaja con un agente patógeno exótico o no, que produce una enfermedad infectocontagiosa, de alta mortalidad y para la cual no existe tratamiento o el tratamiento existente es poco fiable. Normalmente son microorganismos de dosis infectiva baja y alta contagiosidad. Agentes del grupo 4 ó animales de experimentación infectados con ellos: Ejemplos de este nivel son los arenavirus como el que produce la fiebre de Lassa y el virus Machupo, virus Ebola, etc. Además, deben incluirse en este nivel de contención los microorganismos propios del grupo 3 que adquieran propiedades patógenas que los eleven al grupo 4. Un ejemplo sería Mycobacterium bovis multirresistente que puede causar fallecimiento por fracaso terapéutico. En la práctica veterinaria diaria, el profesional se encuentra expuesto a agentes patógenos pertenecientes a los grupos 2, 3 y eventualmente al grupo 4, que son potencialmente peligrosos tanto para él mismo como para sus pacientes y otras personas. Por lo tanto, deben tomarse todas las precauciones y establecer y respetar medidas de contención adecuadas para evitar el riesgo de la diseminación a la comunidad. El inicio de algunas enfermedades profesionales es lento y muchas veces enmascarado por otros trastornos físicos. Por esto, el profesional veterinario tiene que tener una clara conciencia del riesgo de su profesión y conocer en cada una de sus actividades los riesgos a los cuales puede verse expuesto. Sólo si se conocen las posibles enfermedades a las que se expone el veterinario, su forma de transmisión, producción y exposición, se podrán realizar las acciones correspondientes a fin de prevenirlas. Bioseguridad en el consultorio veterinario. Durante la revisación clínica se contaminan las manos del profesional, por lo tanto deben lavarse entre la atención de pacientes. Asimismo, debe desinfectarse la camilla y todos los elementos empleados durante la consulta. Es común la toma de muestras (sangre, orina, materia fecal, biopsias, etc.) para efectuar análisis complementarios que ayuden al diagnóstico o al seguimiento de un caso clínico. Estas muestras, en general, son analizadas por laboratorios de diagnóstico externos a la clínica, por lo tanto debe evitarse la diseminación de patógenos durante su traslado:

Los tubos de sangre deben estar correctamente tapados e identificados. Nunca se debe enviar la sangre dentro de la jeringa de extracción.

Si se toman muestras de orina o muestras de órganos para diagnóstico histopatológico (conservados en formol al 10%), los frascos deben estar cerrados herméticamente.

Las muestras de órganos remitidas en frío para diagnóstico microbiológico deben colocarse en bolsas plásticas cerradas. Nunca se deben colocar muestras de diferentes órganos en la misma bolsa.

Todas las muestras deben remitirse dentro de cajas, preferiblemente de telgopor (con refrigerantes, cuando se requiera) y adecuadamente precintadas para evitar su apertura accidental.

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Las muestras deben ir acompañadas de un protocolo de remisión de muestras que incluya el tipo de muestra que se envía, el análisis solicitado y una reseña clínica del caso. Esta reseña debe contener la especie animal de la que provienen las muestras, edad, sexo, sintomatología observada, hallazgos de necropsia y el diagnóstico presuntivo; de manera que el destinatario esté advertido de los riesgos potenciales antes de tomar contacto con la muestra.

Residuos patogénicos:

“Son considerados residuos patogénicos todos aquellos desechos o elementos materiales en estado sólido, semisólido, líquido o gaseoso que presumiblemente presenten o puedan presentar características de infecciosidad, toxicidad o actividad biológica que puedan afectar directa o indirectamente a los seres vivos o causar contaminación del suelo, del agua o de la atmósfera, que sean generados en la atención de la salud humana o animal por el diagnóstico, tratamiento, inmunización o provisión de servicios, así como también en la investigación o producción comercial de elementos biológicos o tóxicos”. (Ley 154 de la Ciudad Autónoma de Buenos Aires, 18 de febrero de 1999). Residuos patogénicos son, por ejemplo:

Los provenientes de cultivos de laboratorio, restos de sangre y sus derivados.

Restos orgánicos provenientes del quirófano, de servicios de hemodiálisis, hemoterapia, anatomía patológica, morgue.

Restos, carcasas y excrementos de animales de experimentación biomédica.

Algodones, gasas, vendas, jeringas, objetos cortantes o punzantes, materiales descartables y otros elementos que hayan estado en contacto con agentes patogénicos y que no se esterilicen (Nivel de bioseguridad 3).

Todos los residuos, cualesquiera sean sus características, que se generen en áreas de alto riesgo infectocontagioso (Niveles de bioseguridad 3 y 4).

Restos de animales provenientes de clínicas veterinarias, centros de investigación y académicos.

Frascos de medicamentos y vacunas vacíos. Los residuos patogénicos deben tratarse de manera especial hasta su destino final. Esta actividad está reglamentada en la ley Nº 154 de la Ciudad Autónoma de Buenos Aires. Todos los residuos patogénicos deben colocarse en bolsas rojas de más de 120 micrones de espesor. Estas bolsas se colocan en cajas de cartón o en recipientes plásticos debidamente sellados e identificados. El tratamiento de estos residuos es llevado a cabo por empresas especializadas que cuentan con la infraestructura necesaria para esterilizarlos sin riesgo de eliminar patógenos al medio ambiente. En general los residuos patológicos son incinerados en hornos a temperaturas mayores a los 1200ºC que dejan como residuo vapor de agua y cenizas inocuas (hornos pirolíticos). Bioseguridad en la producción agropecuaria Son varias las zoonosis que el profesional puede adquirir durante prácticas rutinarias en la producción agropecuaria, por lo tanto también deben tomarse precauciones.

Usar mameluco descartable o de algodón resistente al lavado intenso y botas de goma.

Revisar el estado de la manga, andenes, cepos, puertas laterales, etc.

Usar guantes para realizar tacto rectal o necropsias.

Comprobar el buen funcionamiento de las jeringas metálicas, verificar que no tengan pérdidas cuando se inyecta. Desinfectarlas y lavarlas muy bien luego del uso.

No reutilizar las jeringas descartables.

Luego del trabajo en la manga, desinfectar las botas y colocar la ropa en una bolsa plástica y luego lavarla, separada de otras, en agua a 90ºC.

Enterrar o incinerar los cadáveres de animales sospechosos de haber muerto por enfermedades infecciosas graves o zoonóticas. La práctica dependerá de la enfermedad de la que se sospeche.

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Remitir las muestras al laboratorio siguiendo las indicaciones descriptas anteriormente. Bioseguridad en el laboratorio de diagnóstico El laboratorio de diagnóstico recibe muestras que deben ser consideradas como potencialmente peligrosas y deben tomarse todos los recaudos necesarios para evitar el contagio y la diseminación de los agentes infecciosos.

No comer, beber o fumar en el laboratorio.

Debe usarse guardapolvo u otra indumentaria diferente a la ropa de calle.

Utilizar guantes para manipular las muestras.

Nunca pipetear con la boca, usar pipetas automáticas, propipetas o peras de goma.

Luego de trabajar, desinfectar las mesadas y todos los elementos utilizados.

Luego de procesadas, tratar las muestras como residuos patogénicos.

Rotular todos los frascos utilizados en el laboratorio indicando su contenido, la fecha de apertura o preparación, la fecha de vencimiento y la peligrosidad de la solución o sustancia química (irritante, carcinogénica, inocua, etc.).

Toma de muestras para la evaluación del Sistema Inmune La toma de muestras es el primer paso antes de indicar cualquier prueba de laboratorio; sin ella no hay sustrato sobre el cual comenzar a trabajar, por lo cual es el primer tema que se trata.

Se entiende la importancia de detenerse en algunos puntos sobre ellas si se piensa qué pasaría si se cometen errores durante su recolección: el estudio de muestras inapropiadas o mal conservadas puede llevar a resultados falsos que invaliden la prueba.

Por lo tanto, se nombran a continuación algunos conceptos a tener en cuenta en la toma de muestras, como primer paso, antes de empezar a trabajar.

Se hace hincapié en las muestras de sangre y suero ya que, la evaluación de la respuesta inmune sistémica se realiza a partir de sangre periférica, y la obtención de suero a partir de sangre es frecuente en inmunología (por ejemplo, para buscar anticuerpos).

Las pruebas sobre estas muestras, en laboratorios de inmunología, se realiza con dos objetivos principales:

1. En el caso del diagnóstico de enfermedades infecciosas:

- Identificar y tipificar antígenos en una muestra: por ejemplo, Parvovirus canino o Coronavirus bovino en materia fecal. En estos casos se utilizan anticuerpos específicos contra el patógeno o contra subtipos o cepas del mismo.

- Identificar la producción de anticuerpos específicos contra un determinado patógeno, por

ejemplo: anticuerpos anti–Brucella abortus, anticuerpos anti–Virus de la Fiebre Aftosa, etc., obteniendo como resultado:

presencia o ausencia de anticuerpos, si la técnica es cualitativa; el título de estos anticuerpos, si la técnica es semicuantitativa; los miligramos de anticuerpos específicos, si la técnica es cuantitativa.

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2. En el caso de la evaluación del sistema inmune (SI):

- Determinar los niveles de inmunoglobulinas en general o de alguna clase de inmunoglobulina en particular, por ejemplo, cuando queremos saber si un animal tiene niveles normales de IgG en suero.

- Determinar la relación entre las células pertenecientes al sistema inmune; por ejemplo, relación CD4/CD8.

- Evaluar la funcionalidad de las células del sistema inmune, midiendo su proliferación o la producción de citoquinas.

Conocer la técnica que se va a usar permitirá: *Elegir la técnica más adecuada, según el objetivo del inmunodiagnóstico. *Tomar la muestra correcta. *Evaluar los resultados de forma de cumplir los objetivos planteados. Es por eso que, consecuente con la toma de muestras se describirán las técnicas, ya que es necesario conocerlas para saber qué muestra tomar y cómo prepararla.

Toma de muestras de sangre: La toma de muestras de sangre es una de las prácticas más habituales en la clínica

diaria. Se realiza en razón de múltiples objetivos, entre los cuales tenemos desde una prueba bioquímica hasta un examen de funcionalidad celular. De acuerdo con estos objetivos, varía la manipulación y preparación de las muestras. Es por ello que es importante conocer algunos conceptos básicos para que la maniobra realizada resulte en datos que nos puedan servir de base para formular un diagnóstico exacto.

A continuación se enumeran algunos consejos particularmente útiles:

- Extraer la cantidad mínima necesaria para las pruebas. Esto es crítico cuando se deben hacer sangrías sucesivas a pequeños animales.

- Consultar con el laboratorio que procesará la muestra. Algunas de las pruebas realizadas en los laboratorios de Inmunología clínica deben tener una notificación previa (como la prueba de estimulación de linfocitos) y requieren del envío de una muestra control junto con la muestra del paciente. Cuando la muestra debe ser extraída con anticoagulante, previo a la extracción debe ser consultado el laboratorista, quien indicará el más conveniente para las pruebas que deba realizar. Los más usados son los quelantes del Ca++ como el citrato de Na o la solución de Alsever que tiene glucosa para proteger a los eritrocitos y citrato de Na como anticoagulante.

- Trabajar cuidadosamente para obtener la muestra en las condiciones más asépticas posibles. Siempre es recomendable usar jeringas y agujas descartables o esterilizadas por calor seco.

- Evitar la hemólisis. La presencia de hemoglobina puede afectar algunos resultados. El uso de elementos sucios o mojados (excepto con anticoagulantes), el manipuleo brusco y la formación de espuma cuando trasvasamos la muestra de la jeringa al tubo de ensayos pueden producir hemólisis. La susceptibilidad a ésta, según las especies y en orden creciente es: equinos, bovinos, ovinos, aves, felinos y caninos.

- Tener en cuenta que lo óptimo es obtener la muestra en el mismo laboratorio para evitar el deterioro que sufre durante el envío; esto es de particular importancia en los estudios que impliquen evaluación de células o de los factores del complemento.

- Las pruebas que requieren células viables hacen necesario que la sangre se transporte en hielo hasta el laboratorio en pocas horas. Si esto no es posible, se debe enviar la muestra acondicionada del modo más conveniente para cada caso y lo más rápidamente posible.

- Rotular las muestras de forma inequívoca y acompañar las muestras con el correspondiente protocolo que contenga la mayor cantidad de información posible. Es común observar que los profesionales remitan muestras en las cuales sólo se detalla, por ejemplo, el nombre de la mascota en tratamiento. Es importante aclarar no sólo las pruebas que se solicitan al laboratorio, sino también adjuntar fecha, especie, sexo, diagnóstico

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presuntivo y una breve reseña del caso en cuestión, ya que esto será de suma utilidad a la hora de interpretar los resultados por parte del personal del laboratorio. (Se adjunta como ejemplo el protocolo de envío de muestras utilizado en el servicio que brinda el área de Inmunología).

Extendidos de Sangre: Los extendidos de sangre conviene hacerlos inmediatamente después de extraída la muestra, junto al animal. Para esto se utilizan las últimas gotas de sangre que quedan en la aguja. Preparados correctamente, estos extendidos son estables aún si no están fijados. Pueden teñirse hasta varios días después si se conservan secos y protegidos de la humedad. Envueltos en papeles limpios y colocados en un recipiente hermético, pueden remitirse por correo. El método de fijación puede variar según la tinción, pero en general se pueden fijar con calor o con distintos alcoholes. Los extendidos fijados son de estabilidad casi indefinida. Extracción de Suero: Para extraer el suero de la sangre total obtenida, se la deja coagular. Una vez formado el coágulo, se lo desprende del vidrio con la ayuda de una aguja o varilla. Para obtener la mayor cantidad posible de suero, se coloca el tubo en una estufa a 37oC durante 30 minutos a 1 hora y luego, para obtener la mayor retracción del coágulo, se lo deja en heladera (4oC) durante una noche. A partir de aquí, se puede centrifugar el tubo (a 3000 r.p.m. durante 30 minutos) o extraer directamente el suero (sobrenadante) con una pipeta. En ambos casos debe operarse cuidadosamente tratando de evitar tocar el coágulo para no producir hemólisis. El suero puede mantenerse a 4oC durante 48-72 horas. Si hay riesgo de contaminación, conviene agregarle una pizca de azida sódica (este conservante puede ser tóxico por lo que es conveniente consultar al profesional del laboratorio antes de hacerlo). Si no se va a usar dentro de ese lapso, el suero debe congelarse a temperaturas inferiores a -20oC (lo óptimo es a -70oC). Si bien a estas temperaturas prácticamente no hay degradación proteica, sí la hay durante cada ciclo de congelación – descongelación. Para los exámenes serológicos de diagnóstico específico no tiene mayor importancia, pero para exámenes electroforéticos conviene evitar el congelamiento si es posible Es conveniente aclarar en el protocolo si la muestra ha sido congelada o mantenida a 4oC y cualquier otra observación que se considere necesario. También se puede enviar la sangre entera, siempre que no se tarde más de unas pocas horas. La sangre entera se conserva refrigerada, nunca congelada, pero si se prevén demoras entre la extracción y la llegada al laboratorio, lo mejor es enviar el suero ya separado.

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Ej. : PROTOCOLO DE ENVÍO DE MUESTRAS

FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS

AREA INMUNOLOGÍA

SERVICIO DE DIAGNÓSTICO INMUNOLÓGICO

N° DE PROTOCOLO

Fecha de recepción: / / Examen solicitado:............................................................................................................ Muestra remitida:............................................................................................................... Observaciones de la muestra:...........................................................................................

DATOS DEL PACIENTE

Especie: C F Raza:................................................................................................................................. Edad:................................................................................................................................. Sexo: M H DATOS DEL PROPIETARIO

Apellido y Nombre:............................................................................................................ Teléfono:............................................................................................................................

DATOS DEL PROFESIONAL

Apellido y Nombre:............................................................................................................ Teléfono:............................................................................................................................ Pertenece al Hospital Canepa: SI – NO N° de Historia Clínica:............................. DIAGNOSTICO PRESUNTIVO:........................................................................................ ANALISIS COMPLEMENTARIOS REALIZADOS:.......................................................... MEDICACIÓN RECIBIDA:...........................................................................................

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Técnicas de evaluación de inmunidad innata

La respuesta inmune innata representa la primera línea de defensa del huésped a la infección. Una de sus características primordiales es la capacidad de responder a patógenos que no ha visto previamente. Esta capacidad inherente del sistema innato se debe a su habilidad de reconocer estructuras muy conservadas y compartidas por diversos patógenos. Dichas estructuras son conocidas como patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs, acrónimo proveniente del nombre en ingles: pathogen associated molecular patterns) entre los que podemos ejemplificar a componentes de la pared bacteriana como lipopolisacáridos (LPS), peptidoglicanos y ácido lipoteicoico entre otras estructuras. Estas moléculas pueden ser vistas como firmas moleculares de los microorganismos invasores.

Si bien las bacterias de distintas cepas presentan algunas diferencias estructurales, se describen patrones conservados. Por ejemplo, el lípido A que forma parte del LPS de las bacterias Gram negativas es siempre constante y es el responsable de los efectos proinflamatorios, mientras que el antígeno O es variable entre las distintas especies y no es reconocido por el sistema inmune inespecífico. De esta forma, el sistema inmune innato puede responder a muchas infecciones sólo con un repertorio limitado de receptores. El reconocimiento de los PAMPs está mediado por estructuras también muy conservadas en la evolución y que son conocidas como receptores para el reconocimiento de patrones (PRRs, acrónimo proveniente del nombre en ingles: pattern recognition receptors). Entre los PRRs se describen varias familias, entre ellas, los receptores de tipo Toll (TLR) son capaces de reconocer distintos PAMPs. Al menos diez miembros de la familia de TLR se identificaron en mamíferos y cada miembro es capaz de reconocer distintos PAMPs. Por ejemplo, el TLR 2 reconoce peptidoglicano y ácido lipoteicoico del S. aureus. El TLR 4 reconoce LPS de bacterias gram negativas incluyendo a E. coli. Fagocitosis Los mecanismos que tienen las células para incorporar en su interior fluidos, solutos y partículas desde el medio externo son: pinocitosis, endocitosis mediada por receptores específicos y fagocitosis. Mediante el proceso de pinocitosis ingresan a las células fluidos y solutos. Por medio de la endocitosis mediada por receptores específicos, entran a la célula macromoléculas, virus y otras partículas de pequeño tamaño. Ambos mecanismos son independientes de la polimerización de la actina. En cambio, la fagocitosis, que es la ingestión de partículas de mayor tamaño, ocurre por mecanismos dependientes de la actina. Las células más eficientes para fagocitar partículas son los monocitos, macrófagos y neutrófilos a los que se los denomina fagocitos profesionales. La fagocitosis fue descripta por Metchnikoff en 1882 y es uno de los mecanismos asociados al sistema inmune que aparece más tempranamente en la escala filogenética. Se conoce como fagocitosis al proceso por el cual una partícula es ingerida por una célula. Las partículas pueden ser bacterias, parásitos, células muertas y partículas inertes como el carbón, etc. La partícula puede ser degradada o no luego de la fagocitosis dependiendo de la naturaleza de la misma. No todos los microorganismos son fagocitados; muchos de ellos tratan de evadir el reconocimiento que es la primera etapa de la fagocitosis. Simultáneamente con esta evasión, el sistema inmune de los vertebrados ha evolucionado para contrarrestarlo. Se conocen factores séricos denominados opsoninas que favorecen el reconocimiento e ingestión de microorganismos. Las principales opsoninas son los anticuerpos (IgG e IgM), los factores del complemento (C3b, C3bi, etc.) y las proteínas de fase aguda. Entre las proteínas de fase aguda se encuentran la proteína C reactiva, las proteínas de unión al lipopolisacárido (LBP) y proteínas de alto peso molecular llamadas fibronectinas. El LBP se une al LPS bacteriano y aumenta la unión de éstos a la molécula de CD14 presente en la membrana de las células fagocíticas. La

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fibronectina puede unirse a algunas bacterias como el Staphylococcus aureus y actuar como puente entre la bacteria y el polimorfonuclear (PMN). El reconocimiento del microorganismo está mediado por diferentes receptores de membrana del fagocito pertenecientes a los PRRs o aquellos que reconocen a las opsoninas. Estos receptores pueden estar involucrados tanto en la adherencia como en la activación del proceso de fagocitosis. Algunos de ellos son, por ejemplo, el receptor para el fragmento

cristalizable constante de la inmunoglobulina G (FcR), el receptor para la proteína C3b del complemento (CR1)), o para la proteína C3 (CR3 o CD11b/CD18), y los receptores de patrones (PRRs) como el receptor de manosa, y el receptor scavenger o carroñero. Se ha observado que la cantidad de anticuerpos IgG necesarios para inducir la ingestión de un microorganismo se reduce alrededor de 100 veces si éste además está recubierto por C3b. Estos receptores actúan cooperativamente para estimular vías de señalización, no sólo para iniciar la polimerización de la actina sino también para activar la NADPH-oxidasa para la producción de O2. Este último es uno de los mecanismos citotóxicos que entran en juego luego de la fagocitosis.

Células efectoras de la fagocitosis Los polimorfonucleares se originan en la médula ósea (MO) y son continuamente enviados a la circulación. Viven pocos días y tan pronto como los microorganismos invaden los tejidos dejan el torrente circulatorio, se adhieren al endotelio celular activado y se mueven a través de la barrera endotelial hacia el sitio de la lesión. Son considerados como la primera barrera de defensa frente a los microorganismos, ya que son los primeros en llegar al sitio de invasión atraídos por los factores quimiotácticos que se generan en el foco inflamatorio. Los factores quimiotácticos son principalmente componentes bacterianos, productos de degradación de las bacterias, mediadores de la inflamación y restos de tejidos alterados por la invasión. Los monocitos se originan también en MO y pasan a la circulación, desde donde se extravasan a los tejidos y se diferencian en los distintos órganos, tomando características propias como es el caso de las células de Kupffer en el hígado, los macrófagos alveolares en el pulmón y los histiocitos en el tejido conectivo. La transformación de monocito a macrófago tisular involucra una serie de cambios morfológicos y metabólicos en la célula, como son el aumento del tamaño celular, la modificación en la calidad y cantidad de enzimas lisosomales, etc.

Activación del polimorfonuclear / macrófago Los PMN responden a una gran variedad de factores quimiotácticos, incluyendo los N-formilpéptidos, factores derivados de la activación del complemento como el C5a, los leucotrienos B4 (LTB4), la interleuquina 8 y el factor activador de plaquetas (PAF). Algunos de los receptores de los factores quimiotácticos han sido identificados como miembros de la superfamilia de los receptores unidos a la GTPasa (proteínas G), cuya característica estructural es que poseen 7 dominios transmembrana. Estos receptores existen en estados interconvertibles de alta y baja afinidad a consecuencia de que desarrollan un ciclo de intercambio del nucleótido guanina e hidrólisis de GTP durante el cual estas proteínas sufren varios cambios conformacionales. Estos estados de alta o baja afinidad dependen del microambiente y los niveles de factores quimiotácticos. Las proteínas G funcionan como intermediarios entre los receptores de superficie celular y las enzimas efectoras responsables de la generación de segundos mensajeros: AMPc inositoltrifosfato (IP3), Ca2+, diacilglicerol (DAG), ácido fosfatídico (PA), ácido araquidónico (AA). Estos segundos mensajeros son generados directa o indirectamente como consecuencia de la activación de las fosfolipasas A2, C y D. La activación de los segundos mensajeros permite la remodelación de la membrana citoplasmática, el aumento del metabolismo de los fosfolípidos, la polimerización de la actina y el estallido respiratorio. Los eventos tempranos de activación están interrelacionados y son fundamentalmente cuatro:

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1- fosforilación en tirosina de proteínas de membrana y citoplasmáticas 2- hidrólisis del fosfolípido inositol de membrana 3- incremento del Ca2+ citoplasmático 4- incremento de la actividad de la proteinquinasa C (PKC)

Los neutrófilos contienen una gran variedad de quinasas de serina/treonina y de tirosinas. Estas enzimas son blanco específico de los segundos mensajeros.

El entrecruzamiento de FcR induce la activación de diversas familias de quinasas y de tirosinas. Macrófagos y PMN defectivos para estas quinasas exhiben una considerable disminución de la fagocitosis y producción de O2.

Mecanismo de fagocitosis La interacción receptor-ligando entre el fagocito y la partícula a ingerir activa la maquinaria de la fase de ingestión para lo cual es necesario la modificación de las proteínas involucradas en el remodelamiento de la membrana y el citoesqueleto: actina, miosina y proteínas de unión a la actina. Los microfilamentos de actina en la porción de citoplasma que subyace al sitio de unión comienzan a polimerizarse. Esta polimerización lleva a que la membrana envuelva la partícula, formándose seudópodos (extensiones de la membrana en forma de dedos). Estos rodean a la partícula y finalmente se fusionan formando la vesícula fagocítica o fagosoma primario. Mientras esto ocurre, los gránulos citoplasmáticos se funden con la membrana del fagosoma y se produce un fagolisosoma. En el interior del fagolisosoma, la partícula ingerida queda expuesta a sistemas microbicidas que pueden clasificarse como oxígeno independientes y oxígeno dependientes.

Moléculas efectoras independientes del oxígeno Estas sustancias están localizadas en los lisosomas o gránulos citoplasmáticos, se liberan dentro de los fagolisosomas y no requieren la producción de oxidantes para ser activas. Pueden actuar tanto intra como extracelularmente en el caso de que la partícula sea muy grande para ser ingerida generando lesión en el tejido subyacente y efecto conocido como fagocitosis frustrada. Estos agentes incluyen proteasas y enzimas hidrolíticas como fosfolipasas, glicosidasas y lisozima; la fagocitina y las leucinas que actúan sobre las membranas bacterianas; la lactoferrina fija el hierro privando a las bacterias de este elemento indispensable para su crecimiento y la lisozima, que cliva los mucopéptidos de la pared celular bacteriana.

Moléculas efectoras dependientes del oxígeno Durante el proceso de fagocitosis las células pueden incrementar en 50 veces la cantidad de oxígeno consumido y metabolizar grandes cantidades de glucosa. Debido al gran consumo de oxígeno, este fenómeno se denomina estallido respiratorio. El consumo de oxígeno es utilizado para la producción de metabolitos tóxicos como anión superóxido, peróxido de hidrógeno, radicales hidroxilo, oxígeno singulete, hipocloritos y cloraminas. Se ha confirmado experimentalmente la relación entre la citoxicidad de los macrófagos y la producción aumentada de los reactivos del nitrógeno e intermediarios del oxígeno. En los sobrenadantes de cultivo de macrófagos activados por citoquinas se encuentran niveles elevados de nitritos inorgánicos (NO2

-) y de anión superóxido (O2-), ambos asociados con la

actividad antimicrobiana. Las vías oxidativas productoras de estos dos metabolitos son diferentes y no comparten precursores comunes. El siguiente esquema muestra las vías de producción de moléculas efectoras, señalando algunos de los estímulos necesarios para su activación, a saber: interferón gamma

(IFN), lipopolisacárido de E. coli (LPS) y forbomiristil acetato (PMA).

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L-arginina oxígeno

Óxido nítrico anión superóxido (NO) (O2)

nitrito peróxido de hidrógeno (NO2

-) (H2O2)

nitrato radicales hidroxilo (NO3

-) (OH)

Existen mecanismos para incrementar la capacidad microbicida del H2O2, Uno de ellos es la acción de la mieloperoxidasa (MPO), que cataliza la oxidación y halogenación de diferentes estructuras presentes en los microorganismos. El óxido nítrico (NO) posee una vida media de pocos segundos, interactúa con una serie de moléculas dando como resultado citotoxicidad. En presencia de oxígeno y agua, el NO genera otros reactivos intermedios del nitrógeno y por último se descompone para formar NO2

- y NO3

-. Los niveles de formación de los reactivos del oxígeno y producción de NO están relacionados con el grado de susceptibilidad a las infecciones. A modo de ejemplo, podemos citar la Enfermedad Granulomatosa Crónica que se presenta en individuos genéticamente deficientes en la enzima NADPH oxidasa. Métodos de evaluación de las fases de la fagocitosis a) Quimiotaxis: La quimiotaxis es el movimiento de los PMN a través de un gradiente de concentración de sustancias (como la formil-metionina) que producen migración dirigida. Los factores quimiotácticos provienen principalmente de componentes bacterianos, de la degranulación de los mastocitos durante el proceso inflamatorio y de la activación del complemento (el C5a está considerado como uno de los más potentes factores quimiotácticos). Las pruebas de quimiotaxis se utilizan, en determinados pacientes sospechados de padecer una inmunodeficiencia, para evaluar la capacidad de sus células principalmente neutrófilos frente a factores comprobadamente inductores de migración Técnica de migración celular bajo capa de agarosa: Consiste en preparar un medio soporte de agarosa sobre un portaobjeto en el cual se siembran las células en posición central, ubicando frente a las mismas la sustancia quimiotáctica y una sustancia control. Durante la incubación las células migran. Luego se fijan con metanol, se desprende la capa de agarosa y se tiñen las células. La migración de los PMN se evalúa microscópicamente comparando la distancia recorrida en dirección al factor quimiotáctico (dirigida) y la migración espontánea de las células (al azar). Los valores normales deben determinarse para cada especie y en el laboratorio de referencia. b) Quimiotaxis y adherencia

Técnica de migración y adherencia a través de una membrana: para ello se utiliza la cámara de Boyden, que posee una membrana microporosa con poros de 3 micrones de diámetro. Se colocan las células en un compartimento y los factores quimiotácticos en otro y se

NADPH oxidasa

Oxido nítrico sintasa (INOS)

Estimulación por

fagocitosis o

tratamiento con

PMA

Otros reactivos intermediarios y moléculas efectoras

Activación por

INF

y LPS

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lleva a incubar. La capacidad de las células para migrar hacia el estímulo se evalúa tiñendo las que quedan retenidas en la membrana. Los resultados se comparan con los obtenidos con células del mismo animal (sin estímulo) y con PMN de un individuo normal utilizado como control de valor de animal sano. b) Activación: La activación de las células fagocíticas se señaliza a través de eventos de fosforilación y desfosforilación de las proteínas celulares involucradas en la trasmisión de la señal de activación. La posibilidad de identificar proteínas fosforiladas con el uso de anticuerpos monoclonales que detectan, por ej., tirosinas fosforiladas, permite identificar el primer paso de activación de las células fagocíticas. Para esta evaluación es necesario recurrir a las técnicas de PAGE e Inmunoblot a partir de las células activadas (ver capítulos correspondientes en la presente guía). La identificación de la migración de proteínas del citoplasma al núcleo celular para regular la trascripción de moléculas relacionadas con la inflamación y fagocitosis constituye también una manera de identificar los primeros eventos de activación celular. Como ejemplos de estos sistemas podemos incluir la activación del factor NF-kB que involucra la degradación del factor inhibidor de kB citoplasmático (proteína IkB) y el incremento de sus componentes p50 y p65 en el núcleo celular. Esta modificación en los componentes proteicos celulares también se estudia utilizando anticuerpos marcados y mediante el uso de técnicas de SDS-PAGE e inmunoblot. c) Ingestión: La etapa de ingestión se puede evaluar utilizando como partícula a ingerir diferentes microorganismos. La utilización de levaduras como por ejemplo el Saccharomyces cerevisiae, se fundamenta en el tamaño de las partículas (fácil de ver en el microscopio óptico) y la estructura de manosas que poseen estos microorganismos que son fácilmente detectados por los PRRs. La capacidad de ingestión de las células provenientes del individuo a evaluar se determina realizando una cuantificación del número de levaduras ingeridas en un determinado tiempo de incubación. El recuento de las partículas o microorganismos ingeridos puede ser realizado mediante diversas metodologías: - Tinción de las células con las coloraciones de Wright o Giemsa; de esta manera se diferencian las células que han ingerido de las que no. Se deben contar por lo menos 200 células y determinar cuentas partículas por citoplasma celular es considerado como ingestión positiva. Los métodos microscópicos requieren una laboriosa observación para determinar la asociación de los microorganismos a las células y discriminar si estos microorganismos fueron ingeridos o no. -Marcación de las partículas a ingerir con fluoresceína; se utiliza la marcación de la partícula con isotiocianato de fluoresceína u otro colorante fluorescente previo a la incubación con las células, luego se elimina por lavado las partículas no ingeridas y se detectan las células que ingirieron por microscopia de fluorescencia o citometría de flujo (ver capítulo correspondiente en la presente guía). La utilización de la coloración combinada diferencial con bromuro de etidio permite identificar las bacterias extracelulares (fluorescen en color rojo-naranja) de aquéllas internalizadas (permanecen de color verde correspondiente a la fluoresceína). -Marcación de componentes bacterianos como proteínas, DNA y/o RNA con sustancias radiactivas. Las bacterias se marcan durante su fase de crecimiento con aminoácidos o nucleótidos marcados con 14C, 35S amino 3H nucleótidos: tritio y luego del experimento de ingestión en el que se incuban las células y las bacterias durante un periodo de tiempo generalmente entre 30 a 60 minutos a 37ºC se lavan las células para eliminar las bacterias no ingeridas y se utiliza un detector de radioactividad como un contador de centelleo líquido o sólido para cuantificar la radiactividad retenida por el sedimento celular. Esta actividad se relaciona con el número de partículas radiactivas ingeridas y por lo tanto con la capacidad de ingestión de las células fagocíticas del individuo evaluado.

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d) Digestión:

Evaluación del estallido respiratorio

Reducción del colorante nitroazul de tetrazolio

El nitroazul de tetrazolio (NBT) es un aceptor de un electrón utilizado para detectar en forma indirecta la producción de superóxido por parte de los PMN estimulados. El NBT de color amarillo y soluble, se transforma en formazán de color azul e insoluble que precipita intracelularmente.

NBT (color amarillo y soluble) + O2-

----------›

Formazán (color azul e insoluble) + O2

Para esta prueba se pueden utilizar PMN provenientes de sangre entera aislados del individuo, estimulados con levaduras o forbolmiristilacetato (PMA) Luego de una incubación de

30 minutos a 37C, la formación del formazán puede ser evaluada cuali o cuantitativamente.

Los cristales pueden identificarse intracelularmente por microscopía y realizar un recuento del número de células que sufrieron estallido respiratorio, o bien los cristales pueden ser solubilizados utilizando N,N dimetilformamida y realizar la cuantificación por espectrofotometría obteniendo los datos en densidad óptica.

Quimioluminiscencia

El estallido respiratorio en los PMN normales está asociado con la generación de energía luminosa conocida como quimioluminiscencia, la cual es dependiente de la producción del oxígeno singulete (1O2). Este oxígeno se produce cuando uno de los electrones desapareados de oxígeno es elevado a una órbita superior con la inversión del spin. La luz se emite cuando el electrón retorna a su nivel inicial y se mide como quimioluminiscencia. El oxígeno singulete es producido por la reacción entre H2O2 y el hipoclorito:

H2O2 + OCl-

----------›

1O2 + H2O + Cl

-

La luz emitida se mide por la detección fluorométrica apropiada. La sensibilidad del ensayo se incrementa por el uso de hidracina cíclica, 5-amino-2,3-dihidro-1,4-phthalazinedione (luminol) que actúan como substrato para el 1O2. La luminiscencia se mide en un contador de centelleo usando el canal del 3H. Evaluación de la producción de Óxido Nítrico (NO) Puede realizarse mediante la evaluación de la producción de NO o de la enzima que cataliza su producción (iNOS o NOS2)

Producción del NO Los niveles de producción de NO en los cultivos de macrófagos estimulados con bacterias o productos bacterianos nos permiten evaluar el grado de activación de estas células. La vida media del NO es de segundos, por esto, la evaluación de su producción se realiza mediante la cuantificación de nitritos en el medio de cultivo.

La síntesis de nitritos comienza 4 a 6 horas luego del tratamiento con IFN y LPS en un cultivo de macrófagos y es lineal por 72 horas. La identificación de este metabolito en los sobrenadantes de cultivo se realiza mediante la utilización del reactivo de Greiss (sulfanilamida y naftiletilendiamina) que se colorea cuando reacciona con nitritos y nos permite relacionar la coloración con los niveles producidos en un cultivo. El cambio de color se evalúa por espectrofotometría a 550 nm. Se realiza una curva patrón utilizando diferentes concentraciones conocidas de NaNO2 y reactivo de Greiss. De esta curva se obtiene la relación que permite estimar la producción de NO in vitro.

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Los análogos de la L-arginina,como la NG-monomethyl-L-arginina (L-NMA), poseen acción inhibitoria de la producción de nitritos a partir del NO por la vía de la iNOS por un fenómeno competitivo. La utilización de estas moléculas permite confirmar que el aumento de producción de nitritos en un cultivo está dado por este mecanismo. Incremento de la síntesis de la enzima óxido nítrico sintasa inducible (iNOS o NOS2) La producción de NO en altos niveles se cataliza por la acción de la enzima óxido nítrico sintasa inducible. La expresión de esta enzima se produce por la acción de IFN y LPS en los cultivos y se relaciona con la activación de macrófagos in vivo. Para la evaluación del aumento en la producción de esta enzima se utilizan anticuerpos monoclonales que reconocen su estructura marcados con enzimas que se utiliza para identificarla en los extractos proteicos celulares evaluados mediante las técnicas de SDS-PAGE e Inmunoblot. Evaluación del efecto bacteriostático o bactericida La digestión de las partículas ingeridas depende no sólo de los mecanismos O dependientes y O independientes descriptos sino de la capacidad del microorganismo de evadir o inhibirlos, las bacterias intracelulares pueden permanecer en estas células fagocíticas que se transforman en su habitat. En el caso de bacterias extracelulares u otros patógenos este mecanismo se constituye como capaz de contener o eliminar al agente agresor constituyéndose en un mecanismo efector bacteriostático o bactericida. Estos mecanismos pueden ser evaluados utilizando técnicas de cultivo bacteriano y determinando el número de unidades formadoras de colonias sobrevivientes al proceso de fagocitosis. Deficiencias en el mecanismo de fagocitosis Las deficiencias pueden estar dadas en el número de células fagocíticas que posee un individuo (diferencias cuantitativas) o sobre la funcionalidad de alguno de los mecanismos descriptos (diferencias funcionales). Las granulocitopenias son frecuentes en las deficiencias secundarias a enfermedades linfoproliferativas, tratamientos inmunosupresores o excesiva destrucción mediada por anticuerpos anti-leucocitarios. Las deficiencias funcionales pueden afectar la movilidad y adherencia o la capacidad de ingestión y digestión. Algunas de las deficiencias descriptas como entidades clínicas son: Enfermedad Granulomatosa Crónica Deficiencia en la adhesión leucocitaria Deficiencia en glucosa 6 fosfatodeshidrogenasa Deficiencia en los gránulos secundarios Para el diagnóstico de estas inmunodeficiencias se trabaja con niveles de complejidad crecientes. Ensayos de nivel básico:

1. Determinación cuantitativa y morfológica de los granulocitos y monocitos. 2. Estudios de mecanismos microbicidas oxigeno dependientes.

a) Prueba de la reducción del nitroazul de tetrazolio. b) Quimioluminiscencia. Ensayos de nivel complejo:

1. Estudio de la expresión de las proteínas de adhesión (antígenos LFA-1, CD11b/CD18, etc.) 2. Ensayos de quimiotaxis. 3. Estudios enzimáticos: mieloperoxidasa, glucosa 6 fosfatodeshidrogenasa, etc.

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Bibliografía 1. Wyllie J. Currents Protocols in Immunology.1994. 2. Margni R.A. Inmunología e Inmunoquímica. Fundamentos. Editorial Médica Panamericana

S A 1996. 3. Baehner RL, Nathan DG. Quantitative nitroblue tetrazolium test in chronic granulomatous

disease. N.Engl. J. Méd. 278: 971-976. 1968. 4. Abramson JS, Wheeler JG. The Neutrophil. Oxford University Press. 1992. 5. Aderem A, Underhill DM. Mechanisms of phagocitosis in macrophages. Ann Rev Immunol

1999. 17:593-623.

Complemento El sistema de complemento (C) está formado por unas 30 proteínas del suero que interaccionan entre sí de modo regulado formando una cascada enzimática que permite una amplificación de la respuesta inmune humoral. Las principales consecuencias de la activación del C son: 1. Lisis del microorganismo o célula diana 2. Opsonización, con la consiguiente mejora de la fagocitosis y destrucción del

microorganismo fagocitado 3. Quimiotaxis sobre los fagocitos 4. Acción anafilotóxica, 5. Eliminación de inmunocomplejos circulantes El complemento puede activarse por tres vías: 1. La vía alternativa, en la que interacciona directamente con la superficie del microorganismo. 2. La vía de las lectinas, una especie de variante de la vía clásica, pero que se inicia sin

necesidad de anticuerpos 3. La vía clásica, a través de la interacción del C con inmunocomplejos. Las tres rutas comparten las últimas fases, consistentes en el ensamblaje del denominado complejo de ataque a la membrana (CAM). El complemento puede ser estudiado para determinar su concentración o funcionalidad en un animal sospechoso de padecer una inmunodeficiencia o una enfermedad autoinmune. La concentración de los factores del complemento en un suero problema se miden por inmunodifusión simple radial o prueba de Mancini (ver capítulo sobre reacciones secundarias). La funcionalidad del complemento en un suero problema se evalúa por la técnica de hemólisis. Por otra parte, el complemento puede ser utilizado como un indicador de que la reacción Ag-Ac tuvo lugar, ya sea para identificar antígenos como anticuerpos. Por ejemplo, la lisis por complemento se puede utilizar para tipificar grupos sanguíneos en animales utilizando anticuerpos específicos. Mientras que, la técnica de fijación de complemento se emplea para detectar Acs específicos para el diagnóstico de algunas enfermedades infecciosas, utilizando un Ag de referencia. Fundamentos de la hemólisis mediada por complemento: Cuando a una suspensión de GR sensibilizados con anticuerpos específicos se le agrega complemento, se produce la hemólisis y la consiguiente liberación de hemoglobina (Hb) en el sobrenadante. Esta concentración de Hb está en función directa con el grado de hemólisis que tuvo lugar en la muestra y puede ser evaluada por absorción a 542 nm en un espectrofotómetro. Los estudios de cinética de esta inmuno-hemólisis han demostrado que la sensibilidad de estas valoraciones es mayor cuando el título se establece sobre la base de la dosis de complemento que produce la lisis del 50% de los hematíes del sistema. Esto tiene una explicación clara si se analiza la curva que resulta de graficar los porcentajes de hemólisis en función de la cantidad de complemento agregado al sistema, puede observarse que dicho gráfico no corresponde a una recta, sino a una curva sigmoidea que presenta una marcada pendiente en la zona que va del 25 al 75% de hemólisis. Los extremos de la curva,

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que corresponden a la zona que va del 0 al 25% y del 75 al 100 % de hemólisis, presentan una pendiente significativamente menor o nula. De este gráfico se deduce que, cuando se hacen cuantificaciones de C a 50% de hemólisis, el consumo de pequeñas cantidades de complemento produce cambios significativos en el porcentaje de hemólisis. Esta relación no se observa cuando las cuantificaciones de C se realizan sobre la base del 100% de hemólisis. Por esto, la técnica es más sensible basándose en el 50% de hemólisis. Se define así la unidad de complemento hemolítica 50% (CH50), que corresponde a los mililitros de suero fresco completo (como fuente de complemento) que son necesarios para producir la lisis del 50% de los GR sensibilizados con anticuerpos, durante una hora de incubación a 37ºC. La unidad CH50 se calcula sobre 5 X 108 eritrocitos óptimamente sensibilizados, resuspendidos en un volumen total de 7.5 ml, en presencia de concentraciones óptimas de Calcio y Magnesio, a una fuerza iónica y a un pH óptimo para cada especie. Evaluación de la funcionalidad del complemento en un suero problema En la prueba para evaluar la funcionalidad del complemento, los sueros de los animales problema y de referencia se diluyen en forma seriada en un rango que va desde 1/20 a 1/320. Luego se agrega una suspensión estándar de eritrocitos óptimamente sensibilizados a cada dilución de suero. El complemento presente en el suero se activa por los Acs que recubren los GR (complejos inmunes) y causa la lisis de los eritrocitos (hemólisis). El porcentaje de hemólisis es proporcional a la concentración de complemento dentro de cada dilución de cada suero en particular. La hemoglobina liberada se mide en un espectrofotómetro luego del período de incubación. Se deben realizar los siguientes controles:

0% de hemólisis (buffer + GR sensibilizados), y

100% de hemólisis (agua destilada + GR sensibilizados). El porcentaje de hemólisis para cada dilución de suero evaluado se calcula de la siguiente forma: DO (problema) - DO (0%lisis) % de hemólisis = x 100

DO (100% lisis) - DO (0%lisis)

Figura 1: Porcentaje de hemólisis en una muestra de GR sensibilizados en función de la cantidad de complemento agregado. El porcentaje de hemólisis se mide como la

concentración de Hb que se obtiene en el sobrenadante por absorción a 542 nm. Fuente de complemento: suero fresco de cobayo.

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Este ensayo produce también una curva sigmoidea si se grafica el % de hemólisis vs. la dilución del suero problema. El valor del 50% de hemólisis es el elegido para definir el título de un suero como la inversa o recíproca de la dilución del suero que produce un 50% de hemólisis. Las muestras de suero que van a ser utilizadas para evaluar la función del C deben ser conservadas a -70ºC dentro de las 2 hs de extraídas, dada la labilidad de las proteínas del C. Mediante esta técnica se evalúa la vía clásica de activación del complemento. Este ensayo también puede ser realizado usando placas de agarosa que contienen GR sensibilizados. El suero se agrega en hoyos cavados en la placa de agarosa y se permite que difunda durante 20 hs a 4ºC. Las placas se incuban luego a 37ºC por 90 min para permitir la hemólisis, que se ve como un anillo rodeando los hoyos, cuyo diámetro es proporcional al logaritmo de la concentración del complemento en el suero.

Anticuerpos Obtención de anticuerpos policlonales o sueros hiperinmunes: Cuando se inmuniza un animal con un antígeno y se provoca una respuesta inmune aumenta notablemente en el suero del animal la cantidad de Igs específicas frente al antígeno empleado. Esto es la consecuencia de la selección clonal de los linfocitos B que producen anticuerpos contra el antígeno, el cual puede presentar diferentes epitopes, y cada uno de ellos ser reconocido por varios clones de linfocitos B que producirán inmunoglobulinas específicas. Como consecuencia de esta respuesta inmune humoral específica se acumulan un número desconocido, posiblemente elevado, de diferentes moléculas de inmunoglobulinas específicas frente al antígeno en el suero del animal inmunizado. Se trata de un suero producido por la acción de síntesis de numerosos clones de linfocitos B y por ello se ha denominado policlonal. (Figura 1)

Figura 1: Producción de anticuerpos policlonales.

Anticuerpo policlonal

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El proceso de inmunización es aquel en el que se inyecta al animal el antígeno sólo o con adición de adyuvantes, cuya función es favorecer su inmunogenicidad. Cuando la inmunización se realiza sobre animales vírgenes o “naive”, a la primera dosis se la describe como: inmunización primaria o respuesta primaria. La primer dosis induce la sensibilización del individuo generando la expansión de los clonos específicos y la aparición de células de memoria, pero la calidad de la respuesta en niveles de anticuerpos y células específicas puede ser incrementada y mejorada en dosis sucesivas, por lo tanto en los planes de inmunización se aplican diversas dosis. Existen numerosos protocolos de inmunización, con una duración variable, aunque una fase de inmunización primaria suele durar de 1 a 3 meses con inyecciones cada 15 a 21 días, y el proceso puede durar de 3 a 6 meses (puede variar también de acuerdo con la especie a inmunizar). La cantidad de antígeno dependerá del animal empleado. Los más comúnmente utilizados son ratón, rata, conejo, cabra y gallina. Las cantidades oscilan de los 50 a 1000 μg de antígeno para una dosis en ratón a los 0,25 a 5 mg por dosis en el caso de la cabra o los 15 mg en el caso de caballo. Cuando nuestro objetivo es obtener sueros hiperinmunes para utilizar como reactivos de diagnóstico o inmunidad pasiva, los planes están compuestos por varias dosis. Si nuestro objetivo es sueros anti-sueros de diferentes especies, debemos considerar la distancia filogenética para la elección de la especie dadora de suero. Como ejemplo, la utilización de la gallina como especie para obtención de anticuerpos tiene dos ventajas: la distancia filogenética existente con los mamíferos, y la purificación de los anticuerpos de la yema del huevo, es engorrosa pero su obtención no afecta la vida del animal dador. En conclusión, se denomina suero hiperinmune al obtenido de animales que han respondido a múltiples inoculaciones de un antígeno determinado. Las aplicaciones son numerosas, por ejemplo, como reactivos para el diagnóstico de ciertas enfermedades. Estos sueros contendrán anticuerpos policlonales en alta concentración contra los distintos componentes de un antígeno. Anticuerpos monoclonales

Kohler y Milstein desarrollaron una técnica que permitió la producción de anticuerpos producidos a partir de un solo clon de linfocitos B. El fundamento de la técnica consiste en fusionar linfocitos B provenientes de un ratón inmunizado con el antígeno de interés con líneas celulares provenientes de mielomas no secretante murino. Los híbridos resultantes presentan dos propiedades: secretan anticuerpos específicos hacia el antígeno empleado en la inmunización, proliferan indefinidamente y pueden ser mantenidos como líneas celulares.

Esta tecnología ha revolucionado el empleo de los anticuerpos, tanto en lo referido al enfoque diagnóstico como terapéutico. Es importante destacar que mediante esta metodología se pueden obtener anticuerpos homogéneos (ya que proviene de un único clon de linfocitos B) y de muy alta especificidad, lo que facilita la puesta a punto y repetitividad de varias técnicas inmunológicas. Los anticuerpos monoclonales son inmunoglobulinas secretadas por un único clon de linfocitos B y por lo tanto, con idéntica secuencia aminoacídica en sus regiones variables. Poseen una especificidad única, con una afinidad hacia el antígeno determinada e invariable y presentan un único isotipo. En estas características residen las principales ventajas que presentan los anticuerpos monoclonales para su uso en investigación y diagnóstico. Por el contrario, los anticuerpos policlonales consisten en una mezcla de inmunoglobulinas provenientes de distintos clones de linfocitos B. A continuación se enumeran las principales diferencias entre anticuerpos monoclonales y policlonales: Anticuerpos monoclonales: 1. Son químicamente homogéneos, poseen las propiedades individuales de la secuencia de

aminoácidos de ese particular anticuerpo. 2. Son de especificidad definida porque todas las moléculas tienen la misma región

hipervariable.

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3. Poseen una única avidez y afinidad. 4. Su estabilidad físico-química depende de cada anticuerpo monoclonal en particular. Pueden

ser sensibles a cambios de pH, temperatura, liofilización y marcación con enzimas o isótopos.

5. En general, no poseen reactividad secundaria, o sea, no forman complejos antígeno-anticuerpo insolubles con antígenos mono o bivalentes. Pueden hacerlo si el antígeno tiene epitopes repetitivos.

6. Se pueden producir en cantidades ilimitadas. Anticuerpos policlonales: 1. Son heterogéneos. Sus propiedades constituyen un promedio de las propiedades de los

distintos anticuerpos constituyentes (del antisuero). 2. Son una mezcla de anticuerpos con especificidades propias para cada epitope del

inmunógeno. Por lo tanto, la probabilidad de reacciones cruzadas con epitopes de otros antígenos es mayor a la de los anticuerpos monoclonales.

3. Su avidez y afinidad corresponden al conjunto de la mezcla de anticuerpos y varían en función del momento de la respuesta inmune en que se realizó la determinación. Así, la afinidad media de los anticuerpos detectada al comienzo de una respuesta inmune será menor que la detectada a medida que la respuesta inmune avanza. Estos se debe a que a medida que la respuesta inmune se va desarrollando, se produce la maduración de la afinidad de los anticuerpos.

4. Son estables como consecuencia de su heterogeneidad, lo que permite que sean más resistentes frente a distintos cambios físico-químicos.

5. Poseen reactividad secundaria debido a la presencia de múltiples anticuerpos dirigidos contra distintos epitopes en la molécula antigénica, lo que permite la formación de una red antígeno-anticuerpo.

6. Se producen en animales inmunizados. Por lo tanto, es difícil de estandarizar.

Purificación y fraccionamiento de anticuerpos

1-Aislamiento y Purificación de Anticuerpos

El aislamiento o la purificación de anticuerpos se requiere para un gran número de técnicas, tanto de diagnóstico como de investigación. Existe una amplia variedad de métodos utilizados para purificar anticuerpos. La correcta elección del método de purificación dependerá de un número de variables, que incluyen: el uso posterior de los anticuerpos purificados, la especie y el material a partir del cual se parte, la clase y subclase de Ig (en el caso de un anticuerpo monoclonal). En la tabla 1 se muestran las posibles fuentes de anticuerpos para su purificación. Tabla 1: Comparación de diferentes fuentes de anticuerpos

Fuentes Tipo de

Anticuerpo

Concentración de Anticuerpos

totales (mg/ml)

Concentración de Anticuerpos específicos

(mg/ml)

Anticuerpos contaminantes

Posible pureza de anticuerpos

específicos (%)

Suero policlonal 10 1 (10% máximo) Otros Ac del

suero 10% como

máximo

Sobrenadante de cultivo de

hibridoma (con 10% de Suero Fetal Bovino)

Monoclonal 1 0.05 (5%) Anticuerpos

bovinos > 95%

Sobrenadante de cultivo (sin Suero Fetal)

Monoclonal 0.05 0.05 (100%) Ninguno >95%

Líquido ascítico Monoclonal 1-10 0.9-9 (90%) Anticuerpos de

ratón 90%

Fuente: Antibodies A Laboratory Manual. Ed. Ed. Harlow y David Lane. Cold Spring Harbor Laboratory. 1988. pp726.

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Métodos de Aislamiento y purificación

1-a Precipitación Las interacciones de una proteína en agua ocurren entre las moléculas de proteína-agua y proteína-proteína. Cuando predominan las interacciones proteína-agua, éstas se hallan en solución; cuando predominan las segundas (proteína-proteína), éstas precipitan. Cuando a una proteína que se encuentra en solución acuosa agregamos una sal, como la sal es más hidrofílica que la proteína, interacciona con el agua, le quita el agua y hace que predominen las interacciones proteína-proteína. Por lo tanto, la proteína precipita. Es importante considerar el pH de la solución de trabajo: Cuando el pH de la solución es igual al punto isoeléctrico (pI) de la proteína, la carga neta de dicha proteína es cero y por lo tanto sus moléculas no se repelen, se aglomeran y precipitan. Es conveniente trabajar con sulfato de amonio a 4ºC: A mayor temperatura, mayor solubilidad proteica y viceversa; esto se cumple para el rango de 0 a 40ºC. En resumen, los factores que afectan la concentración salina a la cual una proteína en particular precipitará son: 1- el número y la posición de los grupos polares; 2- el peso molecular de la proteína a purificar; 3- el pH de la solución; 4- la temperatura a la que se desarrolla la precipitación.

Precipitación salina La precipitación salina es un método que permite separar las distintas fracciones proteicas del suero. Las sales mas comúnmente utilizadas son el sulfato de amonio y el sulfato de sodio. La ventaja de trabajar con sulfato de amonio es que no se cristaliza a temperaturas bajas ni a temperatura ambiente, como lo hace el sulfato de sodio. La concentración de sal a la cual precipitan los anticuerpos varía según la especie. Por ejemplo, la mayoría de los anticuerpos de conejo precipitan con una solución saturada al 40%, mientras que los anticuerpos de ratón necesitan entre 40-50%.

Precipitación con ácido caprílico La adición al suero de ácidos grasos de cadena corta como el ácido caprílico en condiciones medianamente ácidas, precipita la mayoría de las proteínas con excepción de las IgGs. Esta metodología, por lo tanto, permite obtener IgG purificada a partir de suero si se la realiza en combinación con otras metodologías (por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico). 1-b Cromatografía La característica que distingue a los métodos cromatográficos es la presencia de dos fases mutuamente no miscibles (una móvil y una estacionaria) que se hallan en contacto. La muestra a purificar se introduce en la fase móvil, por lo que es transportada a lo largo de una columna que contiene la fase estacionaria homogéneamente distribuida. Los diferentes componentes de la muestra experimentan repetidas interacciones entre la fase móvil y la fase estacionaria. Durante el proceso, los componentes de la muestra se separan en función de su interacción con la fase estacionaria: el componente que menos interactúa es el menos retenido y eluye primero, el que más interactúa resulta retenido más fuertemente y eluye último. Una separación óptima entre dos componentes de una muestra se obtiene cuando el componente que eluye en segundo término es retenido lo suficiente como para impedir su superposición con el componente que eluyó en primer término. Las macromoléculas biológicas difieren en sus características fisicoquímicas: tamaño, forma, carga, hidrofobicidad y arreglo de sus grupos funcionales dentro de su estructura tridimensional. La separación de las muestras entre las fases aprovecha las diferencias entre las propiedades fisicoquímicas de cada uno de los componentes de una muestra dada. Es lógico, por lo tanto, que los métodos cromatográficos más comunes para la purificación de estas moléculas sean:

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Cromatografía de exclusión molecular (discriminación por tamaño y forma),

Cromatografía de intercambio iónico (discriminación por carga),

Cromatografía de interacción hidrofóbica (discriminación por superficie hidrofóbica),

Cromatografía de afinidad (distribución de aminoácidos específicos en la superficie de las proteínas, inmovilización de metales).

Cromatografía de Exclusión Molecular

Fundamentos:

Este tipo de cromatografía utiliza como soporte esferas de gel con poros de diferente tamaño. Una columna construida de esta manera tendrá dos volúmenes medibles, el volumen externo (Vo), constituido por el volumen intersticial (el espacio que queda entre las esferas de gel), y el volumen interno (Vi) que es el volumen de las esferas a los que los solutos y solventes pueden acceder cuando se introducen dentro de aquéllas a través de sus poros. Las moléculas que no puedan acceder al Vi, debido a que su tamaño es mayor al de los poros, sólo se equilibrarán en el Vo, mientras que las de menor tamaño se equilibrarán en ambos volúmenes. Cuando una muestra compleja de proteínas y otros componentes, disuelta en un pequeño volumen, es aplicada a una columna con estas características, filtrará a través de la misma. Las proteínas de mayor peso molecular eluirán con el Vo y por lo tanto eluirán primero, mientras que las proteínas de menor tamaño, que pueden acceder al Vi, eluirán más tardíamente y en un volumen de elución (Ve) determinado que dependerá de su peso molecular. Ver esquema

Aspectos metodológicos: La matriz más utilizada en este tipo de cromatografía es ”Sephadex ®”, que se expende en

forma de polvo y puede tener diferentes tamaños de poro, lo que implica la separación de proteínas de diferente tamaño.

Las muestras no pueden contener una concentración proteica de más de 50 mg/ml. Las muestras deben ser clarificadas por centrifugación a fin de eliminar todo el material insoluble que pueda disminuir el flujo de la columna y contaminar la matriz de la misma previo a la cromatografía.

La fuerza iónica de los solventes cromatográficos debe ser lo suficientemente elevada como para impedir la adsorción inespecífica del soluto a la matriz por interacciones electrostáticas o uniones de Van Der Waals

Como las moléculas de IgM son mucho más grandes que las moléculas de IgG y de otras proteínas que se encuentran en el suero, la cromatografía de exclusión molecular puede

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ser usada para separar IgM. Cuando se requiere obtener una preparación pura de IgM, se puede utilizar esta técnica combinada con la precipitación con sulfato de amonio.

Cromatografía de Intercambio Iónico

Fundamentos:

La cromatografía de intercambio iónico trabaja mediante la unión de biomoléculas con una carga determinada, a una matriz estacionaria de carga opuesta. Las biomoléculas se unen a resinas de intercambio iónico cuando tienen carga opuesta a la de los iones fijos de la resina. Esta unión es de tipo electrostático y reversible: La fuerza de esta unión puede ser modificada variando la concentración salina y el pH de la solución buffer utilizada como eluyente. La separación de dos o más sustancias mediante la utilización de resinas de intercambio iónico se consigue por un mecanismo de adsorción reversible, que consiste en la fijación inicial y posterior remoción de tales sustancias a una resina estabilizada. Si las sustancias fijadas tienen diferentes propiedades eléctricas, mediante la variación del pH o fuerza iónica del eluyente se conseguirá que cada una de ellas eluya por separado. Matrices y solventes: La matriz puede estar constituida por silicato de aluminio, resinas sintéticas, polisacáridos como la celulosa o el dextrano, etc. La naturaleza de los grupos cargados es la que determina el tipo y la fuerza de unión del ión intercambiador. Los dos tipos de resinas más utilizadas son:

de intercambio catiónico (con matrices con carga negativa) y

de intercambio aniónico (con matrices con carga positiva). La elección correcta de la resina, en especial en lo que se refiere al grupo funcional que le aporta la carga, dependerá de la carga neta de la sustancia que se desea separar. En los casos de moléculas anfotéricas como las proteínas, que poseen grupos cargados positiva y negativamente, su carga neta dependerá del pH del medio. Estas sustancias, según sea el pH del medio, podrán unirse a resinas aniónicas o catiónicas; en su punto isoeléctrico (pI), tendrán carga neta cero y no se fijarán a ningún tipo de resina intercambiadora.

Cromatografía de Afinidad Fundamentos: La técnica de cromatografía de afinidad es una de las técnicas más utilizadas para la purificación de proteínas. Consiste en una cromatografía de adsorción en la que se aprovecha la especificidad de interacciones biológicas como las interacciones antígeno-anticuerpo, enzima-inhibidor, hormona-receptor, lectina-hidrato de carbono, etc. La biomolécula que se quiere purificar (por ejemplo, un anticuerpo) usualmente tiene un sitio de reconocimiento a través del cual puede interactuar con otra molécula natural o artificial a la que se llama ligando. El ligando es inmovilizado sobre una matriz polimérica y es usado para capturar selectivamente a la biomolécula que se desea purificar, cuando ésta se encuentra en una mezcla impura. La biomolécula deseada puede ser eluída del ligando por cambios en las condiciones externas (pH, fuerza iónica, solventes y temperatura) que desestabilizan la interacción biomolécula–ligando y permiten que la molécula deseada sea eluida en forma purificada. Existe una gran diversidad de biomoléculas que pueden purificarse por este método cromatográfico, entre ellas: antígenos, anticuerpos, enzimas, proteínas unidas a hormonas, proteínas unidas a vitaminas, receptores, glicoproteínas, lectinas, ARN, ADN, bacterias, virus, fagos, células y proteínas producidas por ingeniería genética. La naturaleza de la matriz a la que se fijan los ligandos es muy importante, ya que en las condiciones experimentales debe ser física y químicamente estable, no debe actuar como tamiz molecular y debe asegurar un buen flujo durante la elución. Existen numerosas matrices comerciales disponibles en su forma activada o sin activar para ser utilizadas como soporte para el ligando. La activación de la matriz se realiza para que el

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ligando quede inmovilizado en ella a través de una interacción química que produzca una unión estable entre matriz y ligando. En general, se utilizan matrices de naturaleza polisacárida, en su mayoría derivados de la agarosa. Debido a su estructura química, estas matrices tienen la característica de ser casi inertes, de forma que no producen interacciones inespecíficas. Esto es esencial porque la cromatografía de afinidad se basa en interacciones específicas. La selección del ligando utilizado en cromatografía de afinidad debe tener en cuenta: 1- que la afinidad de unión del ligando sea específica y reversible por la sustancia que será purificada. 2- que el ligando posea grupos químicamente modificables que permitan su unión a la matriz sin que se destruya su capacidad de unión a la sustancia que será purificada. Por ejemplo, si el ligando es un anticuerpo, éste se va a unir a la matriz a través de su porción Fc, y por lo tanto, quedará libre el sitio de unión al antígeno. Al agregar un antígeno, éste será reconocido y unido por el anticuerpo inmovilizado en la columna. Las demás moléculas presentes pero no unidas a la matriz (no reconocidas por el ligando) se eliminan por lavado. Posteriormente, el antígeno unido al anticuerpo de la columna se eluye y se obtiene en forma pura. El ligando idealmente debería tener una afinidad de unión de 10-4 a 10-8 M-1 en solución. Si la constante de disociación es mayor que 10-8 M-1 esta técnica no puede ser utilizada para la purificación de estas moléculas pues la unión es muy estable y la separación de la biomolécula del ligando se hace muy difícil. Estas afinidades muy altas corresponden a la interacción hormona-receptor para lo cual este método no resulta útil.

Ejemplos:

Purificación por columna de proteína A-sepharosa:

La proteína A se encuentra en las paredes celulares de Staphylococcus aureus y tiene la particularidad de unirse al fragmento Fc de anticuerpos. Se han encontrado proteínas similares en otras bacterias (por ejemplo proteína G en Streptococcus sp.). Aunque se desconoce la explicación biológica de la fuerte afinidad que tienen la proteína A y la proteína G con las moléculas de IgG, se supone que representaría un mecanismo de escape de las bacterias a la respuesta inmune del huésped. A partir del estudio de estas proteínas, se las comenzó a utilizar para purificar específicamente anticuerpos a partir de una muestra impura. La proteína A se acopla a una matriz de sepharosa activada. En la Tabla 2 se muestran las afinidades de las proteínas A y G con anticuerpos de diferentes especies: Tabla 2

Especie Afinidad por Proteína A Afinidad por proteína G

Humano ++++ ++++

Caballo ++ ++++

Vaca ++ ++++

Cerdo +++ +++

Oveja +/- ++

Cabra - ++

Conejo ++++ +++

Hamster + ++

Pollo - +

Cobayo ++++ ++

Rata +/- ++

Ratón ++ ++

Fuente: Antibodies A Laboratory Manual. Ed. Ed. Harlow y David Lane. Cold Spring Harbor Laboratory. 1988. pp726.

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Purificación por columnas de inmunoafinidad En este caso se puede utilizar una columna a la que se une un anticuerpo específico frente al antígeno que se va a purificar o una columna a la que se une un antígeno, al colocar la muestra a purificar solo se unirán los anticuerpos específicos frente a ese antígeno.

Purificación por columnas de afinidad a metales

El níquel es un metal que tiene afinidad por el aminoácido histidina. Esta propiedad es aprovechada para la purificación de proteínas recombinantes a las que se le agrega una cola de 6 histidinas. La columna unida al níquel permite la purificación de dichas proteínas por su afinidad al aminoácido histidina. Posibles métodos de elución de la muestra: La fuerza de los complejos antígeno-anticuerpo depende de la afinidad relativa y la avidez de los anticuerpos. La orientación estérica, la densidad de acoplamiento y las interacciones no específicas pueden también influenciar la unión. Antígenos y anticuerpos están unidos por una variedad de fuerzas, las cuales incluyen: -Fuerza iónica -Interacciones hidrofóbas -Puentes de hidrógeno -Fuerzas de Van Der Waals El objetivo de la elución es recuperar la proteína unida específicamente con un alto rendimiento, pureza y estabilidad. Para ello es necesario recuperar los antígenos o anticuerpos provenientes de los inmunocomplejos. 1-Elución específica: Utiliza soluciones de elución con diferentes características, entre las cuales se encuentran alto pH, presencia de calcio o magnesio, presencia de agentes quelantes como el EDTA, etc. 2-Elución ácida: Se puede utilizar Glicina-HCl 0.02M pH 2.5, Citrato de sodio pH 2.5, etc. En algunos casos en que las soluciones que se utilizan aumentan las interacciones hidrofóbicas entre antígeno y anticuerpo, se obtiene una baja recuperación con este tipo de metodología. La disociación de estos complejos inmunes puede hacerse más efectiva si se incorpora ácido propiónico 1M o 10% de dioxano o etilenglicol al eluyente ácido. 3-Elución básica: Este tipo de elución se utiliza para obtener proteínas de membrana que se unen por interacciones hidrofóbicas y otros antígenos que precipitan en condiciones ácidas pero son estables en condiciones básicas. Es menos frecuentemente utilizada que la elución ácida. Pueden usarse los siguientes compuestos: NaOH 1M, Dietilamina 0.05 M pH 11.5, etc. 4-Elución por agentes caotrópicos: Estos agentes desestabilizan la estructura terciaria de las proteínas. Se utilizan para romper interacciones iónicas como los puentes de hidrógeno y algunas interacciones hidrofóbicas. Los agentes caotrópicos más utilizados son: guanidinio, urea-HCl 6M etc. En la Figura 1 se esquematiza la metodología de purificación de proteínas por columna de afinidad. Regeneración de las columnas El último paso, luego de la elución por cualquier método de elección, es la regeneración de las columnas de afinidad. Este paso es importante dado que las columnas pueden reusarse y tras sucesivos lavados con soluciones buffer se pueden utilizar para otras muestras.

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Figura1: Esquema de purificación de una proteína a través de una columna de afinidad

En la tabla 3 se muestran los métodos de purificación de anticuerpos. Generalmente es necesario utilizar varias técnicas para obtener una mejor purificación

Interacción ligando-receptor (unión reversible)

c) Elución de la muestra unida (receptor) en forma pura

pura

+

a) Inmovilización del ligando

+ Matriz

Ligando

b) Adsorción del ligando al receptor en una muestra

compleja

Muestra

+ impurezas

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Tabla 3: Métodos de aislamiento y purificación de anticuerpos

2- Fraccionamiento de anticuerpos El uso de un anticuerpo intacto en algunas técnicas inmunoquímicas introduce ciertos problemas. Por ejemplo, muchas células tienen receptores para el fragmento Fc de los anticuerpos y al interaccionar con ellos puede ocurrir activación celular, lisis, etc. Estos problemas se pueden resolver si se utilizan fragmentos de anticuerpos. Como método de estudio de la estructura de las inmunoglobulinas, se han empleado enzimas proteolíticas que clivan a los anticuerpos en diferentes fragmentos. Las enzimas que más se utilizan son la papaína, la tripsina y la pepsina. En la figura 2 se muestran los resultados esperados de la digestión de los anticuerpos con las diferentes enzimas.

La papaína cliva la molécula de IgG en tres fragmentos de semejante peso molecular (45 a 50kDa). Dos de estos fragmentos, idénticos entre sí, son denominados Fab (fragmento de unión al Ag). En ellos reside la capacidad de reconocimiento antigénico, expresando una única valencia. El tercer fragmento, denominado Fc (fragmento cristalizable) no participa en el reconocimiento antigénico.

La tripsina actúa de manera similar a la papaína y permite obtener los mismos fragmentos.

La pepsina, por su parte, cliva el fragmento Fc en piezas pequeñas y deja el resto de la molécula intacta. Esta porción intacta, denominada (Fab’)2, se halla constituida por dos fragmentos Fab unidos a través de los puentes disulfuro intercatenarios. Presenta, por lo tanto, dos sitios de reconocimiento antigénico por lo que su valencia es dos.

Aplicaciones Ventajas Desventajas A

isla

mie

nto

Precipitaciones y cromatografía de intercambio iónico (DEAE)

Aislamiento y concentración de anticuerpos de todas las fuentes

y espacios. No como paso único. Ácido caprílico para IgG.

Fácil. Bajo costo. Útil para grandes volúmenes.

Concentra la muestra.

Rinde anticuerpos impuros. No se usan solas. Ácido

caprílico no se usa para IgM.

Sulfato de amonio/ Ac. Caprílico – DEAE/ Sulfato de amonio

Aislamiento a partir de líquido ascítico y suero policlonal.

Bajo costo. Útil para grandes volúmenes. Rinde

anticuerpos casi puros.

Requiere múltiples pasos. Rendimiento moderado. Con

ácido caprílico solo IgG.

Exclusión molecular

Obtención de IgM. No como paso único.

Separa IgM de otros anticuerpos en sueros

policlonales.

Rinde anticuerpos impuros. Diluye la muestra. No para

IgG.

Pu

rifi

cació

n

Cromatografía de afinidad: Proteína A

Obtención de IgG. Anticuerpos puros. Fácil. Un

paso. Altos rendimientos. Caro.

Cromatografía de afinidad: Antígeno (Inmunoafinidad)

Purificación de líquido ascítico y sueros policlonales.

Rinde anticuerpos puros y específicos.

Caro. Muchos pasos. Antígenos puros.

Inactivación de anticuerpos.

Cromatografía de afinidad: Anticuerpo (Inmunoafinidad)

Purificación de clases y subclases de anticuerpos

específicos de sueros policlonales.

Rinde anticuerpos específicos de especie.

Caro. Rendimiento bajo a moderado. Muchos pasos.

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Un tercer fragmento de anticuerpos, el Fv, es de gran utilidad para los estudios de afinidad de antígeno y anticuerpo. Este fragmento está compuesto por las porciones variables de las cadenas liviana y pesada, con lo cual posee un sólo sitio de combinación al antígeno. Tanto el fragmento Fab como el fragmento (Fab’)2 están estabilizados por los puentes disulfuro intercatenarios. Dado que el fragmento Fv no posee estas uniones, debe estabilizarse agregando un péptido de unión o “linker”. El fragmento linker es una pequeña secuencia que une el extremo amino terminal de la cadena liviana con el extremo carboxiterminal de la cadena pesada. La estructura que se obtiene recibe el nombre de “single chain fracción variable” (scFv) que se puede sintetizar mediante técnicas de ADN recombinante.

Bibliografía: 1. Antibodies A Laboratory Manual. Ed. Ed. Harlow y David Lane. Cold Spring Harbor

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Pepsina Papaina

36

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10. Wilchek, M and chailen, I. An Overview of Affinity Chromatography. 2000. Methods in Molecular Biology. Vols 147: 1-6.

Proteínas del plasma y suero

La sangre está compuesta por células (eritrocitos, leucocitos y plaquetas) y plasma. Cuando se extrae sangre venosa con anticoagulantes, los elementos celulares en suspensión pueden ser separados por centrifugación. El sobrenadante que se obtiene, denominado plasma sanguíneo, posee un 10% de solutos disueltos, compuestos a su vez por un 2 % de nutrientes orgánicos y sustancias de desecho, un 1% de sales inorgánicas y un 7% de proteínas plasmáticas. Si por el contrario dejamos que la sangre extraída coagule y luego la centrifugamos, obtendremos lo que denominamos suero, que no posee fibrinógeno ya que es el precursor de la fibrina, proteína formadora del coágulo sanguíneo y se consume durante la coagulación. El suero contiene las mismas proteínas del plasma excepto el fibrinógeno y los factores V y VIII de la coagulación que son consumidos durante la formación del coágulo. El fibrinógeno, precursor de la fibrina, es producido por el hígado y constituye el 4 – 6 % de las proteínas totales del plasma. Si se somete un suero a una corriente eléctrica y bajo determinadas condiciones (electroforesis) las proteínas del suero se distribuyen en diferentes fracciones, a saber: *Albúminas: es la proteína más abundante del suero, varía según la especie entre un 35 y 50% de las proteínas totales. Es sintetizada por el hígado y su principal función es el mantenimiento del volumen (equilibrio osmótico). Además es transportadora de sustancias poco solubles en agua (ej: ácidos grasos libres). *Globulinas: la fracción globulínica de las proteínas plasmáticas es una mezcla muy compleja que se agrupa en cuatro fracciones con funciones diferentes: alfa-1, alfa-2, beta y gamma

1. -1 globulinas: Glicoproteínas Globulina fijadora de tiroxina Protrombina Antitripsinas HDL (lipoproteína de alta densidad)

2. -2 globulinas: Factor IX Antiplasmina Haptoglobina Ceruloplasmia Amiloide A VLDL (Lipoproteína de muy baja densidad) LDL (Lipoproteína de baja densidad)

3. -globulinas: Transferrina Fibrinógeno Factores del Complemento Proteína C reactiva

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Amiloide A Ferritina Pueden aparecer trazas de IgM, IgA e IgG en especies domésticas.

4. Fracción globulinas: IgM IgA IgE en concentraciones ínfimas IgG

Cada especie posee un perfil electroforético caracteristico, a modo de ejemplo se muestran los Valores Normales en suero para caninos Proteínas Totales 5.50 - 7.50 g/dl

Albúminas 2.47 - 3.60 g/dl

Globulinas 0.66 - 1.57 g/dl

Globulinas 1.04 - 2.17 g/dl

Globulinas 0.33 - 0.75 g/dl Relación A/G 0.70 - 1.20

Electroforesis Se conoce como electroforesis al movimiento de partículas cargadas bajo la influencia de un campo eléctrico. Cuando una mezcla de moléculas que presentan diferente carga neta y tamaño es colocada en un campo eléctrico uniforme, migran a distintas velocidades. Como resultado, ocurre la separación de estas sustancias. La velocidad de migración de una sustancia en un campo eléctrico depende de varios factores tales como la carga, el tamaño de la partícula, el pH, la fuerza iónica, la viscosidad del medio y además, la temperatura e intensidad de la electricidad. Las proteínas y los aminoácidos poseen cargas positivas y negativas debido a la presencia de grupos ionizables como el grupo carboxilo o el grupo amino, lo que hace que en una solución se comporten como anfolitos. Así, dependiendo del pH de la solución, pueden existir en tres formas iónicas: *Cargados positivamente *Cargados negativamente *Sin carga o como moléculas neutras (en una solución con pH igual a su punto isoeléctrico). El punto isoeléctrico (PI) de una molécula (en este caso una proteína) es el pH en el cual la carga neta de la misma es cero. Si se mantiene a este pH, la proteína no migra cuando se la somete a la acción de un campo eléctrico. El PI es inherente a la estructura primaria de la proteína, pues depende de cuáles aminoácidos forman la cadena polipeptídica. Por lo tanto, a determinado pH, distintas proteínas con distinto punto isoeléctrico tendrán distinta carga neta, lo que permitirá separarlas e identificarlas por medios electroforéticos. J. Tiselius fue el primero que utilizó la electroforesis en 1937 para separar los componentes del suero. Existen dos métodos generales para separación de proteínas por electroforesis: electroforesis libre o de frente móvil, que se realiza en una fase líquida, y electroforesis de zona, que utiliza una matriz sólida o soporte, como el papel de filtro,

membranas de acetato de celulosa o geles de almidón, poliacrilamida, agar o agarosa. Estos materiales son porosos e hidratados y permiten retener las proteínas.

De ambas, la electroforesis de zona es la que tiene mayor aplicación en el laboratorio clínico por su sencillez y mayor capacidad de resolución. Para la separación de las proteínas del suero, por ejemplo, se utiliza frecuentemente acetato de celulosa como matriz y se escoge un

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pH alcalino, en el que todas las proteínas están cargadas negativamente y migran hacia el polo positivo (ánodo). En estas condiciones, la albúmina es la que migra más rápidamente hacia el polo positivo, seguida por: alfa, beta y gammaglobulinas. Técnica La muestra se siembra sobre un soporte de agar o acetato de celulosa y se somete a corriente eléctrica. El paso de la corriente provoca la migración de las diferentes proteínas que conforman la muestra, pero cada una de ellas lo hará a una velocidad diferente según su punto isoeléctrico. El pH del buffer utilizado es de 8,6, a este pH, todas las proteínas están cargadas negativamente. La más cargada es la albúmina, con un PI mucho menor que el pH del medio (PI de la albúmina: 4,4); las menos cargadas, por el contrario, son las gammaglobulinas, con un PI mucho más cercano al pH del buffer (PI de las gamaglobulinas: 6,8-7,2). Por lo tanto, las albúminas son las que migran más rápido hacia el polo positivo, seguidas por las alfa, beta y por último las gammaglobulinas. Al efecto de la carga se suma el efecto electroendosmótico, que consiste en un movimiento en sentido opuesto a la corriente eléctrica que detiene parcialmente la corrida de las proteínas. Este es causado porque la mayoría de los soportes no son neutros. Debido a su carga fuertemente negativa, las albúminas logran superar ampliamente el efecto, mientras que las gammaglobulinas, cuya carga negativa es menor, no pueden superarlo tan fácilmente y quedan detenidas en el punto de siembra o incluso son arrastradas hacia el polo negativo.

Materiales

Tiras de acetato de celulosa para electroforesis Solución amortiguadora (Buffer Veronal pH 8,4-8,6) Cuba de electroforesis Fuente de poder Solución colorante Solución decolorante Solución transparentizante Densitómetro Integrador

Procedimiento

Es fundamental que todo el material que se vaya a utilizar esté bien limpio y seco. 1. Se sumergen las tiras en la solución amortiguadora (buffer) durante por lo menos 10

minutos. 2. Se elimina el exceso de líquido entre dos hojas de papel de filtro. 3. Se extienden las tiras sobre un portaobjetos teniendo la precaución de que no queden

burbujas entre el vidrio y la tira. Las tiras de acetato de celulosa tienen dos caras diferentes: una es la superficie penetrable donde deben sembrarse las muestras, la otra no es penetrable de tal manera que no debe ser utilizada para la siembra. Para diferenciarlas, las tiras tienen uno de sus ángulos recortado, este debe quedar ubicado en el ángulo inferior derecho.

4. Se coloca el portaobjetos sobre el puente de la cuba de electroforesis. 5. Se siembran las muestras con el sembrador. Los sembradores están estandarizados para

sembrar siempre el mismo volumen de muestra. Los equipos generalmente traen 3 sembradores de diferente volumen. Según el ancho de sembrador que se utilice, se podrán sembrar 1, 2 ó 3 muestras por tira. Una de las muestras se tiñe con azul de bromofenol, el cual se asocia a las moléculas de prealbúmina y permite identificar el frente de corrida.

6. La cuba se llena hasta una altura determinada con el buffer de corrida, se conecta a la fuente de poder y se aplica una corriente constante de 200 voltios durante 30 minutos. El grado de separación obtenido para las proteínas de una muestra dada, varía según sea la especie de la que de proceda la muestra y depende del tiempo de corrida y del voltaje aplicado. Por lo tanto, estos parámetros deben estandarizarse previamente según las

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necesidades de cada caso en particular. (Por ejemplo, una muestra de suero equino se corre a 200 voltios durante 25 minutos; una muestra de suero canino se corre a 180 voltios durante 20 minutos).

7. Una vez finalizada la corrida, se desconecta la cuba de la fuente de poder y se procede a colorear las tiras, sumergiéndolas durante 5 minutos en la solución colorante de proteinas.

8. Se procede luego a la decoloración de la tira, sumergiendo las tiras en solución decolorante. El objetivo del decolorante es barrer con el colorante que no se unió a las proteinas. Este procedimiento se repite hasta que las tiras queden blancas (es conveniente ir renovando la solución decolorante durante este procedimiento).

9. Las tiras se sumergen en metanol puro durante 30 segundos y luego en la solución transparentizante durante 1 minuto.

10. Las tiras se colocan sobre un portaobjetos con el ángulo cortado de la tira ubicado en el ángulo inferior izquierdo (en forma invertida a como lo sembramos), de esta forma la cara sembrada queda boca abajo, mirando el vidrio. No deben quedar burbujas entre el vidrio y la tira.

11. Los portaobjetos se colocan en una estufa a 80 ºC hasta su transparentización total. La tira de acetato debe quedar completamente transparente para que pueda efectuarse la medición por densitometría.

12. Las diferentes bandas de proteínas separadas a partir de la muestra original sobre la tira de acetato de celulosa, teñidas y transparentizadas, son leídas en un densitómetro. El aparato debe ser previamente calibrado según la longitud de onda que vamos a utilizar (generalmente 520 nm), el largo de la tira que vamos a medir y la concentración de proteínas de la que partimos. El densitómetro detecta y registra los datos de absorción de luz de cada banda de proteína y los transforma en un valor numérico de concentración y en un gráfico (ver figura al final del tema)

Aplicaciones de la electroforesis La electroforesis es un método extraordinariamente valioso para el diagnóstico de las alteraciones en los componentes proteicos del suero, orina y líquido cefalorraquídeo (LCR). Mediante esta técnica se puede diagnosticar un aumento, disminución o alteración de las proteínas (paraproteínemias) Por ejemplo ciertas patologías como: Mieloma múltiple: se detecta la aparición de una banda o curva restringida en la región de

las gamma globulinas, asociada a hallazgos anormales en la electroforesis de orina (proteína de Bence-Jones)

Hipogammaglobulinemias: Disminución de las gammaglobulinas. Esclerosis Múltiple: Aparición de bandas oligoclonales en el LCR (en humanos). Hipoproteinemias por pérdida de proteínas por el sistema digestivo: Disminución general de

todas las proteínas. Déficit de alfa-1 antitripsina: Disminución de las alfaglobulinas. Enfermedades infecciosas o neoplásicas agudas: Aumento de alfa-1 globulinas. Síndrome nefrótico o procesos hemolíticos: Aumento de alfa-2 globulinas. Debe hacerse hincapié que la electroforesis es casi siempre una prueba que puede llevar a un diagnóstico presuntivo de las anormalidades de las proteínas del suero, orina o LCR. Ejemplos de hiperglobulinemias Policlonales

- Infecciones virales, bacterianas (brucelosis, piodermis), hongos, parásitos (dilofilarias). - Enfermedades inmunomediadas:

Lupus eritematoso sistémico Trombocitopenia inmunomediada Anemia hemolítica autoinmune. Pénfigo. Artritis reumatoidea, Poliartritis

- Neoplasias (generalmente no relacionadas con el sistema inmune)

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Monoclonales - Neoplasias (Mieloma múltiple, linfosarcoma, macroglobulinemia.)

Ejemplos de hipoalbuminemias Resultado de enfermedades como insuficiencia hepática crónica y síndrome de mala

digestión – mala absorción. Hipergammaglobulinemia Secuestro de proteínas en cavidad pleural, peritoneal y tejido subcutáneo. Dilución por fluidoterapia. Patologías renales (glomerulopatías). Quemaduras Ejemplos de hiperalbuminemia Deshidratación

Patrones de electroforesis de anomalías de las proteínas séricas en diversas enfermedades

ACETATO DE CELULOSA PROTEINOGRAMA

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Patrón electroforético del LCR en un sujeto normal y en un enfermo con esclerosis múltiple

ACETATO DE CELULOSA PROTEINOGRAMA

Patrón electroforético de las anomalías urinarias en mieloma

ACETATO DE CELULOSA PROTEINOGRAMA

Bibliografía 1. Morilla A. y Bautista C. R. Manual de Inmunología México: Editorial Diana.1º edición,

septiembre de 1986. Capítulo 6. 2. Margni R. A. Inmunología e Inmunohistoquímica Fundamentos. Bs.As.: Editorial médica

Panamericana 1º edición, octubre de 1972. Edición consultada: 5º edición septiembre de 1996. Capítulo V.

3. Stites Daniel P. y Terr Abba I. Inmunología Básica y Clínica Editorial El Manual Moderno S.A. de C. V. México D.F. 7° edición. 1993 Sección II. Capítulo 18.

4. Inmunología básica. Guía de trabajos prácticos. Fac. Cs. Veterinarias. Año 2000.

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Electroforesis en Geles de Poliacrilamida (PAGE)

La técnica de electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) es un método analítico de mezclas de proteínas u otras sustancias que combina la velocidad de migración por acción de un campo eléctrico (relacionado con el tamaño molecular de la sustancia) con el tamizado molecular (relacionado con el tamaño del poro del gel soporte), para separar los componentes de una muestra simple o compleja. Los geles de poliacrilamida pueden ser:

PAGE no desnaturalizante: La muestra se analiza en su estado natural y este método nos permite identificar el peso molecular (PM) de sus componentes.

SDS-PAGE: La muestra se analiza luego de un proceso de disociación de la muestra con detergentes. Este método es el más utilizado en Inmunología y nos permite identificar antígenos o epitopes secuenciales ya que la muestra que se analiza está desnaturalizada o disociada.

A continuación describiremos las características del SDS-PAGE.

Las muestras a analizar son hervidas a 100C en presencia de un agente disociante (dodecilsulfato de sodio o SDS), presente en exceso y un agente desnaturalizante (2-mercaptoetanol o 2-ME). En estas condiciones, el grupo tiol del 2-mercaptoetanol rompe los puentes disulfuro que puedan existir y hace que la proteína se desdoble en sus polipéptidos constitutivos, los que fijan SDS en una relación constante (1.4g SDS/g de proteína). La carga del polipétido se hace insignificante ante el exceso de carga negativa del SDS. En consecuencia, la carga de todas las moléculas será idéntica y su desplazamiento en el campo eléctrico dependerá exclusivamente de su tamaño molecular.

El SDS-PAGE permite determinar aproximadamente el PM de una proteína si se la compara con patrones conocidos que hayan sido analizados simultáneamente.

El gel utilizado en esta técnica resulta de la polimerización en largas cadenas de acrilamida monomérica y su entrecruzamiento con la NN-metilenbisacrilamida. La polimerización necesita un iniciador del proceso, como el NNNN-Tetrametildiamina (TEMED) y el persulfato de amonio (PSA). El TEMED cataliza la formación de radicales libres a partir del persulfato de amonio.

La concentración de los componentes del gel (acrilamida y bis-acrilamida) utilizados en su armado determina el diámetro de poro. Cuanto mayor es el porcentaje de acrilamida/bis-acrilamida utilizado, más pequeño es el poro obtenido.

De acuerdo al PM que necesitemos estudiar se seleccionará un determinado poro de gel, por ejemplo:

15% de acrilamida permite separar un PM de 12 a 45 kD 10% de acrilamida permite separar un PM de 17 a 50 kD 5% de acrilamida permite separar un PM de 60 a 200 kD Las muestras se siembran en un gel de poro grueso (gel de paso rápido, apilamiento o stacking) que permite que todos los componentes de la muestra se concentren en una zona estrecha y comiencen la migración por el gel de separación en forma simultánea, lo que facilita la comparación entre muestras y los patrones de PM. Existen sistemas de geles continuos y discontinuos. En los sistemas discontinuos (los más usados) los buffers utilizados para los geles de apilamiento y de separación poseen diferente fuerza iónica y pH.

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En forma de síntesis los pasos a seguir son: A- Armado del gel de poliacrilamida B- Preparación de las muestras C- Siembra de las muestras en el gel D- Corrida electroforética E- Tinción del gel F- Análisis e interpretación de los resultados

Los geles teñidos muestran la complejidad de las muestras ya que en cada calle se observarán un número de bandas variables dependiendo de las distintas proteínas que componen la mezcla. La distancia que recorrió cada proteína en el gel desde el sitio de sembrado de la muestra es proporcional a su peso molecular, por lo tanto, cuanta más distancia recorrida menor el PM de esta proteína. Las proteínas del mismo PM corren en forma conjunta. Algunas de las utilidades son: Identificar el PM de los componentes en muestras complejas Identificar pureza en extractos purificados Constituir el primer paso para el análisis antigénico en muestras que se conoce como inmunoblot Anexo A modo de ejemplo, se describen los pasos necesarios para realizar un gel de poliacrilamida al 15% utilizando la cuba Mini-Protean II (nombre comercial del equipo provisto por laboratorios Bio-Rad). 1. Armado del gel entre de placas de vidrio:

Realizar una delicada limpieza de las placas de vidrio con alcohol etílico.

Formar un sándwich con ambos vidrios ubicando entre ellos los espaciadores.

Ubicar el sándwich en la abrazadera de manera que la placa más pequeña quede hacia delante (introducir entre ambos platos la tarjeta alineadora).

Ajustar los tornillos de la abrazadera en forma manera cruzada.

Verificar que no existan pérdidas de líquido: colocar agua entre ambos platos con una pipeta plástica y observar si el nivel de agua desciende.

Si existen pérdidas, rehacer el armado.

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2. Preparación de la solución de poliacrilamida-bisacrilamida

La preparación del gel de poliacrilamida debe realizarse en un frasco limpio y desengrasado. Debe trabajarse siempre con guantes y preferentemente con barbijo (la acrilamida es una sustancia neurotóxica que se absorbe a través de piel y mucosas).

El oxígeno inhibe la polimerización, por lo que se recomienda desgasificar el agua y todas las soluciones a utilizar.

Preparar el gel de separación: Agregar al frasco las respectivas cantidades de agua, mezcla de acrilamida: bisacrilamida (en una proporción de 30:0.8), 1.5 M Tris y SDS 10%.

Agregar los agentes iniciadores de la polimerización: PSA y TEMED. Se debe tener en cuenta que la mezcla comenzará a gelificarse, de manera que los pasos a seguir deberán realizarse con la debida celeridad.

Verter la solución con una pipeta plástica entre ambas placas hasta 2 cm por debajo del borde superior. Agregar rápidamente unas gotitas de agua sobre la solución para evitar el ingreso de oxígeno que retrasa la polimerización de la acrilamida.

Preparar el gel de apilamiento o stacking. Hacer esto mientras gelifica el gel de separación, que generalmente demora entre 20 y 30 minutos. No agregar el PSA ni el TEMED a la solución de gel de apilamiento hasta que el gel de separación haya gelificado.

Una vez ocurrida la gelificación, retirar el agua, verter el gel de stacking y colocar el peine (para generar las calles) suavemente, evitando la formación de burbujas.

Dejar que la acrilamida polimerice durante 60 minutos a temperatura ambiente. Una vez gelificado, retirar el peine.

3. Armado de la cuba Con el armado de la cuba se generan las dos cámaras entre las cuales pasará la corriente

eléctrica. Los geles de poliacrilamida quedarán comunicando las dos cámaras (una anódica y otra catódica) y el pasaje de corriente a través del gel producirá la corrida del material a analizar. Por lo tanto, del correcto armado dependerá el éxito del análisis de la técnica.

Se colocan ambos geles en el soporte ad hoc tomando en cuenta la limpieza de las gomas y su lubricación. Es fundamental que la cámara que se genera entre los dos geles no pierda. Para comprobar esto se debe cargar con buffer la cámara interna fuera del tanque y observar que no se produzcan pérdidas. Si esto sucede es posible sellar los bordes de la cuba con agar al 1%, hasta lograr el aislamiento de la cámara interior. Una vez logrado esto, se coloca el soporte dentro del tanque y se llena la cámara exterior con un volumen de buffer que llegue aproximadamente hasta la mitad de su altura. El buffer con que se llenan las cámaras y que se utiliza para la corrida es denominado buffer electrodo.

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4. Preparación de las muestras

El volumen máximo de muestra que puede sembrarse por cada calle es de 20l. En este caso, hay que considerar que la muestra está diluida en buffer muestra (preparado a una

concentración de 2X), y por lo tanto el volumen real de la muestra será de 10l. Una vez diluida la muestra en su buffer se debe hervir durante 10 minutos a fin de que se produzca la desnaturalización de las proteínas a estudiar. Nota: La sensibilidad de la técnica depende del colorante de proteínas que se va a utilizar para

ver las bandas, pero el rango de detección se encuentra entre 1 a 10g. En el caso de

muestras complejas conviene sembrar de 50 a 100g de proteína total.

5. Siembra de las muestras

Las muestras se siembran una por cada calle, tomando nota del orden en el que fueron sembradas para poder identificarlas más tarde. Como control se agrega una calle con marcadores de PM. Estos marcadores son una mezcla de proteínas con PM conocido que permiten confirmar el tamaño de un fragmento cualquiera en el gel.

6. Corrida

La cuba se conecta a la fuente de poder y se corre a voltaje constante, 70 volts durante 2 a 3 horas. El frente de corrida, marcado por el colorante presente en el buffer muestra, permite determinar en qué momento la muestra ha alcanzado la parte inferior del gel. Una vez concluida la corrida, se desconecta la fuente de poder y se desarma la cuba. Con guantes y una espátula se despega el gel de los vidrios. El destino de este gel puede ser la tinción o la

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transferencia a una membrana de nitrocelulosa para posteriormente identificar la proteína por inmunoreactividad.

7. Coloración de las proteínas corridas

Si el destino es la coloración para proteínas, se lo sumerge en colorante Azul de

Coomassie (Coomassie Blue). Este colorante permite detectar entre 0.2 a 0.5 g de proteínas. La solución colorante contiene ácido acético que permite fijar las proteínas a la vez que se tiñen. En los casos en que la sensibilidad de la tinción con Coomassie Blue no sea suficiente, se puede utilizar la tinción argéntica (Silver stain) que permite detectar hasta 2 ng de proteínas por banda. La tinción argéntica, además es útil para detectar polisacáridos y proteínas altamente glicosiladas.

Bibliografía

Antibodies A Laboratory Manual. Ed. Ed. Harlow y David Lane. Cold Spring Harbor Laboratory. 1988. pp726.

Mini-PROTEAN II Electrophoresis Cell Instruction Manual. Bio-Rad Margni, R.A. 1996. Inmunología e Inmunoquímica Fundamentos. Ed. Interamericana.

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Introducción a las técnicas serológicas

El diseño de una técnica inmunológica está relacionado con el resultado que pretendemos

obtener. Este resultado permite clasificarlas en:

TÉCNICAS CUALITATIVAS Indican la presencia o ausencia de una "sustancia" (antígeno o anticuerpo) en una muestra. En algunos casos el resultado es suficiente para confirmar un diagnóstico.

TÉCNICAS SEMICUANTITATIVAS Brindan una idea de la cantidad de “sustancia” presente en una muestra. A tal fin, la técnica se realiza sobre varias diluciones de la muestra para obtener el título, que es la inversa de la última dilución que da resultado positivo. El título es una manera indirecta de cuantificar la sustancia reaccionante y es directamente proporcional a la cantidad de "sustancia" presente en la muestra y al límite de detección de la técnica utilizada. Por esto, cuando tenemos un resultado expresado en título debemos indicar cuál fue la técnica empleada.

TÉCNICAS CUANTITATIVAS Determinan la cantidad o la concentración de la "sustancia" presente en una muestra. Requieren utilizar estándares de concentraciones conocidas que se evalúan simultáneamente con la muestra y nos permiten realizar curvas patrones. La cantidad de la sustancia presente en la muestra se calcula a partir de la curva patrón, por interpolación del resultado obtenido en la medición de la muestra problema. Controles internos y externos Para que una técnica sea convalidada necesitamos incluir controles internos y externos. Consideramos controles internos a aquéllos que se corren simultáneamente en cada prueba

que se realiza. Generalmente son históricos y deben corresponder a sueros o muestras cuyos resultados son positivos y a otros cuyos resultados deben ser fehacientemente negativos. Antes de realizar la lectura de las muestras problemas debe confirmarse que los resultados de los controles internos se encuentren dentro de los rangos esperados; de no ser así la prueba debe descartarse y repetirse para obtener un resultado confiable.

Nos referimos a controles externos a aquéllos que son evaluados en otros laboratorios, llamados “laboratorios de referencia”, que controlan y avalan nuestros resultados.

Método de obtención del título en las técnicas semicuantitativas Las técnicas semicuantitativas utilizan la dilución de la muestra a fin de evaluar los niveles de antígeno o anticuerpo presentes en ella. .

Diluciones Una dilución es una mezcla volumen/volumen en proporciones conocidas, formada por una cierta cantidad de la sustancia que queremos diluir, o soluto (en el ejemplo, un suero) más una cierta cantidad de diluyente (por ejemplo solución fisiológica o medio de cultivo) Puede expresarse como una fracción donde el numerador representa la unidad del soluto (S) y el denominador la suma del soluto más el diluyente (D), o sea el total de la solución. Por ejemplo - Dilución 1/2 (factor de dilución 2): 1 parte de S + 1 parte de D. - Dilución 1/5 (factor de dilución 5): 1 parte de S + 4 partes de D. - Dilución 1/8 (factor de dilución 8): 1 parte de S + 7 partes de D. - Dilución 1/10 (factor de dilución 10): 1 parte de S + 9 partes de D.

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Las diluciones pueden expresarse también en forma logarítmica, con sólo colocar el logaritmo del denominador de la fracción como potencia negativa. Así, por ejemplo: - la dilución 1/2 (log 2= 0.3) se expresa como 10 -0,3 - la dilución 1/10 (log 10=1) se expresa como 10 -1 Como se ve, S está más diluido en la dilución 1/10 (10-1) que en 1/8, 1/5 ó 1/2. (10-0,3) O sea, que la mayor de estas cuatro diluciones es 1/10. Para preparar una dilución 1/3, por ejemplo, se pueden usar diferentes volúmenes según el requerimiento de la técnica a usar: Dilución 1/3: 1 parte de S + 2 partes de D. - 0,3 ml de volumen final: 0,1 ml de S + 0,2 ml de D - (0,1/0,3 = 1/3) - 1,5 ml de volumen final: 0,5 ml de S + 1,0 ml de D - (0,5/1,5 = 1/3)

Una dilución seriada es aquélla en la que se realizan diluciones sucesivas del soluto, de forma tal que el factor de dilución se mantiene constante y la dilución anterior se utiliza como fuente de soluto para la dilución siguiente. Por ejemplo: Dilución seriada en base 2. (Factor de dilución=2) 1/2 x2 1/4 x2 1/8 x2 1/16 x2 1/32 x2 1/64 (2=1+1) 1+1 1+1 1+1 1+1 1+1 Dilución seriada en base 10. (Factor de dilución =10) 1/10 x10 1/100 x10 1/1000 x10 1/10000 (10=1+9) 1+9 1+9 1+9 En todos los casos, si deseamos mantener el volumen constante, se descarta del último tubo la misma cantidad que tomamos de cada uno de los tubos anteriores. El título nos da una idea de los niveles de antígeno o anticuerpo presentes en una muestra. La principal aplicación de este concepto se refiere al nivel de anticuerpos específicos (contra un antígeno dado) presente en un suero u otra muestra biológica. Para obtener el título de anticuerpos, por ejemplo, de un suero, se hace una dilución seriada de dicho suero y a cada dilución se la enfrenta con una cantidad fija del antígeno para el cual es específico. La reacción observada entre antígeno y anticuerpo dependerá de la técnica que se use (aglutinación, precipitación, ELISA, etc.). El título de anticuerpos presentes en el suero (título del suero) será la inversa de la mayor dilución en la que se observa reacción positiva. En el siguiente ejemplo: Dilución 1/2: reacción positiva Dilución 1/4: reacción positiva Dilución 1/8: reacción positiva Dilución 1/16: reacción positiva Dilución 1/32: reacción positiva Dilución 1/64: reacción negativa El título será la inversa de la dilución 1/32, es decir, 32.

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Si la dilución 1/64 hubiese dado un resultado positivo, deberíamos haber seguido diluyendo el suero hasta llegar al primer resultado negativo: cuando nuestro objetivo es obtener el título de un suero debemos llegar hasta la dilución límite o final de reacción. El nivel o título de anticuerpos específicos contra un antígeno en particular presentes en el suero de un individuo refleja la respuesta inmune humoral de ese individuo frente a ese antígeno. En medicina veterinaria, el análisis serológico poblacional es empleado para realizar estudios epidemiológicos, para establecer diagnósticos y desarrollar planes sanitarios frente a distintas enfermedades.

Conversión serológica o seroconversión Se dice que hay conversión serológica cuando el título de anticuerpos contra determinado antígeno en un individuo aumenta en por lo menos dos diluciones seriadas entre una primera y una segunda muestra de sangre obtenida esta última, por lo menos 15 a 20 días después de la primera. Una variación menor a 2 diluciones podría deberse sólo a variaciones en el procedimiento, o sea al error experimental aceptado. La seroconversión aporta datos referentes a la etapa de la infección en la que se encuentra un individuo, sobre todo en enfermedades tales como toxoplasmosis o leptospirosis, en las que únicamente el aumento del título de anticuerpos contra los respectivos microorganismos indica enfermedad aguda. Independientemente de la técnica utilizada para determinar el título podemos decir que dado que la capacidad de respuesta es propia de cada individuo y está influenciada genéticamente, sólo una comparación con valores propios (previos y posteriores) puede determinar si ha aumentado o disminuido la respuesta frente al antígeno.

Fundamentos de las técnicas serológicas

Las reacciones antígeno-anticuerpo (Ag-Ac) pueden llevarse a cabo in vitro si se respetan las condiciones fisiológicas en las que normalmente ocurren (pH, tonicidad, temperatura) y pueden emplearse como una herramienta diagnóstica de rutina tanto en laboratorios de investigación básica como en la clínica médica veterinaria. La reacción Ag-Ac implica una unión de tipo no covalente, reversible entre ambas moléculas. La forma complementaria de las nubes de electrones en el sitio de combinación entre el anticuerpo (paratope) y el determinante antigénico (epitope) hace que las dos moléculas encajen de manera ajustada, de modo que la distancia intermolecular se torna muy pequeña y aumentan en grado considerable las fuerzas de interacción no covalentes que participan en la unión. Cuando la complementariedad espacial no es la ideal, se produce superposición de las nubes electrónicas y se generan fuerzas de repulsión que determinan que la fuerza de unión (afinidad) sea diferente en distintos anticuerpos que reconocen un mismo epitope. La especificidad de la reacción antígeno–anticuerpo es de tal magnitud que el cambio de un solo aminoácido de una proteína puede provocar el reconocimiento nulo por parte de un anticuerpo o al menos variaciones significativas de su afinidad por la proteína modificada. Esta característica se emplea en diferentes campos de la investigación científica para la identificación y caracterización in vitro de infinidad de moléculas, tales como hormonas, drogas, etc. En el campo de la investigación aplicada y el laboratorio de diagnóstico, la especificidad de la reacción se emplea además para diferenciar e identificar virus, bacterias, glóbulos rojos (determinación de grupos sanguíneos) u otros antígenos en diferentes muestras biológicas (sangre, suero, orina, tejidos, etc). Las técnicas inmunológicas pueden ser de interacción primaria o secundaria

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De Interacción PRIMARIA: Ocurren en milisegundos y están determinadas por la afinidad del paratope del anticuerpo por el epitope de un antígeno. La reacción no se puede reconocer a simple vista, por lo tanto, para determinar si la misma tuvo lugar se emplean métodos en los que el antígeno o el anticuerpo se marcan con una molécula que puede ser un radioisótopo (en la prueba de RIA), una enzima (en las pruebas de ELISA, Inmunoblot e Inmunohistoquímica) o un fluorocromo (en la Inmunofluorescencia). Estos métodos transforman la reacción primaria en señales (radiactivas, colorimétricas o fluorescentes) que pueden interpretarse y cuantificarse.

De Interacción SECUNDARIAS: Es la consecuencia de la unión antígeno-anticuerpo luego de ocurrida la reacción primaria, dadas por las características del antígeno y del anticuerpo. Si el antígeno es polivalente (varios determinantes antigénicos) y el anticuerpo actúa como divalente o polivalente, se forma una red o entramado en el que un anticuerpo está unido a por lo menos 2 partículas antigénicas diferentes y cada partícula antigénica está unida a una o más moléculas de anticuerpo. Esta reacción puede observarse a simple vista. Según la solubilidad del antígeno involucrado en la reacción (soluble o particulado) recibe diferentes nombres:

SI EL ANTÍGENO ES SOLUBLE, SE DENOMINA PRECIPITACIÓN.

SI EL ANTÍGENO ES PARTICULADO, SE DENOMINA AGLUTINACIÓN.

De interacción TERCIARIAS: Cuando el reconocimiento del antígeno por el anticuerpo ocurre in vivo, pueden presentarse manifestaciones visibles en el animal evaluado. Características de una prueba serológica Las interacciones primarias Ag-Ac no siempre son detectables por interacción secundaria o terciaria. Existen requisitos mínimos para que las reacciones secundarias o terciarias se produzcan, que son de tipo cuantitativo, como la concentración del anticuerpo y del antígeno, y cualitativo, como las propiedades de la clase de inmunoglobulina comprometida en la reacción y las características del antígeno, además de la concentración de sales en el medio. Las pruebas serológicas aplicadas al diagnóstico de enfermedades infecciosas: El estado de enfermedad de un individuo se confirma por el aislamiento del agente causal. Esta confirmación constituye el denominado estándar de oro (gold standard). En enfermedades no infecciosas, el estándar de oro puede ser una biopsia u otro criterio que pueda diagnosticar inequívocamente la enfermedad. Dado que no siempre es posible la identificación del agente involucrado, la detección de anticuerpos específicos contra ese agente se puede emplear como herramienta para arribar al diagnóstico. Sin embargo, debemos considerar que la sola detección de anticuerpos específicos contra un microorganismo no significa que el individuo esté enfermo. Los anticuerpos calostrales y los producidos por vacunaciones son reconocidos de la misma manera que los producidos por el agente salvaje. No todas las pruebas serológicas tienen la misma capacidad para diferenciar los individuos sanos de los enfermos. Existen dos parámetros empleados generalmente para evaluar las pruebas diagnósticas en general y las pruebas serológicas en particular: la sensibilidad y la especificidad, que se obtienen al comparar los resultados obtenidos en la prueba evaluada con los obtenidos con la prueba estándar de oro o de referencia.

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Podemos definir entonces: SENSIBILIDAD: Es la habilidad de una prueba para detectar a TODOS los animales probadamente enfermos (positivos reales). ESPECIFICIDAD: Es la habilidad de una prueba para detectar SOLO a los animales probadamente enfermos (verdaderos positivos). Dicho de otra manera, es la capacidad detectar como negativos a los que verdaderamente negativos.

Técnica de Referencia o Infección Real

+ (enfermo)

- (sano)

Técnica Objeto de Valoración

+ A B

- C D

Los cálculos se realizan mediante las fórmulas: SENSIBILIDAD = A / A+C ESPECIFICIDAD = D / B+D

En las que: (A) Positivos en que coinciden ambos métodos (Positivos Verdadero). (B) Negativos reales que la técnica objeto de valoración da como positivos (Falsos Positivos).

(C) Positivos reales que la técnica objeto de valoración da como negativos (Falsos Negativos). (D) Negativos por ambas técnicas (Negativos Verdadero)

Resultado de la prueba: - + Valor de corte S: Proporción de verdaderos positivos que son detectados.

E: Proporción de verdaderos negativos que son detectados.

Población sana

Población enferma

S

E

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El término sensibilidad posee otra acepción que se refiere al nivel de detección mínimo o límite de detección de una técnica inmunológica. Este concepto se refiere a la cantidad mínima de anticuerpos reaccionantes necesaria para que éstos puedan ser detectados por una determinada técnica. En la tabla se ejemplifican los valores de sensibilidad como límite de detección de las técnicas inmunológicos a fin de compararlas

Técnica Límite de detección

(mg/ml de Ac)

RIA 0,0001

ELISA 0,0003

AGLUTINACIÓN 0,0300

INMUNOFLUORESCENCIA 0,5000

PRECIPITACIÓN (*) 1 - 4,0000

(*) Difusión doble en agar

ELISA

Engval y Perlmann en Holanda, al mismo tiempo que Van Weemen y Schuurs en

Suecia (1971) describieron una técnica inmunoenzimática para detectar antígenos o anticuerpos en líquidos corporales, como método alternativo al uso de radioisótopos radioinmunoensayo (RIA). Ambas (ELISA y RIA) son técnicas de interacción primaria. Esta técnica se denomina ELISA, por el acrónimo del término en inglés Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay o Ensayo Inmuno-absorbente Ligado a Enzimas. El ELISA es una técnica de interacción primaria que permite evidenciar la presencia de anticuerpos (o antígenos) a través de la unión específica con su antígeno (o anticuerpo) correspondiente que se encuentra unido a un soporte inerte. El revelado de esta interacción Ag-Ac se realiza utilizando alguno de los dos componentes de la interacción (generalmente un anticuerpo) marcado con una enzima (conjugado). La presencia de la enzima en la reacción se revela a través de la transformación de un sustrato incoloro en un producto coloreado. Existen diversos esquemas de la técnica que comprenden generalmente tres etapas: 1. Inmovilización del inmunorreactante (antígeno o anticuerpo) en la fase sólida. 2. Reacción del inmunorreactante con su correspondiente antígeno o anticuerpo. 3. Detección del antígeno o anticuerpo mediante la utilización de un segundo anticuerpo

conjugado con una enzima. Como toda reacción antígeno-anticuerpo, posee un equilibrio dinámico con una primera etapa reversible y una etapa irreversible. Esta cinética depende de la molaridad del medio (soluciones tamponadas -o buffers- utilizados) y del tiempo y temperatura en que se produce la reacción (incubación).

Enzimas utilizadas en los ensayos inmunoenzimáticos

Las enzimas a ser utilizadas en estos ensayos deben reunir ciertos requisitos.

Deben ser solubles en agua, incoloras, inodoras y atóxicas.

Deben ser estables al almacenamiento y luego de la detención de la reacción enzimática.

No deben ser fotosensibles.

Deben ofrecer un amplio rango de linealidad entre su concentración y la intensidad de color formado.

Los sustratos de estas enzimas deben poseer un alto coeficiente de extinción molar, con un máximo de absorbancia entre 400 y 600 nm.

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La peroxidasa y la fosfatasa alcalina son las dos enzimas más utilizadas. Desde hace

algunos años se ha difundido el uso de ureasa, -galactosidasa y glucosa-oxidasa. Peroxidasa Las peroxidasas son hemoproteínas que transfieren Hidrógeno desde un donante (DH) al O del H2O2. La peroxidasa más utilizada, obtenida del rabanito (HRP: Horse-Radish Peroxidase), posee un alto contenido en hidratos de carbono que facilita la conjugación a anticuerpos. Para revelar la reacción química producida se utilizan diferentes cromógenos, entre ellos:

2,2-azino-di-(3-etil-benzotiazolina)-6-sulfonato de diamonio (ABTS), que absorbe a 405 nm. cuando se oxida vira al color verde.

3-metil-2-benzotiazolinona hadrazona (MBTH), que reacciona con el ácido 3-(dimetilamino) benzoico (DMAB), que absorbe a 590 nm.

orto-fenilendiamina (OPD) o 1,2,-bencenodiamina, que absorben a 492 nm. Cuando se oxida vira al color ocre

Diaminobenzidina (DAB): cuando se oxida vira al color pardo El sustrato más utilizado con peroxidasa es el agua oxigenada o peróxido de hidrógeno (H2O2): La acción de la peroxidasa sobre el peróxido de hidrógeno degrada este compuesto dando agua y liberando oxígeno (O-). El oxígeno, a su vez, oxida al cromógeno que pasa de incoloro en su estado reducido a coloreado en su estado oxidado.

H2O2 (sustrato) PO H2O + O- (dador de electrones)

Cromógeno (-) incoloro Cromógeno (+) coloreado (-) reducido, (+) oxidado Como todas las enzimas, la peroxidasa acelera el proceso de degradación del sustrato sin perder su funcionalidad, por lo tanto, se encuentra en condiciones de reaccionar nuevamente una y otra vez es por eso que debe agregarse una sustancia de solución de freno o stop que modifica el pH. Fosfatasa alcalina

Las fosfatasas alcalinas utilizadas en los ELISAs se aíslan a partir de intestino bovino o de Escherichia coli. Estas enzimas hidrolizan una amplia gama de ésteres de fosfatos (como los de alcoholes primarios, secundarios, fenoles y aminas), tienen un pH óptimo alcalino (por lo que se emplean soluciones a base de dietanolamina con pHs cercanos a 9) y requieren Mg y Zn como cofactores. Los cromógenos más utilizados para esta enzima son:

-pNPP (paranitrofosfato) que vira de incolora a amarillo.

-5- bromo-4-cloro-3-indolil fosfato/nitro blue tetrazolium (NBT/BCIP) que vira de incoloro a azul.

a) Procedimiento general de la técnica de ELISA aplicada a la medición de anticuerpos: La muestra a evaluar puede ser un suero, un producto de secreción o de excreción. 1. El Ag (ej: Brucella abortus) se resuspende en buffer Carbonato-Bicarbonato pH 9.6 o en

buffer fosfato (PBS) pH 7 y se adsorbe sobre los hoyos de una microplaca de plástico

durante 1 hora a 37C o durante 16 hs a 4C. 2. El exceso de Ag se remueve mediante lavados con 0.05-0.1% de Tween 20 en PBS (PBST). 3. Se agrega una solución que contiene proteínas que no son reconocidas por los anticuerpos

específicos (solución bloqueante), para limitar la unión inespecífica de proteínas. Se puede

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utilizar 10% de leche descremada en polvo resuspendida en PBS. Se incuba durante 1 hora

a 37C o durante 16 hs a 4C. 4. El exceso de solución bloqueante se remueve mediante lavados con PBST. 5. Se agrega el suero problema y los sueros control positivo y negativo por duplicado o

triplicado. Se incuba durante 1 hora a 37C o durante 16 hs a 4C. (El suero problema es aquél del cual se quiere conocer si posee Acs específicos contra el Ag que se encuentra pegado en la placa, en este caso es un suero bovino en el que se analiza la presencia de Acs anti-B. abortus).

6. Los anticuerpos no unidos al Ag se remueven mediante lavados con PBST. 7. Se agrega un anticuerpo unido a enzima (conjugado) que reconoce a las inmunoglobulinas

de la especie de la cual estamos evaluando el suero (En este caso, el conjugado será un Ac anti-Ig bovina). Si el Ac específico está presente, el anticuerpo conjugado reacciona con él y

queda unido. Se incuba durante 1 hora a 37C o durante 16 hs a 4C. 8. El exceso de conjugado se remueve mediante lavados con PBST. 9. Se agrega el sustrato de la enzima. La reacción de la enzima con el sustrato resulta en un

producto coloreado y es un indicador visual de que la reacción antígeno-anticuerpo ha tenido lugar.

10. Dado que las enzimas pueden continuar degradando el sustrato dependiendo del tiempo y la temperatura se realiza el frenado de la actividad enzimática a tiempo de reacción determinado que se relaciona con la aparición de color en los controles negativos de sustrato. El freno depende de la enzima utilizada y es en el caso de peroxidasa ácido sulfúrico y para fosfatasa se utiliza el hidróxido de sodio, ambos modifican el pH y la reacción se frena.

11. La reacción cromática puede ser leída a simple vista o cuantificada por espectrofotometría. La intensidad de la reacción es proporcional a la cantidad de enzima activa presente en cada hoyo.

Lectura: En caso de haber anticuerpos antibrucella en el suero bovino problema, se observará la aparición o cambio de color en el sustrato. En un primer paso, los anticuerpos del suero se unen al antígeno pegado a la placa. Al agregar los anticuerpos conjugados a la enzima, éstos reconocen y se unen a los anticuerpos del suero. La enzima queda adherida y se produce así la reacción al agregar el sustrato. De no haber anticuerpos específicos en el suero problema, el resto de los anticuerpos se eliminan con el lavado. Al agregar el Ac anti-bovino marcado con la enzima, éste no reconoce ninguna molécula específica y se elimina al realizar el último lavado. Por lo tanto, al agregar el sustrato no se producirá ninguna reacción específica. Se puede observar un nivel bajo de señal por autodegradación del sustrato o debido a la presencia de enzima por lavado ineficaz de la placa. Por esto es tan importante que después de cada incubación se proceda al lavado con soluciones salinas con detergentes suaves, a fin de eliminar las proteínas unidas de manera inespecífica a los soportes sólidos. b) Procedimiento general de la técnica de ELISA aplicada a la medición de antígenos: La muestra a evaluar puede ser un suero, un producto de secreción o de excreción. 1. El anticuerpo específico para ese antígeno se resuspende en buffer Carbonato-Bicarbonato

pH 9.6 o en buffer fosfato (PBS) pH 7 y se adsorbe a los hoyos de la placa durante 1 hora a

37C o durante 16 hs a 4C. 2. El exceso de Ac se remueve mediante lavados con 0.05-0.1% de Tween 20 en PBS (PBST). 3. Se agrega una solución que contiene proteínas que no son reconocidas por los anticuerpos

específicos (solución bloqueante), para limitar la unión inespecífica de proteínas. Se puede utilizar 10% de leche descremada en polvo resuspendida en PBS. Se incuba durante 1 hora

a 37C o durante 16 hs a 4C. 4. El exceso de solución bloqueante se remueve mediante lavados con PBST.

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5. Se agrega la muestra a evaluar (muestra problema) y los controles positivos y negativos por

duplicado o triplicado. Se incuba durante 1 hora a 37C o durante 16 hs a 4C. (Muestra problema es aquélla en la que se quiere determinar la presencia del Ag para el que son específicos los Acs fijados a la placa)

6. Los antígenos no unidos al Ac se remueven mediante lavados con PBST. 7. Se añade un segundo anticuerpo específico para ese antígeno, pero unido a una enzima

(conjugado). Si el Ag específico está presente, el anticuerpo conjugado reacciona con él y

queda unido. Se incuba durante 1 hora a 37C o durante 16 hs a 4C. El exceso de conjugado se remueve mediante lavados con PBST.

8. Se coloca el sustrato de la enzima y se relaciona la actividad enzimática observada con la concentración del antígeno presente en la muestra.

Clasificación de los ELISAs

Los ELISAs pueden clasificarse: - Según busque antígenos (Directo) o anticuerpos (Indirecto) - Según la metodología utilizada en:

1- De amplificación de actividad o no competitivos En estos ELISAs se emplea un exceso del inmunorreactante con el objeto de obtener una señal máxima debida a la presencia del compuesto a medir. Estos ELISAs se subdividen de acuerdo a que el antígeno o anticuerpo a identificar sea inmovilizado en la fase sólida (ELISA directo) o capturado por la molécula complementaria (ELISA indirecto y ELISA sándwich). ELISA DIRECTO: La muestra problema (de la cual no se sabe si contiene o no Ac o Ag) se inmoviliza sobre la fase sólida. En caso de analizar Ac, estos se detectan por medio de Ags conjugados, y en el

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caso de analizar la presencia de Ag, estos se detectan por Ac conjugados. (Fig. 1).

Negativa

Positiva

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ELISA INDIRECTO: En el ELISAs indirecto el antígeno o anticuerpo a identificar es capturado en la placa por la molécula complementaria (Ag o Ac), según corresponda. O sea, si se desea detectar Acs específicos en un suero, se inmoviliza el antígeno en la fase sólida y se lo hace reaccionar con el suero problema. Luego se utiliza un Ac anti-Ig de la especie conjugado a una enzima. Este sistema tiene alta detectabilidad debido a que varias moléculas del conjugado enzimático (Anti-Ig marcados con la enzima) pueden unirse a cada molécula de Ac que reaccionó a su vez con el Ag inmovilizado, este efecto se traduce en una amplificación de la señal. (Fig. 2)

ELISA DE CAPTURA O SANDWICH: Este sistema se emplea para la cuantificación de Ags o para la detección de Acs contra el Ag capturado. En general es deseable que el conjugado enzimático y el Ac inmovilizado provengan de la misma especie para evitar interferencias en el sistema, originadas por reacción cruzada del conjugado con el Ac de captura. Para la detección de antígenos: se inmoviliza un Ac con el que se “captura” el Ag y se revela su presencia con un conjugado enzimático anti-Ag, (Fig. 3).

Para la detección de anticuerpos: se inmoviliza un Ac con el que se “captura” el Ag, se agrega el anticuerpo problema o incógnita y se revela su presencia con un conjugado enzimático anti-Ac o anti especie, (dibuje el esquema basándose en la Fig 3).

= Ac problema o incógnita

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2- De modulación de actividad o competitivos Estos ELISAs se basan en la competición del analito a evaluar (antígeno o anticuerpo incógnita) con un reactivo patrón de similar estructura y afinidad (antígeno o anticuerpo conocido o patrón) y se detecta el resultado de esta reacción luego de la estabilización del sistema. El conjugado enzimático puede ser antígeno o anticuerpo según el esquema, el que modula por competición con el compuesto a analizar (antígeno o anticuerpo, respectivamente). Cantidades pequeñas del conjugado enzimático permiten obtener una mayor detectabilidad. Existen dos diseños generales de ensayos de modulación de la actividad: a) Incubación simultánea: El compuesto marcado con enzima y el compuesto sin marcar

(compuesto a dosar) se incuban simultáneamente en el sistema. b) Incubación en etapas o por saturación: El compuesto no marcado (a ser dosado) se incuba en una primera etapa. En una segunda etapa se incuba el compuesto marcado enzimáticamente, el que reaccionará con los sitios no ocupados por el compuesto que reaccionó en la primera etapa. Por ejemplo: en el ELISA competitivo se puede inmovilizar el anticuerpo en la fase sólida y agregar el antígeno marcado con la enzima, aplicando cualquiera de estos dos diseños generales. Se observará una disminución de la actividad enzimática a medida que aumenta la cantidad de antígeno libre no marcado presente en una solución patrón o en la muestra problema. El producto coloreado formado es inversamente proporcional a la concentración de antígeno libre.

En la Fig 4 se muestra un ELISA de competición en etapas una de las cuales se realiza en fase líquida. Como se observa se inmoviliza el Ag patrón conocido en la placa y se cuenta con Acs anti-Ag específicos marcados con enzima. La muestra problema (en la cual se quiere conocer la presencia y cantidad del antígeno) se incuba en fase líquida con el anticuerpo marcado y luego se realiza el ELISA en placa con el antígeno patrón adsorbido en la placa. Cuanto más antígeno problema haya reaccionado en la fase líquida menos cantidad de anticuerpo marcado podrá reaccionar en la placa con el Ag patrón, por lo que los resultados (cantidad de antígeno en la muestra) son inversamente proporcionales a la densidad óptica obtenida.

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Cálculo del valor de corte Para la interpretación del ensayo y a fin de poder diferenciar entre muestras positivas y negativas, debe calcularse el valor de corte utilizando la siguiente fórmula. Valor de corte = D.O promedio de los controles del suero negativo + 2 desvíos estándar del suero negativo. El valor de corte debe ser tal que minimice los resultados falsos, ya sean positivos o negativos. En muchos casos existe una zona de solapamiento en la distribución de la reactividad de sueros positivos y negativos, en la que no puede establecerse con certeza si una muestra es positiva o negativa. Por este motivo el valor de corte se determina de manera tal de tener más falsos positivos o falsos negativos, según qué tipo de error produzca consecuencias menos graves.

Controles Para una correcta interpretación de los resultados deben realizarse controles de todos los reactivos utilizados. Los controles deben permitirnos afirmar que el cambio de color detectado corresponde a la interacción específica entre Ag y Ac y no a reacciones inespecíficas. Si las reacciones inespecíficas se detectan estas deben ser minimizadas y tomadas en cuenta en el momento de establecer el valor de corte. Podemos ejemplificar los controles en un ELISA indirecto de la siguiente manera:

Controles de los sueros Los valores obtenidos con estos controles repetidos en todos los ELISAs a través del tiempo nos permite detectar repetitividad del ensayo y comparar resultados de diferentes días o entre laboratorios. A- Control positivo: suero de un animal convaleciente o polivacunado, con alto título de anticuerpos específicos. B- Control negativo: suero de un animal sano y virgen (libre de anticuerpos específicos).

o patrón

o incógnita

Muestra negativa

Muestra positiva

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Controles del conjugado A- Control negativo del Conjugado: Dicho control se realiza para determinar que el anticuerpo conjugado a la enzima no interacciona con ningún otro componente del sistema que no sea el anticuerpo primario. Se realiza de la siguiente manera: se pega a la placa el antígeno, se bloquea, no se incuba con el suero o anticuerpo primario (se mantiene el bloqueante), se coloca el anticuerpo conjugado y por último el sustrato. Este no debería reaccionar con el antígeno pegado a la placa, dando reacción negativa. B- Control positivo del Conjugado: Este control se realiza a fin de determinar que el anticuerpo conjugado a la enzima interactúa correctamente con el anticuerpo primario. Se realiza de la siguiente manera: Se pega un suero de la especie frente a la cual es específico en conjugado. Por ejemplo si el anticuerpo conjugado es un anticuerpo anti ratón se coloca en la placa suero de ratón, se bloquea, no se coloca anticuerpo primario y se coloca el anticuerpo secundario marcado con la enzima, continuando el resto de la técnica de la misma manera. Este control debe dar positivo, es decir debe haber color en los hoyos indicando el correcto funcionamiento del conjugado.

Control del sustrato: Este control nos permite determinar que el sustrato de la enzima no reacciona con ningún otro componente del sistema excepto con la enzima. Se realiza de la siguiente manera: se pega a la placa el antígeno, se incuba con el anticuerpo 1º, es decir, el suero, y no se coloca el anticuerpo conjugado, y se coloca el sustrato el cual no debería modificar su color, ya que no hay en los hoyos enzima que catalice la reacción.

Control del bloqueante: Permite determinar que el bloqueo se realizó correctamente. Se realizan todos los pasos del ELISA, pero en la placa no se pega el antígeno, sino que se comienza a partir del bloqueante. Se coloca un suero positivo, el cual no debería reaccionar ya que no hay antígeno pegado en la placa.

Sistemas alternativos de reconocimiento

Los límites de la reacción Ag-Ac están determinados por la valencia del Ac (2 para la IgG y 5 para la IgM) y por la constante de afinidad de unión del Ac (Ka =108 a 1010 M-1). La utilización de sistemas alternativos en algunas etapas de las reacciones de ELISA permiten amplificar los límites de las reacciones Ag-Ac y/o facilitar la técnica. Sistema avidina-biotina / estreptavidina-biotina: La avidina es una proteína de la clara de huevo y la estreptavidina es una proteína producida por ciertas levaduras. Ambas se caracterizan por su elevada afinidad por la biotina (Ka=1015 M-

1). Debido a que la biotina es fácilmente acoplable a distintas proteínas (entre ellas, Ac y enzimas) por unión covalente, sin que se afecte su actividad biológica, se han desarrollado métodos inmunoenzimáticos basados en la interacción avidina-biotina. Proteína A: Es una proteína de la pared de Staphylococcus aureus que tiene alta afinidad por los fragmentos Fc de algunos isotipos de Igs (Ka=108 M-1). Tiene 4 sitios de unión, aunque generalmente reaccionan sólo dos.

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RADIOINMUNOENSAYO (RIA)

Los inmunoanálisis radiométricos comprenden un conjunto de técnicas en las cuales las moléculas utilizadas se marcan radiactivamente. Como guía general puede considerarse que la determinación de los antígenos se efectúa con anticuerpos específicos marcados radiactivamente y que inversamente, la detección de anticuerpos específicos se realiza con los correspondientes antígenos marcados.

El desarrollo del radioinmunoensayo (RIA) comienza en 1956 en trabajos sobre el metabolismo de la insulina. En estos experimentos se halló que la cantidad de insulina marcada con átomos radiactivos que se unía in vitro a una fracción de globulinas de individuos diabéticos, se relacionaba con la concentración de insulina fría (no marcada) existente en el suero del paciente. Entre las ventajas que tiene esta técnica se encuentran: Alto límite de detección Sencillez con respecto a las técnicas utilizadas en endocrinología. Versatilidad para su utilización en pequeños volúmenes y en grandes series. La desventaja más importante consiste en la manipulación de componentes radioactivos que requieren de condiciones de bioseguridad estrictas tanto para la protección del operador como del medio ambiente, por lo tanto se utilizan en casos puntuales en los que la concentraciones del analito lo requieran. Por ejemplo, determinación de hormonas o niveles de IgE séricas específicas. Dado que el RIA es una técnica que se utiliza generalmente para medir sustancias que se encuentran en muy baja concentración, los esquemas utilizados corresponden a la modalidad competitiva (ver descripción referente a la técnica de ELISA).

Un ejemplo de la técnica es la determinación de TSH, ensayo que se realiza por el sistema de inhibición competitiva de un antígeno marcado radiactivamente (trazador) a su anticuerpo específico por parte del antígeno no marcado. El sistema descrito puede esquematizarse como una interacción reversible combinada:

Ag* Ac-Ag* Ac +

Ag Ac-Ag Donde Ac representa al anticuerpo específico; Ag* es el antígeno marcado (trazador) libre; Ag es el antígeno libre no marcado de las soluciones patrones o de las muestras desconocidas; Ac-Ag* es el complejo soluble entre el anticuerpo y el antígeno marcado, y Ac-Ag es el complejo soluble con el antígeno no marcado. La reacción obedece a la ley de acción de masas. El anticuerpo no discrimina entre antígeno no marcado (frío) y antígeno marcado (trazador), de modo que cuanto mayor sea la cantidad de antígeno frío presente, menor será la cantidad de trazador que se une al anticuerpo. Bajo este principio, se puede determinar la concentración de antígeno en muestras complejas de fluidos biológicos con suficiente sensibilidad y especificidad, siempre que se cumplan los siguientes requisitos: Que el trazador sea altamente radiactivo y por lo tanto pueda colocarse en concentraciones infinitesimales. Que el anticuerpo sea altamente específico, posea muy alta afinidad y se halle en muy baja concentración. Que el anticuerpo no reconozca con diferente afinidad el antígeno frío del marcado.

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Ejemplos de aplicación de la técnica de RIA

RAST (RadioAlergoSorbent Test) o prueba de radialergoadsorción: Es utilizado para la detección de IgE específica de alergenos. El reactivo marcado es un Ac (generalmente monoclonal) anti-IgE. Si el animal tiene en su suero IgE específica contra el alérgeno previamente adsorbido a un soporte, la radiactividad detectada por el RIA será directamente proporcional a la concentración de esa IgE. PRIST (Paper RadioImmunoabSorbent Test) o prueba radioinmunoabsorbente en papel: Es usado para la cuantificación de niveles séricos de IgE. Se adsorbe la anti-IgE al soporte inerte, se agrega el suero del paciente, y luego de la incubación y el lavado se revela con la utilización de una anti-IgE marcada radiactivamente. En esta técnica hay una relación directa entre la radiactividad medida y la concentración de IgE.

Bibliografía

1- Margni, R. 1996 Inmunología e Inmunoquímica. Fundamentos. Editorial Panamericana. 2- Antibodies A Laboratory Manual. Ed. Ed. Harlow y David Lane. Cold Spring Harbor

Laboratory. 1988. pp726. 3- Roitt, I; Brostoff, J and Male, D. Immunology . Fifth Edition. Mosby International. LTD. 423

pp. 4- Morilla A. y Bautista C. R. Manual de Inmunología México: Editorial Diana. 1º edición,

septiembre de 1986.

Inmunoblot o Western-blot1 El análisis de una muestra por la técnica de inmunoblot requiere realizar una primera etapa de separación de los componentes en un campo eléctrico en geles de poliacriamida (PAGE) y posteriormente la transferencia de esas proteínas ya separadas por peso molecular (PM), a una membrana. Esta transferencia se realiza poniendo en contacto el gel con una membrana de nitrocelulosa y aplicando una corriente eléctrica a pH alto. Las moléculas proteicas se movilizan y contactan con la membrana, a la cual se fijan. La unión a la membrana de nitrocelulosa es debida fundamentalmente a interacciones de tipo hidrofóbico. Las moléculas transferidas a la membrana son identificadas posteriormente por interacciones con anticuerpos específicos. Utilidades del Inmunoblot: Mediante este método podemos identificar cuál o cuáles de las moléculas componentes de una mezcla son reconocidas por un anticuerpo. La posibilidad de separar los componentes biológicos de una muestra por peso molecular, sumado al reconocimiento con anticuerpos, potencia la caracterización del antígeno. Recuerden que los antígenos evaluados con esta metodología, si utilizamos como método de separación previo el SDS-PAGE, se encuentran desnaturalizados (por acción del beta-mercaptoetanol y del SDS sobre la muestra), por lo tanto estamos identificando antígenos de tipo secuenciales y no conformacionales. También podemos evaluar la monoespecificidad de un anticuerpo como en el caso de los monoclonales para lo cual se realiza el PAGE del antígeno complejo luego la transferencia a

1 La transferencia de fragmentos de ADN separados por electroforesis desde un soporte

gelificado a una membrana, fue descripta inicialmente por el Dr. Southern. Debido a ello, esta

técnica se denominó Southern-blot. La aplicación de esta técnica para el estudio de RNA se

denominó Northern-blot y cuando ésta se desarrolló para proteínas se la llamó Western-blot.

Por lo tanto son sinónimos.

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una membrana de nitrocelulosa la que se usa como antígeno para interaccionar con el anticuerpo monoclonal. Como resultado se espera el reconocimiento de un sólo componente por parte del anticuerpo. En forma de síntesis los pasos a seguir son:

A- Preparación de las muestras a analizar y realización del SDS-PAGE B- Transferencia del gel obtenido a una membrana de nitrocelulosa C- Bloque de los sitios libres de la membrana con una mezcla de proteínas irrelevantes

para el análisis D- Utilización de un anticuerpo para identificar el antígeno a analizar sobre la membrana

(Anticuerpo primario) E- Utilización de una anticuerpo conjugado con una enzima específico para la especie que

fue origen del anticuerpo primario (Anticuerpo secundario) F- Revelado con el sustrato que corresponda que precipite en el papel o que pueda ser

revelado sobre una placa fotográfica G- Análisis e interpretación de los resultados

Las membranas teñidas muestran la complejidad de las muestras ya que en cada calle se observarán un número de bandas variables dependiendo de las distintas proteínas que sean reconocidas por el anticuerpo primario que componen la mezcla. Al dato del PM se le suma la antigenicidad de estos componentes analizados. Anexo A modo de ejemplo, se describen los pasos necesarios para realizar un inmunoblot utilizando la cuba Mini-Protean II (nombre comercial del equipo provisto por laboratorios Bio-Rad). Materiales necesarios: Guantes libres de talco 2 Esponjas finas tipo Scotch Brite 2 hojas de papel Whatman 3MM o equivalente Membrana de nitrocelulosa Aparato de electrotransferencia o electroblotting Lapicera que permita marcar la membrana aunque esté humedecida. 1. Cuando la electroforesis ha concluido, se desarma la cuba y se retiran los geles. Se pueden

equilibrar 30 minutos a temperatura ambiente en buffer de transferencia. Esto previene el cambio de tamaño del gel durante la transferencia y elimina el exceso de SDS que puede interferir en ella.

2. El armado del sándwich se realiza en un contenedor lo suficientemente grande para que quepa el soporte abierto. Se llena el contenedor con buffer para que el soporte de transferencia quede cubierto. El soporte debe armarse sumergido para evitar en lo posible la formación de burbujas de aire.

3. Sobre la base negra de una mitad del soporte, se coloca la esponja, seguida por un papel de filtro Whatman. Ambos deben ser del mismo tamaño que el gel y deben estar embebidos en buffer de transferencia.

4. Se coloca el gel sobre el papel Whatman. Se quita cualquier burbuja de aire que haya quedado entre el gel y el papel, utilizando una pipeta de vidrio a modo de palo de amasar Las burbujas de aire se observarán posteriormente como manchas blanquecinas en las membranas.

5. Se corta la membrana a transferir unos milímetros más grandes que los bordes del gel y se la equilibra durante 10 a 15 minutos sumergida en el buffer de transferencia.

6. Se humedece la superficie del gel y se coloca la membrana sobre su superficie. Se deben eliminar las burbujas de aire como en el paso 4. Se debe evitar levantar y re-posicionar la membrana sobre el gel, ya que algunas proteínas comienzan a transferirse tan pronto como el gel toma contacto con la membrana.

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7. Se coloca una segunda pieza de papel Whatman pre-humedecido y de esponja y se completa el armado cerrando el soporte de transferencia.

8. Se colocan los dos soportes armados en la cuba “ad hoc”. Se debe tener la precaución de controlar los códigos de colores que indican los electrodos. Como las proteínas están cargadas negativamente porque están recubiertas con SDS, se mueven hacia el ánodo (+: base roja).

9. Se coloca el contenedor con hielo dentro de la cuba y se llena la cuba con buffer de transferencia. El nivel del buffer debe superar el borde superior de la membrana, con el objetivo de que ésta quede sumergida por completo y la transferencia sea pareja.

10. La transferencia se puede realizar durante 1 hora a 100 V agregando un refrigerante en la cuba durante 16 horas a 15-30 V en una habitación refrigerada y con agitación del buffer.

11. Cuando el tiempo se ha cumplido, se desconecta la cuba de la fuente de poder y se desarma el aparato. Los geles pueden ser teñidos con Coomassie blue para determinar la eficiencia de la transferencia. Si se utilizó un marcador de peso molecular preteñido, éste se puede utilizar como control de la transferencia.

12. Las membranas deben ser marcadas en sus extremos y calles para poder luego determinar la identidad de la muestra.

En este procedimiento se logra tener las muestras (antígenos) adheridas a la membrana y en una posición conocida y determinada por su PM. Detección por anticuerpos de los antígenos trasferidos a una membrana 1. Una vez retirada del aparato de transferencia, la membrana se coloca en un recipiente

limpio, preferentemente de vidrio o polipropileno, o en una bolsa de nylon sellable 2. La membrana se bloquea con 10% de leche descremada en PBS (buffer de bloqueo),

durante 1 hora a temperatura ambiente o durante 16 horas a 4C en agitación constante. El objetivo del bloqueo es llenar todos los sitios libres con proteína no reactiva.

3. La membrana se lava 4 veces con PBS durante 10 a 15 minutos por vez, a temperatura ambiente en agitación constante.

4. El anticuerpo primario, es decir, el anticuerpo específico para el antígeno que se quiere detectar, se diluye en el buffer de bloqueo.

5. El bloqueante se reemplaza por el anticuerpo primario y se incuba la membrana con el anticuerpo primario durante 1/2 a 1 hora a temperatura ambiente en agitación constante.

6. La membrana se lava 4 veces con PBS durante 10 a 15 minutos por vez, a temperatura ambiente en agitación constante.

7. El anticuerpo secundario, es decir, conjugado con fosfatasa alcalina o peroxidasa, se diluye en el buffer de bloqueo.

8. Se incuba la membrana con el conjugado durante 1/2 a 1 hora a temperatura ambiente en agitación constante.

9. Se lava la membrana igual que en el punto 3. 10. El revelado se realiza dependiendo del substrato que corresponda según la enzima

utilizada. Si el anticuerpo usado está conjugado con peroxidasa, se debe agregar H2O2

como substrato y un colorante que cambia de color al oxidarse y precipita sobre la membrana, como el TMB (3,3¨, 5,5¨ tetramethylbenzidine). En el caso de usar un anticuerpo conjugado con fosfatasa, se puede usar BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-phosphate toluidine salt) como substrato y NBT (nitroblue tetrazolium clhoride) como colorante.

Las bandas donde hubo reacción antígeno-anticuerpo se hacen visibles por la precipitación del colorante sobre la membrana; el fondo del papel donde no ocurrió la unión se observa blanca. Cuando la imagen es óptima, se frena la reacción diluyendo el substrato y el colorante con agua destilada. Luego la membrana se coloca entre papeles absorbentes y se puede registrar el resultado mediante un scanner o cámara fotográfica.

El poro de la membrana puede ser de 0.45m cuando se requiere retener proteínas, pero algunos polipétidos pueden atravesar estas membranas sin unirse. Esto puede solucionarse

utilizando membranas de poro más pequeño, como por ejemplo, de 0.1m.

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Las membranas de nitrocelulosa tienen una capacidad de unión de 80g de proteína por cm2 de superficie. Otras membranas, como las catiónicas de nylon (Zeta-Probe o Bio-Rad), son más resistentes (no se rompen al secarse) y con su utilización se obtiene una capacidad de

unión de proteínas de hasta 500g/cm2. Esta característica es ventajosa, pero por otro lado puede ser una desventaja, ya que hace que las membranas sean difíciles de bloquear.

Inmunocromatografía

La inmunocromatografía es una técnica inmunológica que permite visualizar la reacción antígeno-anticuerpo por la acumulación de oro coloidal en zonas específicas del papel de nitrocelulosa donde se fijan previamente anticuerpos o antígenos de captura. Se realiza gracias a que el complejo de oro coloidal con los antígenos migran sobre el papel de nitrocelulosa para reaccionar específicamente con los anticuerpos inmovilizados en el papel, dando bandas coloreadas. El papel de nitrocelulosa permite la migración por capilaridad de líquidos y solutos y a la vez conserva activos los anticuerpos fijados. El uso de anticuerpos conjugados con oro coloidal en las técnicas de diagnóstico rápido permiten la detección de antígenos en muestras biológicas, siendo el objetivo principal de estas técnicas alcanzar la señal específica más intensa con una mínima o nula reacción inespecífica En la actualidad, esta técnica se viene utilizando para el diagnóstico rápido de varias enfermedades, a través de la detección de antígenos en diversos líquidos biológicos, tales como en infecciones por Streptococcus beta-hemolítico, Chlamydia, virus de la hepatitis, malaria, virus de la inmunodeficiencia felina y virus de la leucemia felina (VIF, VILEF) y parvovirus canino en Veterinaria.

Resultado positivo

Resultado negativo

El papel de nitrocelulosa con los anticuerpos de captura se incorporan a un casete de plástico y al agregar el fluido biológico sospechoso como suero u orina este migra a través del papel por cromatografía y reacciona o no en los sitios correspondientes a los anticuerpos. Esta reacción se visualiza a través del depósito localizado del Ac secundario marcado con oro coloidal. Bibliografía

Antibodies A Laboratory Manual. Ed. Ed. Harlow y David Lane. Cold Spring Harbor Laboratory. 1988. pp726.

Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell Instruction Manual. Bio-Rad Margni, R.A. 1996. Inmunología e Inmunoquímica Fundamentos. Ed. Interamericana.

NITROCELULOSA

AAnnttííggeennoo eenn llaa mmuueessttrraa

AAnnttiiccuueerrppoo ddee CCaappttuurraa

ccoonnttrraa aannttííggeennoo EEssppeeccííffiiccoo

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ccoonnttrraa aannttiiccuueerrppoo ddee ddeetteecccciióónn

Siembra de la muestra

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Millipore A. A short guide for developing inmunochromatographic test strips (en línea). 2nd edition; 2001 (Fecha de acceso: diciembre 2001). URL disponible en: http://www.com/oemproducts.

Engler KH, Efstratiou A, Norn D, Koslov RS, Selga I, Glushkevich TG, et al. Immunochromatographic strip test for rapid detection of diphtheria toxin: description and multicenter evaluation in areas of low and high prevalence of diphtheria. J Clin Microbiol 2002; 4(l): 80-3.

Inmunohistoquímica

La historia de la inmunohistoquímica comienza en 1941 cuando Coons identifica neumococos usando un método de fluorescencia directa. Más tarde se desarrollan la inmunofluorescencia indirecta y las técnicas inmunoenzimáticas.

En las últimas décadas, el uso de las técnicas inmunohistoquímicas ha ido creciendo progresivamente hasta consolidarse como tecnología esencial en el diagnóstico anatomopatológico de rutina. La inmunohistoquímica (IHQ) y la inmunocitoquímica (ICQ) son técnicas cualitativas de detección y de localización de antígenos presentes en células y tejidos. Todas las técnicas de IHQ e ICQ utilizan anticuerpos o sistemas amplificadores (sistema avidina: biotina) conjugados con enzimas y un cromógeno que precipita sobre los tejidos generando una reacción coloreada. Existen diversos métodos:

Directo: el anticuerpo primario (dirigido contra el antígeno de interés) se encuentra conjugado con la enzima. Es fácil y rápido de realizar, pero tiene bajo límite de detección.

Indirecto: el anticuerpo primario, dirigido contra el antígeno, no está marcado luego se agrega un anticuerpo secundario conjugado con la enzima, que reconoce específicamente al anticuerpo primario (anti-Ig de la especie). El límite de detección de este método es 4 a 5 veces mayor que el método directo La ventaja del uso de dos anticuerpos es la amplificación de la reacción en cada paso, es decir, por cada anticuerpo primario que reaccione lo reconocerán dos o más moléculas de anticuerpos secundarios.

Los anticuerpos utilizados en estas técnicas pueden ser monoclonales o policlonales. En ambos casos tienen que tener alta afinidad y especificidad por el antígeno. En el caso de los sueros inmunes, es deseable que tengan títulos elevados. De esta forma pueden ser usados en diluciones altas (muy baja concentración) y se evita la aparición de falsos positivos Si los anticuerpos no tienen elevada especificidad pueden producir reacciones inespecíficas que lleven a falsos positivos. También, algunas veces, puede aparecer reactividad cruzada cuando los anticuerpos reconocen sitios similares en moléculas relacionadas. Para evitar estas falsas interpretaciones, la técnica necesita realizarse con controles estrictos de todos lo pasos y de todos los reactivos. Las ventajas de las técnicas inmunohistoquímicas son que permiten una localización más precisa de la reacción antígeno-anticuerpo; la tinción es permanente, estable, puede contrastarse y puede evaluarse con microscopio óptico. El material así estudiado puede archivarse por años sin pérdida de la intensidad de la reacción. Tiene algunas desventajas como la presencia de reacciones inespecíficas o cruzadas, especialmente cuando se utilizan anticuerpos policlonales. Los anticuerpos monoclonales han permitido aumentar la especificidad y sensibilidad de esta técnica. Algunos reactivos son carcinógenos potenciales y su manipulación debe ser cuidadosa, requieren de estandarización precisa y estricto control de calidad.

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Existen diversos tipos de técnicas, cuya indicación dependerá del anticuerpo a utilizar (monoclonal o policlonal), del material disponible (fresco, congelado o fijado en formalina) y de los antígenos a estudiar (de superficie o membrana, citoplasmáticos o nucleares). Estas técnicas necesitan de controles internos o paralelos, usualmente positivos y negativos. En los tejidos, las uniones inespecíficas se pueden bloquear con albúmina bovina, con leche descremada, o con suero normal de alguna especie distinta y alejada filogenéticamente de la que se esta estudiando. Métodos que utilizan la interacción avidina-biotina: La avidina es una glucoproteína tetramérica de 67 kda, presente en la clara de huevo, que posee en su superficie regiones hidrofóbicas que unen con gran afinidad la biotina. Por otra parte, las cadenas glucídicas de la avidina tienen una carga tal que las hace adhesivas con regiones cargadas del tejido, lo que aumenta el ruido de fondo (uniones inespecíficas). La estreptavidina es una proteína tetramérica de 60 kDa procedente de Streptomyces avidinii, con alta afinidad por la biotina. La biotina es una proteína soluble en agua (vitamina H) de peso molecular bajo (244 Da) con un grupo carboxílico que permite su unión a los restos amino de las proteínas. La biotinilización es una reacción bioquímica que permite unir biotina por unión covalente a una gran variedad de moléculas como enzimas, lectinas, anticuerpos, ácidos nucleicos, etc. El pequeño tamaño de la biotina hace que la biotinilización no afecte drásticamente las propiedades biológicas de las moléculas a las que se conjuga la biotina. Se han desarrollado varios métodos que combinan los tres reactivos mencionados, puesto que a medida que se amplifican las señales, se aumenta ostensiblemente el límite de detección de la técnica. El esquema general del método IHQ sería: 1º paso: Preparación histológica de los tejidos o células a estudiar 2º paso: Bloqueo de las peroxidasas endógenas 3º paso: Incubación de los tejidos con el anticuerpo primario 4º paso: Incubación con el anticuerpo secundario unido a biotina (anticuerpo biotinilado) 5º paso: Incubación con una solución de estreptavidina marcada con enzima peroxidasa 6º paso: Agregado del sustrato de la enzima y el cromógeno.

Enzimas utilizadas: Las enzimas más utilizadas son peroxidasa y fosfatasa alcalina, que reaccionan dando distintos colores con los diferentes sustratos según la reacción, lo cual servirá para detectar distintas uniones antígeno-anticuerpo. Preparación de tejidos para inmunohistoquímica: El éxito de la inmunohistoquímica depende de la preservación de los antígenos y del manejo de los anticuerpos. La conservación de los tejidos por congelación puede afectar los tejidos y la estructura celular, debido a la formación de cristales de agua intracelulares. La necesidad de mantener la estructura tisular hace de la fijación un paso fundamental en las técnicas histológicas. Esta necesidad de fijación se contrapone al riesgo de provocar cambios estructurales y moleculares asociados a cualquier tratamiento de las células o tejidos destinados a la observación microscópica. En IHQ, la fijación y el tratamiento previo de los tejidos debe satisfacer diferentes criterios como: Retener los antígenos Preservar la antigenicidad Preservar la estructura Permitir la interacción antígeno- anticuerpo Fijación: El mayor problema que suelen presentar los fijadores químicos es que pueden impedir la unión antígeno-anticuerpo, por el enmascaramiento del antígeno debido a cambios conformacionales

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que ocurren en el antígeno (epitope). No existe un fijador universal, en todos los casos hay que realizar distintas pruebas con diferentes fijadores (y diferentes condiciones de fijación) para cada antígeno y para cada tejido. El fijador mas utilizado es el formol tamponado, (formaldehído al 10 % en fosfato disódico y monobásico) debido a que es más accesible por costos y es menos agresivo a los tejidos que el formol puro. Bloqueo de peroxidasas endógenas Los tejidos tienen sus propias peroxidasas que interfieren con la reacción cuando se utilizan anticuerpos marcados con peroxidasa. Para bloquear las peroxidasas endógenas se pueden incubar los cortes con una solución de peróxido de hidrógeno y metanol absoluto (entre 10 y 30 minutos) a temperatura ambiente. El método es muy eficiente y lleva a la neutralización de las peroxidasas de los tejidos, sin afectar la inmunoreactividad. Otro método consiste en hacer reaccionar las peroxidasas endógenas (inespecíficas) con un cromógeno y luego efectuar la reacción inmunohistoquímica (específica) con otro cromógeno que desarrolle un color contrastante con el anterior. Preincubaciones Una vez obtenidos los cortes y antes de iniciar las incubaciones con los anticuerpos, se han de hacer diversas preincubaciones y lavados a fin de facilitar la penetración de los anticuerpos y disminuir el marcaje inespecífico. Generalmente todas las preincubaciones se realizan en soluciones fosfato o tris-HCl o bien en solución salina tamponada. En el caso de que el proceso se realice sobre portaobjetos gelatinizados, hay que calentarlos previamente entre 37 y 50ºC (dependiendo de la sensibilidad de los antígenos a la temperatura) durante 10 min. Aplicaciones de la IHQ en medicina veterinaria I. Diagnóstico de infecciones: detección de microorganismos en los tejidos afectados. II. Diagnóstico de enfermedades autoinmunes: detección de depósitos de anticuerpos o

complejos inmunes en los tejidos afectados. III. Diagnóstico de neoplasias: detección de marcadores tumorales específicos en las

células neoplásicas. IV. Investigación: por ejemplo, utilizando marcadores leucocitarios (CD “Cluster of

diferentiation”) a fin de determinar poblaciones leucocitarias predominantes en ciertas afecciones o tejidos.

Inmunofluorescencia La inmunofluorescencia es una técnica de interacción primaria que permite la

localización de antígenos en tejidos, frotis de microorganismos, células o cultivos en monocapa. También permite la búsqueda de anticuerpos específicos. Utiliza como reactivo una inmunoglobulina marcada con colorantes fluorescentes. Esta técnica puede ser:

Directa

Indirecta Inmunofluorescencia Directa: Consiste en demostrar la presencia de un antígeno mediante la reacción directa con un anticuerpo específico marcado con un colorante fluorescente. El anticuerpo es obtenido a través de la inoculación del antígeno en un animal de experimentación.

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Inmunofluorescencia Indirecta: En este caso se busca, en el suero del paciente la presencia de anticuerpos específicos para un antígeno determinado. Se preparan improntas de los antígenos sobre portaobjetos, por ejemplo T. gondii, células infectadas por virus, etc. Sobre las improntas se coloca el suero en el cual se sospecha la presencia de anticuerpos específicos. Si la reacción es positiva, habrá formación de complejos inmunes. Para hacer ostensible esta unión antígeno-anticuerpo, se debe utilizar una inmunoglobulina (anti-especie o antigamma) marcada, que reaccionará con el anticuerpo del paciente. La ventaja de la técnica indirecta es que no se necesita un anticuerpo marcado para cada antígeno

Ventajas y desventajas de las técnicas de inmunofluorescencia directa e indirecta: Ventajas: 1) Son muy versátiles y seguras para la detección de antígenos o anticuerpos. 2) Permiten implementar rápidamente nuevos ensayos. 3) En la IF indirecta, la señal es más brillante que en la técnica directa debido a que varias

moléculas de anti-inmunoglobulinas fluorescentes se pueden unir a cada uno de los complejos antígeno-anticuerpo formados en la primera etapa (es decir que la señal se amplifica).

4) En la IF indirecta, el uso de un reactivo conjugado anti-especie único, para estudiar los anticuerpos problema frente a diferentes antígenos, permite ahorrar tiempo y dinero.

. Desventajas: 1) Es necesario tener un microscopio de fluorescencia. 2) Es difícil la evaluación de detalles básicos. 3) Las preparaciones tienen vida muy corta debido a la pérdida de color de los fluorocromos. 4) Se necesita personal muy entrenado para poder determinar entre una reacción positiva y

una impronta negativa, ya que habitualmente las células tienen un mínimo de autofluorescencia, que puede llevar a error cuando quien efectúa la lectura no tiene experiencia suficiente.

Fluorocromos Los fluorocromos son sustancias que se utilizan para marcar estos anticuerpos específicos. Estos colorantes permiten identificar la presencia de las sustancias marcadas con ellos, cuando son excitados por luz ultravioleta. Para unir los fluorocromos a un anticuerpo, estos deben cumplir con una serie de requerimientos:

Que el fluorocromo desarrolle suficiente fluorescencia para que la señal emitida sea visible y no se vea interferida por la autofluorescencia del tejido.

Que tenga un grupo funcional capaz de fijarse a la molécula de anticuerpo.

Que sea soluble en soluciones acuosas, ya que los solventes pueden producir la desnaturalización de las proteínas durante la unión.

Que no pierdan fluorescencia al unirse con los anticuerpos.

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Que no alteren la especificidad ni la actividad de los anticuerpos.

Que al formar los conjugados no pierdan su fluorescencia con la acción de la luz. La marcación de los anticuerpos con los fluorocromos se basa en complejas reacciones que llevan a la formación de uniones covalentes entre ellos y las moléculas de inmunoglobulinas. Esta unión se hace a pH alcalino. Además, la conjugación entre ambas moléculas depende de la temperatura y del tiempo de reacción. Cuando hay un exceso de anticuerpo con respecto al fluorocromo, se obtienen conjugados que emiten escasa fluorescencia. Cuando sucede lo contrario, es decir, cuando hay mucho fluorocromo unido al anticuerpo, se corre el riesgo de tener marcación inespecífica. Los isotiocianatos reaccionan con los grupos aminos libres de los aminoácidos de los anticuerpos, particularmente de la lisina. Es importante entonces que los buffers usados para la conjugación no tengan grupos aminos (tris, azida, glicina, amonio, etc). El isotiocianato de fluoresceína (FITC) es el fluorocromo más usado para la conjugación con anticuerpos. Produce una muy buena señal de color verde, que se diferencia notablemente de la autofluorescencia generalmente más amarillenta y pálida de los tejidos. La fluoresceína es muy sensible a las variaciones de pH: La mayor emisión se obtiene a pH 8-9. El inconveniente más importante es que pierde color rápidamente. Por ello, durante el tiempo que se mantengan las improntas teñidas hay que tener la precaución de guardarlas envueltas en papel de aluminio y en un sitio oscuro, para evitar el deterioro que les produce la exposición a la luz.

Microscopio de fluorescencia El microscopio de fluorescencia consta de: - el microscopio óptico - una lámpara de mercurio o halógena que emite luz ultravioleta - un sistema de filtros: a) El primer filtro es el de excitación o selección de luz, ubicado entre la fuente de luz y el

preparado. Tiene por objeto permitir el paso de ondas de luz con longitud tal que caiga en el rango azul, con el fin de que el preparado sea alcanzado exclusivamente por la luz azul y produzca emisión de luz fluorescente.

b) El segundo filtro es el de calor y está ubicado entre la fuente de luz y el filtro de excitación en los microscopios de luz transmitida, y entre la fuente de luz y el espejo dicrómico en los microscopios de luz incidente.

c) El tercer filtro es el de barrera, colocado antes del ocular para prevenir daños retinianos que podrían ser causados por rayos ultravioletas que escapan por reflejo en el espejo dicrómico.

Preparación de los reactivos: Obtención de los anticuerpos: Se obtienen mediante inmunización en animales. Las inmunoglobulinas se aplican en 2 ó 3 inyecciones a intervalos de 3 a 4 semanas. El suero se recoge 7 a 10 días luego de la última inyección. La respuesta de anticuerpos se mide mediante métodos serológicos. Concentración del Anticuerpo: Se logra mediante precipitación con soluciones saturadas de sales de amonio. Los anticuerpos precipitados pueden permanecer en solución salina de fosfatos (PBS) a pH 7.1. Conjugación: Es posible conjugar las inmunoglobulinas a partir de suero completo o fracciones de suero luego de concentrar los anticuerpos. Se debe añadir al suero buffer carbonato-bicarbonato para mantener condiciones óptimas de pH (9.0). Se agita en baño de hielo añadiendo fluorocromo en un período de 15 minutos, Luego se mantiene el preparado en heladera toda la noche, en agitación, ya que la conjugación es del orden del 100% en 24 horas. Purificación del conjugado: Se logra mediante la eliminación por diálisis de las sales del buffer y de los elementos utilizados como solventes del fluorocromo (acetona) que podrían dañar al conjugado. Además se utiliza extracción con carbón o filtración en columna de sephadex para eliminar los restos de fluorocromo que no se conjugaron y que pueden ocasionar tinción inespecífica.

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Manejo de cortes y tejidos: Los cortes y frotis montados sobre portaobjetos que no se estudien de inmediato, se pueden proteger por inmersión en carbowax y almacenamiento a -20°C. Los cortes liofilizados, protegidos con resina de poliéster, se pueden conservar varios meses en un desecador a 0°C sin que pierdan sus antígenos. Es preferible trabajar con cortes fijados ya que la tinción inmunofluorescente en cortes sin fijar se acompaña de difusión o pérdida del antígeno. Se deben usar fijadores que no alteren la estructura antígeno-anticuerpo, los más empleados son alcohol etílico al 95% entre 4-30°C, alcohol metílico, acetona o formol. Para bacterias es muy útil la fijación mediante calor. La inclusión en parafina de los tejidos es muy usado y puede lograr una localización más precisa y una tinción más viva que con cortes en congelación. Procedimiento recomendado para la tinción por inmunofluorescencia directa: 1) Llevar el portaobjetos que contiene la muestra (células o tejido a analizar) a temperatura

ambiente.

2) Colocar de 10 a 50 l (dependiendo del tamaño de la muestra) de anticuerpo anti-antígeno conjugado en el portaobjetos.

3) Incubar en cámara húmeda a 37°C por 30 minutos 4) Lavar el portaobjetos con buffer de lavado (PBS) y luego sumergirlo por 10 minutos en buffer

de lavado (PBS) 5) Secar la parte posterior y los bordes del portaobjetos con una toallita de papel. No deben

secarse las superficies teñidas. No lavar con agua 6) Colocar una gota de líquido de montaje. Cubrir con cubreobjetos y observar en microscopio

de fluorescencia a 100 a 250X. Confirmar a 400X.

Procedimiento recomendado para la tinción con inmunofluorescencia indirecta 1) Llevar el portaobjetos que contiene la muestra (células o tejido a analizar) a temperatura

ambiente.

2) Colocar de 10 a 50l (dependiendo del tamaño de la muestra) de suero problema diluido en el portaobjetos.

3) Incubar el portaobjetos en cámara húmeda a 37°C por 30 minutos. 4) Lavar el portaobjetos con buffer de lavado (PBS) y luego sumergirlo por 10 minutos en el

mismo buffer.

5) Secar la parte posterior y bordes del portaobjetos. Colocar sobre la muestra 10 a 50 l de anti-IgG o anti-IgM conjugado con FITC.

6) Incubar como en el paso 3. 7) Lavar como en el paso 4. 8) Secar la parte posterior y los bordes del portaobjetos con una toallita de papel . No se deben

secar las superficies teñidas. No lavar con agua. 9) Colocar una gota de líquido de montaje. Cubrir con cubreobjetos y observar en microscopio

de fluorescencia a 100 a 250X. Confirmar a 400X.

Bibliografía

1) Roum. Biotechnol. Lett., Vol. 6, No. 3, 2001, pp. 177.206. Bucharest University, Center for Research in Enzymology and Biotechnology, Roumanian Society of Biological Sciences

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3) Immunobiology 5th ed. Janeway, Charles A.; Travers, Paul; Walport, Mark; Schlomchik, Mark. Garland Publishing c 2001

4) http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/fluorophase.html 5) Manual de procedimientos. Instituto Malbrán.

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Citometría de flujo

La citometría de flujo es una técnica que permite la medición y análisis de múltiples características de una misma partícula. Estas partículas, generalmente células, fluyen a través de una tubuladura sobre la cual incide un rayo láser. Las propiedades que pueden ser medidas incluyen el tamaño de las partículas, la granularidad relativa (que es una medida de la complejidad interna) y la intensidad de la fluorescencia emitida. Estas características se determinan usando simultáneamente un sistema óptico y un sistema electrónico que permiten conocer cómo la célula o partícula desvía el rayo láser incidente y la fluorescencia que emite. Un citómetro de flujo consta de tres sistemas: 1. Sistema de fluidos 2. Sistema óptico 3. Sistema electrónico. El sistema de citometría de flujo permite analizar partículas de 0,2 a 150 micrómetros. La luz desviada por las partículas así como la fluorescencia emitida por ellas es captadas por lentes posicionados para tal fin. Luego la información es trasmitida a detectores que producirán señales electrónicas proporcionales a la señal óptica recibida Es decir que el sistema electrónico convierte las señales ópticas en electrónicas para que puedan ser procesadas por una computadora. En algunos casos, cuando el aparato tiene sistema de separación de partículas, el sistema electrónico identifica cuáles de las células o partículas guardar y cuáles desechar. .

1-Sistema de fluidos La zona del citómetro donde las células (o partículas) se juntan con el fluido se la conoce como cámara de flujo El fluido del citómetro se encuentra a presión y conduce la muestra a través de la cámara de flujo. Las partículas de la muestra a ser analizadas llegan separadas y en una corriente de fluido presurizado. El propósito de este sistema es permitir que el rayo láser atraviese la muestra justo por el centro 2-Sistema óptico Está formando por un sistema de excitación y uno de recolección. El sistema de excitación consiste en un láser y lentes que se usan para enfocar el rayo láser El sistema de recolección consiste en lentes que colectan la luz emitida por la interacción entre el rayo láser y la partícula y un sistema de espejos y filtros que encausan rangos de ondas determinados de la luz colectada a detectores ópticos específicos. Generación de dispersión: Cuando una partícula es incidida por el rayo láser se produce una desviación de la luz que dependerá de las propiedades físicas de las partículas, es decir: su tamaño y complejidad interna. La membrana celular, el núcleo, y cualquier material granular que se encuentre dentro de la célula, afectan la desviación de la luz. La forma de la célula y la topografía de la superficie celular también contribuyen a la desviación total de la luz. La luz desviada hacia adelante (Forward Scattered light: FSC) es proporcional a la superficie o tamaño celular. FSC es una medida de la luz difractada y es detectada por un fotodiodo en dirección frontal. La luz desviada hacia el costado (Side Scattered light: SSC) es proporcional a la granularidad celular y a la complejidad interna de las células. SSC es, esencialmente, una medida de la luz refractada que ocurre en cualquier interfase dentro de la célula donde hay un cambio en el índice de refracción. SSC se colecta aproximadamente a 90 grados del rayo láser mediante lentes colectoras y luego es redireccionada a un detector.

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Correlacionando las mediciones de FSC y SSC se pueden diferenciar tipos celulares en una población heterogénea. La mayoría de las poblaciones leucocitarias pueden diferenciarse usando FSC y SSC. Fluorescencia: Un compuesto fluorescente absorbe energía de cierto rango de longitud de onda que es característico para ese compuesto. Esta absorción de luz provoca que un electrón de la sustancia fluorescente alcance un mayor nivel de energía. El electrón así excitado decae en energía emitiendo el exceso como un fotón. Esta transición de energía se denomina fluorescencia. Cuanta más energía es consumida en la absorción, más energía es emitida en la fluorescencia. - El rango de onda en el cual un compuesto fluorescente puede ser excitado se conoce como su espectro de absorción. - El rango de onda emitido por este compuesto es denominado su espectro de emisión. El láser de argón es comúnmente usado en citometría debido a que su longitud de onda de 488 nm puede excitar más de un fluorocromo. Entonces, se puede usar más de un fluorocromo simultáneamente, siempre que todos sean excitados a 488nm y que sus picos de emisión se encuentren lo suficientemente alejados entre sí. La combinación de isotiocianato de fluoresceína (FITC) y ficoeritrina (PE) satisfacen este criterio. La magnitud de la señal detectada es proporcional al número de moléculas de fluorocromo en la partícula. En una mezcla de células se pueden usar diferentes fluorocromos conjugados a anticuerpos monoclonales para distinguir las diferentes subpoblaciones celulares. El tipo de tinción captada por cada subpoblación junto con la FSC y SSC, pueden ser usadas para identificar qué tipos celulares están presentes en una muestra y los porcentajes relativos de las mismas. Filtros ópticos: Una vez que la partícula pasó a través del láser, la SSC y la señal fluorescente emitidas van al fotomultiplicador, mientras que el fotodiodo colecta la FSC. La especificidad de un detector para una tinción fluorescente en particular se puede optimizar colocando un filtro que permite que sólo un rango estrecho de longitudes de onda alcance el detector. Detección de señales: Los fotodetectores convierten las señales de luz en señales eléctricas. La intensidad de las señales eléctricas es proporcional a la intensidad de las señales de luz. Cuando la partícula se interpone en el haz de láser y comienza a desviar la luz o producir fluorescencia, se crea un pulso. El punto más alto de este pulso ocurre cuando el rayo incide sobre el centro de la partícula y se capta el máximo de luz desviada o fluorescencia emitida. A medida que la partícula se aleja del rayo, el pulso baja a la línea de base. Una vez que las señales de luz (fotones) golpean al fotodiodo, son convertidos en un número proporcional de electrones que se multiplican para crear una corriente eléctrica mayor. La corriente eléctrica viaja al amplificador y se convierte en un pulso de voltaje; este pulso depende del número de fotones detectados por el fotomultiplicador. 3-Sistema electrónico: recolección de datos. Las señales de luz se convierten finalmente en señales electrónicas, lo que permite que los datos puedan guardarse en una computadora. Pero cómo se define la muestra a tomar? Adquisición de las muestras: Se denomina así a la toma de muestra por parte del citómetro Qué tipo de datos guardará la computadora, dependerá de los parámetros que previamente establezca el operador. Estos parámetros varían de acuerdo con las muestras a analizar.

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Umbral: Se usa para limitar el número de eventos que adquiere un citómetro. El umbral se establece en un parámetro. Por ejemplo si el umbral se establece en FSC, sólo serán registradas las señales generadas por partículas cuyo tamaño sea mayor que el umbral establecido. Este control se usa para eliminar señales generadas por polvo, restos celulares, o ruido electrónico en el sistema. En aquellos equipos que tienen más de un láser, se puede establecer un segundo umbral. En ese caso la señal emitida por la partícula a ser analizada deberá alcanzar los dos umbrales para ser procesada como un evento. Los datos se guardan en un formato standard denominado “Flow Cytometry Standard Format”. Una sola célula analizada para cuatro parámetros FSC, SSC, FITC y PE genera 8 bytes de datos. Si se multiplica este valor para un sólo dato, por el número de eventos que se adquieren en cada muestra y teniendo en cuenta que cada operador procesa cerca de treinta muestras por día, se puede tener una idea de la capacidad de almacenamiento de datos que tiene un citómetro. Una vez que los datos han sido guardados, pueden ser presentados y graficados en el citómetro de diversas maneras: como histogramas, gráficos tridimensionales, gráficos de puntos, etc. Determinación de regiones o “Gating”: Un grupo de datos puede ser definido por un “gate” que es una barrera numérica o gráfica. Esta barrera se usa para definir las características de las partículas que se analizarán. Por ejemplo, en una muestra de sangre, el operador puede querer analizar sólo la población linfocitaria. Basado en la FSC o el tamaño celular la barrera (gate) puede establecerse en una curva de FSC vs SSC para permitir el análisis de células que tengan sólo el tamaño de los linfocitos. Otro ejemplo. De la muestra sólo se desea tomar la población indicada en color amarillo, entonces se establece una barrera (gate) en esa zona y el equipo sólo adquiere las partículas de esa región.

Gate 1

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Esquema de un citómetro de flujo

Una vez adquirida la muestra, los datos son guardados en la computadora del citómetro y pueden ser analizados en cualquier momento y de diversas maneras. Por ejemplo:

Análisis de datos para la determinación de subpoblaciones:

Consiste en mostrar en un gráfico los datos colectados en un archivo y luego evaluar la distribución de los eventos dentro de la curva. Los datos pueden ser subdivididos creando barreras (gates) sobre poblaciones específicas. Cabe aclarar, que en este caso los gates o barreras establecidos no son para la toma de muestras, sino para el análisis de muestras ya adquiridas por el citómetro. Esto quiere decir que si el operador se equivocó cuando definió los parámetros de adquisición de la muestra, esos datos los perdió. Por eso es muy importante conocer el material en análisis. Por ejemplo, se puede establecer un gate sobre la población linfocitaria, para obtener y analizar los datos de los eventos que se encuentran exclusivamente en esa región determinada. Los datos obtenidos de esta región delimitada, se analizan en otros gráficos: histogramas de un parámetro, gráficos de puntos de dos parámetros, curvas tridimensionales, etc. A partir de estos datos luego se obtienen análisis estadísticos, que también son producidos por el sistema de análisis de datos del citómetro. Por ejemplo, un histograma permite analizar un parámetro contra el número de eventos. Siempre se usa un control negativo para saber dónde hay que ubicar los marcadores sobre el histograma (Ver figura1a y b derecha). Estos marcadores son usados para especificar el rango de eventos que serán considerados positivos para un parámetro. Una vez que se ha

Muestra

Lámina de

líquido

Láser Dispersor de luz de

90º (granulosidad)

Collar de

carga

- +

Desechos

Tubos colectores

Flujo celular vibratorio

Dispersor de luz

frontal (tamaño)

Fluorescencia Roja

Fluorescencia Verde

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establecido el primer marcador sobre el control negativo (M1) se ubica el segundo marcador sobre el pico del histograma que contiene la población considerada positiva (M2). Un gráfico de puntos (dot plot) muestra los datos de dos parámetros. Cada punto puede representar uno o más eventos, de acuerdo a lo establecido por el operador. (Ver figura 1b izquierda y figura 2) El marcador de cuadrantes divide un gráfico de dos parámetros en cuatro secciones y permite distinguir poblaciones negativas, positivas y doble positivas. - El cuadrante inferior izquierdo (LL) muestra la población negativa para ambos parámetros. - El cuadrante superior izquierdo (UL) muestra la población que es positiva para el parámetro graficado sobre el eje vertical. - El cuadrante inferior derecho (LR) muestra la población positiva para el parámetro graficado sobre el eje horizontal. - El cuadrante superior derecho (UR) muestra la población positiva para ambos parámetros. FiGURA 1a

Negativo Positivo

Fluorescencia

Nº

de

célu

las

M1 M2

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Figura 1 b: Gráfico de puntos e histograma

SSC-H: Granulosidad y complejidad de la partícula FSC-H: Tamaño de la partícula

Counts: Número de eventos FL1-H: Parámetro Figura 2: Gráfico de puntos (dot plot)

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Separación de partículas (SORTING) En la mayoría de las aplicaciones, una vez que la partícula ha pasado a través del rayo láser, es enviada a desecho. El sistema de separación de partículas permite capturar aquéllas consideradas de interés para análisis posteriores. Una vez colectadas, estas partículas pueden ser examinadas microscópica, bioquímica o funcionalmente. No todos los citómetros están equipados para hacer separación de partículas. Para efectuar la separación de partículas, el equipo debe primero determinar cuáles son las de interés. Una vez que la población de interés ha sido identificada en una curva de adquisición de datos, se dibuja una región alrededor de ella. Luego se carga esta información en el citómetro como “región de separación”. Esta región identifica aquellas células que serán separadas de la corriente de fluido por donde transita toda la muestra. A medida que cada célula pasa por el láser, el equipo determina si la misma pertenece a la población de interés. Dado que el alineamiento del láser y la velocidad de la corriente son fijos, el tiempo que toma el pasaje de las células a separar desde el láser hasta el tubo de captura, es constante.

Bibliografía:

1. Roum. Biotechnol. Lett., Vol. 6, No. 3, 2001, pp. 177.206. Bucharest University, Center for Research in Enzymology and Biotechnology, Roumanian Society of Biological Sciences

2. Veterinary Medical Research and Development, 2003 VMRD, Inc . P.O. Box 502,Pullman, WA 99163, U.S.A.

3. Immunobiology 5th ed Janeway, Charles A.; Travers, Paul ; Walport, Mark ; Schlomchik, Mark. Garland Publishing c 2001

4. http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/fluorophase.html

TÉCNICAS DE INTERACCIÓN SECUNDARIA: PRECIPITACIÓN Y AGLUTINACIÓN

Las reacciones secundarias pueden observarse a simple vista y reciben diferente nombre según el antígeno involucrado en la reacción sea soluble o particulado.

Si el antígeno es soluble, hablamos de una reacción de precipitación.

Si el antígeno es particulado, hablamos de una reacción de aglutinación. 1. PRECIPITACIÓN

Cuando un anticuerpo bivalente es puesto en contacto con un antígeno polivalente soluble (proteínas, virus) contra el cual el Ac es específico, se forman complejos Antígeno-Anticuerpo (Ag-Ac) que se insolubilizan y dan lugar a una reacción de precipitación. La precipitación se produce en dos etapas. En la etapa inicial, que se desarrolla rápidamente, es específica y muy poco influida por la temperatura y la concentración de electrolitos, se forman los complejos Ag-Ac primarios. En una segunda etapa, a medida que el tiempo transcurre, esos complejos Ag-Ac iniciales se agregan y originan micelas de diferentes tamaños. Cuando las micelas crecen por encima de cierta masa crítica, se tornan insolubles y precipitan espontáneamente. Algunos complejos no alcanzan a hacerlo y quedan en solución. Las micelas precipitadas tienden a sedimentar por acción de la gravedad y la velocidad de sedimentación, es proporcional al volumen de las partículas y a las densidades de las partículas e inversamente proporcional a la densidad del solvente. La temperatura acelera esta segunda etapa, que es además electrolito–dependiente. Esta segunda etapa es más lenta que la inicial, puede durar minutos e incluso horas para que se complete.

80

En los agregados de complejos Ag-Ac, cada molécula de antígeno está unida a más de una molécula de anticuerpo y cada molécula de anticuerpo está unida a más de una molécula de antígeno.

Cuando los complejos Ag-Ac se producen con haptenos monovalentes o antígenos que poseen un solo determinante antigénico por molécula, la precipitación no se produce.

Un hecho particular lo constituyen los anticuerpos monoclonales, que en su mayor parte no muestran actividad precipitante. Esto se debe a que en muchos de los casos los anticuerpos monoclonales reconocen a un único epitope no repetido, lo que les impide formar agregados (micelas) aunque el antígeno sea una macromolécula (figura 1).

Cuando se utilizan sueros inmunes obtenidos a partir de animales inoculados con estas mismas macromoléculas la precipitación sí tiene lugar, pues en estos sueros hay una mezcla de anticuerpos que reconocen distintos epitopes del mismo antígeno, lo que posibilita la formación de complejos mixtos Ag-Ac insolubles.

La formación de estos complejos ha sido explicada mediante la teoría del enrejado, que considera que la composición del precipitado formado es una consecuencia del modo en que el anticuerpo y el antígeno se han unido. Dada la bivalencia del anticuerpo y multivalencia del antígeno, las posibilidades de combinación varían según sea que en la mezcla exista exceso de antígeno, exceso de anticuerpo o equivalencia de ambos (figura 2).

Figura 1

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La capacidad de producir una reacción de precipitación es una propiedad de la mayor parte de los anticuerpos (a los que originalmente se llamó anticuerpos precipitantes). Existen anticuerpos no precipitantes, llamados coprecipitantes, que pertenecen a la clase IgG. Los anticuerpos coprecipitantes carecen de la capacidad para precipitar el antígeno, no activan el complemento y su poder protector es diferente al de los anticuerpos precipitantes. - Se ha demostrado que en los anticuerpos coprecipitantes hay un resto glucídico del tipo “rico en manosa”, que puede ser removido mediante el empleo de enzimas. Cuando esto ocurre, los anticuerpos coprecipitantes se convierten en precipitantes. - La glicosilación afecta a uno solo de los fragmentos Fab y es la responsable del particular comportamiento inmunoquímico y biológico de estos anticuerpos, convirtiendo al anticuerpo en monovalente. - El comportamiento biológico de los anticuerpos coprecipitantes de tipo IgG, podrá resultar beneficioso o perjudicial para el huésped según el carácter propio o no propio de los antígenos involucrados y de la situación particular en la que actúan los anticuerpos. - Cuando un animal es inoculado a repetición, los anticuerpos coprecipitantes constituyen del 10 % al 15% de la población total y están presentes a lo largo de toda la respuesta inmune. - Por inmunodifusión no se han detectado diferencias antigénicas entre anticuerpos precipitantes (o simétricos) y coprecipitantes (o asimétricos) con la misma especificidad. - La relación de IgG simétrico / asimétrico varía según el antígeno sea soluble o particulado. Cuando el antígeno se encuentra en solución, esta relación en general es de 90 / 10, mientras que cuando el antígeno es particulado esta relación se invierte y puede llegar hasta 30 / 70. - Se ha demostrado que en infecciones microbianas o parasitarias crónicas como brucelosis o tripanosomiasis, estos anticuerpos se producen en gran cantidad y se fijan firmemente al agente patógeno, pero no son protectores frente a la infección. Se especula que los anticuerpos asimétricos serían capaces de bloquear antígenos o epitopes, disminuyendo su concentración y como consecuencia, interviniendo en la tolerancia de baja dosis. - Durante la preñez hay un aumento de moléculas IgG asimétricas específicas contra antígenos paternos. Esto, sumado al efecto bloqueante de los anticuerpos asimétricos, sugiere que estos anticuerpos con especificidad para los antígenos de origen paterno deben participar en la protección del feto en el útero materno.

Figura 2

82

Los anticuerpos asimétricos deben ser tenidos en cuenta en la interpretación de los resultados de las pruebas de diagnóstico. Las pruebas que se basan en reacciones de interacción primaria (como ELISA o IFI) miden todos los anticuerpos específicos presentes en la muestra. Por el contrario, las pruebas que se basan en reacciones de interacción secundaria (como precipitación, aglutinación y fijación de complemento), sólo detectan anticuerpos funcionalmente bivalentes o polivalentes (no así los anticuerpos monovalentes). Las proporciones relativas de anticuerpos simétricos / asimétricos presentes en los sueros hacen que cada prueba deba interpretarse de manera diferente, dado que una misma muestra arrojará diferentes títulos de anticuerpos en las diferentes pruebas a las que sea sometida, según sea el tipo de anticuerpos que identifique la prueba. Estas diferencias deben tenerse en cuenta cuando se realizan estudios de respuesta inmune humoral, correlaciones entre nivel de anticuerpos y evolución de un proceso infeccioso o grado de protección contra el antígeno en estudio. Según sea el medio en que se realice la prueba, la precipitación puede ser en medios líquidos o en medios con geles. 1.a. Precipitación en medios líquidos

Precipitación cualitativa Si una muestra biológica sospechosa de contener un antígeno en particular se mezcla con igual volumen de una solución que contiene los anticuerpos específicos (antisuero) y se observa turbidez del medio de reacción, significa que la reacción Ag-Ac tuvo lugar. La turbidez que se observa se debe a la precipitación de los complejos inmunes formados entre el anticuerpo específico presente en el suero y el antígeno presente en la muestra. La reacción es cualitativa, ya que sólo indica la presencia del antígeno en estudio, pero no aporta datos sobre su concentración. El “Método del anillo”, se basa en la reacción que se produce en la interfase entre dos sustancias cuando en una serie de pequeños tubos se colocan sucesivamente y evitando que se mezclen, las soluciones de antígenos en diferentes diluciones y los anticuerpos que se corresponden. MÉTODO:

Se coloca en una serie de tubos 0,2 ml del suero con Ac específicos para el antígeno en estudio.

Se añade luego por las paredes 0,2 ml de la muestra sospechosa de contener el antígeno, en diluciones seriadas. Se deja en baño de María a 37 ºC durante una hora y se observa si en alguno de los tubos aparece un precipitado anular blanco que indica reacción positiva en ese tubo, es decir correspondencia entre Ag y Ac específicos que producen el enrejado en el tubo que contiene las concentraciones óptimas de ambos reactantes. 1.b. Precipitación en medios con geles Las macromoléculas pueden difundir libremente a través de geles. Empleando soportes adecuados, en especial aquellos que como base tienen agar disuelto en soluciones salinas, es posible hacer migrar antígenos y anticuerpos de modo que al encontrarse interaccionen. En estos casos, los precipitados que se originan se visualizan como nítidas bandas de precipitación. Se han descrito numerosas técnicas cualitativas, semicuantiativas y cuantitativas entre las que pueden citarse la difusión simple, la difusión doble y la difusión radial.

Difusión simple en tubo Este método es conocido también como técnica de Oudín simple, que se puede utilizar para analizar un antisuero. Consiste en colocar en un tubo de ensayo pequeño agar fundido (solución al 1%) mezclado con un volumen igual del antisuero a analizar. Producida la solidificación, se añade la solución de antígeno. El antígeno difunde a través del gel y crea un

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gradiente de concentración. En la interfase líquido-gel no se forma precipitado debido a la alta concentración antigénica en esta zona. La precipitación aparece en forma de bandas en la zona donde la concentración del antígeno que ha difundido es la óptima. Si en el suero hay más de un anticuerpo y en la solución añadida hay más de un antígeno que se correspondan, se formarán tantas bandas de precipitación como sistemas hayan interaccionado.

Difusión bidireccional En este caso ambos reactivos (antígeno y anticuerpo) migran hacia un gel intermedio (sin reactivos) por diferencias de concentración y forman el enrejado (precipitación visible) en la zona en la cual se encuentran la mayor concentración de complejos inmune asociados. MÉTODO:

Mezclar partes iguales de agar al 1% (fundido y enfriado a 50 ºC) y el antisuero con especificidad contra el antígeno en estudio.

Transferir 1 ml de la mezcla al tubo de reacción, y enfriarlo rápidamente para que solidifique.

Inmediatamente después, añadir 0,5 ml de agar al 0,5% fundido y enfriado a 50 ºC. Una vez solidificado, agregar 1 ml de una mezcla en partes iguales de agar al 1% y antígeno. Después de la solidificación, dejar los tubos a temperatura ambiente durante 24 a 48 horas convenientemente tapados para evitar evaporaciones (*2)

Proceder a la lectura de los resultados. Los anticuerpos y las partículas antigénicas difunden desde la zona de agar al 1% hacia la zona de agar al 0,5%. En el punto de encuentro se forma la banda de precipitado.

Difusión simple en placa, Inmunodifusión radial o técnica de Mancini Este método ha dado magníficos resultados para la cuantificación de antígenos. Cuando un antígeno es colocado en un orificio practicado en una placa de agar, éste difunde en forma radial. Si en la matriz del agar hay anticuerpos monoespecíficos, el antígeno que difunde formará complejos inmunes con los anticuerpos disueltos en el agar. Esta reacción se observa como un halo de precipitación. De acuerdo a los principios básicos de la difusión, el diámetro del halo de precipitación estará en relación directa con la concentración de antígeno. Si esta operación se repite colocando en diferentes orificios de la placa cantidades variables y conocidas del antígeno en estudio (por ejemplo, diluciones en base 2) y se incuba hasta que el halo de precipitación no se modifique, se puede confeccionar una recta con los resultados obtenidos, en la que se relaciona el diámetro de cada círculo de precipitación (X) con la correspondiente concentración antigénica (Y). Esta recta permite calcular la concentración de ese mismo antígeno en cualquier muestra desconocida, estableciendo el diámetro del halo de precipitación de la muestra problema. La concentración de la muestra podrá determinarse luego por simple cálculo o por interpolación a partir de la curva de calibración. La difusión radial se utiliza con muy buenos resultados para la valoración de proteínas que se encuentran presentes en mezclas complejas como por ejemplo los componentes del suero. Es indispensable disponer para ello de anticuerpos específicos contra cada uno de los antígenos que se quiere valorar. MÉTODO:

Añadir 5-10 % del suero específico (que contiene los anticuerpos) al agar fundido y enfriado a 50ºC, procurando que la mezcla sea lo más homogénea posible.

Cubrir inmediatamente la placa con la mezcla anterior y dejar en reposo hasta su solidificación.

Mediante un sacabocados, efectuar sobre el gel una serie de orificios, los que deben estar situados a distancias convenientes entre sí para evitar interferencias. (Se necesita un orificio para cada muestra a valorar y cuatro a cinco orificios para las distintas concentraciones del antígeno patrón que se utilizan para la elaboración de la recta de calibración).

En uno de los orificios de la placa, colocar 2 microlitros de la solución antigénica a valorar (muestra problema), o una dilución conveniente de esta solución.

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En los orificios restantes, colocar 2 microlitros de cada una de las diluciones del antígeno patrón, de concentración conocida.

Mantener las placas a temperatura ambiente, en cámara húmeda, hasta que el halo de precipitación no varíe.

Evaluar los resultados mediante la determinación del diámetro de los halos de precipitación. Los resultados pueden leerse sobre el material fresco o después de lavar las placas (Ver método más adelante).

Difusión doble en placa, Inmunodifusión doble o técnica de Ouchterlony Ouchterlony describió un método interesante de difusión doble en placas, el cual consiste en enfrentar las soluciones de antígeno y anticuerpo en perforaciones efectuadas en el gel (agar) a distancias convenientes. De esta manera, ambos difunden a través del agar, se ponen en contacto y producen una banda de precipitación cuando las respectivas concentraciones están en relación óptima. - Si las concentraciones de Ag y Ac colocados en los reservorios son las que corresponden a la

zona de equivalencia, la banda de precipitación se forma aproximadamente en la distancia media que separa esos reservorios.

- Cuando hay exceso de antígeno, la banda de precipitación se forma próxima al reservorio del anticuerpo

- Cuando hay exceso de anticuerpo, la banda de precipitación se forma próxima al reservorio del antígeno.

Con esta técnica puede tenerse una idea de las relaciones entre los pesos moleculares de los antígenos y anticuerpos reaccionantes, cuando se trabaja con concentraciones óptimas de Ag y Ac. - Si la banda de precipitación formada es recta, indica que los pesos moleculares de ambos

son muy próximos. - Si la banda es cóncava con respecto al reservorio del antígeno, señala que el peso molecular

de éste es superior al del anticuerpo. - Si la banda es convexa con respecto al reservorio del antígeno, señala que el peso molecular

de éste es menor que el del anticuerpo Los dos fenómenos descritos son una consecuencia de las leyes generales de la difusión, que establecen que la distancia a la que una sustancia difunde está en relación directa con su concentración y en relación inversa con su peso molecular. Dependiendo de la cantidad de muestras a analizar o del tipo de estudio a realizar, se emplean distintos esquemas reactivos, como por ejemplo:

Esta metodología permite determinar si hay más de un sistema reaccionando en forma simultánea, pues cada uno de ellos dará una banda de precipitación específica. Además, nos permite identificar reacciones cruzadas, pues en estos casos habrá fusión de bandas. Originalmente Ouchterlony describió tres tipos de reacciones: de identidad, no-identidad e identidad parcial. Estas reacciones se esquematizan en la figura 3 para el caso hipotético de tres antígenos (a, b, ab) y dos anticuerpos (A: anti-a, AB: anti-a y anti-b).

1) 2) 3) 4)

85

- En el caso I, los dos sistemas Ag-Ac que reaccionan son iguales y se funden en una única banda de precipitación (reacción de identidad). - En el caso II hay dos sistemas Ag-Ac diferentes que reaccionan independientemente y cada uno produce una banda de precipitación que se cruzan (reacción de no-identidad) evidenciando la presencia de reacciones Ag.-Ac diferentes. - En el caso III, uno de los antígenos tiene un epitope que no existe en el otro. Por lo tanto ambas bandas de precipitación se unen y funden parcialmente en una banda, apareciendo una prolongación o espolón en la banda correspondiente al antígeno que contiene los dos epitopes. Este espolón indica que en este antígeno “ab” hay componentes antigénicos no compartidos con el antígeno “b” (reacción de identidad parcial).

La difusión doble en placa es un excelente método para el estudio de la homogeneidad de antígenos y anticuerpos purificados. Resulta muy útil también para la búsqueda de impurezas, lo que está limitado por la concentración en que éstas se encuentren presentes, ya que la precipitación se hace visible cuando los reactivos exceden valores mínimos. Para obviar este inconveniente, se emplean generalmente altas concentraciones de Ag y Ac, lo que permite aumentar la concentración de las impurezas y asegurar su precipitación. La inmunodifusión doble es utilizada ampliamente en el diagnóstico serológico de varias enfermedades en Medicina Veterinaria, por ejemplo para el diagnóstico serológico de la Anemia Infecciosa Equina, método denominado “Test de Coggins” (figura 4). En esta prueba, en una perforación central se coloca un purificado proteico del virus de la anemia infecciosa equina y en seis perforaciones equidistantes del antígeno y entre sí, se intercalan sueros de animales positivos (suero control positivo) y sueros de animales que se desea investigar (sueros problema: S1, S2 y S3).

- Si el suero problema es negativo (S3) las bandas de precipitación de los dos sueros positivos adyacentes se introducen en la perforación. - Si el suero problema es positivo (S2), se forma una banda de precipitación entre el suero problema y el antígeno que se fusiona con las bandas de precipitación de los dos sueros positivos adyacentes (reacción de identidad). - Si la banda del suero positivo se dobla pero no forma una banda de identidad completa, el suero problema es considerado positivo débil (S1).

En cualquiera de estos dos últimos casos el animal se considera infectado. Este esquema también se emplea para el diagnóstico serológico de otras enfermedades como Fiebre Aftosa en bovinos, Brucelosis en caninos (Brucella canis) u ovinos (Brucella ovis ) o la Enfermedad de Marek en aves.

Figura 3

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MÉTODO:

En una placa de Petri o un portabojetos se vierte el agar fundido y enfriado a 50ºC. Se deja solidificar y se confeccionan los orificios con un sacabocados.

Para las pruebas diagnósticas de rutina en Medicina Veterinaria, se coloca el antígeno en el orificio central y en los orificios exteriores se intercalan el suero control positivo y cada uno de los distintos sueros problema.

Las placas o portaobjetos se mantienen en cámara húmeda. La lectura de los resultados se efectúa a las 48 - 72 horas.

Si interesa conservar los resultados, el agar puede colorearse, previa desecación. - En este caso, el agar debe lavarse previamente por inmersión en solución salina durante un total de 24 a 48 horas, efectuando el recambio de la solución salina cada 12 horas. Este lavado es necesario para eliminar las proteínas no precipitadas. - Luego del lavado, el agar se cubre con un trozo de papel de filtro húmedo y se deja secar a temperatura ambiente. - Una vez seco, se retira el papel y se lo sumerge en la solución colorante Azul de Coomasie durante aproximadamente 1½ hora. El exceso de colorante se elimina por inmersión en solución decolorante y se procede luego al secado en estufa a 50 ºC.

2. AGLUTINACIÓN

Cuando un anticuerpo (bi o polivalente) es puesto en contacto con el antígeno para el cual es específico, si este antígeno es polivalente y se encuentra en estado particulado (hematíes, bacterias, células), se forman complejos Ag - Ac que dan lugar a una reacción de aglutinación. Esta reacción puede observarse micro o macroscópicamente como agregados o grumos de número y tamaño variable. Los principios que regulan la aglutinación son los mismos que regulan la precipitación; la ocurrencia de uno u otro fenómeno depende de que el antígeno sea particulado (se encuentre en suspensión) o soluble (en solución). La aglutinación se lleva a cabo en medio salino. La concentración óptima de electrolitos es de 0,15 M. Se cree que el mecanismo de aglutinación se debe a que los iones neutralizan en parte las cargas superficiales de las partículas antigénicas, evitando el rechazo entre ellas y asegurando la aproximación indispensable para que una molécula de anticuerpo reaccione con al menos dos partículas antigénicas. De esta manera se inicia la formación de los complejos inmunes que llevan a la aglutinación.

Figura 4

S 3

+ +

S 2

+

Ag

S 1Ag: antígeno

+: suero control positivo

S 1: suero positivo débil

S 2: suero positivo

S3: suero negativo

S 3

+ +

S 2

+

Ag

S 1

S 3

+ +

S 2

+

Ag

S 1Ag: antígeno

+: suero control positivo

S 1: suero positivo débil

S 2: suero positivo

S3: suero negativo

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2.a. Aglutinación cualitativa; Los métodos de aglutinación cualitativa son muy utilizados en serología diagnóstica con el

objeto de identificar bacterias, tipificar grupos sanguíneos, etc. En estos casos es indispensable disponer de anticuerpos monoespecíficos. Estas reacciones se efectúan en portaobjetos mezclando las suspensiones de bacterias o hematíes a identificar, con una batería de anticuerpos con diferente especificidad. La presencia de aglutinación indica la especificidad del sistema reaccionante. MÉTODO (Identificación de microorganismos):

Se suspende el cultivo microbiano en estudio en solución salina, procurando que la suspensión sea lo más densa posible (no menos de 2 x 1010 bacterias/ ml).

En un portaobjetos se coloca una gota de cada uno de los anticuerpos específicos (por ejemplo, suero anti Escherichia coli K88, suero anti E. coli K99 y suero anti E. coli F41) y otra de solución salina (control negativo), de modo que estén a una distancia tal que se evite su mezcla accidental.

A cada una de estas gotas, se añade un volumen igual de la suspensión bacteriana y se mezcla para homogeneizar. El portaobjetos se agita suavemente por rotación manual.

Se incuba durante unos minutos a temperatura ambiente y se observa. La aparición de grumos o agregados en alguna de las mezclas indica la identidad de la bacteria en estudio. Estos grumos son de tamaño variable. A veces son visibles a simple vista pero otras veces es necesario el uso de lupa o microscopio para observarlos. 2.b. Aglutinación semicuantitativa: Los métodos semicuantitativos consisten en determinar cuál es la máxima dilución del suero que se está analizando que es capaz de producir aglutinación. Las diluciones se hacen generalmente en base dos y el título se expresa por la inversa de la máxima dilución aglutinante. Por ejemplo, si la dilución 1/1024 aglutina y no lo hace la dilución 1/2048, el título será 1024. Los valores obtenidos son groseros y pueden aproximarse efectuando diluciones intermedias. El estudio de la cinética del título de anticuerpos específicos permite seguir la evolución de una infección bacteriana o de una iso-sensibilización, por ejemplo, por antígenos hemáticos. La determinación de anticuerpos por aglutinación puede hacerse mediante reacciones de lectura lenta o rápida. En el primer caso (lectura lenta) se emplean suspensiones diluidas y estandarizadas de un antígeno, que se mezclan con volúmenes iguales de diferentes diluciones del suero a valorar, empleando como diluyente una solución salina. Antígeno y anticuerpo se incuban en tubos de ensayo a 37ºC durante tiempo variable según el estudio. El título se determina buscando cuál es el tubo con la máxima dilución del suero que presenta aglutinación. Tal es el caso de la prueba de Wright para el diagnóstico de brucelosis y de la prueba de Microaglutinación de Martin y Petit para el diagnóstico de leptospirosis En la prueba de Wright la reacción se realiza en tubos, en los que se enfrentan diluciones 1/25, 1/50, 1/100 y 1/200 del suero problema con una cantidad estandarizada de bacterias (Brucella abortus cepa 19). Las mezclas (de aspecto turbio blanquecino debido a las células bacterianas) se incuban a 37ºC durante 48 horas y luego se observan con luz tangencial sobre fondo oscuro. La aglutinación se manifiesta como formación de grumos grandes que sedimentan en el fondo del tubo. Paralelamente se observa la clarificación del medio líquido, dado que las bacterias que le daban turbidez se encuentran en los grumos. La aglutinación rápida es muy usada en serología diagnóstica. Por ejemplo para el diagnóstico de brucelosis (por Brucella abortus, mellitensis y suis) se emplea la Reacción de B.P.A. (Buffered Plate Antigen). En este caso, la reacción se efectúa en placas de vidrio. El antígeno que se emplea está 20 veces más concentrado que el usado en la aglutinación lenta y la lectura de los resultados se hace a los 8 minutos. En la práctica diaria el uso de las pruebas de aglutinación se encuentra muy estandarizado, al punto que son las pruebas oficiales para el diagnóstico de la brucelosis bovina. El “Plan

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Nacional de Erradicación de la Brucelosis Bovina” se basa en la vacunación obligatoria de las terneras entre los 3 y 8 meses de edad y en la posterior identificación y segregación de los animales infectados. La identificación de los animales infectados se realiza a través de la detección de anticuerpos específicos contra Brucella abortus. En el caso particular de la cepa 19 de B. Abortus, la vacunación desencadena en el animal una respuesta inmune primaria, con niveles de IgM que se mantienen en el tiempo y niveles bajos de anticuerpos de tipo IgG. Las técnicas serológicas de aglutinación rápida y lenta se emplean para diferenciar los animales que presentan anticuerpos de tipo IgM a consecuencia de la vacunación de aquellos que presentan anticuerpos de tipo IgG inducidos por una infección activa con la cepa de campo. Los sueros problema son analizados por la prueba de B.P.A, que permite la identificación de los animales que presentan anticuerpos específicos contra Brucella abortus. Esta prueba es muy sensible pero poco específica y además no permite discriminar si los anticuerpos que reaccionan son de tipo IgG o IgM. Por lo tanto, las muestras que resultan positivas a B.P.A. son analizadas luego por las pruebas de Wright y por la Prueba del 2-mercaptoetanol. En ambos casos se enfrentan diluciones seriadas del suero problema con una suspensión estandarizada de Brucella abortus cepa 19. Los tubos de la prueba de 2-mercaptoetanol (2-ME) son tratados previamente con una solución de 2-ME que destruye los puentes disulfuro de las IgM, por lo que estos anticuerpos pierden su poder aglutinante. De esta manera, si se observa aglutinación aún en los tubos tratados con 2-ME, significa que la aglutinación es debida a la presencia de anticuerpos de tipo IgG. Los animales que resultan positivos a esta prueba son considerados como infectados y deben ser segregados del rodeo. Otra aplicación de la técnica de aglutinación es la determinación cualitativa y cuantitativa de anticuerpos antitoxoplasma. MÉTODO:

Colocar 60ul de suero a analizar en el pocillo número 1 de una placa de microaglutinación con pocillos de fondo cónico.

Colocar una gota de buffer borato a temperatura ambiente desde el pocillo número 2 al número 8.

Diluir el suero en el buffer borato utilizando un microdilutor, descartar el excedente del pocillo número 8).

Colocar una gota de antígeno de toxoplasma en todos los pocillos.

Agitar las placas enérgicamente durante 30 segundos cuidando de que no se derrame el contenido de los pocillos.

Colocar un film plástico a fin de evitar la desecación e incubar 24 horas a temperatura ambiente.

La lectura se facilita si se efectúa sobre un fondo oscuro o mediante iluminación oblicua. La ausencia de aglutinación se traduce por la aparición de un pequeño botón netamente destacado. En caso de aglutinación positiva, se observa un tapiz homogéneo de células o un botón de mayor tamaño que el anterior y con contornos irregulares. El título del suero corresponde a la dilución más elevada que muestre una aglutinación total o casi total. En este último caso, el diámetro del tapiz debe ser superior a la mitad del diámetro del pocillo. El control del antígeno debe ser totalmente negativo. También en este caso, para diferenciar si el anticuerpo que actúa es de isotipo IgM o IgG se utiliza la prueba del 2-ME. Los valores límite de esta técnica son 1/128 para el perro y 1/256 para el gato. 2.c. Aglutinación pasiva

Los anticuerpos específicos contra un antígeno soluble no pueden detectarse por

precipitación si su concentración es inferior a los 20 g/ml. Teniendo en cuenta que la aglutinación es más sensible, se ha procurado fijar antígenos solubles a partículas de modo de

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transformar la reacción de precipitación en una reacción de aglutinación. Esto se ha logrado con magníficos resultados mediante la fijación de antígenos solubles a hematíes o partículas inertes como el poliestireno, el látex y la bentonita. A la reacción que resulta del empleo de glóbulos rojos como soporte se la llama Hemoaglutinación pasiva, y simplemente Aglutinación pasiva cuando se utilizan otros soportes. Generalmente las uniones de los antígenos a los soportes son no covalentes y la fijación se obtiene por mezcla directa. En el caso de los hematíes, la fijación de hidratos de carbono no necesita intermediarios; en cambio para la fijación de proteínas es necesario el tratamiento previo de los glóbulos rojos con aldehídos simples como el fórmico o pirúvico. La aglutinación pasiva es un método semicuantitativo que, al igual que la aglutinación, permite determinar concentraciones relativas de anticuerpos sobre la base de la máxima dilución aglutinante. Es cuatro veces más sensible que la aglutinación y mucho más aún que la precipitación. Esto es consecuencia del tamaño de las partículas antigénicas que intervienen en la reacción. En la precipitación, el antígeno es pequeño y se necesitan muchos complejos Ag-Ac agregados para que la reacción se visualice, en tanto que en la aglutinación pasiva se ha transformado al antígeno en una partícula de gran tamaño, capaz de dar aglutinados visibles con unos pocos complejos Ag-Ac. El número de moléculas de anticuerpo que intervienen en uno y otro caso difieren muchísimo, de ahí la distinta sensibilidad (límite de detección). La reacción se efectúa colocando en tubos distintas diluciones del suero a valorar y un volumen determinado del antígeno fijado al soporte. Anticuerpo y antígeno se mezclan mediante agitación suave y se incuban durante un tiempo determinado, en general a temperatura ambiente. Los tubos se observan sin centrifugar, por la parte inferior, para determinar si ha habido aglutinación. Esta técnica se emplea para investigar hormonas y antígenos solubles en sangre, orina y otros fluidos. Fenómeno de Prozona: Cuando se valora un antisuero, la disminución de la concentración de los anticuerpos por el efecto de la dilución del suero hace que la reacción de aglutinación decrezca hasta hacerse nula. No obstante ello, en algunos sueros se observa un comportamiento particular que está caracterizado por la ausencia de aglutinación en los primeros tubos de la serie, en los que la concentración de anticuerpos es máxima, y aglutinación positiva a diluciones mayores del suero. A este fenómeno se lo llama prozona. Mediante el empleo de anticuerpos marcados se ha podido demostrar que en estos tubos, aún en ausencia de aglutinación, el anticuerpo está unido al antígeno. Puesto que existe un marcado exceso de anticuerpos respecto a los determinantes antigénicos, estadísticamente es muy poco probable que los dos fragmentos Fab del anticuerpo puedan unirse a dos epitopes ubicados en partículas diferentes. Este fenómeno además está relacionado con los anticuerpos asimétricos o monovalentes mencionados anteriormente. La reacción de Coombs permite identificar estas reacciones incompletas. (Ver capítulo de grupos sanguíneos y reacciones post-transfusionales). Todo esto indica la necesidad de evaluar los sueros a más de una dilución para descartar los falsos negativos debidos al fenómeno de prozona. Bibliografía 1. Morilla A. y Bautista C. R. Manual de Inmunología México: Editorial Diana.1º edición,

septiembre de 1986.Capítulo 6. 2. Margni R. A. Inmunología e Inmunoquímica Fundamentos. Bs. As. Editorial medica

Panamericana 5º edición septiembre de 1996. Capítulo I. 3. Inmunología básica. Guía de trabajos prácticos. Fac. Cs. Veterinarias. Año 2000. 4. Guerrero R.; Gonzalez C.L.; Medina E.L.; Epidemiología.E.A.U.: Editorial: Addison-Wesley

Iberoamericana.1° edición, 1981. Edición consultada, 1986. Capítulo 14.

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5. Manual de Procedimientos para el Diagnóstico de la Brucelosis Bovina. Departamento de Brucelosis. DILACOT – SENASA. 2000

Grupos sanguíneos en caninos y reacciones post-transfusionales

Los antígenos de grupos sanguíneos son glucolípidos y glucoproteínas localizados en la superficie de la membrana celular de los glóbulos rojos. Son heredados en forma independiente entre ellos y por herencia mendeliana de dominancia autosómica. La denominación internacional de grupos sanguíneos caninos y sus características de muestra en la Tabla 1. TABLA 1: Grupos sanguíneos del canino

Grupo sanguíneo (DEA) (1)

Incidencia en la población

(%) (2)

Presencia de anticuerpos naturales (3)

Importancia en la transfusión

1.1 42 No Reacción hemolítica aguda.

1.2 20 No Reacción hemolítica aguda.

3 6 Sí Retardada, secuestro de células, no hemólisis.

4 98 No Ninguna.

5 23 Sí Retardada, secuestro de células, no hemólisis.

6 98-99 No Desconocida.

7 45 Sí Retardada, secuestro de células, no hemólisis.

8 40 No Ninguna.

(1) DEA = Dog erythrocyte antigen. (antígeno eritrocitario canino) (2) La incidencia en la población está basada en una compilación de estudios internacionales. (3) Los anticuerpos naturales son anticuerpos específicos contra los antígenos de grupo

sanguíneo que el individuo no posee. Están presentes en la sangre sin que haya habido exposición previa a dichos Ags. Se sintetizarían por estímulos antigénicos provocados por sustancias que están en la naturaleza, especialmente en plantas y bacterias, que son de estructura muy similar a los Ags eritrocitarios.

La importancia de los diferentes Ags de grupos sanguíneos en las reacciones post-transfusionales se relaciona con su inmunogenicidad, su frecuencia en la población y la presencia de anticuerpos naturales. El grupo sanguíneo DEA1.1 es el más inmunogénico (siguiéndole el DEA1.2) y es capaz de provocar reacciones agudas de fuerte hemólisis intravascular por activación de la vía clásica del complemento. Sin embargo, debido a que no hay anticuerpos naturales contra este Ag, la reacción post-transfusional aguda no tiene lugar en una primera transfusión a un receptor DEA1.1 negativo. El resto de los grupos sanguíneos (a excepción de DEA4), están constituidos por Ags débiles, que no provocan hemólisis intravascular sino una reacción de secuestro y destrucción extravascular de los eritrocitos incompatibles por parte del sistema mononuclear-fagocítico. El carácter retardado y no agudo de este tipo de respuesta determina que aún con presencia de anticuerpos naturales en los animales negativos, como es el caso de los grupos DEA 3, 5 y 7, tampoco resulte crítica una primera transfusión de sangre incompatible. No se han identificado reacciones post-transfusionales relacionadas con el grupo sanguíneo DEA4. Por esta razón, los animales portadores de este grupo sanguíneo son considerados dadores universales. Las características de los grupos sanguíneos caninos en lo que respecta a su inmunogenicidad (y consecuentemente, al tipo de reacción que provocan) y la presencia o ausencia de anticuerpos naturales en la población, determinan que una primera transfusión de sangre

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incompatible, cualquiera sea el grupo sanguíneo al que pertenezcan los eritrocitos transfundidos, no produzca una rápida destrucción masiva, sino las siguientes consecuencias: - Estimulación de una respuesta inmune primaria que disminuye la vida media de los

eritrocitos transfundidos, pues los mismos son destruidos progresivamente a medida que la respuesta inmune se desarrolla.

- Vida media más breve de los eritrocitos transfundidos si la incompatibilidad se debe a antígenos contra los cuales el receptor posee anticuerpos naturales.

- Sensibilización del animal receptor a los Ags del grupo sanguíneo incompatible transfundido. De este modo, en futuras transfusiones con sangre incompatible de igual grupo que la primera se producirá una respuesta inmune secundaria. Este efecto es importante para grupos que provocan reacción fuertemente hemolítica (DEA1.1 y en menor medida DEA1.2).

- Posible sensibilización de la madre DEA1.1 negativa a los eritrocitos DEA1.1 del feto durante la preñez (25 % de incidencia). Esta situación es equivalente a la sensibilización por transfusión. En cuanto al recién nacido, éste puede llegar a tener problemas de hemólisis intravascular al mamar calostro que contiene los anticuerpos maternos contra su grupo eritrocitario (ver isoeritrólisis neonatal).

Para prevenir las situaciones mencionadas, se recomienda tipificar previamente la sangre de donante y receptor o, en su defecto, realizar la “prueba cruzada (cross-match)”. La mayor eficacia en la transfusión se logra cuando los eritrocitos del donante pertenecen a igual grupo sanguíneo que los del receptor, o cuando se transfunden eritrocitos del grupo DEA-4.

Tipificación de los antígenos de grupos sanguíneos: La tipificación consiste en incubar una suspensión de eritrocitos del individuo con antisuero o Acs monoclonales específicos para cada antígeno eritrocitario. La presencia de aglutinación indica que se ha producido reacción antígeno-anticuerpo y en consecuencia, hay certeza de que esos eritrocitos tienen el antígeno de grupo sanguíneo para el cual es específico el antisuero o los Acs monoclonales utilizados. Dada la alta probabilidad de reacciones falsas negativas, debe confirmarse el resultado mediante la prueba de Coombs (ver más adelante). Es frecuente que sólo se tipifique el grupo sanguíneo DEA1.1. De este modo, si bien no se evita la disminución de la vida media de los eritrocitos transfundidos debido a la posible incompatibilidad con otros grupos sanguíneos, se elimina la posibilidad de reacciones hemolíticas agudas graves.

Prueba cruzada: En el caso de que no sea posible realizar la tipificación, se impone la realización de una prueba cruzada. Esta prueba se subdivide en prueba mayor y prueba menor. En la prueba mayor se incuban los eritrocitos del donante con el suero o plasma del receptor. En la prueba menor se incuban los eritrocitos del receptor con el suero o plasma del donante. Se procede luego a la centrifugación. La reacción positiva, que consiste en la presencia de aglutinación en el sedimento y/o de hemólisis en el sobrenadante, indica que el plasma tiene Acs contra los Ags eritrocitarios. En el caso de la prueba mayor, el resultado positivo hace contraindicada la transfusión. Una reacción positiva en la prueba menor resulta significativa cuando se van a transfundir volúmenes grandes de sangre y nos indica la conveniencia de transfundir sólo eritrocitos y no sangre entera. El resultado de la prueba cruzada no indica identidad de grupos sanguíneos entre dador y receptor; sólo manifiesta la presencia o ausencia de Acs contra los Ags eritrocitarios en el plasma. Es una medida indirecta y parcial de compatibilidad sanguínea, debido a que un resultado negativo sólo indica que la transfusión no provocará reacciones post-transfusionales inmediatas, pero no garantiza que se eviten las consecuencias a mediano y largo plazo descriptas en el primer apartado.

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PRUEBA DE COOMBS

La aglutinación es la manifestación visible de una reacción Ag-Ac en la cual el Ag es particulado, como por ejemplo las bacterias y los eritrocitos. Sin embargo, en algunos casos, si bien tiene lugar la reacción Ag-Ac no se produce la esperada manifestación visible, o sea, la formación de lo que se denomina “enrejado” y que se visualiza en forma de aglutinación. Diversas son las causas que pueden concurrir para producir este efecto: a- Exceso de Acs: En este caso, cada molécula de Ac se uniría con la totalidad de sus

valencias a una misma partícula antigénica. Así, sería imposible la formación del enrejado pues no se producirían puentes de Acs entre las moléculas de Ag.

b- Presencia de Acs monovalentes: Son Acs que debido a determinadas características de glicosilación se comportan como monovalentes, imposibilitando la formación del enrejado. Los Acs contra Ags eritrocitarios pertenecen en su mayoría a este grupo.

c- Defecto de Acs: La cantidad de Acs específicos contra el Ag es muy escasa, y no alcanza para formar un enrejado del tamaño suficiente como para que resulte visible.

La prueba de Coombs, también llamada de la antiglobulina, permite evidenciar estas reacciones Ag particulado-Ac mediante el agregado de anti-Igs de la especie. Las anti-Igs agregadas (también llamadas suero de Coombs), harán de puente entre las regiones Fc de los Acs unidos a las partículas antigénicas, formando de este modo el enrejado que se ve en forma de aglutinación. La prueba de Coombs puede ser directa o indirecta. La técnica de Coombs directa consiste en el agregado de la anti-Ig a una suspensión de partículas de la que nos interesa saber si ya llevan unidas anticuerpos. El diagnóstico de la anemia hemolítica autoinmune, caracterizada por la presencia de auto-Acs contra los eritrocitos propios, constituye un ejemplo de uso de esta técnica directa y consiste en el agregado del suero de Coombs a una suspensión de eritrocitos de un animal sospechoso de sufrir la enfermedad. La técnica de Coombs indirecta, en tanto, consiste en el agregado de anti-Ig de la especie a una reacción previa de aglutinación que ha resultado negativa. Por lo tanto, implica dos pasos: una primera incubación de la suspensión de Ag particulado con el antisuero y una segunda incubación luego del agregado del suero de Coombs. De este modo podemos diferenciar los resultados falsos negativos, cualquiera sea la causa que los provoque, de los resultados negativos reales debidos a la ausencia de Acs específicos. La prueba de Coombs indirecta resulta de suma utilidad para evidenciar los fenómenos de prozona y para la tipificación de grupos sanguíneos. La reacción de Coombs se esquematiza en la figura 1. Figura 1

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ISOERITRÓLISIS NEONATAL

Esta enfermedad, también denominada ictericia hemolítica del recién nacido, se produce cuando la madre transmite Acs contra los Ags eritrocitarios del cachorro a través del calostro, provocando en el cachorro una reacción de hemólisis intravascular aguda. Puede producirse cuando una madre DEA1.1 negativa, previamente sensibilizada al Ag eritrocitario DEA1.1, tiene un cachorro DEA1.1 positivo. El resto de los Ags de grupos sanguíneos carecen de relevancia en lo que respecta a esta enfermedad, debido a que son Ags débiles y no provocan reacciones de hemólisis intravascular. La sensibilización de la madre puede suceder por dos circunstancias: a- Que alguna vez haya recibido una transfusión de sangre DEA1.1. b- Que en una anterior preñez de un cachorro DEA1.1 positivo, los eritrocitos del feto hayan

pasado a la circulación sanguínea materna. Este hecho, que cuando sucede tiene lugar en fecha cercana al parto, estimula la producción de una respuesta inmune específica de tipo primaria en la madre. Esta respuesta da lugar a una muy baja o nula cantidad de Acs anti-DEA1.1 al momento de la producción de calostro, por lo que no hay riesgo de isoeritrólisis neonatal en esta primera preñez. No obstante, la madre queda sensibilizada para futuras gestaciones. En una posterior gestación de un cachorro DEA1.1 y en el caso de que los eritrocitos del feto pasen a la circulación materna, la hembra ya sensibilizada (cualquiera sea la causa de la sensibilización) responderá a este estímulo antigénico con una respuesta de tipo secundaria. Esta respuesta dará lugar a una rápida síntesis de una elevada tasa de Acs que serán transmitidos al recién nacido mediante el calostro. Los Acs anti-DEA1.1 al unirse a los eritrocitos del neonato, provocarán la activación de la vía clásica del complemento con la consecuente hemólisis intravascular aguda. La isoeritrólisis neonatal puede prevenirse si se evita que el recién nacido mame calostro, pero dado que el calostro es un alimento fundamental, no conviene privar de él al cachorro a menos que exista la seguridad de la presencia de Acs anti-eritrocitos. La realización de una prueba cruzada entre el suero o plasma de la madre y los eritrocitos del recién nacido, es la herramienta con que se cuenta para tomar la decisión: Un resultado positivo hace contraindicado el mamado de calostro. Es posible realizar esta prueba antes del parto utilizando los eritrocitos del padre; de este modo obtenemos el dato con anticipación para poder preparar el manejo adecuado del recién nacido en caso de que la prueba arroje resultado positivo (administración de calostro artificial, búsqueda de nodriza, etc) APENDICE

Grupos sanguíneos del felino

Grupo sanguíneo

Genotipo (1)

Frecuencia de expresión (2)

Anticuerpos naturales (3)

A A/A - A/B El más común (74-100%) Puede haber una mínima reacción anti-B

B B/B Menos común (0-26 %) Altos títulos de anticuerpos naturales anti-A

AB A/B Menos común (0,1-9,7%) Ninguno

(1) El alelo A es dominante. El fenotipo AB es el resultado de un tercer alelo que permite la

expresión codominante de A y B. (2) Estos datos están basados en una compilación de estudios internacionales. (3) Hay peligro de reacción post-transfusional entre receptor de grupo B y donante de grupo

A, aún en la primera transfusión.

Grupos sanguíneos del equino La determinación de grupo sanguíneo en el equino se puede utilizar para la determinación de paternidad. También es una técnica corriente en esta especie debido a la incidencia de anemia hemolítica del recién nacido.

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Sistemas Alelos o factores Grupos sanguíneos (1)

A A1 - A` - H - A - H - a A1 - A` - H - A1A` - A1H - A`H - A1A`H - (-)

D D - J – d D - J - DJ - (-)

P P1 - P` - p P1 - P` - P1P` - (-)

Q Q - R - S - QR - RS - q Q - R - S - QR - QS - RS - QRS - (-)

C C – c C - (-)

K K – k K - (-)

T T – t T - (-)

U U – u U - (-)

(1): Los complejos antigénicos se heredan en bloques, es decir, en asociaciones definidas de factores sanguíneos que constituyen los grupos sanguíneos, no heredándose los factores componentes por separado. Bibliografía: 1. Halle A. Canine blood groups and their importance in veterinary transfusion and medicine.

Veterinary Clinics of North America: Small Animal Practice. Vol. 25, Number 6, Nov. 1995, 1323-1332.

2. Giger U et al. An acute hemolytic transfusion reaction caused by dog erythrocyte antigen 1.1 incompatibility in a previously sensitized dog. JAVMA, Vol. 206, May 1, 1995, 1358-1362.

3. Margni R. A. Inmunología e Inmunoquímica Fundamentos. Bs. As. Editorial Médica Panamericana. 5º edición, septiembre de 1996.

4. Tizard, I. Inmunología Veterinaria. Ed. Interamericana. M.C.Graw – Hill. 4° Edición, 1995.

Evaluación de Inmunidad celular por linfoproliferación La prueba de linfoproliferación consiste en la evaluación de la expansión clonal de los

linfocitos de sangre periférica en cultivos estimulados en forma inespecífica (con mitógenos) o específica (con antígenos). Los mitógenos son sustancias que tienen afinidad por determinadas estructuras químicas de la superficie linfocitaria y que, al unirse a ellas, inducen la activación y proliferación de los linfocitos en forma policlonal e inespecífica. Son ejemplos de estos mitógenos la Concanavalina-A (Con-A), la Fitohemaglutinina (PHA), el mitógeno de la hierba carmín (PWM), el Lipopolisacárido (LPS) y la proteína A del Staphylococcus, entre otros. Las poblaciones linfocitarias sobre las que actúan estos mitógenos varían según la especie animal. En la especie canina, por ejemplo, la Con-A se clasifica como mitógeno de células T en tanto que el LPS, la proteína A y el PWM estimulan la diferenciación de linfocitos B y la PHA activa ambas poblaciones linfocitarias. A diferencia de los mitógenos, los antígenos activan sólo los linfocitos de los clones específicos y desencadenan una respuesta proliferativa, oligoclonal y específica. Metodología (Figura 1): A) Obtención de las células mononucleares por separación en gradiente de densidad Se centrifuga sangre heparinizada sobre una columna de un reactivo denominado Ficoll-Hypaque o similar. Este reactivo tiene la propiedad de crear un gradiente de densidad durante la centrifugación, en el que cada componente de la sangre se ubica en un diferente nivel. De mayor a menor densidad (desde el fondo a la boca del tubo) se obtienen los siguientes estratos: eritrocitos, polimorfonucleares, Ficoll-Hypaque, células mononucleares y plasma. El halo formado por las células mononucleares (linfocitos y un mínimo porcentaje de monocitos) se aspira con una pipeta. Las células obtenidas se lavan con solución salina y se resuspenden en medio de cultivo a la concentración celular de uso.

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B) Cultivo en microplacas de 96 hoyos Las células se resuspenden en medio de cultivo y se siembran en microplacas de cultivo de 96 hoyos. En estas placas vamos a tener: Hoyos controles, que contienen la suspensión celular sin estimular. Hoyos estimulados, que contienen la suspensión celular a la que se le agrega el estímulo proliferativo, ya sea mitógeno inespecífico o antígeno. Ambos tipos de cultivo se realizan al menos por triplicado. Las placas se incuban a 37°C en estufa con ambiente húmedo y 5% de CO2. C) Marcación con timidina tritiada Luego de varios días de cultivo, se agrega timidina tritiada a cada cultivo. Las moléculas de timidina marcadas con tritio (3H) se incorporan al ADN de las células en proliferación, que ahora tendrán ADN tritiado en sus núcleos. Transcurridas 12 a 16 horas de cultivo con el medio que contiene timidina tritiada, las células de cada hoyo se aspiran con un cosechador quedando retenidas sobre filtros especiales. D) Revelado de la proliferación El tritio que marca las moléculas de timidina emite radiación beta que puede ser leída en un contador de centelleo líquido y cuantificada como cuentas por minuto (cpm) o desintegraciones por minuto (dpm). A mayor proliferación en cada hoyo, mayor será la radiactividad retenida en cada filtro, o sea mayor el número de cpm leído. Se realiza el promedio de los triplicados correspondientes a cada muestra. Los resultados se expresan como índice de estimulación (I.E.), de acuerdo a la siguiente fórmula: I.E. = promedio de cpm en los hoyos estimulados promedio de cpm en los hoyos controles

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Controles (SCM + medio de cultivo)

Figura 1 Plasma Halo mononucleares Ficoll Hypaque Polimorfonucleares Eritrocitos

IE: X c.p.m. estimulados

X c.p.m. controles

Sangre periférica

Gradiente de Ficoll-Hypaque

Incubación

Suspensión de células mononucleares (SCM)

Cultivo

Estimulados (SCM + medio de cultivo + estímulo:

mitógeno o Ag)

Pulso de timidina tritiada

c.p.m.

Cosecha

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Se ha desarrollado una variante de la metodología descripta, que utiliza directamente la sangre entera heparinizada diluida en medio de cultivo como fuente de linfocitos. En caninos, se ha demostrado que esta metodología es comparable y aún más reactiva que la técnica clásica descripta. Se postula que tiene la ventaja de reproducir mejor las condiciones in vivo y evitar la pérdida de células (supoblaciones de L con diferentes funciones) que conlleva el proceso de purificación en gradiente utilizado en la metodología convencional.

Aplicaciones

La técnica de linfoproliferación puede aplicarse para evaluar:

La capacidad funcional de los linfocitos. Los linfocitos normales deben presentar una respuesta proliferativa a la estimulación con mitógenos inespecíficos.

La respuesta linfocitaria frente a un antígeno determinado, que nos permite identificar la sensibilización previa del individuo frente al antígeno.

El efecto que tienen sobre la capacidad funcional de los linfocitos, aquellas enfermedades que provocan inmunodeficiencia (ej. moquillo canino, parvovirosis canina, leishmaniasis canina, etc.).

El efecto de los inmunoestimulantes sobre la inmunidad celular

El efecto de diferentes tipos de vacunas o esquemas de vacunación sobre la inmunidad celular. Para ello, se vacuna a los animales in vivo y se mide la respuesta proliferativa al Ag in vitro.

La acción inmunosupresora de ciertos fármacos como medicamentos inmunosupresores (utilizados para el tratamiento de enfermedades autoinmunes o linfoproliferativas) o de medicamentos cuyos efectos colaterales inmunosupresores requiere un seguimiento del paciente.

El efecto que tienen las interleuquinas que se secretan frente a diferente tipo de situaciones (stress, quemaduras, traumatismos, etc.) sobre los linfocitos.

Por ejemplo, la inmunodeficiencia severa combinada de los caninos (XSCID) es un desorden genético caracterizado por la falta de funcionalidad de linfocitos B y T. En el trabajo que se cita infrascripto, esta anomalía se evidencia in vitro mediante la prueba de proliferación linfocitaria en cultivos estimulados con fitohemaglutinina (PHA). Los resultados no están expresados en índice de estimulación, sino directamente en cpm. Como puede observarse en el gráfico que se reproduce, la respuesta proliferativa de los linfocitos en los caninos con inmunodeficiencia severa combinada es significativamente menor a la de los linfocitos provenientes de caninos normales. cpm 30.000 20.000 10.000 0 Normal XSCID

(Felsburg, J et al. Canine X-linked severe combined immunodeficiency. Veterinary Immunology and Immunopathology, 69 (1999), 127-135).

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Bibliografía

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2. Letwin, Bruce and Quimby, Fred. Effects of concanavalina-A, phytohemagglutinin, pokeweed mitogen, and lipopolysaccharide on the replication and immunoglobulin synthesis by canine peripheral blood lymphocytes in vitro. Immunology Letters, 14 (1986/1987), 79-85.

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4. Krakowa, Steven et al. Immunosuppression by canine distemper virus: modulation of in vitro immunoglobulin synthesis, interleukin release and prostaglandin E2 production. Veterinary Immunology and Immunopathology, 15 (1987), 181-201.

5. Millen, G.L. et al. Vaccination of racing greyhounds: effects on humoral and cellular immunity. Veterinary Immunology and Immunopathology, 49 (1995), 101-113.

6. Cook G. et al. Transforming growth factor beta from multiple myeloma cells inhibits proliferation and IL-2 responsiveness in T lymphocytes. J. Leukoc. Biol. 1999 Dec; 66 (6): 981-988.

7. Choudhry MA, Hockberger PE, Sayeed MM. PGE2 suppresses mitogen-induced Ca2+ mobilization in T cells. Am. J. Physiol. 1999 Dec.; 277 (6 Pt 2): R1741-8.

8. Freitag KA et al. Acute starvation and subsequent reffeding affect lymphocyte subsets and proliferation in cats. J. Nutr. 2000 Oct.;130 (10): 2444-9.

Técnica de Seroneutralización Se define como seroneutralización a la prueba que detecta la pérdida de infectividad de un microorganismo (virus o bacteria) o de toxicidad (toxinas) que se produce in vitro por la acción de anticuerpos específicos presentes en el suero. Dada la importancia que tiene la aplicación de esta técnica en virología, la explicación de la misma será realizada basándonos en estos microorganismos. Fundamentos de la reacción

La reacción consiste en mezclar un virus y el suero que se intenta evaluar y determinar si la capacidad infectante del virus se modifica (por la presencia de anticuerpos neutralizantes) o no.

La combinación de virus y suero generalmente es débil y en ocasiones el virus no se inactiva durante el proceso. Por esta razón, la reacción en un primer estadio puede ser reversible si se somete la mezcla a ciertas condiciones como vibración iónica, centrifugación, variaciones de pH o simplemente dilución y las partículas virales vuelven a ser infecciosas. Existe una relación entre la reversibilidad de la reacción virus-anticuerpo y el tiempo y la temperatura de incubación. Cuanto mayor sea el tiempo de incubación, la reacción virus-anticuerpo será cada vez más estable. La temperatura y el tiempo utilizados dependen del tipo de virus y el huésped con que se trabaja. Generalmente se utiliza 1 hora a 37 ºC, pero los protocolos varían según el sistema y se fijan para poder comparar resultados.

Una de las explicaciones del fenómeno de neutralización es que el anticuerpo específico envuelve a la partícula viral e impide que ésta se ponga en contacto con las células susceptibles. Algunos autores afirman que hay dos etapas en la neutralización: 1) Formación de partículas no infectivas pero absorbibles a las células por los sitios libres del

virus. 2) Formación de partículas no infectivas ni absorbibles, por bloqueo de todos los sitios activos. La presencia del virus no neutralizado se detecta a través de diferentes sistemas como cultivos celulares (ya sean primarios, secundarios o líneas celulares), animales de laboratorio (ratones, hámster, etc.) o embriones de pollo (utilizando distintas vías de inoculación: corioalantoidea, alantoidea, cavidad amniótica, cerebral, venosa, etc.).

99

Factores que influyen en la reacción Los resultados de las pruebas de seroneutralización varían según:

- la especie y edad del individuo del cual provienen los anticuerpos - el sistema de detección, - la vía de inoculación (si se utilizan animales susceptibles), - la estabilidad del virus a cambios de temperatura, - el pH y otros diversos factores físicos y químicos.

Por esta razón conviene contar con sueros testigos positivos (con anticuerpos neutralizantes) y negativos, pues un aumento aparente del título neutralizante por elevación de temperatura de incubación o por un tiempo de incubación más prolongado, puede deberse a la pérdida de infectividad del virus y no a la capacidad neutralizante del suero.

Aplicaciones Esta técnica serológica puede ser utilizada para detectar y tipificar virus en animales

infectados o para detectar la presencia de anticuerpos neutralizantes en animales que han superado la infección o han sido vacunados.

La seroneutralización permite también identificar individuos que carecen de anticuerpos neutralizantes en su suero; estos individuos se deben seleccionar con preferencia en casos de vacunaciones, ya que representan una población de riesgo. Recordemos que uno de los objetivos de la vacunación es estimular la producción de anticuerpos protectores, que son los que se evalúan por esta metodología y corresponden a anticuerpos capaces de evitar la infección.

Con esta prueba se pueden seleccionar los animales vírgenes para las pruebas de potencia de vacunas y también evaluar la eficacia de una vacuna en desarrollo. Sin embargo, la prueba de seroneutralización no revela el estado inmunitario del animal en su conjunto, ya que evalúa únicamente inmunidad humoral. Esto significa que como muchas otras pruebas, no tiene en cuenta la actividad inmunitaria de base celular.

a) Seroneutralización como método de tipificación de un virus: Cuando los virus tienen una constitución antigénica única (como rubéola), todas las cepas

de ese virus pueden ser neutralizadas con un mismo suero. Por el contrario, cuando un virus presenta diferencias antigénicas entre sus distintas cepas, cada una de ellas deberá ser neutralizada con un suero específico que permita distinguir serotipos o serovariedades virales. Entre estos virus, que constituyen el grupo más numeroso, se encuentran el de la Fiebre Aftosa, algunos enterovirus como el de la Poliomielitis, y adenovirus como el de la Hepatitis Canina.

Cuando se procede al estudio de neutralización de algunos de los virus mencionados, es necesario disponer de tantos sueros neutralizantes específicos como tipos serológicos (serotipos) existen. Esta operación de neutralización se denomina “tipaje o tipificación”. La reacción consiste en mezclar volúmenes iguales de virus purificado (ya sea por filtración o centrifugación) con cada uno de los sueros hiperinmunes monoespecíficos, (anticuerpos monoclonales o anticuerpos policlonales absorbidos), incluyendo los controles de virus y sueros. Las mezclas se incuban 1 hora a 37ºC, después de lo cual cada una de ellas se siembra en cultivos celulares o se inocula en animales de laboratorio.

En esta reacción, el antisuero que neutraliza indica qué cepa o virus es el responsable de la destrucción o lesión del sistema sensible. La verificación de la presencia eventual de dos o más tipos de virus en una muestra se facilita si la neutralización se hace con todos los anticuerpos existentes. Por ejemplo, en el caso de parvovirus canino, la seroneutralización se lleva a cabo con los tres anticuerpos específicos para las cepas CPV2, CPV2a y CPV2b por separado y en forma combinada para poder identificar con que anticuerpo (s) específico (s) se logra la neutralización.

100

b) Seroneutralización como método de identificación de anticuerpos neutralizantes: En ciertos casos es útil determinar la presencia de anticuerpos neutralizantes homólogos en

el suero de un animal, ya que éstos indican una infección o vacunación anterior. Cuanto mayor sea el título obtenido indicará que cualquiera de estos eventos es más reciente. En seroneutralización existen dos técnicas: 1- Suero variable–virus fijo (SV - VF) 2- Suero fijo–virus variable (SF - VV)

Para ambas técnicas se debe contar con sueros de referencia negativos y positivos. Los sueros positivos se obtienen de animales que han estado en contacto anteriormente con el antígeno (virus) y los negativos de animales que no han tenido contacto alguno con el mismo. Los sueros se inactivan durante 30 minutos a 56ºC para destruir los factores termosensibles del complemento y se titulan varias veces en cualquiera de los sistemas sensibles (células, embriones de pollo, ratones, etc.) Por último se calcula la media de los títulos obtenidos en las diferentes repeticiones. Estos sueros se conservan fraccionados a -70ºC.

Los sueros problema se procesan de la misma manera, es decir, se inactivan 30 minutos a 56 ºC antes de proceder a su estudio y se prueban en las diluciones de uso sobre el sistema seleccionado para evaluar la seroneutralización, para determinar si presentan efecto de toxicidad. En general, en bajas diluciones, la mayoría de los sueros poseen efecto tóxico.

En estos casos se debe aumentar las diluciones y considerarse en el cálculo del Índice de Seroneutralización (ver anexo). Los resultados se pueden expresar como: Índice de seroneutralización (IS): Este se obtiene a partir de diferentes cálculos, por ej:

Título del virus - Título del virus incubado con suero problema, o

Título del virus incubado con suero normal negativo - Título del virus incubado con suero problema Por ejemplo, Título de virus= 106.33 Título del virus incubado con suero problema= 103.40 IS = 106.33 - 103.40 = 10 2.93

10 2.93expresa las dosis neutralizantes 50% del suero problema.

Ventajas y desventajas de la elección de cada una de estas técnicas:

En la técnica a SF - VV en general no se deben descartar los resultados por problemas de título viral, a no ser que se produzca contaminación.

La técnica a SV - VF es más precisa, pero si las dosis infectantes obtenidas no son las correctas, la prueba debe ser desechada.

Las técnicas descriptas para cultivos celulares se pueden realizar en frascos de cultivo o en microplacas de cultivo, modificando los volúmenes de reacción.

A fin de facilitar la lectura del efecto citopático, se pueden utilizar colorantes sensibles al pH en el medio de cultivo, como por ejemplo rojo fenol, que permiten determinar el estado metabólico de la microplaca. El color será amarillo en los hoyos donde las células mantienen su viabilidad y será rojo en los hoyos donde hubo efecto citopático. Bibliografía 1. Guía de trabajos prácticos. Inmunología. Año 1980 2. Harris, RJC. Techniques in Experimental Virology. New York/London: Academic Press.

1964.

101

3. Robson, DS; Gillespie, JH; y Baker, J.A. The neutralization test as an indicator of immunity to virus diarrhea. Cornell Vet. 50: 503-509.

4. Sorenson, DK; Chow, TL; Kowalczyk, T.; Hanson, RP.; y Brandly, CA. Persistence in cattle of serum-neutralizing antibodies of vesicular stomatitis virus. Am. J. Vet. Res. 19: 74-77. 1958.

Anexo

Seroneutralización a Suero fijo-virus variable (SF–VV):

En esta técnica el suero problema se diluye entre 1/2,5 y generalmente no más de 1/10, dependiendo del virus con que se trabaje. Esta dilución se siembra en cuatro tubos a razón de aproximadamente 1ml por tubo.

Simultáneamente se procede a la dilución del virus en base 10.

Las diluciones de virus a utilizar en la seroneutralización dependen de que los animales a evaluar sean libres o vacunados. Los rangos utilizados son arbitrarios, pero para su selección debemos tener en cuenta el origen de los animales a evaluar:

- En el caso de ser animales libres de infección, se emplea un número bajo de dosis infectivas ya que al tener el suero niveles mínimos o nulos de anticuerpos, se necesita poco virus para superar el efecto neutralizante de los anticuerpos y llegar a determinar el efecto citopático viral necesario para calcular el título.

- En cambio, si se trabaja con suero de animales vacunados, se utiliza un número más alto de dosis infectivas ya que los niveles de anticuerpos esperados son mayores.

Una vez obtenidas las diluciones del suero y el virus, se mezclan en partes iguales y se incuban 1 hora a 37ºC.

Luego de la incubación se siembran o se inoculan en el sistema elegido (células, ratones o embriones de pollo). No hay que olvidarse de colocar los controles con sueros de referencia positivos y negativos.

Estas reacciones se incuban por un período variable que depende del sistema y del tipo de virus, pero que en general es de 3 a 10 días.

Las lecturas se realizan diariamente buscando el efecto de la infección viral según el sistema utilizado.

- En el caso de los cultivos celulares, las lecturas se efectúan por observación microscópica del efecto citopático que se pone de manifiesto como muerte celular, modificación de la morfología celular, etc.

- En el caso de los huevos embrionados pueden ser la aparición de pústulas, muerte del embrión, etc.

- En el caso de los animales de laboratorio se tendrá en cuenta si sobreviven o no.

El cálculo de los títulos se realiza utilizando el método de Reed y Muench, referido a las dosis infectivas en cultivo de tejido al punto final 50% (TCID50, por las siglas en inglés Tissue Culture Infectious Dosis 50%). Este término también se lo puede encontrar descrito como dosis de efecto citopático 50% (DEC50).

En la titulación, el punto final se toma como la dilución en la cual cierto porcentaje de cultivos o animales muestran lesiones. Se ha demostrado estadísticamente que el valor más apropiado es aquél en el que la mitad de éstos muestran efecto producido por la infección viral y la otra mitad no. Esta región es la que ofrece mínimo error en lo que atañe a la variación individual en la sensibilidad al virus. La obtención de resultados estadísticos requiere inocular el mayor número posible de réplicas y hacer diluciones poco espaciadas.

Reed y Muench idearon un método simple, denominado “método de los totales acumulativos”. Éste se basa en considerar que los animales o cultivos celulares que recibieron menor dosis de virus infectante y presentaron lesiones, hubieran mostrado las mismas lesiones con virus más concentrado.

El objetivo de este método es conocer la dilución del virus que corresponde al 50% de infección. Se utiliza un sistema de sumas para obtener los totales acumulados y obtener el cálculo del punto final. Los valores acumulados se obtienen sumando en el sentido de las flechas, como se esquematiza en el siguiente cuadro.

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Dilución de virus

Muestras o animales infectados / No infectados

Infectados o muertos (positivos)

No infectados o vivos (negativos)

Valores acumulados positivos

Valores acumulados negativos

Relación acumulados positivos / Total de acumulados

% (1)

10-1 4 / 4 4 0 19 0 19 / 19 100

10-2 4 / 4 4 0 15 0 15 / 15 100

10-3 4 / 4 4 0 11 0 11 / 11 100

10-4 4 / 4 4 0 7 0 7 / 7 100

10-5 3 / 4 3 1 3 1 3 / 4 75

10-6 0 / 4 0 4 0 5 0 / 5 0

10-7 0 / 4 0 4 0 9 0 / 9 0

(1) El porcentaje de cultivos o animales infectados representa la relación entre el total de infectados y el total de cultivos o animales inoculados. Se observa que el punto final 50% está entre el 75% y 0%, que corresponde a las diluciones 10-5 y 10-6. Por lo tanto el valor debe estar comprendido entre ellos, debe ser mayor a 10-5 pero menor que 10-6. Para estimar cuál es este valor se calcula la distancia proporcional (DP) entre dichas diluciones, utilizando la siguiente fórmula: DP =. % de positivos superior a 50 – 50 . % de positivos superior a 50 - % de positivos inferior a 50 En este ejemplo,

DP = 75 - 50 = 0.33 75 - 0

Luego, (DP x log. del factor de dilución) se suma en valor absoluto al exponente de la dilución superior a 50. En este ejemplo,

El factor de dilución es 10 y el logaritmo de 10 es 1.

La dilución que da un porcentaje de positivos superior a 50 es 10-5

Por lo tanto, (0.33 x 1) + 5, determina que el valor es 10 5.33

El título se expresa con exponente positivo y su valor corresponde a 1 ml de inóculo. En este ejemplo,

El volumen de virus inoculado fue de 0.1 ml.

El título, por lo tanto, será: 10 5.33 x 10 = 10 6.33 TCID50/ml. Índice de seroneutralización (IS): Se puede obtener a partir de diferentes cálculos, por ej:

Título del virus - Título del virus incubado con suero problema, o

Título del virus incubado con suero normal negativo - Título del virus incubado con suero problema Por ejemplo, Título de virus= 106.33 Título del virus incubado con suero problema= 103.40 IS = 106.33 - 103.40 = 10 2.93

10 2.93expresa las dosis neutralizantes 50% del suero problema.

103

Seroneutralización a Suero variable – virus fijo (SV-VF):

En esta técnica se preparan diluciones (generalmente 1:2) de los sueros problemas y testigos en un buffer, con el siguiente criterio:

Si los animales son vacunados se usará generalmente una dilución entre 1/4 y 1/32 o más, dependiendo del tipo de vacuna.

Si los animales se trata de animales vírgenes se usarán diluciones de 1/2 a 1/8. Para realizar esta técnica es necesario tener el virus que se va a utilizar previamente

titulado, fraccionado y congelado a bajas temperaturas (en nitrógeno líquido a -196ºC, o en freezers ultrafríos a -80ºC).

Simultáneamente se realiza la dilución del virus de manera de obtener un inóculo con las dosis infectantes deseadas con el que se enfrentarán los sueros. En esta técnica debe incluirse siempre la titulación del virus en la misma prueba, a fin de comprobar que las dosis infectantes inoculadas fueron las correctas. Generalmente para esta prueba se utilizan 1000 dosis infectantes/ml. Para preparar el inóculo, por lo tanto, se debe conocer el título previo del virus, por ejemplo 10 7.5 TCID50/ ml. Para obtener 103 TCID50/ml hay que diluir el virus. Para calcular qué dilución del virus stock hay que efectuar para tener esa dosis, se realiza el siguiente cálculo:

1 TCID50/ ml se obtendría en una dilución 10-7.5

1000 TCID50/ ml se obtiene en una dilución 1000 veces más concentrada y ya que 1000 corresponde a 103, en este caso es 10-4.5

Es decir, que en este caso en una dilución 10–4.5 de este virus habrá 1000 TCID50/ ml. La dilución 10–4.5 se puede realizar de diversas formas, por ejemplo con diluciones seriadas en base 10 mediante la cual se llega a la dilución 10-4.

La fracción de dilución que falta realizar es la representada por 10–0.5. El antilogaritmo de 0,5 es 3,16. Es decir que una dilución 1/3,16 equivale a 10–0.5.

En total, si la dilución 1/3,16 se realiza a partir del tubo 10–4, se obtiene una dilución 1/31600) que equivale a 10–4.5 y que contiene 1000 TCID50/ ml.

A partir de esta dilución, se realizan tres diluciones más en base 10 para titular el inóculo viral en simultaneidad con la prueba (control de título viral).

El inóculo con las 1000 TCID50 se mezcla en partes iguales con los sueros problema y con los sueros de referencia. Dichas mezclas se incuban 1 hora a 37ºC y luego se siembran (sobre cultivos celulares) o se inoculan (en ratones o embriones de pollo).

A partir de este punto las consideraciones son iguales que para la técnica SF–VV. Ejemplo de análisis de resultados:

Al igual que en el caso SF-VV, se debe calcular la distancia proporcional (DP). DP = % de no infectados superior a 50 - 50 . % de no infectados superior a 50 - % de no infectados inferior a 50 DP = 80 - 50 = 0.5 80 - 20

Dilución del suero

Log. de la dilución

Infectados o muertos

No infectados o vivos

Valores acumulativos infectados o muertos

Valores acumulativos no infectados o vivos

% de no infectados o vivos

1 / 4 0.6 0 4 0 12 100

1 / 8 0.9 0 4 0 8 100

1 /16 1.2 1 3 1 4 80

1 / 32 1.5 3 1 4 1 20

1 / 64 1.8 4 0 8 0 0

104

“DP x log. del factor de dilución” se suma al log. de la dilución que presenta un porcentaje de no infectados superior al 50%, con el fin de obtener el Índice de Seroneutralización.

La dilución con un porcentaje de no infectados superior al 50% es 1/16 (log 16 es 1,2)

El factor de dilución es 2 (log.2 es 0.3), por lo tanto

IS = 0.5 x 0.3 + 1,2 = 1,35.

El antilogaritmo de 1,35 es 22,4.

Podemos decir, entonces, que 1/22,4 es la dilución del suero que protege al 50% de los animales. En este caso se calcula el porcentaje de animales vivos o no infectados ya que se desea conocer el poder de protección del suero.

La prueba será considerada como válida si el título de virus obtenido es el mismo que el título previo con un margen de error de 0,3 log (una dilución) por encima o por debajo del mismo.

Inhibición de la Hemoaglutinación

Introducción: Hemoaglutinación La capacidad de aglutinar glóbulos rojos de ciertas especies animales (Hemoaglutinación o HA) fue descripta para los virus de las familias Paramixoviridae, Ortomixoviridae y Parvoviridae. Las proteínas virales responsables de esta propiedad se conocen como “hemaglutininas”. Estas son proteínas de superficie de los viriones que se unen con receptores de la membrana de los hematíes que poseen ácido acetil neuramínico en su composición. Esta interacción entre los viriones y los hematíes resulta en la producción de un cuerpo compacto. La HA se produce cuando la proporción entre la hemaglutinina viral y los eritrocitos es óptima, permitiendo la unión de varios eritrocitos adyacentes a una unidad de hemaglutinina. Esta característica viral nos permite identificar y clasificar virus hemaglutinantes, aislados a partir de individuos infectados y propagados en huevos embrionarios o cultivos celulares. Además, se puede titular virus por su efecto hemaglutinante, así como evaluar la capacidad de un suero de inhibir esta hemaglutinación. La técnica, que evalúa la capacidad de un suero de bloquear el efecto hemaglutinante del virus se conoce como Inhibición de la Hemoaglutinación (IH). Ambas pruebas (HA - IH) se realizan en microplacas de 96 hoyos con fondo en U o V. La HA se lleva a cabo utilizando diluciones del virus en base 2 a partir de la dilución 1:2; los glóbulos rojos (GR) capaces de ser aglutinados se colocan a una concentración final de 0.5% o 1%. Como diluyente de los Ag y GR se utiliza solución salina buffereada (PBS) con 0.1% de seroalbúmina bovina (BSA). PROTOCOLO DE TITULACIÓN VIRAL POR HA: - Colocar 50 μl de diluyente para el virus en cada uno de los 12 hoyos de la fila A de la

microplaca. - Agregar 50 μl de virus puro (obtenido del cultivo en huevos embrionados o en cultivos

celulares) en el primer pozo de la fila A. - Utilizando una micropipeta de 50 μl, efectuar diluciones seriadas en base 2 del Ag (de 1:2 a

1:2048), dejando el último hoyo de la fila sin Ag para que sirva como control de eritrocitos. - Agregar 50 μl de la suspensión de eritrocitos al 0,5 o 1% a cada hoyo, agitar levemente

para mezclar los reactivos. - Cubrir la microplaca e incubar a 4 ºC durante 16 hs. - Leer una vez que esté bien delimitado un “botón” en el fondo de cada pozo control de

eritrocitos. Lectura: Con la ayuda de un espejo se observa el fondo de cada pocillo. Primero se realiza la lectura de los hoyos control. Hemoaglutinación negativa: se observa la formación de un botón de hematíes de borde liso, ocasionado por la sedimentación de los GR (Ej, en el control de GR).

105

Hemoaglutinación positiva: se observa la formación de un halo de hematíes de mayor diámetro, color claro y borde irregular, ocasionado por la aglutinación de los GR por acción del virus. Interpretación de la Titulación: El punto final de la titulación será la dilución más alta del virus en la que se observe 100% de HA. Se considera que en esta dilución existe una (1) unidad hemoaglutinante (UHA). En la siguiente figura se esquematiza la titulación por Hemoaglutinación de ocho muestras de virus (filas A - H). Los títulos obtenidos figuran a la derecha de la placa.

La técnica de IH, descripta originalmente por Hirst (1942) y modificada posteriormente por Salh (1944) nos permite detectar y cuantificar anticuerpos (Ac) que poseen la propiedad de bloquear la actividad hemaglutinante de ciertos virus, uniéndose a las hemaglutininas virales e impidiendo de este modo su unión con los receptores eritrocitarios. Por lo tanto, esta técnica nos permite identificar en un suero problema el nivel de anticuerpos capaces de inhibir la hemoaglutinación. Hay que tener en cuenta que los resultados pueden verse afectados por la presencia en los sueros de inhibidores inespecíficos (por ej. enzimas) y hemaglutininas naturales, por lo que es necesario evaluar simultáneamente la capacidad hemaglutinante del suero. Cuando el nivel de hemaglutininas de los sueros es muy alto, algunos autores sugieren el tratamiento previo de los sueros con Kaolín o glóbulos rojos para eliminar estas aglutininas. Debe considerarse que dichos tratamientos resultan en detrimento de la detección de bajos niveles de anticuerpos. PROTOCOLO DE TITULACIÓN DE ANTICUERPOS POR I.H.: a) Distribuir 25 μl de solución PBS 1X en los hoyos 1 a 11 de las filas que vayan a utilizarse de

una placa de microtitulación (utilizar placas con pocillos de fondo en V o en U) y 50 μl a los hoyos 12 de las mismas hileras.

b) Colocar 25 μl de cada suero en el primer pocillo de cada dos hileras. Por cada suero se utilizan dos hileras.

c) Utilizar una micropipeta para hacer diluciones 1:2 del suero en toda la placa (en general se comienza con una dilución final de 1/10 para el primer hoyo (Nº 1) y se continúa diluyendo en base 2 hasta el hoyo correspondiente a la columna 11 (1/10; 1/20; 1/40;... 1/10240). Descartar los 25 μl excedentes del hoyo 11. De esta manera se obtiene una dilución seriada (en base 2) del suero y un volumen homogéneo de 25 μl.

A

B

C

D

E

F

G

H

1/2

048

Virus

Ejemplo de titulación de virus por hemoaglutinación

106

d) Agregar 25 μl de antígeno (virus) que contenga 4 a 8 unidades hemoaglutinantes, en los hoyos 1 a 11 de la primera hilera correspondiente a cada suero. Agregar 25 μl de PBS en los hoyos 1 a 11 de la segunda hilera correspondiente a cada suero (para completar el volumen a 50 μl).

e) Homogeneizar golpeando ligeramente la placa e incubar a temperatura ambiente durante 60 minutos.

f) Añadir 50 μl de suspensión de hematíes al 1% o al 0,5% a todos los hoyos utilizados. La segunda hilera de cada suero no contiene virus, sólo suero y glóbulos rojos y nos permite realizar un control sobre la capacidad hemaglutinante del suero per se. Por su parte, el hoyo 12 de cada hilera contiene glóbulos rojos y el diluyente del virus (PBS), como control para descartar una posible hemoaglutinación inespecífica.

g) Homogeneizar golpeando ligeramente la placa e incubarla a 4°C durante 16 hs. h) Leer las placas cuando se hayan sedimentado los hematíes de control (columna 12). La

lectura se efectuará inclinando las placas y observando la presencia o ausencia de un botón bien definido similar al de los hoyos de control.

i) El título de Inhibición de la Hemoaglutinación será la mayor dilución del suero que produzca una inhibición completa de 4 u 8 unidades hemaglutinantes de virus.

j) En todas las pruebas deberá incluirse una titulación simultánea del virus para confirmar la presencia de las unidades de hemoaglutinación requeridas

Técnica de Fijación de Complemento

Las características del sistema de complemento han permitido idear una reacción serológica denominada “Fijación de Complemento”, la que mediante un sistema indicador permite determinar la fijación del C a cualquier complejo antígeno-anticuerpo, esté el antígeno en solución o en suspensión. Como sistema revelador se emplea el denominado “sistema hemolítico”, que consiste en una suspensión de complejos antígeno-anticuerpo formados por glóbulos rojos de carnero y anticuerpos con especificidad por estos hematíes (hemolisina). Esta técnica es muy empleada para la identificación cuantitativa de anticuerpos contra un antígeno en particular y es la técnica de referencia para muchas enfermedades infecciosas. Por ejemplo, en el diagnóstico de brucelosis mediante este método, el suero en estudio se incuba con una suspensión estandarizada de Brucella abortus y una cantidad conocida y estandarizada de complemento (medida en unidades CH50). En un paso posterior se agrega el sistema hemolítico. (Figura 1)

107

Si la muestra no posee anticuerpos específicos contra Brucella abortus (figura 2 A), no se forman complejos antígeno-anticuerpo que activen el C. Por lo tanto, al agregar el sistema hemolítico, el C se fija a las membranas de los glóbulos rojos sensibilizados y produce su lisis (figura 2 B).

Si la muestra en estudio contiene anticuerpos específicos contra Brucella abortus, éstos se fijan a la bacteria (figura 3 A) y activan el complemento por la vía clásica, que produce su lisis. Cuando en un paso posterior se agrega el sistema hemolítico, ya no hay complemento disponible y los glóbulos rojos permanecen intactos (figura 3 B).

Figura 1 Componentes de la reacción

Suero problema

C’

Complemento

GR

Sistema hemolítico

Ag

Suspensión de antígeno

Figura 1 Componentes de la reacción

Suero problemaSuero problema

C’

Complemento

C’

Complemento

GR

Sistema hemolítico

GRGR

Sistema hemolítico

Ag

Suspensión de antígeno

Ag

Suspensión de antígeno

Ag

C’

Ag

GRC’

Figura 2 BFigura 2 A

Ag

C’

Ag

GRC’

Ag

GRC’

GRC’

Figura 2 BFigura 2 A

108

El consumo de C por los complejos inmunes se manifiesta indirectamente por la ausencia de hemólisis al agregar el sistema hemolítico. El C no “fijado” indica la ausencia de reacción antígeno-anticuerpo durante la primera etapa de la prueba y se mide en unidades CH50 . Se realizan diluciones del suero en base 2 que se incuban con cantidades fijas y conocidas del resto de los reactantes. El título se determina como la máxima dilución de suero que produce la hemólisis del 50% de los glóbulos rojos del sistema hemolítico. Para medir la hemólisis se centrifugan los tubos (para que sedimenten los glóbulos rojos que no se hemolizaron). La hemoglobina presente en el sobrenadante se lee en unidades de densidad óptica en un espectrofotómetro a 542 nm de longitud de onda. Para llevar a cabo esta prueba deben tenerse una serie de consideraciones: Las muestras de suero, libres de hematíes, deben ser inactivadas a 56°C durante 30

minutos para desnaturalizar los factores del complemento del suero y evitar que interfieran en la prueba.

El antígeno consiste en una suspensión de Brucella abortus cepa 19, inactivada, a una concentración standard de 0,00018% v/v.

Como fuente de complemento (C) se utiliza suero normal de cobayo. Éste se conserva congelado y debe titularse cada vez que se usa. Para la prueba diagnóstica se emplean 5 unidades CH50.

La hemolisina es un suero de conejo hiperinmune contra hematíes de oveja y se utiliza a la concentración que produce como resultado en ese sistema 12 unidades CH50.

Los hematíes de oveja se obtienen por punción de la vena yugular en condiciones de asepsia y con anticoagulante. Posteriormente se lavan por centrifugación y reemplazo del suero por una solución buffer. Se utilizan en una suspensión al 6% v/v.

La Fijación de Complemento es una técnica muy laboriosa y que depende de parámetros muy estrictos en lo que refiere a la estandarización y titulación de los reactantes. Su aplicación esta limitada a los laboratrios de referncia nacionales e internacinales y reutiliza generalmente para confirmar la positividad de otras tecnicas. No es de práctica rutinaria, aunque como se mencionó es la prueba de referencia para el diagnóstico de muchas enfermedades infecciosas. Este método también se emplea para identificar, tipificar y/o semicuantificar antígenos. En estos casos se emplean sueros específicos conocidos y a concentración fija y diluciones de la muestra en estudio (en la cual se sospecha la presencia de un antígeno). La ausencia de hemólisis indica la formación de complejos antígeno-anticuerpo debido a la presencia del antígeno en la muestra, e inversamente, la observación de hemólisis indica que la muestra carece de antígeno.

Ag

C’

GR

Ag

Figura 3 A Figura 3 B

Ag

C’ Ag

C’

GR GR

Ag Ag

Figura

109

Bibliografía

Margni, R.A. 1996. Inmunología e Inmunoquímica Fundamentos. Ed. Interamericana. 976 pp.

Day, MJ. 1999. Clinical Immunology of the Dog and the Cat. Iowa State University Press.

Técnica de polarización Fluorescente (FPA)

Este ensayo ha mostrado tener buena utilidad en la detección de ciertas enfermedades

infecciosas. Es utilizada para identificar anticuerpos frente al Ag O-polisacárido de bacterias gram negativas (Brucella sp., Salmonera sp.) en muestras de suero, leche y sangre entera. También está descripto su uso para la identificación de antígenos como proteínas o péptidos de Mycobacterium bovis y virus de la Anemia Infecciosa Equina. Esta técnica detecta la unión de pequeñas moléculas marcadas con fluoresceína (por Ej. antígenos) a grandes moléculas (anticuerpos) cuando la muestra es incidida con un haz de luz polarizada. Fundamento: Todas las moléculas en solución rotan al azar. La velocidad de rotación depende del tamaño y es inversamente proporcional, por lo tanto las moléculas pequeñas rotan a mayor velocidad que las moléculas grandes. Para realizar este ensayo se requiere de la emisión de una luz (onda electromagnética) (a partir de una lámpara de tungsteno) cuyo campo eléctrico oscila en todas las direcciones espaciales al azar y con distintas longitudes de onda. Dicha radiación atraviesa un polarizador de cristal líquido que deja pasar solo un rayo de luz polarizada plana azul (481-489 nm). Al incidir la luz polarizada plana sobre el trazador (fluorocromo ligado al antígeno), lo eleva a un estado de excitación, tras el cual dicho trazador vuelve al estado de equilibrio emitiendo un haz de luz verde (525-550 nm) que es captado y analizado por el equipo. En el caso de que el antígeno marcado estuviese unido a una molécula de anticuerpo de gran tamaño, su velocidad de rotación disminuye y permite que la emisión de luz verde se detecte en el mismo plano de polarización que la radiación recibida, manteniéndose la polarización. Por lo tanto, se detecta un valor alto de polarización. Por lo contrario, si dicho trazador está unido solo al antígeno (de pequeño tamaño) la rotación es rápida y la luz verde emitida se ubicará en otro plano distinto al de la luz polarizada. De esta manera, se pierde el grado o valor de polarización.

110

Durante el tiempo que la molécula conjugada con fluoresceína permanece excitada, rota a una determinada velocidad, produciendo una diferencia entre plano de polarización que la excita (plano de excitación) y el plano de polarización que emite (plano de emisión), ésta diferencia se cuantifica y se determina utilizando una fórmula. Expresión de los resultados: unidades de milipolarización (mP) del suero frente al antígeno. Cálculo de las unidades de mp de cada muestra. mP = ( Iv – (Ih x G) / (Ih x G) x 1000 Iv = intensidad vertical de la luz Ih = intensidad horizontal de la luz G = Factor de polarización

Ejemplos de los antígenos más utilizados: El polisacárido O-: Extraído a partir del LPS de cepas lisas de bacterias gram negativas. Estos antígenos son específicos para cada serotipo y se obtiene a partir de la purificación del LPS. Ej.: Brucella sp. Salmonella sp.

Dirección del haz de luz azul polarizada incidente

Antígeno marcado con fluorescencia. (Luz verde)

Luz tungsteno

Polarizador

Luz azul polarizada

Emisión del haz de luz en un único plano

Suero positivo

Suero negativo

Dirección del haz de luz azul polarizada incidente

Dirección del haz de luz verde emitida

Dirección del haz de luz verde emitida

Anticuerpo

111

Estructura de LPS

Péptidos: Sólo puede utilizarse péptidos de bajo peso molecular (que no superen los 20 kDa), para que no interfiera su tamaño en una menor rotación del antígeno-trazador libre. Equipamiento * El SENTRY (Diachemic corporation) es un instrumento computabilizado para determinar las unidades de milipolarización (mP) del suero problema. Presenta una ranura para el acoplamiento del tubo de ensayo. Este aparato lee una muestra por vez en tubos de 10mm x 75mm. Es transportable al campo y puede funcionar una hora sin fuente externa de energía. * El POLARION (Tecan) También es un lector de polarización pero adaptado para la lectura de microplacas de 96. Puede leer hasta 1500 muestras por hora. Metodología Protocolo FPA 1) Agregar 10µl de la muestra (generalmente suero del animal a evaluar) a 1 ml de buffer. 2) Leer el blanco 3) Agregar 10 µl de antígeno marcado 4) Incubar no menos de 2 minutos 5) Realizar la lectura de las muestras ya sea en tubos o en multiplacas. 6) Como dato orientativo, las muestras con lecturas de 10 mP mayores al control negativo son consideradas positivas

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Esquema de la técnica. Utiliza como ejemplo el Ag O de Brucella sp.

Ventajas: Es fácil de realizar y los resultados se obtienen rápidamente. Implica solamente 2 pasos. Es una técnica de alta sensibilidad y especificidad. Permite el procesamiento de varias muestras a la vez. Suspensiones turbias tales como leche, sueros lipémicos y yemas de huevo o soluciones coloreadas como sueros hemolizados o sangre entera, no interfieren en la lectura de las muestras

Citotoxicidad

Introducción La citotoxicidad es un mecanismo efector de las células del sistema inmune que permite eliminar células infectadas o alteradas del organismo o células de microorganismos u organismos invasores. Varios tipos celulares, receptores y mecanismos están involucrados en este mecanismo. Su evaluación permite conocer el nivel de protección frente a enfermedades infecciosas de origen viral, capacidad de eliminar células alteradas por procesos tumorales, etc. Hay dos condiciones indispensables para que cualquier mecanismo citotóxico mediado por células se lleve a cabo: 1- viabilidad de las células efectoras 2- contacto estrecho entre la célula efectora y la célula blanco. La lisis de la célula blanco (o célula diana) es la consecuencia de la reacción citotóxica. Cuando se encara el análisis de un fenómeno de este tipo es necesario contar, en primer lugar, con un método apropiado para evaluar la muerte de la célula blanco.

113

Por ejemplo, si se trata de una bacteria o un parásito, es posible observar microscópicamente su destrucción o la inhibición de su capacidad para proliferar en medios de cultivo adecuados, luego de su contacto con la célula efectora. En cambio, si la célula blanco es una célula tumoral o normal, pueden utilizarse colorantes vitales como naranja de acridina o azul tripán (trypan blue) para poner en evidencia la lisis, ya que estos colorantes tienen la particularidad de teñir únicamente a las células muertas. Asimismo, es posible recurrir a alguna característica metabólica particular que pueda asociarse con la viabilidad de la célula blanco utilizada en la reacción. Por ejemplo, si se trata de una célula secretora, medir su capacidad para liberar un determinado producto de secreción. El método más difundido para el estudio de los mecanismos citotóxicos es el de la incorporación de sustancias radiactivas a las células blanco. La destrucción de estas células permite que la sustancia radiactiva se libere al medio y pueda ser cuantificada fácilmente. Las sustancias radiactivas deben cumplir ciertos requisitos para ser utilizadas: Deben incorporarse a las células blanco en cantidades compatibles con los sistemas de

microrreacciones. No deben liberarse al medio espontáneamente. Su liberación al medio debe tener correlación directa con el efecto lítico producido Una vez liberadas al sobrenadante, no deben ser reutilizables en forma significativa por las

células restantes. El agente radiactivo más utilizado es el Na2

51CrO4 (dicromato de sodio) que tiene la ventaja adicional de poner de manifiesto rápidamente el efecto citotóxico. Para el caso de bacterias o parásitos que no incorporan 51Cr o que lo liberan en forma espontánea, se usan bases nitrogenadas radiactivas, como por ejemplo la 3H-Timidina (timidina tritiada) que se incorpora a los ácidos nucleicos o la 35S-Metionina que se incorpora a las proteínas.

Mecanismos de Citotoxicidad

Los mecanismos de citotoxicidad pueden clasificarse de acuerdo a los requerimientos del sistema, en: Mecanismos de citotoxicidad específicos: Si es necesaria la sensibilización previa del animal

del cual provienen las células blanco (por ejemplo, citotoxicidad por LT o ADCC). Mecanismos de citotoxicidad innatos: Si funcionan sin necesidad de sensibilización previa

(por ejemplo. citotoxicidad por células NK o por complemento). Mecanismos de citotoxicidad específicos

Linfocitos T:

Los mecanismos citotóxicos mediados por linfocitos T son de gran importancia para la defensa del individuo contra las infecciones causadas por virus y contra parásitos intracelulares. Tienen participación, además, en el rechazo de los transplantes y de ciertos tumores. Citotoxicidad Celular Dependiente de Anticuerpos (CCDA o ADCC): Algunas células pueden ejercer citotoxicidad cuando se unen con un anticuerpo ya ligado al antígeno sobre la célula blanco a través de los receptores para Fc (CD16). Este proceso se denomina citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. La función de CCDA está comprometida en procesos de inmunidad contra tumores, en el rechazo de transplantes, en procesos de destrucción de bacterias, parásitos y células infectadas por virus. La reacción citotóxica se inicia con el reconocimiento de los anticuerpos que recubren a la célula blanco por parte de la célula efectora, a través de receptores para el fragmento Fc de la Ig. En la mayor parte de los casos, el anticuerpo que participa en la CCDA es de la clase IgG y, por consiguiente, los receptores para Fc (FcR) presentes en la membrana de las células

efectoras intervinientes son los receptores para el Fc de la IgG (FcR). Sin embargo, ciertos

114

linfocitos con FcR para IgA (FcR) y los polimorfonucleares neutrófilos, son capaces de mediar CCDA contra células blanco sensibilizadas con IgA. Además, los monocitos y los

polimorfonucleares eosinófilos que expresan FcR para IgE (FcR) inducen la destrucción de células recubiertas con IgE. Este último sistema tiene relevancia en la inmunidad contra parásitos.

Mecanismos de citotoxicidad innatos

Células NK: El sistema inmune presenta poblaciones linfocitarias que tienen la capacidad innata de lisar cierto tipo de células tumorales y células infectadas por virus. Este fenómeno citotóxico, descrito alrededor del año 1970, se conoce como citotoxicidad natural killer o actividad NK. Para que se lleve a cabo no es necesaria sensibilización previa de las células efectoras. La actividad NK no se ve influida por la exposición previa al antígeno por parte del individuo del cual provienen estas células.

Citotoxicidad generada por complemento:

Este mecanismo, a diferencia de los detallados anteriormente, no está producido por la acción de células efectoras sino por la activación del complemento.

Citotoxicidad celular inducida por IL-2

Se ha demostrado que el tratamiento in vitro de linfocitos periféricos con IL-2 (ex vivo), además de favorecer la citotoxicidad T y NK, induce una actividad citolítica sobre un grupo de células denominadas células LAK (por la sigla en inglés de células “Killer” activadas por linfoquinas). Se cree que estas células pertenecen al linaje de las NK, aunque aún no están bien definidas. Éstas son capaces de lisar una gran variedad de células tumorales, incluso muchas que no son sensibles a células NK. La activación de células ex vivo de pacientes oncológicos ha sido una de las propuestas terapéuticas ensayadas en humanos. Evaluación de la funcionalidad celular por medio de reacciones de citotoxicidad mediadas por LT citotóxicos. El primer paso de una determinación de citotoxicidad comprende la obtención de los linfocitos T citotóxicos específicos. Éstos pueden encontrarse pre-estimulados en el huésped y deben ser expandidos in vitro. Los linfocitos T citotóxicos no pueden ser detectados habitualmente en sangre periférica sin una estimulación previa para ampliar el número de células activas por medio de la expansión clonal, a menos que el individuo se encuentre en el período de actividad de una infección viral. Cuando se requiere medir la reactividad de los linfocitos T citotóxicos, generalmente es necesario estimular a las células efectoras in vitro con el antígeno específico. Para ello, se co-cultivan las células mononucleares obtenidas de sangre periférica con el antígeno en forma soluble o con células irradiadas que expresan el antígeno de interés. Los linfocitos T citotóxicos se cosechan después de 5 a 7 días de cultivo. La técnica más frecuentemente empleada para determinar citotoxicidad utiliza la liberación de 51Cr debida a la lisis de la célula blanco. Las células efectoras son puestas en contacto con las células blanco marcadas radiactivamente con 51Cr, durante 4 hs de incubación. La radiactividad liberada es directamente proporcional a la lisis celular producto de la citotoxicidad. Si bien la liberación de 51Cr es un procedimiento ampliamente utilizado para detectar citotoxicidad, en los últimos años se han desarrollado métodos colorimétricos, fluorímetricos y más recientemente por quimioluminiscencia, tendientes a reemplazar el material radiactivo y aumentar la sensibilidad. Metodología: 1. Marcación de la célula blanco con dicromato de sodio (51Cr): Las células deberán

encontrarse en fase logarítmica de crecimiento. - Centrifugar la suspensión celular y resuspender el precipitado en dicromato de sodio

marcado.

115

- Incubar 60 min a 37ºC con agitación suave. - Lavar con medio de cultivo y resuspender las células marcadas a la concentración

deseada. 2. Medición de la actividad citotóxica por medio de un ensayo de liberación de 51Cr: La relación

entre células blanco y células efectoras es un factor importante a tener en cuenta. Generalmente las evaluaciones se realizan con diferentes proporciones de células blanco y células efectoras (por ej. 1:50). - Sembrar en una placa de cultivo de 96 pocillos, células efectoras y células blanco (no

olvidar los controles). - Centrifugar las placas para aumentar el contacto entre las células e incubar a 37ºC por 4

hs en estufa gaseada con CO2 al 5%. - Recoger el sobrenadante para la posterior medición de radiactividad en contador de

centelleo. Medición de liberación espontánea (cpm espontáneas): En los cultivos de células blanco (sin células efectoras), se mide la liberación espontánea del 51Cr fijado durante la marcación. Medición de la máxima liberación de marca (cpm máximas): A los co-cultivos de células efectoras + células blanco se agrega un detergente (Tritón X-100) que solubiliza las membranas plasmáticas de las células produciendo la liberación total del 51Cr fijado durante la marcación. Cálculo del porcentaje de lisis específica: (cpm experimentales – cpm espontáneas)

(cpm máximas - cpm espontáneas) Las cpm espontáneas no deben superar el 20% de las cpm máximas para que la prueba sea válida. En algunas ocasiones es conveniente expresar los resultados como unidades líticas (UL), correspondientes a un determinado porcentaje de lisis. Frecuentemente se utiliza el 30% o el 50%. Para ello se grafica el porcentaje de lisis en función de la relación células efectoras: células blanco. Pruebas para determinar citotoxicidad de células Natural Killer (NK) La actividad NK se mide generalmente en ensayos de liberación de 51Cr, utilizando una metodología similar a la utilizada para linfocitos T citotóxicos. Si la evaluación se realiza en seres humanos, se utiliza como células blanco una línea celular denominada K562 que son células tumorales humanas. Cuando se realiza la evaluación en un sistema murino, generalmente se utilizan como células blanco las células de la línea Yac 1, que provienen de un linfoma murino inducido por el virus Moloney. Como fuente de células efectoras se utiliza una suspensión celular de bazo. Para evaluar la actividad NK en perros se utiliza una línea celular de adenocarcinoma canino, CTAC. En todos los casos, la metodología utilizada es similar a la descripta para linfocitos T citotóxicos. Reacción de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo Clínicamente, el ensayo de CCDA es útil en la evaluación funcional de células efectoras inmunocompetentes, por ejemplo, en pacientes con cáncer en tratamiento inmunológico. Otra aplicación importante de la CCDA es la evaluación de anticuerpos contra aloantígenos, células tumorales o virus. La CCDA se utiliza para estudiar sueros de los pacientes que recibirán un trasplante o que padecen una infección viral. A continuación se describe un método para medir actividad efectora de CCDA en células mononucleares de sangre periférica, empleando células blanco marcadas con 51Cr.

Lisis específica =

X 100

116

Metodología: 1. Sensibilización y marcación de las células blanco:

- Se lavan las células tres veces con medio de cultivo. Antes del último lavado se dividen en dos alícuotas iguales.

- A una de las alícuotas se le agrega el antisuero. Este antisuero ha sido previamente calentando a 56ºC por una hora, procedimiento que inactiva los factores del complemento. A la otra alícuota se la toma como control sin suero.

- Se agrega dicromato de sodio marcado (51Cr) y se incuba a 37ºC por 30 min. - Se lavan las células tres veces con medio de cultivo para retirar el cromo radiactivo no

incorporado. 2. Medición de la actividad de CCDA por un ensayo de liberación de 51Cr:

- Se prepara una suspensión de células efectoras, se hacen diluciones seriadas (1:2, 1:4, 1:8) y se siembran en una placa de 96 pocillos, con los correspondientes controles.

- Se agregan células blanco incubadas con y sin anticuerpos, marcadas con 51Cr. - Se centrifugan las placas para aumentar el contacto entre las células y se incuban a 37ºC

por 4 a 18 hs. en estufa gaseada con CO2 al 5%. - Luego de la incubación, los cultivos se vuelven a centrifugar a mayor velocidad y se

levanta el sobrenadante, que se analiza en un contador de centelleo líquido. Las cpm determinadas en el sobrenadante corresponden al radiactivo liberado por la ruptura celular.

Medición de la máxima liberación de marca (cpm máximas): A los co-cultivos de células efectoras + células blanco recubiertas con anticuerpos y células efectoras + células blanco sin recubrir con anticuerpos, se agrega un detergente (Tritón X-100) que solubiliza las membranas plasmáticas de las células produciendo la liberación de 51Cr. Medición de liberación espontánea (cpm espontáneas): A los cultivos de células blanco recubiertas con anticuerpos y células blanco sin recubrir con anticuerpos (ambos sin células efectoras), se mide la liberación espontánea del 51Cr fijado durante la marcación. Cálculo del porcentaje de lisis específica: (cpm experimentales – cpm espontáneas)

(cpm máximas - cpm espontáneas) El porcentaje de lisis específica debe calcularse para las células blanco recubiertas por anticuerpos y paralelamente para las células no recubiertas por anticuerpos. El porcentaje de CCDA se calcula restando al porcentaje de lisis específica de las células recubiertas con anticuerpos, el porcentaje de lisis encontrado para las células blanco sin recubrir.

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Lisis específica =

X 100

117

Técnicas para la detección de anticuerpos maternales

Una adecuada protección contra enfermedades infecciosas que pueden comprometer la

vida del neonato depende de la presencia de al menos 400–800 mg/dl de Igs transferidas pasivamente. Valores de 200 a 400 mg/dl indican falla parcial en la transferencia pasiva y menores a 200 mg/dl son indicativos de falla total en la transferencia pasiva de la inmunidad materna. En los dos últimos casos nos encontramos con neonatos hipogammaglobulinémicos. Estos valores son válidos para bovinos y equinos, especies en las cuales el tipo de placentación que poseen (placentación completa), impide la transferencia de Acs a través de esta vía. Por lo tanto, el consumo de calostro durante las primeras horas de nacido favorece la sobrevida del neonato. El éxito de la transferencia pasiva no puede evaluarse sino hasta las 18 horas después del nacimiento, cuando se completa la parte esencial de la absorción de anticuerpos. Es fundamental, entonces, asegurar al neonato la ingesta de calostro de buena calidad y en cantidad suficiente, o si fuera necesario, elegir un método de suplementación adecuado (suero) que le permita adquirir anticuerpos.

Existen diferentes métodos que nos permiten al veterinario detectar si en cada ternero o potrillo, hubo (o no) ingestión de calostro y absorción de inmunoglobulinas. Las pruebas de laboratorio que se utilizan miden proteínas en el suero del neonato y pueden clasificarse en: Pruebas cuantitativas Pruebas semicuantitativas Pruebas cualitativas

Pruebas cuantitativas a) Inmunodifusión radial o técnica de Mancini Es la técnica de referencia. Permite conocer la concentración de Igs y a la vez reconocer clases y subclases de Igs. La desventaja es el tiempo de lectura, de 18 a 24 horas (Ver capítulo sobre técnicas de interacción secundaria en esta guía). b) Prueba de sulfato de zinc La técnica se basa en la capacidad de los iones pesados de dicha sal de unirse al Fc de las Igs y hacerlas precipitar. Es un procedimiento rápido y económico, ya que sólo utiliza una solución de sulfato de zinc que se mezcla con el suero del animal. El resultado puede evaluarse a simple vista (cualitativamente) comparando la turbidez existente en el tubo de ensayo que contiene el suero del neonato con el tubo que contiene el suero de su madre. Una menor turbidez en el tubo del neonato indica falla en la transferencia pasiva de anticuerpos. Las Igs del recién nacido se pueden cuantificar mediante la lectura en espectrofotómetro a 620nm, previa realización de una curva de calibración con sueros patrones de concentraciones conocidas. c) Electroforesis

La electroforesis clásica de proteínas séricas sobre cellogel (tiras de acetato de celulosa) es una técnica rápida y relativamente sencilla, que permite la posterior cuantificación de las proteínas por densitometría (Ver capítulo correspondiente en esta guía).

d) ELISA

Esta es una técnica de interacción primaria, altamente sensible y específica. (Ver capítulo correspondiente en esta guía). Pruebas semicuantitativas a) Prueba de látex o aglutinación pasiva

Es una técnica confiable y rápida. Las partículas de látex se cubren con anticuerpos anti–IgG de la especie en estudio. Al mezclarse con el suero problema, si éste tiene IgG calostrales,

118

los anticuerpos anti-IgG adheridas a las partículas de látex se unen a las IgGs del suero y determinan que las partículas de látex aglutinen. Esta prueba se efectúa en 10 minutos aproximadamente. El tiempo que tarda en producirse la aglutinación es indicativo del estado de protección, ya que la concentración de Igs es proporcional al tiempo de lectura; cuanto más rápido aparece la aglutinación, mayor es la concentración de Igs en el suero. A modo de ejemplo, si aglutina en 2 minutos, indica buen estado de protección. b) Prueba de sulfito de sodio Es una técnica similar a la prueba de precipitación con sulfato de zinc. La presencia, ausencia o ligera turbidez producida por el sulfito de sodio que precipita las Igs se determina a ojo desnudo. Es una técnica confiable en bovinos. Cada suero es probado con 3 soluciones con concentraciones del 14, 16 y 18% de reactivo. Las soluciones de concentración inferior a 14% no producen turbidez alguna y las concentraciones superiores a 18% pierden sensibilidad. La presencia (+), la ausencia (-) o la ligera turbidez (+/-), son los parámetros para estimar el rango de concentración de Igs en el suero, mediante una tabla de valores ya estipulado.

Concentración de Igs (mg/ml)

Solución de sulfito de sodio

14% 16% 18%

0 a 1 - - -

Menos de 5 - - +

4 a 5 - +/- +

6 a 12 - + +

12 a 18 +/- + +

Más de 15 + + +

c) Refractometría

Utiliza un refractómetro que permite medir el índice de refracción de la luz al incidir sobre una gota de suero. Braun y Tennat relacionaron el nivel de gammaglobulinas en suero con la concentración de proteínas totales determinadas por refractometría. Esto le permitió clasificar el riesgo del recién nacido.

Concentración de Proteínas totales (g/dl)

Nivel de inmunidad

Menos de 4,9 alto riesgo

5 a 5,4 riesgo medio

5,5 a 6,9 bajo riesgo

d) Dosaje de proteínas totales En forma indirecta pueden ofrecernos datos de valor sobre el nivel de gammaglobulinas totales, teniendo en cuenta que éstas constituyen del 18 al 22% de las proteínas totales y que del 90 al 97% de las gammaglobulinas plasmáticas corresponden a las Igs. Las técnicas de dosaje de proteínas son de uso más común en el laboratorio de diagnóstico clínico son:

119

- Técnica de Biuret - Técnica de Lowry - Técnica de Bradford Pruebas cualitativas a) Prueba del glutaraldehído

Esta prueba determina si hubo o no falla en la transferencia pasiva, basándose en la coagulación de las gammaglobulinas por el agregado de glutaraldehído (no permite cuantificar las Igs). La técnica consiste en colocar en un tubo de ensayo 0,5 ml de suero y agregar una gota de reactivo, agitar y controlar la gelificación cada 10 minutos durante el término de una hora. El tiempo se toma desde la adición del reactivo (minuto o tiempo cero). La reacción es positiva cuando se forma un ”gel sólido” (coágulo) luego de la adición del reactivo. Esto se visualiza inclinando el tubo unos 45º, verificando que el contenido no se vuelque, es decir, que el suero se haya gelificado.

Tiempo de reacción Concentración

aproximada de IgG (mg/dl)

Interpretación

Entre 0 y 10 minutos Mayor de 800 Buena trasferencia calostral

Valor normal.

Entre 10 y 60 minutos De 400 a 800 Falla parcial de trasferencia calostral.

Animal en riesgo potencial.

Mayor de 60 minutos Menor de 400 Falla total de trasferencia calostral.

Animal en alto riesgo.

Se deben tener algunas precauciones para realizar esta prueba: El suero utilizado no debe estar hemolisado, ya que la hemólisis puede conducir a resultados

falsos, al aumentar la reacción de coagulación. La prueba debe realizarse a temperatura ambiente (20 – 25ºC).

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Inmunoelectroforesis

La técnica de inmunoelectroforesis combina la electroforesis y la inmunodifusión en gel

de agar. El primer paso es la separación de los componentes de la mezcla antigénica por electroforesis en gel de agar. Si se usa una solución amortiguadora alcalina, la mayoría de las proteínas se cargarán negativamente y migrarán hacia el ánodo (polo positivo). Algunas moléculas como las gammaglobulinas, que poseen un punto isoeléctrico (PI) muy cercano al pH de la solución amortiguadora utilizada, migran hacia el cátodo (polo negativo) debido al fenómeno conocido como movimiento electroendosmótico. Este efecto es producido porque el agar en un medio alcalino tiene carga negativa, lo que hace que el agua se cargue positivamente y migre hacia el cátodo arrastrando las moléculas que se encuentran en solución, sobre todo las que no tienen carga o poseen carga baja. Una vez terminada la separación electroforética, se coloca el antisuero en un canal cortado en el agar, paralelo a la dirección de la migración electroforética. Durante el período de incubación, los antígenos que fueron separados electroforéticamente y los anticuerpos del antisuero se desplazan en el gel de agar hasta encontrarse (al igual que en la inmunodifusión doble), para producir una banda o línea de precipitación. Cada línea de precipitación representa la reacción de un antígeno con su respectivo anticuerpo. Materiales necesarios:- Cuba de electroforesis Portaobjetos limpios y desengrasados Cámara húmeda Agar noble Solución amortiguadora (Buffer Veronal pH 8,4-8,6) Soluciones de antígenos y de anticuerpos a valorar Procedimiento 1- Se colocan dos capas de agar sobre un mismo portaobjeto. La primera, denominada capa de impregnación, contiene una solución de agar al 2% (0,2 g de agar en 10 ml de solución amortiguadora). Con un hisopo embebido en esta solución, se cubre el portaobjetos tratando de formar una delgada capa y luego se deja secar. 2- Los portaobjetos (con la capa de agar de impregnación seca) se colocan en posición horizontal y sobre ellos se agregan 3 ml de una solución de agar al 1% caliente. Se deja gelificar a temperatura ambiente. 3- Se efectúan dos perforaciones en el agar: una con un molde circular (sacabocado) y otra estrecha y longitudinal. En este momento se extrae el agar sólo de la perforación circular. 4- En el recipiente de la unidad de electroforesis (cuba), se coloca la cantidad necesaria de solución amortiguadora (Buffer Veronal pH 8.6). Los portaobjetos con el agar perforado se colocan en la cuba y se establece contacto entre la placa de agar y la solución utilizando tiras de papel de filtro previamente humedecidas con la solución amortiguadora (uno de los extremos de la tira se apoya sobre el agar y el otro se sumerge en la solución amortiguadora). 5- Se conecta la cuba a la fuente de poder y se ajusta la corriente a razón de 10 voltios/cm. de gel ó 8 mAmp/portaobjeto durante 15 minutos para equilibrar el sistema.

121

6- Se desconecta el aparato. Las soluciones de antígeno se colocan en las perforaciones circulares de las placas de agar utilizando una pipeta Pasteur. Una de las muestras de antígeno deberá estar teñida con azul de bromofenol para indicar el desplazamiento (frente de corrida). 7- Se asegura que las tiras de papel de filtro estén bien colocadas y se conecta nuevamente el aparato, cuidando que la corriente sea correcta. 8- Cuando se observa que la muestra teñida ha migrado lo suficiente hacia el ánodo para una correcta separación, se desconecta el aparato y se retiran los portaobjetos de la cuba. Se remueve el agar del canal para colocar el anticuerpo específico. Esto debe hacerse con rapidez para evitar la difusión excesiva del antígeno. 9- Los portaobjetos se incuban en cámara húmeda durante 24 a 48 horas. Para una correcta interpretación de los resultados, la capa de agar puede teñirse de manera similar a la descripta para la técnica de inmunodifusión doble. (Ver capítulo sobre técnicas de interacción secundaria) Aplicaciones de la inmunoelectroforesis La inmunoelectroforesis permite separar e identificar antígenos o anticuerpos en una mezcla antigénica debido a su diferente movilidad electroforética, observándose el resultado por medio de la tinción de las bandas de precipitación que se producen luego de la incubación con el antisuero. Es una técnica cualitativa y semicuantitativa, pues se puede estimar la concentración de antígenos según sean las características de las bandas de precipitación respecto de la muestra testigo normal. En el caso de la inmunoelectroforesis en placa de agar, a mayor intensidad, longitud y cercanía de las bandas al lugar de siembra del anticuerpo, mayor es la concentración inicial del antígeno. En el diagnóstico de laboratorio de las paraproteinemias, los resultados de la electroforesis de zona y de la inmunoelectroforesis deberán ser combinados. Así, por ejemplo:

La presencia de un aumento franco o de una espiga en la región gamma en una electroforesis sugiere fuertemente la presencia de una paraproteinemia monoclonal. No obstante, es necesario llevar a cabo una inmunoelectroforesis para determinar la clase de cadena pesada y de cadena liviana de la inmunoglobulina.

La inmunoelectroforesis puede ayudar a distinguir si un aumento en las gammaglobulinas es policlonal o monoclonal.

La disminución o ausencia de inmunoglobulinas que se observa en diversos trastornos o deficiencias inmunológicas, pueden ser analizados mediante esta técnica.

La inmunoelectroforesis permite la identificación de cadenas livianas en la orina de enfermos con discracias de células plasmáticas o trastornos autoinmunitarios, mediante anticuerpos anti–kappa o anti–lambda específicos. De esta manera se puede confirmar la naturaleza monoclonal de la proteína de Bence–Jones en el mieloma.

Finalmente, la inmunoelectroforesis es útil para identificar las proteínas presentes en cantidades elevadas en el líquido cefalorraquídeo de pacientes con diversas enfermedades nerviosas.

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Comparación de un proteinograma con una inmunoelectroforesis.

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Técnica de inmunoelectroforesis:

Bibliografía 1. Morilla A. y Bautista C. R. Manual de Inmunología México: Editorial Diana 1º edición,

septiembre de 1986. Capítulo 6. 2. Margni R. A. Inmunología e Inmunoquímica. Fundamentos. Bs. As. : Editorial Médica

Panamericana 1º edición, octubre de 1972. Edición consultada: 5º edición septiembre de 1996. Capítulo I.

3. Inmunología Básica. Guía de trabajos prácticos. Fac. Cs. Veterinarias. Año 2000. 4. Stites Daniel P. y Terr Abba I. Inmunología Básica y Clínica. Editorial El Manual Moderno

S.A. de C. V. México D.F. 7° edición. 1993 Sección II. Capítulo 18.

A) Gel de agar vertido y solidificado sobre un portaobjetos. Se han excavado una ranura para el antisuero y un pozo para el antígeno.

B) El pozo para el antígeno se ha llenado con el suero en estudio. C) Los componentes del suero son separados por electroforesis.

D) La ranura se llena con antisuero. E) El suero y el antisuero difunden a través del agar. F) Se forman líneas de precipitación. Cada línea corresponde a un único componente del suero.

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Ejercicios y problemas de aplicación

1) Realice un cuadro que incluya las células que intervienen en el sistema inmune innato indicando: receptores de membrana, mecanismos involucrados en su acción (fagocitosis, apoptosis, etc.), si actúan o no como presentadoras de antígeno y patrón de migración. 2) Complete el siguiente cuadro con los componentes humorales del sistema Inmune Innato.

Células o tejidos que los producen

Funciones

Complemento (vía alterna)

Proteínas de fase aguda

IFN y

Anticuerpos naturales

3) Se realizó un experimento en el cual se evaluó la producción de óxido nítrico (ON) utilizando el reactivo de Griess. Para ello se obtuvo sangre con heparina de dos perros con las siguientes características: Canino 1: animal adulto de 3 años de edad y el Canino 2: cachorro de tres días), se centrifugó y se separó el halo de células mononuclares Estas células se incubaron con dos antígenos distintos: LPS y Staphylococcus sp inactivados con formol. Un tercer grupo de células a las que no se incubó con antígeno se utilizó como control negativo. Los resultados se muestran en el siguiente gráfico:

a) Indique mediante una tabla que respuesta en producción de ON se obtuvo según los

estímulos indicados, en los dos animales. b) Compare los resultados obtenidos entre los animales. c) Proponga una hipótesis que pueda justificar las diferencias observadas. d) Diseñe un experimento para confirmar la hipótesis propuesta.

4) La Peritonitis pleuritis infecciosa felina (PPIF) es una infección de etiología viral en la cual se desarrolla en el animal una intensa respuesta inflamatoria por parte del sistema inmune. Recientemente se descubrió que la alfa glicoproteína ácida (AGP), una proteína de fase aguda, sufre un gran incremento en el suero de los animales afectados. En base a sus conocimientos analice las imágenes que corresponden a las electroforesis (EF) de suero de dos felinos distintos y responda:

Canino 1

0

1

2

3

4

5

6

Control LPS 10ug/ ml Staphylococcus

spp.

Nan

om

ole

s d

e O

xid

o n

ítri

co

Canino 2

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

Control LPS 10ug/ ml Staphylococcus

spp.

Nan

om

ole

s d

e O

xid

o n

ítri

co

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Paciente A Paciente B

a) ¿Que técnica se utilizó para detectar el aumento en las proteínas de fase aguda? Describa el fundamento

b) ¿Qué paciente sospecha que puede estar afectado de PPIF? ¿Cuál es el mecanismo inmunológico por el cual aumentan las proteínas de fase aguda?

c) ¿Cuales son los componentes en los cuales puede separarse un suero? ¿Qué componente está alterado en este caso?

5) Durante una investigación sobre mecanismos de fagocitosis implicados en la inmunidad frente a distintas bacterias, se realiza un experimento para determinar la importancia de la opsonización en cada caso. A estos fines, se cultivan las bacterias en dos medios distintos: plasma humano y RPMI (medio de cultivo). Luego se agrega a los medios un cultivo de células dendríticas -con actividad fagocítica- y se los deja interactuar por 1,5 horas. Por último, se lleva a cabo el recuento del nº de bacterias fagocitadas a través de tinción con Giemsa de las células dendríticas y visualización de los microorganismos en su citoplasma. Los resultados obtenidos se representan en el siguiente gráfico:

Pie de figura: Cuantificación del nivel de ingestión de L. monocytogenes, por células dendríticas. Las bacterias fueron pre-incubadas con: A- Medio de cultivo, B- Suero decomplementado, C- complemento purificado, D- suero

1

2

C A B D

Albúmina

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completo. Los resultados se expresan como número de bacterias intracelulares por 100 células dendríticas luego de la tinción con Giemsa,

a) ¿Cuáles son los mecanismos de inmunidad evaluados? ¿Qué fases de la fagocitosis

está estudiando? b) ¿Qué conclusiones puede extraer a partir de este experimento? c) ¿Qué componentes del suero pueden haber actuado como opsoninas? Explique.

6) Un veterinario necesita purificar anticuerpos de tipo IgG presentes en el suero de un conejo para probar un nuevo tratamiento.

a) Enumere y explique los pasos que debería seguir en la purificación. b) Según los resultados de SDS-PAGE que se muestran a continuación: indique qué

enzimas puede haber utilizado para el fraccionamiento de las IgG obtenidas. Esquematice la molécula de IgG e indique los PM de cada uno de sus componentes antes (To) y después (Tf) de la digestión enzimática.

7) Se desea estudiar el efecto de la presencia de anticuerpos específicos frente a Staphyloccus sp. en la fagocitosis de dicha bacteria. Como fuente de Igs, se cuenta con suero de un animal infectado, y de Igs purificadas a partir del mismo por diferentes métodos. En las siguientes figuras se observa la corrida electroforética y el SDS-PAGE de los 3 tipos de muestras de Igs que se poseen:

a) Las muestras 1, 2 y 3 corresponden a las fracciones: Igs purificadas por afinidad a

proteína G, suero e Igs obtenidas por precipitación salina. Observando las figuras, qué imagen considera que podría corresponder a cada muestra y por qué?

b) Cuál de las 3 muestras usaría para opsonizar las bacterias y realizar ensayo de fagocitosis. Justifique

1 2 3 1 2 3

50 kDa

25 kDa

25

30

50

97

PM T0 Tf

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8) Se evaluó un nuevo kit diagnóstico para virus rábico, para ello se seleccionaron 180 cobayos libres de patógenos específicos (LPE) a los que se dividieron en dos lotes de 90 animales cada uno. Los animales del lote Nº 1 se conservaron como negativos, mientras que los del lote Nº 2 fueron inoculados con virus rábico y presentaron las lesiones características en el 100% de los animales (positivos). El análisis del suero de los 180 animales, a través del nuevo kit diagnóstico arroja los siguientes resultados: Lote Nº 1: 3 positivos y 87 negativos Lote Nº 2: 85 positivos y 5 negativos Realice un cuadro con los resultados y calcule la sensibilidad y especificidad del kit diagnóstico. 9) La Paratuberculosis bovina es una enfermedad crónica y de difícil diagnóstico que afecta a los bovinos. La prueba de oro para la confirmación de esta enfermedad es el aislamiento del microorganismo causante (Mycobacterium paratuberculosis) a partir de muestras de animales sospechosos. Dado el lento desarrollo de este microorganismo, se hace necesario contar con otras pruebas que permitan un diagnóstico más rápido. A continuación se transcribe una tabla de datos obtenidos por un equipo de investigadores que analizó el valor predictivo de un ELISA frente a un antígeno proteico de M. paratuberculosis como prueba diagnóstica de rutina:

Aislamiento

positivo negativo Total

ELISA comercial

positivo 3 0 3

negativo 2 75 77

total 5 75 80

Calcule la sensibilidad (S) y la especificidad (E) de la prueba de ELISA y decida en función de estos parámetros, si la implementaría o no como prueba diagnóstica de rutina. 10) A partir de las siguientes muestras para el diagnóstico de enfermedades infecciosas indique que tipo de Inmunofluorescencia realizaría (directa o indirecta) y reactivos necesarios.

Sospecha muestra IF Reactivos necesarios

Rabia canina Impronta de cerebro

Leptospirosis canina Sedimento urinario

Toxoplasmosis Suero

11) La Pseudorrabia es una enfermedad infecciosa, producida por el virus de Aujeszky, que afecta principalmente a cerdos pudiendo transmitirse a otras especies. Se caracteriza clínicamente por trastornos nerviosos, respiratorios y reproductivos, siendo el prurito generalizado seguido de parálisis y muerte los signos característicos. El agente etiológico pertenece a la familia Herpesviridae, presenta una cápside icosaédrica que contiene glicoproteínas (GP) que son los principales componentes estructurales reconocidos por el sistema inmune y contra las que se producen grandes cantidades de anticuerpos. La detección de anticuerpos específicos contra el virus en un cerdo se considera sinónimo de infección y el animal debe ser separado de la población sana. Para la prevención de la enfermedad se utilizan vacunas que generan una respuesta inmune similar a la infección natural.

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Un grupo de investigación generó, por técnicas de ingeniería genética, una variante de la cepa de campo a la que denominó “GPp 7 (-)”. Esta variante es idéntica a la cepa de campo, excepto que carece de una de las glicoproteínas de superficie, la GP7. Diseñe un ELISA donde se pueda diferenciar animales sanos no vacunados de vacunados y de infectados (No olvide los controles) 12) Al final de la prueba de ELISA se agrega una solución ácida (o alcalina, dependiendo del protocolo) ¿Cuál es el objetivo? 13) ¿Cómo sería el esquema de un ELISA diseñado para detectar la presencia del virus de la Influenza equina en muestras de secreciones nasales? Indique los reactivos que necesitaría. 14) Los siguientes datos son los resultados de un ELISA de tres gatos sospechosos de padecer VIF. Los números expresan el promedio de los valores de densidad óptica de cada muestra leída a 450 nm. Las densidades ópticas comprendidas en el rango de 0.300 a 0.499 indican valores indeterminados; en estos casos se deben repetir los estudios.

Control Positivo

Control Negativo

PACIENTE

A B C

1.689 0.153 0.055 0.412 1.999

Responda:

a) ¿Cuál seria su informe sobre cada uno de los pacientes? b) ¿Qué sucedería si se hubiese omitido por error el agregado de los sueros, y los otros

pasos se hubiesen realizado correctamente? c) ¿Qué sucedería si no se hubiese lavado el conjugado Anti-inmunoglobulinas felinas

antes del agregado del sustrato? d) ¿Por qué repetiría los resultados en el paciente B? ¿En qué momento lo haría?

15) La anemia infecciosa equina es una enfermedad de etiología viral de los caballos, de carácter crónico, con aparición de episodios agudos febriles, marcada depresión y debilitamiento. El contagio se produce a través de vectores hematófagos que transportan el virus en forma mecánica desde los animales enfermos a los sanos. El diagnóstico se realiza por la identificación de anticuerpos precipitantes en el suero de los animales infectados, test de Coggins. Usted tiene un laboratorio de diagnóstico y realiza esta prueba de forma rutinaria. Un colega tomó muestras de sangre de tres caballos y se las remite para su análisis.

Ag: antígeno P: control positivo 1-2-3: muestras

P

Ag

3

P

2

P

1

P

Ag

3

P

2

P

1

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Analice los resultados explicando a que se deben las bandas observadas y como las interpreta. Indique ¿Qué informaría sobre estos animales?

16) La campaña nacional de erradicación de la brucelosis bovina se basa en dos pilares: la vacunación de todas las terneras entre los 3 y 8 meses de edad (los machos no se vacunan) y la posterior identificación de los animales infectados y su segregación del rodeo. La vacunación se lleva a cabo con una cepa viva atenuada de Brucella abortus denominada cepa 19. Para identificar los animales infectados se realiza diagnóstico serológico a la totalidad de las hembras mayores de 18 meses de vida y los toros mayores de 6 meses.

a) Explique el fundamento de la prueba de aglutinación. b) Explique por qué el diagnóstico serológico se realiza a diferentes edades según sean

hembras o machos. 17) La leucosis bovina es una enfermedad inmunosupresora que afecta al ganado y es producida por un retrovirus. El SENASA acepta como prueba de diagnóstico de rutina a la inmunodifusión doble en placa con un antígeno estandarizado altamente conservado entre las cepas de este virus. Responda: Analice las variaciones esperables en la sensibilidad y la especificad de esta prueba diagnóstica de esta prueba si sustituimos el antígeno empleado por:

a) Otro antígeno viral de alta variabilidad entre cepas debido a una gran frecuencia de mutación.

b) Otro antígeno viral compartido que se expresa tanto en la superficie del virus de la leucosis como en la de otros virus emparentados.

. 18) Un canino hembra de 8 meses de edad presenta convulsiones. El veterinario, entre otras pruebas, solicita serología de toxoplasmosis al momento de la primera consulta y quince días después. El laboratorio realiza las pruebas de inmunofluorescencia indirecta (I.FI.) y aglutinación directa (A.D.) y obtiene los siguientes resultados:

Día 0 I.F.I: 1/512 A.D: 1/128

Día 15 I.F.I: 1/2048 A.D: 1/512

a) ¿Por qué los titulos informados son diferentes? b) Analice si hubo conversión serológica y explique el por qué de su respuesta

19) Con el objetivo de estudiar el efecto de la inmunización pasiva frente al desafío viral se obtuvieron sueros inmunes frente al virus del Sarampión de diferentes cepas de ratones y se utilizaron para inmunizar pasivamente un grupo homogéneo de ratones de la cepa Balb/c. Los ratones tenían dos semanas de vida y se les aplicó una dosis de 150ul de suero. Se evaluó la supervivencia de los ratones luego del desafío

a) ¿Cuáles fueron los resultados al día 2, al día 9 y al día 17? Realice un cuadro. b) ¿En que consistió en control negativo y para que lo realizó?

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c) Admitiendo que las diferencias observadas entre los tratamientos son estadísticamente significativas ¿Cómo interpreta los resultados?

Cuadrados negro: ratones tratados con suero proveniente de cepa Balb/c Cuadrados blanco: ratones tratados con suero proveniente de cepa CBA Triángulos blancos con borde negro: ratones tratados con suero de ratón normal 20) En la prueba de fijación de complemento se inactivan los sueros antes de evaluarlos, ¿cuál es el objetivo? Y ¿cómo se realiza? Además, el suero en estudio debe estar completamente libre de hemólisis y de contaminaciones. ¿Por qué? 21) En 1974 Peter Doherty y Rolf Zinkernagel realizaron el siguiente experimento: Infectaron cepas de ratones BALB/c y CBA con virus de la linfocoriomeningitis murina (LCMV). Siete días después tomaron células de bazo de estos ratones y evaluaron su habilidad para lisar células blanco infectadas con el virus (midieron el grado de lisis por la liberación del radioisotopo 51Cr por parte de las células blanco).

a) Explique los mecanismos celulares y las moléculas involucradas en esta evaluación.

b) En base a los resultados: Explique qué demostraron con este experimento.

Cepa dadora de Lisis de célula blanco

Célula efectora Célula blanco Infectadas No infectadas

BALB/c inmune BALB/c + -

BALB/c no inmune BALB/c - -

CBA inmune BALB/c - -

CBA no inmune BALB/c - -

BALB/c inmune CBA - -

BALB/c no inmune CBA - -

CBA inmune CBA + -

CBA no inmune CBA - -

% supervivencia

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22) Haga un cuadro en el que se comparen los siguientes mecanismos de citotoxicidad celular: fagocitosis, actividad NK, ADCC, lisis por complemento. Mencione la célula blanco, la célula y/o mediadores químicos efectores, mecanismo de reconocimiento y de lisis.

23) Para evaluar una vacuna BCG recombinante, se procedió a la inoculación de ratones BALB/c y se evaluó el porcentaje de lisis específica utilizando diferentes tratamientos: Medio de

cultivo solo (●), Anti-CD4 () y Anti-CD8 (□) Se realizó una estimulación previa in vitro con un péptido y luego se la evaluó sobre células blanco que expresan el mismo péptido. Explique los mecanismos celulares y las moléculas involucradas en esta evaluación. Explique los resultados en las diferentes proporciones de células.

24) Como se denominan los Ac. dirigidos contra los antigenos eritrocitarios en una transfusión? (alo – iso – idio) 25) Luego de una castración, un potrillo recibe antibióticos y suero antitetánico para prevenir complicaciones postquirúgicas. Unos meses después el potrillo es vendido y su nuevo dueño decide vacunarlos contra el tétanos. Ante la información de que el potrillo ya ha recibido una dosis de suero antitetánico, el veterinario actuante decide darle sólo una dosis de vacuna y suprimir el refuerzo, argumentando que el suero antitetánico ya recibido funcionaría como primer estímulo para el sistema inmune. ¿Está de acuerdo con la actuación del veterinario? Justifique

26) a) Analice el cuadro y explique qué pasará con el potrillo en cada caso

b) En caso que sea necesario realizar una transfusión: Cual seria según su criterio el donante indicado: - madre

- padre - otro

Justifique en cada caso.

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27) La Arteritis Viral Equina es una enfermedad respiratoria que puede causar abortos en yeguas preñadas. Se transmite por vía aérea y venérea, y cura espontáneamente dejando inmunidad duradera. En los machos, el virus puede acantonarse en el tracto reproductor transformando al animal en portador sano, que elimina virus con los fluidos seminales. La enfermedad es endémica en Estados Unidos y Europa, donde se utiliza una vacuna a virus vivo atenuado como herramienta profiláctica. En nuestro país es una enfermedad exótica de la que se han registrado algunos brotes en los últimos años como consecuencia de la importación de semen infectado. Los dueños de los haras afectados solicitan que se importe y se aplique la vacuna de USA, que ha dado muy buenos resultados.

a) ¿Si usted fuera responsable del organismo de control sanitario nacional, permitiría la utilización de dicha vacuna? ¿Por qué? De no permitirlo, proponga un plan profiláctico alternativo.

28) Las vacunas a subunidades proteicas pueden ser obtenidas por técnicas de biología molecular. Utilizando clonación en un vector de expresión (el plásmido: PRsetA este vector agrega a la proteina una cola de histidinas) se obtuvo en un cultivo de bacterias E. coli la siguiente proteína perteneciente a una secuencia de Mycobacterium paratuberculosis. Los cultivos de E. coli se analizaron por la técnica de SDS-PAGE.

madre

2º parición

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En la calle 1 se observa las proteínas de los cultivos de E. coli sin transformar y en la calle 2 las proteínas de los cultivos de E. coli transformadas con el plásmido. En la calle 3 se observan los patrones de PM. En las calles 4, 5, 6 y 7 se observan las eluídos de la columna de Níquel.

a) ¿Cuál es el fundamento de la metodología utilizada para la purificación proteica? b) Según los resultados de las corridas, ¿considera que la purificación fue efectiva?

Justifique. 29) Un grupo de investigadores está intentando desarrollar una vacuna contra leptospirosis bovina a subunidades, cuentan con aislamientos de las serovariedades de la zona y con sueros de bovinos infectados.

a) ¿Qué metodología les propondría para la identificación de proteínas compartidas por las distintas serovariedades?

b) Una vez identificados las proteínas compartidas ¿Cómo podrían seleccionar aquellas que son más inmunogénicas para los bovinos?

30) Para ahorrar material descartable un veterinario carga en la misma jeringa una dosis de vacuna antirrábica (virus inactivado) y una de moquillo (virus atenuado). ¿Es correcto inmunizar con 2 antígenos distintos el mismo día? ¿Y administrarlos en la misma jeringa? ¿Por qué? 31) Un veterinario había oído decir que la vía ideal para la inmunización es la puerta de entrada natural del patógeno y sabía que el virus de la Fiebre Aftosa ingresa por vía aerógena. Juntando estos conocimientos, se propuso evaluar el efecto de la aplicación en spray de la vacuna covencional antiaftosa (virus inactivado) sobre las vías áreas. Para esta evaluación, dividió en dos grupos losa animales de un campo en el que trabajaba; a la mitad le aplicó la vacuna por la vía convencional y con la otra mitad empleó el sistema de spray. Unos meses después un brote de aftosa afectó a la gran mayoría de los animales vacunados con el sistema de spray, sin provocar alteraciones entre los animales vacunados de la manera convencional.

a) ¿Le parece correcto vacunar con spray sólo a la mitad de los animales disponible para evaluar la eficacia del sistema? ¿Por qué?

b) ¿Cómo explicaría los resultados obtenidos por este colega? 32) Usted debe elegir entre dos vacunas atenuadas para vacunar a todos los cerdos del país contra la gastroenteritis transmisible. Una contiene el virus completo y otra el virus completo más una proteína extraña (la betagalactosidasa) Desde el punto de vista epidemiológico, ¿qué vacuna le parece mejor? Justifique 33) Un laboratorio entiende que, por haber formulado una vacuna a virus atenuado con un vehículo a base de agua destilada estéril apirógena no debe realizar un control de inocuidad. ¿Está usted de acuerdo?

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34) Un cerdo ingresa al país desde un área de USA libre de Pseudorrabia. Como los anticuerpos contra el virus de la Pseudorrabia son protectores, se decide administrarle una dosis de suero hiperinmune anti-pseudorrabia al momento del ingreso al país. Al llegar al establecimiento de destino el veterinario propone esperar unas semanas para vacunarlo contra la enfermedad. ¿Le parece correcto este proceder? Justifique 35) Cuando aparece un foco de una enfermedad exótica es imperioso el control de dicho foco para evitar la diseminación de la enfermedad. Entre las medidas sanitarias que se adoptan en estos casos se encuentran el rifle sanitario y la vacunación en anillo de todos los animales susceptibles que habitan las zonas lindantes a la de la aparición del foco. Qué tipo de vacuna eligiría para aplicar en uno de estos casos: a) vacuna a virus vivo atenuado b) vacuna a virus inactivado c) vacuna a subunidades? Justifique su elección 36) A un pueblo llega un nuevo veterinario que sostiene la teoría de que es mejor no vacunar contra el virus del moquillo debido a que, además de no producir 100% de protección, esta vacuna induce reacciones adversas en algunos de los animales vacunados. Debido a su prédica, muchos dueños de perros dejan de vacunar contra este patógeno. Al cabo de unos años aparece en el pueblo un brote de moquillo que afecta principalmente a los perros no vacunados, pero también a algunos que sí habían sido vacunados. Cuando el veterinario es confrontado como responsable del brote, aduce que después de todo el tenía razón, ya que también habían enfermado los animales inmunizados.

a) Si usted fuera una autoridad sanitaria con jurisdicción en dicho pueblo, ¿cómo respondería a la aseveración del veterinario?

37) A una clínica veterinaria llega a consulta una perra recientemente preñada. Su dueña está preocupada porque la perra nunca fue vacunada y una vecina le comentó que los cachorros se podían morir de parvovirosis. La mujer quiere saber cómo proceder.

a) ¿Usted qué le aconsejaría como veterinario? Si decide vacunarla, indique qué tipo de vacunas utilizaría y ¿por qué?

38) Un cachorro de 2 ½ meses recibió 2 dosis de vacuna contra Parvovirus y Moquillo. Sus dueños lo sacan de paseo por la plaza y a la semana el perro comienza a manifestar signos compatibles con Parvo/Moquillo. Se presentan los dueños en la veterinaria con la queja, alegando que la vacunación recibida por su mascota no había sido correcta, ya que a pesar de haber recibido 2 dosis de vacuna el cachorro se había enfermado. ¿Tienen razón estos dueños? ¿Cómo argumenta su respuesta? 39) La Rabia es una enfermedad neurológica de origen viral. Cuando un animal se infecta, el virus se disemina por vía neurógena hacia el encéfalo, donde produce las lesiones causantes de la sintomatología de la enfermedad. Teniendo en cuenta estas consideraciones:

a) Proponga una técnica diagnóstica que permita confirmar la etiología rábica frente a la muerte de un animal con signos clínicos compatibles.

b) Esquematice la metodología propuesta. c) Indique reactivos y equipamiento necesarios.

40) Para la elaboración de suero antitetánico se recurre a la inoculación de equinos, debido entre otras razones a los grandes volúmenes de suero que producen estos animales.

a) ¿Qué antígenos inocularía y cómo diseñaría el plan de inoculación del equino en cuanto al nº de dosis y al intervalo temporal entre las mismas? ¿Por qué? b) ¿Qué técnica utilizaría en los equinos inoculados para evaluar la respuesta frente al antígeno? c) ¿Qué tipo de inmunidad podría conferir la administración a otro animal del antisuero producido?

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d) Explique ventajas y desventajas de la administración del antisuero a otro animal. 41) En la Clínica veterinaria, es recibido un paciente canino con signos de anemia aguda severa. Entre las pautas iniciales de manejo, el profesional actuante decide instaurar una hemotransfusión. Dada la urgencia del caso y considerando que el animal no había recibido transfusiones previas se decide recurrir a “Lucy”, mascota de la veterinaria, como donante de sangre. El paciente comienza a manifestar vómitos, hipertermia y signos compatibles con un shock incipiente. Explique:

a) ¿Qué mecanismos inmunológicos podrían estar involucrados? b) ¿Cómo se podría confirmar el diagnóstico? c) ¿Cómo se podría haber prevenido el agravamiento del caso?

42) El virus de la linfocoriomeningitis murina infecta, entre otras, a las células dendríticas. En ellas disminuye la expresión de moléculas de MHC clase II, CD40 y CD80. ¿Cuáles serán las consecuencias de esta acción en el desarrollo de la respuesta inmune contra el virus? Explique. 43) Usted trabaja en un laboratorio y lo consultan porque una empresa desea exportar plasma bovino.

Para ello la aduana le exige un análisis cualitativo del mismo. Usted en su laboratorio sólo posee los siguientes reactivos:

Anti – IgG bovina marcada con fluoresceína. Anti – plasma bovino. Anti – IgA bovina marcada con fosfatasa alcalina.

Con sus conocimientos sobre técnicas Inmunológicas y con los reactivos que usted posee: ¿Qué técnica puede usted realizar que le permita determinar si lo que se está exportando es plasma bovino? Explique brevemente cómo la realizaría. 44) Estoy desarrollando una vacuna inactivada para caninos y quiero efectuar una prueba de potencia.

a) ¿Cuál es la especie de elección? b) ¿Qué características deberán tener los animales en los que se lleve a cabo la prueba? c) ¿Cómo diseña y evalúa la prueba?

45) Los potrillos son susceptibles de padecer neumonía por Rhodococcus equi. Esta es una bacteria intracelular facultativa, que se aloja en los pulmones y causa lesiones que suelen llevar a la muerte. Al estudiar las causas de la marcada susceptibilidad de los potrillos, se encontró que los animales jóvenes tienen deficiencia de IFN gamma, lo que afecta su respuesta inmune.

a) Describa alguna técnica in vitro que le permita demostrar la diferencia en la producción de IFN gamma.

b) ¿Cómo se verá afectada la respuesta inmune a esta bacteria por la deficiencia de IFN gamma?

46) Un perro de cinco años de edad sufre una herida el ojo. Tiempo después, presenta lesiones oculares resistentes a la terapéutica convencional. Este animal no tenía historia previa de enfermedad autoinmune. Se le detectan anticuerpos contra antígenos de la retina en suero. ¿Por qué normalmente un individuo no tiene anticuerpos contra antígenos de la retina en suero? ¿Por qué se podrían haber desarrollado en este caso?

136

47) Dentro de las patologías del tracto digestivo que afectan a los terneros neonatos, la Rotavirosis es una de las más relevantes. Este virus ingresa al organismo por vía oral e infecta los enterocitos de las vellosidades intestinales, generando las lesiones responsables del cuadro de diarrea observado. Responda:

a) ¿Qué mecanismos efectores del sistema inmune consideran que tendrán mayor importancia para lograr una respuesta inmune efectiva frente a Rotavirus?

b) Proponga un modelo de vacunación para la prevención de esta enfermedad en terneros neonatos, explicando qué tipo de vacuna, justifique.

48) Se presenta a consulta una gata siamesa de 5 años de edad con 5 cachorros de los cuales 1 estaba muerto y otros 2 presentaban decaimiento e ictericia. El veterinario sospecha de isoeritrólisis neonatal.

a) ¿Qué le preguntaría a los dueños (anamnesis)? b) ¿Qué técnicas utilizaría para comprobar sus sospechas?

49) El diagnóstico de la tuberculosis se realiza por la intradermorreacción con PPD. Un grupo de investigadores desea mejorar el diagnóstico de bovinos infectados, para ello realizan la intradermorreacción de las proteinas recombinantes E6/C10 (de Myobacterium tuberculosis) a bovinos infectados. La lectura se realizó a las 72 hs. Aquellos que presentaban un aumento de 5mm de diámetro o más, se los consideró como positivos.

a) Describa cómo se obtienen las proteinas recombinantes.

b) ¿Cuál es el objetivo buscado al realizar intradermorreacción a bovinos con PPD?

c) ¿Qué grupo/s control faltaría/n?

d) ¿Qué tipo de hipersensibilidad es esta intradermorreacción? ¿Cómo se

produce?

e) Interprete los resultados

50) Un grupo de investigadores estudió la respuesta de memoria de células T humanas en individuos con antecedentes de infección por dengue, para una evaluación posterior de la antigenicidad de proteínas virales inmunodominantes para su empleo en el diseño de futuros inmunógenos. Para esto se incubaron células mononucleares de sangre periférica de individuos inmunes (expuestos) a dengue y un grupo de individuos controles no expuestos.

a) ¿Cuál fue el experimento llevado a cabo? b) Describa la técnica y su fundamento c) ¿Cuáles son las células que los investigadores pretenden evaluar? d) ¿Por qué se seleccionaron individuos previamente expuestos al antígeno?

51) Los individuos positivos (con anticuerpos frente al Dengue) fueron seleccionados a través de la técnica de ELISA, y se los consideraba como tal a aquellos que presentaban títulos en suero mayor o iguales a 256.

a) Describa el tipo de ELISA utilizado, materiales, fundamento y controles.

137

b) Indique las diluciones de uso de los sueros, teniendo en cuenta que títulos > 256 son considerados positivos y la dilución final de uso fue de 1/2048. ¿Cómo realiza las diluciones teniendo en cuenta que el volumen a utilizar es de 20 μl de suero?

52) Un paradigma clásico de la inmunología plantea que para que ocurra cambio de isotipo en los anticuerpos es condición sine qua non la presentación del antígeno a un linfocito T helper (LTh) por parte de una célula presentadora de antígeno (CPA). En el presente trabajo se presentó un modelo animal, ratones BALB/c, de respuesta inmune frente a dos antígenos típicos. Se utilizó dextran como Ag T independiente y seroalbúmina bovina como Ag T dependiente, y se estudió la respuesta analizando los isotipos de los anticuerpos producidos. Se utilizaron 12 ratones BALB/c machos y 12 ratones BALB/c hembras de entre 5 y 8 semanas de edad y fueron divididos en dos grupos de 12 animales c/u (6 machos y 6 hembras) Los animales fueron inoculados intraperitonealmente con seroalbúmina bovina el grupo 1 y con Dextran el grupo 2, los días 1 (preinmune), 7,14 y 28 (A la vez se tomaron muestras de sangre del seno venoso retroorbital). Los ensayos para evaluar respuesta inmune se realizaron mediante un ELISA y los sueros utilizados en una dilución 1/250 Responda:

a) ¿Qué isotipos deberían evaluarse para conocer la respuesta inmune primaria y secundaria?

b) Establezca los pasos del ELISA utilizado c) Si la dilución utilizada fue siempre la misma ¿Cómo se evaluaron los niveles

de Ac. medidos en este trabajo? d) Grafique la respuesta primaria y secundaria esperable para ambos antígenos,

indicando el isotipo predominante. Si existen diferencias, ¿A que las atribuye? e) Analice los gráficos de detección de anticuerpos frente a ambos antígenos.

¿Encuentra diferencias? Explique f) ¿Qué control agregaría?

138

53) Una Cabaña vende un torito a un establecimiento ganadero. Para prevenir la ¨Fiebre de los transportes¨, antes de subir al camión, el torito recibe una vacuna contra IBR y Pasteurella multocida (principales agentes causales de la enfermedad). Cinco días después de llegar a destino el torito muere súbitamente. La necropsia se realizó inmediatamente, se observaron lesiones compatibles con neumonía. Durante la anamnesis se informó que el animal recibió 2 dosis de vacuna contra IBR hace 1 año, no así contra Pasteurella. Se sospecha de ¨Fiebre de los transportes¨ Se toman muestras y se envían al laboratorio. Los resultados son concluyentes. La muerte se debió a una infección aguda por P. multocida, sin participación del virus de IBR. Discuta

a) 1 ¿Qué muestras envió al laboratorio? b) 2 ¿Qué estudios solicitó? Descríbalos y fundamente su elección c) 3 ¿Cómo debieron ser los resultados para asegurar que la muerte del animal se

debió a una pasteurelosis aguda y que el virus de IBR no puede ser acusado de toricidio

d) 4 ¿Qué medidas se deberían haber tomado para evitar esta muerte? 54) La producción industrial de pollos para carne se ve afectada por la ocurrencia de diferentes enfermedades virales (Bronquitis infecciosa, Gumboro, New Castle, etc) que se transmiten muy rápidamente entre los pollos de un galpón de engorde Las gallinas transfieren anticuerpos en forma pasiva a sus pollitos a través del huevo, que lo protegen contra enfermedades específicas durante un período variable de tiempo (hasta un máximo de 40 días) si éstas fueron correctamente inmunizadas. Para evaluar la eficacia de esa transferencia se emplea la técnica de ELISA indirecto. Se toman muestras de sangre de 30 cada 10.000 aves. De acuerdo a los valores de D.O. obtenidos (en relación directa con la concentración de anticuerpos específicos contra la enfermedad en cuestión) se elaboran histogramas de frecuencia según rangos de D.O. establecidos por estudios estadísticos. De acuerdo a la distribución de las D.O. obtenidas se establece el “grado de protección” o “status inmunitario” del lote frente a esa enfernedad y se anticipa o retrasa el momento de vacunación activa para mantener las aves en un “alto status inmunitario” durante todo el período de producción (45 – 60 días).

Densidad Optica Grupo

0 – 0.20 1

0.21 – 0.40 2

0.41 – 0.60 3

0.61 – 0.80 4

0.81 – 1.00 5

139

1.01 – 1.20 6

1.21 – 1.40 7

1.41 – 1.60 8

1.61 – 1.80 9

1.81 – 2.00 10

a) Describa la técnica empleada. b) El Diseño empleado: ¿Corresponde a una técnica cualitativa, semicuantitativa o

cuantitativa? c) Los gráficos representan los histogramas de frecuencias de D.O. obtenidas de muestras de

suero de 4 grupos diferentes de pollitos bb que ingresaron a galpones de engorde. Realice comparaciones sobre el “status inmuntario” de cada lote y sobre la necesidad, cantidad y tipo de vacunas convencionales a emplear en cada lote.

55) Se sabe que el Virus de la Inmunodeficiencia Felina (VIF) infecta a los linfocitos T CD4+, causando una depleción de los mismos y que en esta infección, la relación CD4:CD8 de linfocitos circulantes constituye un factor pronóstico. Los siguientes gráficos corresponden a la corrida en un citómetro de flujo de la muestra de sangre de un paciente felino recién diagnosticado. Para marcarla se emplearon 3 anticuerpos: anti CD3 (maracador de LT), anti CD4 y anti CD8; cada uno marcado con un fluorocromo distinto.

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17

0

5

10

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1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Grupo 1

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nti

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4

6

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Grupo 4

ca

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tra

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3

0

2

4

6

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1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Grupo 2

ca

nti

da

d d

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0

5

10

15

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Grupo 3

ca

nti

da

d d

e m

ues

tra

s

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Teniendo en cuenta que la relación CD4:CD8 esperada para un felino sano es aproximadamente 2:1, analice e interprete estos resultados:

Los gráficos CD8 vs. CD3 y CD4 vs. CD3 fueron construidos considerando solamente los eventos incluidos en la región linfocitaria (gate linfoide) 56) Un grupo de científicos está investigando la respuesta inmune de porcinos frente al virus de la Peste Porcina (VPP). En este problema se muestran los resultados de uno de sus ensayos, donde realizaron una prueba de linfoproliferación de sangre periférica de animales infectados con el virus. Emplearon como estímulo linfoproliferativo una solución de virus inactivado. a) Analice los resultados expresados en la siguiente tabla y proponga un diseño (muestras empleadas, controles, reactivos) para el ensayo realizado.

Indice de Estimulación (IE)

Animal Infectado Animal NO infectado

Células SIN estímulo - -

Células + ConA 17,3 15,5

Células + VPP 9,1 1,8

CD4: 10% CD8: 19%

SSC-Height ->

Linfocitos

141

b) Luego, evaluaron las citoquinas producidas por los LT CD4+ proliferados usando la citometría de flujo.

Expresión intracitoplasmática de citoquinas en LT CD4+ de porcinos vacunados contra la Peste Porcina. Se representa CD4-FITC en eje Y y las respectivas citoquinas en el eje X. Los gráficos “A” representan células no estimuladas (control de producción basal de citoquinas); los gráficos “C” corresponden a células estimuladas in vitro con una solución viral inactivada

a) Qué información puede extraer de los gráficos presentados? b) En los gráficos de il-2 e IFNγ, qué tipo celular cree que está representando la

nube de puntos CD4-? c) Qué conclusiones piensa que el equipo de investigación pudo haber extraído

analizando el perfil de citoquinas encontradas?

142

GUIA DE LECTURA PARA UN TRABAJO CIENTÍFICO MODELO Texto: Fernández B., Jolly A., Colavecchia S., Fernández E., Mundo S.L. 2011. “Efecto de la infección de Mycobacterium avium paratuberculosis en la producción de anticuerpos bovinos”. In Vet 13(1):9-17.

Esta guía fue pensada para acercarlos a la lectura del trabajo mencionado, que es un artículo publicado recientemente en la Revista InVet, editada semestralmente por nuestra Facultad y en la que se nuclean publicaciones científicas de diversas áreas de la veterinaria. Los docentes de Inmunología Básica estamos convencidos de que adquirir competencias de lectura e interpretación de trabajos científicos es fundamental para ustedes, dadas las exigencias de actualización que la actividad profesional veterinaria supone en cualquiera de sus ámbitos. Además, en la medida que se familiaricen con este tipo de textos, podrán difundir en un futuro sus propias experiencias y los nuevos conocimientos que generen, a través de la escritura de nuevas publicaciones científicas. Particularmente en esta clase, la lectura del trabajo elegido les permitirá abordar algunas de las principales técnicas de Interacción Primaria antígeno-anticuerpo desde una perspectiva diferente a la planteada en la Guía de lectura y trabajos prácticos de nuestra materia. Podrán reflexionar sobre la aplicación de la técnica de ELISA a partir de este caso real, evaluar la metodología empleada, y analizar la manera en que los autores del trabajo muestran los resultados que obtuvieron.

Antes de centrarnos en la lectura del trabajo, analicemos rápidamente cómo es la estructura general de este tipo de texto. ¿Podrían mencionar cómo se denominan las partes principales que aparecen con una secuencia dada en él? Primero está el Título, seguido de los nombres de los autores y la/s institución/es a la/s que pertenecen, luego aparecen el Resumen (en español y en inglés), una Introducción, los Materiales y Métodos empleados, los Resultados y la Discusión de los mismos, las Conclusiones y por último, los Agradecimientos y la Bibliografía citada.

Ahora, una a una irán leyendo las partes del texto y podremos detenernos para analizar detalles de su estructura, comunes a todos los trabajos científicos, y del contenido particular que en este trabajo se presenta:

El Título suele guardar relación con la problemática investigada, los objetivos y la pregunta de investigación. En este caso, el título nos sitúa en la enfermedad en estudio (la paratuberculosis, producida por Mycobacterium avium subp. paratuberculosis - Map -) y en la especie animal en la que se abordó su estudio: bovinos. También nos dice que el trabajo se va a centrar en el análisis de la respuesta inmune de anticuerpos generada en animales que padecen esta infección.

Debajo del título, figuran los Autores del trabajo y su Filiación. Como pueden ver, en este caso son investigadores de dos Cátedras de nuestra Facultad. Otra información de los autores que puede incluirse es un mail de correspondencia (aquí aparece en el pie de página), que permite a los lectores la posibilidad de contactarse con los autores del trabajo.

El Resumen es una parte muy importante de una publicación científica. En él se presenta de manera sintética los objetivos, métodos, resultados, y conclusiones del trabajo. Generalmente, cuando uno realiza una búsqueda bibliográfica en bases de datos internacionales en la web, el resumen es a lo que primero se accede para leer. En función de la información que los resúmenes nos proveen es que decidimos qué trabajos de todos los que se enlistan como resultado de nuestra búsqueda sobre un tema en particular son los que nos interesaría leer en su versión completa. A veces, como es aquí el caso, el resumen aparece tanto en el idioma oficial de la revista como en inglés, a los fines de incrementar la difusión del mismo dentro de la comunidad que podría tener interés en leerlo. Si se fijan, al finalizar el resumen aparece una serie de Palabras clave. Éstas tienen que ver con la esencia de la investigación y ayudan a la localización del artículo en los buscadores de bibliografía, funcionando estas palabras clave como “motores de búsqueda”.

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Ahora sí nos sumergimos en el cuerpo del texto, a través de su Introducción. En este apartado, en general se presenta la problemática abordada y su contextualización, los antecedentes, objetivos del estudio, la pregunta de investigación, la/s hipótesis y la justificación. En este trabajo, la enfermedad estudiada es la paratuberculosis. En relación a ella, vamos a referirnos a algunos conceptos que aquí aparecen implícitos pero que sería bueno tener presentes:

La enfermedad en cuestión es causada por una micobacteria. Si recuerdan estas bacterias son de vida intracelular, y por lo tanto el sistema inmune tendrá que combatirlas valiéndose principalmente de sus mecanismos celulares (perfil Th1, con producción de IFNγ, activación de macrófagos, citotoxicidad mediada por linfocitos CD8+ y células NK).

En el tercer párrafo, los autores nos cuentan que parece existir una relación entre el estadio de la infección y el tipo de respuesta inmune predominante en el animal. Si necesitan revisar los conceptos generales relacionados con los perfiles de la respuesta inmune, pueden remitirse a:

FAINBOIM, L. y GEFFNER, J. 2005. Introducción a la inmunología humana. 5ta ed., Ed. Médica Panamericana. Cap. 9 y 10.

Como cierre de la Introducción, se menciona el objetivo que persiguieron al realizar esta investigación: la evaluación y caracterización de la presencia de anticuerpos, tanto a nivel sistémico (en suero) como local (en materia fecal) en bovinos en distintos estadios de paratuberculosis. Seguramente habrán notado la aparición de números, en formato de superíndice al finalizar algunas de las frases. Estos números nos llevan al apartado final: Bibliografía, e identifican los trabajos previos en que se basa aquello que los autores están afirmando en esa frase. Por ejemplo, en el primer párrafo, la frase que dice “La enfermedad causa notables pérdidas económicas en la producción agropecuaria.(…)” nos conduce a las citas 19 y 20. Si leen los títulos de esos dos trabajos en la Bibliografía, podrán darse cuenta de que en ellos se abordó el estudio del impacto económico de esta enfermedad y es seguramente en base a los resultados que esos autores encontraron que los autores de este trabajo enuncian esa afirmación.

A continuación se presentan los Materiales y Métodos, es decir el diseño experimental general, el origen de las muestras estudiadas, los procedimientos metodológicos y las técnicas empleadas. Esta sección suele estar a su vez subdividida en segmentos, cada uno con un subtítulo, que hacen referencia a distintas metodologías aplicadas y que pretenden organizar la información de manera más clara para el lector. Debería contener toda la información necesaria como para que otro investigador pudiera, a partir de esos datos, reproducir los experimentos planteados en el trabajo. Si vemos cómo está organizada en este caso, el primer apartado que contiene es Animales y muestras, donde nos cuentan la cantidad de animales estudiados, cuál fue el criterio de clasificación aplicado para considerarlos sanos o infectados; y a su vez, dentro de esta categoría, cómo se los subdividió en asintomáticos, sintomáticos y sintomáticos en fase terminal. Si leyeron este apartado con atención, habrán notado que se hace referencia al estado de los bovinos con respecto a otra enfermedad que no es la paratuberculosis: la tuberculosis. La aclaración de que los animales controles provienen de campos libres de tuberculosis surge de que al ser ambas enfermedades producidas por micobacterias, la respuesta inmune inducida por la infección con una de ellas podría generar interferencias o reacciones cruzadas con el diagnóstico inmunológico de la otra.

En el apartado siguiente Detección de anticuerpos específicos en sueros frente al PPA por ELISA, los autores detallan el protocolo empleado, especificando los reactivos utilizados y los laboratorios que los produjeron. Ustedes cuentan con una descripción general de esta técnica en la Guía de Lectura y Trabajos Prácticos de la materia (páginas 53 a 62). Si el antígeno usado para realizar este ELISA no les resulta familiar, vuelvan al último párrafo del apartado anterior del trabajo, donde se explica qué es. Aquí también se explicita cuál fue el criterio para considerar positivo/sospechoso/negativo un resultado obtenido, explicando de qué manera se estableció el valor de corte.

144

En Aislamiento e identificación de Map a partir de materia fecal nos detallan cómo realizaron este procedimiento. Hay que tener en cuenta que si bien el objetivo de este trabajo es focalizar en la respuesta inmune humoral inducida durante esta infección, la confirmación del diagnóstico de paratuberculosis en los animales no puede realizarse sólo mediante el estudio de la respuesta inmune específica. Es por esto que para clasificar certeramente a un bovino como infectado se necesita encontrar al microorganismo en muestras tomadas de él, ya sea logrando su crecimiento en un medio de cultivo o identificando la presencia de un fragmento de ADN exclusivo de esta bacteria (IS900) mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que utilizando secuencias de cebadores (primers) específicos para dicho segmento, puede amplificarlo hasta lograr concentraciones detectables a partir de una muestra tomada del animal. Los apartados que siguen, Producción de IgG3 bovina recombinante y Caracterización de los anti-isotipos de IgG, los vamos a pasar por alto en esta ocasión. Básicamente, hacen referencia al origen de los reactivos empleados para la identificación de los diferentes isotipos de inmunoglobulinas bovinas estudiadas: IgM, IgG total, IgG1, IgG2 e IgG3. Más adelante en la cursada, volveremos sobre este trabajo para poder profundizar en estos puntos (producción de antígenos con vectores de expresión, planes de inmunización, producción de sueros hiperinmunes) que hoy exceden el límite de los conocimientos que hasta ahora poseen. En Isotipos de inmunoglobulinas por ELISA nos cuentan qué determinaciones hicieron: por un lado evaluaron los niveles de anticuerpos totales en suero y materia fecal; y por otro los niveles de anticuerpos, totales o por isotipos, específicos frente a paratuberculosis. Pero ¿de qué manera se vinculan los niveles totales de anticuerpos con esta enfermedad? Otros autores describieron previamente que en los estadios terminales de la paratuberculosis se produce un cuadro de hipoproteinemia (niveles circulantes de proteínas totales por debajo del rango normal para la especie), derivado de la malabsorción que las lesiones granulomatosas producidas por esta enfermedad generan en la pared intestinal, limitando la asimilación de nutrientes de la dieta. Entonces, en este caso, los autores quisieron evaluar si en aquellos bovinos con hipoproteinemia (en Animales y Muestras de Materiales y Métodos explican cómo los detectan) los niveles totales de anticuerpos, que también son proteínas circulantes, estaban o no afectados. El último apartado de Materiales y Métodos hace referencia al Análisis Estadístico, indicando qué programa se empleó y qué estadísticos se aplicaron para analizar los diferentes resultados obtenidos.

Ahora sí aparecen los Resultados. En esta sección se muestran, en forma verbal y gráfica, los hallazgos resultantes de la investigación y su interpretación más directa y el análisis estadístico de los mismos. Teniendo en cuenta la aclaración que realizamos sobre la metodología, el segundo apartado titulado Producción de IgG3r y caracterización de los anti-isotipos de IgG bovinos como así también la Figura 1, no serán analizados en esta ocasión. Focalícense en la lectura de los otros apartados y en el análisis de la información contenida en las tablas y en Figura 2. Se describen los resultados obtenidos en relación a la caracterización de la respuesta de anticuerpos en los bovinos en diferentes estadios de la infección estudiados. En la Figura 2, los autores nos demuestran, a través de un gráfico de barras, los valores de IgM e IgG totales y Map-específicos obtenidos por ELISA a partir del suero y la materia fecal de los animales evaluados. Mientras que en la Tabla 2, de doble entrada, nos encontramos con la concentración relativa de los diferentes isotipos de IgG-específica a Map encontrados en cada uno de los grupos de bovinos evaluados.

Bajo el título de Discusión se suele presentar la interpretación más extensiva de los resultados y la reflexión sobre el logro de objetivos, si se respondió o no a la pregunta de investigación, si se refutó o no la hipótesis. En general, proyecta los alcances del nuevo conocimiento generado y puede proponer nuevas líneas de investigación.

En este trabajo vemos cómo se comparan algunos resultados obtenidos con otros ya publicados por otros autores. Por ejemplo, en la primer frase “Nuestros resultados muestran (…), en contraposición al estudio realizado en pequeños rumiantes3.“. También en esta sección

145

se suele incluir las hipótesis que los autores elaboran para explicar aquellos resultados anómalos o no esperados, si es que los hubiera. Este es el caso en el párrafo que dice “La IgM es una inmunolgobulina pentamérica que posee alta avidez pero poca afinidad. Por lo tanto, los altos niveles de IgM obtenidos en los bovinos controles podrían deberse a reacciones cruzadas con otras micobacterias25.” Puesto que no es esperado que animales que no están infectados (ni que tampoco han tenido contacto vacunal) con el microorganismo en cuestión posean altos niveles de anticuerpos específicos, los autores enuncian esta hipótesis que explicaría el hallazgo. Los párrafos que comienzan por “Son pocos los trabajos (…)” y “La IgG2 e IgG3 (…)” hacen referencia a cuestiones relacionadas con los apartados que hemos omitido en este lectura, a los fines de no generar confusiones. El último párrafo de las discusión menciona el hallazgo que los autores del trabajo consideran más destacable: “(…) el predominio de la IgG3 específica en los animales asintomáticos(…)”; que, recordemos, era la categoría de animales más difícil de diagnosticar en esta enfermedad. Este hallazgo los lleva a plantear como proyección de su línea de investigación el “(…)desarrollar un ELISA diagnóstico utilizando PPA como antígeno y antisuero frente a IgG3 bovina recombinante(…)” Esta nueva prueba podría mejorar la identificación de los bovinos con infección subclínica y en un futuro poder ser incorporada en los planes de control de paratuberculosis en los rodeos. Como reflexión final, pensemos cómo de esta manera una investigación básica habría generado un nuevo conocimiento que podría transferirse a la práctica profesional veterinaria, aportando una herramienta que mejoraría el diagnóstico de esta enfermedad en los rodeos bovinos.

Las Conclusiones pretenden resumir en pocas palabras los resultados más relevantes encontrados.

La Bibliografía es el listado de fuentes documentales utilizadas para el sustento de la investigación y que aparecen referenciadas en el cuerpo del artículo. Cada revista, en sus normas editoriales, especifica los lineamientos para la presentación de las referencias. No es la idea leerlas sino, dirigirse puntualmente a alguna de ellas si al aparecer citada en el texto nos interesa profundizar más en ese tema o tener acceso a la fuente original de información.

Finalmente, llegamos a la sección de Agradecimientos, la cual suele ser opcional. Aquí los autores se refieren a quienes les han aportado ayuda: técnica, para realizar alguna de las metodología (en nuestro trabajo, serían los agradecimientos a L. Gilardoni y L. Goldman); material, por ejemplo cuando algún otro investigador facilita un reactivo o alguna muestra que fue obtenida en otro centro de investigación); económica, mencionando a las instituciones que, a través del otorgamiento de subsidios de investigación, han financiado la investigación (en nuestro texto, sería la referencia a los subsidios de UBA-SeCyT). También puede incluirse un agradecimiento a alguna persona que haya participado en la lectura y revisión crítica del manuscrito previamente a su remisión a la revista (en este caso, el agradecimiento al Dr. Fernando Paolicchi).

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InVet. 2011, 13(1): 9-17ISSN 1514-6634 (impreso)ISSN 1668-3498 (en línea)

ANTICUERPOS BOVINOS EN PARATUBERCULOSIS

InVet Vol. 13 Nº 1, 2011

Efecto de la infección de Mycobacterium avium paratuberculosis en la producción de anticuerpos bovinos

Effect of the infection with Mycobacterium avium paratuberculosis on the production of bovine antibodies

Fernández, B. 1.; Jolly, A.1; Colavecchia, S.1; Fernández, E.2; Mundo S.L.1

1 Cátedra de Inmunología, 2 Cátedra de Clínica de Rumiantes, Facultad de Ciencias Veterinarias. Universidad de Buenos Aires. Chorroarín 280 (1427) Buenos Aires.

RESUMEN

La paratuberculosis es una enfermedad granulomatosa crónica intestinal, causada por Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis, que afecta a los rumiantes. El objetivo del trabajo fue caracterizar la respuesta inmune humoral sistémica y local de bovinos infectados. Se estudiaron once bovinos, seis infectados (asintomáticos, sintomáticos y terminales) y cinco controles. Se determinaron los niveles de inmunoglobulinas totales y se cuantifi caron los subisotipos de IgG específi cos a paratuberculosis en suero y materia fecal por ELISA. Los niveles de inmunoglobulinas totales en sueros fueron similares. Sin embargo, se evidenciaron aumentos signifi cativos de IgM e IgG totales, e IgG-específi ca en materia fecal de los sintomáticos. La IgG1 específi ca fue predominante en sueros de bovinos sintomáticos y terminales. La IgG3 fue la inmunoglobulina específi ca de mayor cantidad detectada tanto en suero como en materia fecal de los asintomáticos. Nuestros resultados muestran que la infección no afecta la producción de inmunoglobulinas totales. El aumento de inmunoglobulinas en materia fecal podría relacionarse con la lesión de la mucosa intestinal. El predominio de IgG1 se corresponde con el cambio de perfi l a Th2 en el periodo sintomático. El hallazgo de incrementos de IgG3 específi ca en asintomáticos sugiere el estudio de este isotipo para poder mejorar su identifi cación.

Palabras clave: (paratuberculosis), (bovino), (anticuerpos).

ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN

Correspondencia e-mail: Silvia Mundo smundo@fvet.uba.ar Recibido: 26-05-2011Aceptado: 20-07-2011* Premio “Estímulo a la Investigación Científi ca 2010” en la categoría graduados de la Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad de Buenos Aires.

10

FERNÁNDEZ, B.; JOLLY, A.; COLAVECCHIA, S.; FERNÁNDEZ, E.; MUNDO S.L.

InVet Vol. 13 Nº 1, 2011

INTRODUCCIÓN

La paratuberculosis es una patología crónica intestinal que afecta a los rumiantes y es causada por el Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (Map)10. La enfermedad causa notables pérdidas económicas en la producción agropecuaria19; 20.

La infección se produce por ingestión de calostro, leche o materia fecal de animales eliminadores de bacterias.

Los animales infectados atraviesan un largo estadio subclínico durante el cual eliminan pequeñas cantidades de Map por leche y heces en forma intermitente. Su identifi cación es dificultosa, se utilizan principalmente kits que evalúan la producción de inteferón gamma por linfocitos en cultivo22. En algunos bovinos, por causas todavía inciertas, la forma subclínica avanza hacia el período clínico, que se caracteriza por la aparición de diarrea profusa, mala absorción de nutrientes y pérdidas de proteínas. En ese momento hay un cambio de perfi l de la respuesta inmune de Th1 (celular) a Th2 (humoral)1;6;7, lo que conlleva a un aumento de inmunoglobulinas (Ig) circulantes facilitando el diagnóstico serológico de la enfermedad.

En la especie bovina, al perfil Th1 se lo relaciona con las IgM e IgG2, mientras que al Th2 se lo asocia con IgG1 e IgA8. Sin

embargo, el papel funcional de los isotipos de anticuerpos (Ac) aún no ha sido totalmente dilucidado. Se describe al isotipo IgG1 como crítico para bloquear bacterias y toxinas en el sitio de infección, y al IgG2 se lo relaciona principalmente con el incremento de la fagocitosis mediada por neutrófi los frente a las infecciones bacterianas agudas.

El papel de los Ac en la protección frente a micobacterias ha sido reevaluado, demostrando que los Ac juegan un rol importante en la respuesta inmune frente a micobacterias2;11;24. Nuestro grupo ha demostrado un incremento en la asociación del Map con la célula blanco de la infección (el macrófago bovino) luego de la opsonización con IgG1 específi ca frente a la bacteria entera o a la proteína p34 recombinante. Además, se detectó un incremento en la activación celular y la formación del granuloma17.

En este contexto, se plantean como objetivos del presente trabajo la evaluación de la respuesta inmune humoral local y sistémica de bovinos en distintos estadios de paratuberculosis.

MATERIALES Y MÉTODOS

Animales y muestrasSe estudiaron 11 bovinos adultos:

6 provenientes de rodeos infectados con paratuberculosis y 5 bovinos controles (C)

SUMMARY

Paratuberculosis, caused by Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis, is a chronic granulomatous enteric disease affecting ruminants. Our aim was to characterize systemic and local humoral responses of infected cows. Eleven cows were studied: six naturally infected (asymptomatic, symptomatic and terminal) and fi ve control. Total IgM and IgG and paratuberculosis-specifi c IgG subisotypes, from feces and serum, were assessed by ELISA. No differences were detected on the levels of total immunoglobulins in sera. Symptomatic cows showed signifi cative higher level of totals IgM and IgG, and specifi c-IgG in feces. IgG1 was the highest from sera of symptomatic and terminal. IgG3 was the highest specifi c immunoglobulin in sera and feces of asymptomatic. Our results showed total immunoglobulins levels in serum are not modifi ed by the infection. The increment of immunoglobulins in feces could be caused by the lesions of intestinal mucosa. The predominance of IgG1 in symptomatic period is related to the change toward Th2 profi le. The use of anti-IgG3 could improve the identifi cation of asymptomatic cows.

Key words: (paratuberculosis), (bovine), (antibodies).

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provenientes de campos libres de paratuberculosis y tuberculosis de la provincia de Buenos Aires. De cada bovino se obtuvo 10 ml de sangre sin anticoagulante y materia fecal (MF). El suero se fraccionó y congeló a -20ºC hasta el momento de utilización. Las MFs fueron fraccionadas para realizar el cultivo y los ELISAs (se homogenizó 10 gr de MF y 10 ml de PBS Tween 20 al 0,05%, se centrifugaron varias veces a fi n de obtener las muestras lo más límpida posible15. Luego fueron fraccionadas y congeladas a -20ºC hasta el momento de uso).

Los bovinos fueron clasificados según: rodeo de origen; presencia de signos clásicos de la enfermedad; niveles de proteínas séricas (evaluados por refractometría); detección de anticuerpos específi cos en sueros frente al Antígeno Protoplasmático de Map (PPA); aislamiento e identifi cación de Map a partir de materia fecal.

Detección de anticuerpos específi cos en sueros frente al PPA por ELISA

Se utilizaron placas de 96 hoyos sensibilizadas con 2µg/hoyo PPA (Allied Monitor Inc., Missouri, USA). Para evitar reacciones cruzadas con otras micobacterias, se pre-adsorbieron los sueros con Mycobacterium phlei (M. phlei) inactivada por calor (crecida en nuestro laboratorio). El sistema de revelado empleado fue un anticuerpo anti-IgG bovina en conejo conjugado a peroxidasa (Cappel, Fountain, USA) (anti-IgG-HRP). Para interpretar los valores de densidad óptica (DO) obtenidos se calculó el valor de corte (VC) sumando al promedio de los sueros controles negativos, dos desvíos estándares. A partir de los resultados se clasifi có cada suero como: negativo (menor al VC), sospechoso (con densidades ópticas entre el VC y 1,5 el VC) y positivo (mayor a 1,5 el VC).

Aislamiento e identifi cación de Map a partir de materia fecal

Se cultivó la MF de los bovinos problema en medio Herrold con huevo, piruvato y micobactina (Allied Monitor Inc., Missouri, USA), a fi n de confi rmar el diagnóstico12;16.

Se observaron todos los cultivos una vez por semana durante 18 semanas. En aquellos casos que crecieron colonias de bacterias con las características esperadas, se identifi có el IS900 por PCR9. Para ello se utilizaron las secuencias de primers diseñadas por Mundo18 y Collins5. Map ATCC 19698 y M. phlei ATCC 11758 fueron utilizadas como cepas controles.

Producción de IgG3 bovina recombinante

Para obtener la IgG3 bovina recombinante (IgG3r) se cultivaron21 las E. coli BL21 pLysS transformadas con un plásmido obtenido en nuestro laboratorio17. Se realizó la purifi cación parcial de las proteínas a través de una columna de Níquel (His*Bind® Resin, Novagen, Darmstadt, Germany). Posteriormente se realizó la diálisis de las proteínas purifi cadas. Las bacterias E. coli BL21 (BL21-pRSET A) transformadas con el plásmido pRSET A sin inserto fueron procesadas y denominadas como extracto de E. coli (EEc).

Caracterización de los anti-isotipos de IgG.

Para el estudio de IgG1 e IgG2 se utilizaron reactivos comerciales: anti-IgG1 bovina en ovino conjugado a peroxidasa (Bethyl inc., Montgomery, USA), anti-IgG2 bovina monoclonal en ratón (Sigma-Aldrich Co., USA.), anti-IgG de ratón conjugado a peroxidasa (Jackson Immuno Research Laboratories, Inc., Pennsylvania, USA). Mientras que para evaluar la IgG3 se utilizó el suero de conejo anti-IgG3r obtenido previamente en nuestro laboratorio17, y el anti-IgG de conejo en cabra conjugado a peroxidasa (Kirkegaard & Perry Laboratorios, inc. Maryland, USA).

El suero de conejo anti-IgG3r fue pre-adsorbido con BL21-pRSET A en medio líquido (a una densidad óptica

660nm de 2) y EEc en medio

sólido (en placas de 96 hoyos) con el fi n de disminuir la cantidad de Ac anti-E.coli.

La determinación de las reacciones cruzadas se realizó por Inmunoblot y ELISA, utilizando los patrones comerciales IgG1 e IgG2 (Bethyl

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inc., Montgomery, USA), IgG3r, suero de un bovino normal y EEc.

Isotipos de inmunoglobulinas por ELISA

Niveles de Igs totales. Se sensibilizaron hoyos con 50µl de los sueros diluidos 1/6000 (IgM) y 1/20000 (IgG), y de las MFs sin diluir (IgM) y 1/100 (IgG). Se utilizaron los siguientes Ac conjugados a peroxidasa: anti-IgM bovina en ovino (Bethyl inc., Montgomery, USA) y anti-IgG-HRP.

Niveles de Igs específi cas a Map. Los hoyos fueron sensibilizados con una cepa de referencia de origen bovino totalmente caracterizada y secuenciada denominada K1014 (gentilmente cedida por el Dr. Raul Barletta). Esta cepa se cultivó en medio 7H9 líquido y fue inactivada por calor en nuestro laboratorio. Se utilizaron 50µl de K10 a una DO

660nm de 0,4.

Análisis EstadísticoPara analizar los resultados se utilizó el

software estadístico Stastistix 8.0 (Analitical Software, Tallahasee, USA). Para la comparación de los niveles (DO) o cantidad de isotipos (µg/ml) entre grupos, se realizó el análisis de varianza (ANOVA). Los niveles de signifi cación fueron fi jados en un 5%. Se determinó la homogeneidad de varianza y se realizó el Test de Dunet como análisis post-ANOVA.

RESULTADOS

Clasifi cación de los grupos de animales infectados

El origen, sinología y los resultados de niveles de proteínas séricas, de reactividad frente a PPA en suero y el aislamiento e identifi cación de Map en materia fecal se muestran en la Tabla 1. Estos resultados permitieron clasifi car a este grupo en infectados asintomáticos (IA), infectados sintomáticos (IS) e infectados terminales (IT).

Producción de IgG3r y caracterización de los anti-isotipos de IgG bovinos

La purifi cación permitió obtener la IgG3r acompañada de una pequeña cantidad de proteínas contaminantes provenientes de la E. coli (Figura 1A). La pre-adsorción del suero de conejo anti-IgG3r disminuyó notablemente la cantidad de Ac anti-E. coli (Figura 1B). La evaluación del reconocimiento de E. coli por el anti-IgG3r mediante ELISA demostró que, al pre-adsorber el suero, la DO obtenida pasó de 1.01 (suero sin pre-adsorber) a 0.16 (suero pre-absorbido).

La lectura de los Inmunoblots reveló la existencia de reacciones cruzadas entre IgG3r con IgG1 e IgG2, ya que el anti-IgG3r pre-adsorbido reconoce a las tres subclases de IgG bovina (Figura 1B). Por otro lado, los anti-isotipos comerciales (anti-IgG1 y anti-IgG2) sólo reconocieron el patrón correspondiente (IgG1 e IgG2 respectivamente, resultados no mostrados).

Por la técnica de ELISA se observó que el reactivo comercial anti-IgG2 reconoce la IgG3r y el antisuero anti-IgG3r pre-adsorbido reconoce IgG2 (patrón comercial). Sin embargo, estas reacciones cruzadas son siempre con menor intensidad que al reactivo correspondiente (Figura 1C).

Isotipos de inmunoglobulinas totales y específi cas a Map en sueros y MFs

Niveles de IgM. Los resultados se muestran en Figura 2. Se detectó un leve aumento de IgMs totales y específi cas a Map en los sueros de los infectados, especialmente en los IS en relación al C, aunque el análisis estadístico no permitió identifi car estas diferencias como signifi cativas. En MF los niveles fueron bajos en relación a los del suero. Sin embargo, el comportamiento fue similar al del suero. Se evidenció un incremento en los niveles de IgMs totales en IS e IT, siendo sólo signifi cativa la diferencia entre los C y el IS.

Niveles de IgG. Los resultados se muestran en la Figura 2. Se determinaron niveles similares de IgG totales en sueros de los distintos grupos.

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Se observó un incremento estadísticamente significativo en los niveles de IgG Map-específi ca en los sueros de los bovinos IS e IT. Llamativamente, la cantidad de IgG específi ca a Map en sueros de IA fue menor que en los C. En MFs se evidenciaron comportamientos similares entre IgG totales y específi cas. Así mismo se detectaron altos niveles en IS e IT (IgG total y específi ca), siendo signifi cativa la diferencia entre el IS y el C.

Isotipos de IgG específicas a Map: Los resultados se muestran en Tabla 2.

Niveles de IgG1: Se observaron incrementos signifi cativos en los niveles de IgG1 de sueros de IS e IT. Mientras que sólo se detectó IgG1 específi ca en MF del grupo sintomático (14,8± 3 µg/ml).

Tabla 1. Clasifi cación de los grupos de bovinos. Grupo C (control), IA (infectado asintomático), IS (infectado sintomático), e IT (infectado terminal).

Grupoproteínas séricas

(g/dl)Campo de origen Signos

ELISA PPA

Cultivo de MF

PCR

C (n=5) 6,6±0,5 - - - - -

IA (n=2) 8,2±0,3 + - Sospechoso - -

IS (n=2) 7,3±1,1 + + + + +

IT (n=2) 4,7±0,3 + + + + +

Figura 1. Producción de IgG3r y caracterización de los anti-isotipos de IgG bovinos.A. Producción de IgG3r. SDS-PAGE al 12%. Calle 1 IgG3r expresada por Clon 36; Calle 2 IgG3r purifi cada; Calle 3 E. coli BL21 transformadas con el plásmido pRSET A sin inserto (EEc). B. Caracterización del anti-IgG3r. Inmunoblot. Antígenos: Calle 1 IgG2; Calle 2 IgG1; Calle 3 suero bovino; Calle 4 EEc; Calle 5 IgG3r. Se utilizó el anti-IgG3r como anticuerpo primario. C. Reacciones cruzadas de los anti-isotipos de IgG. ELISA.

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Niveles de IgG2. Se identifi có un aumento signifi cativo en los sueros de todos los animales infectados (IA, IS e IT). En MF sólo pudo ser detectado en el grupo sintomático y en baja concentración (0,09±0.0 µg/ml). Mientras que en el resto de los bovinos los niveles fueron menores a 0.08 µg por ml correspondiente al límite de detección de la técnica.

Niveles de IgG3. Se determinó un incremento signifi cativo en los sueros de los bovinos infectados mostrando además cantidades similares entre ellos. En MF, los infectados IA e IS mostraron niveles similares a los detectados en suero.

DISCUSIÓN

Nuestros resultados muestran que la infección con Map afecta los niveles de

proteínas séricas sin modifi car la producción de anticuerpos totales en suero, en contraposición al estudio realizado en pequeños rumiantes3. Por otro lado, se pudo observar un incremento de los niveles de IgM e IgG totales en materia fecal coincidiendo con el periodo clínico sintomático (IS). La IgM es el isotipo indicador de respuesta activa, sólo esperable en infecciones agudas o re-agudizaciones de infecciones crónicas. Este aumento de IgM en MF podría ser posible por la lesión intestinal y la re-estimulación de nuevos clonos de linfocitos B como respuesta a la re-infección endógena característica de éste periodo.

La IgM es una inmunoglobulina pentamérica que posee alta avidez pero poca afi nidad. Por lo tanto, los altos niveles de IgM obtenidos en los bovinos controles podrían deberse a reacciones cruzadas con otras micobacterias25.

Figura 2. Niveles de IgM e IgG totales y Map-específi cas en sueros y materias fecales evaluados por ELISA.

Grupos IgG1 IgG2 IgG3 IgG1/IgG2

Suero MF Suero MF Suero MF Suero

C <0.08 <0.08 3.4±0.7 <0.08 <0.08 9.2±0.8 <0.02

IA 2.07±0.1 <0.08 10.2±2.8* <0.08 18.5±8.8* 10.3±0.8 0.2

IS 679.2±1* 14.8±3* 14.1±0.7* 0.09±0.0 17.5±6.7* 18.9±13 48

IT 1160.3±3* <0.08 10.4±3.7* <0.08 19.5±14* <0.08 112

*p<0.05

Tabla 2. Análisis de isotipos de IgG en sueros y materias fecales, expresados en μg/ml.

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Estos resultados coinciden con trabajos nuestros previos sobre bovinos infectados18.

El aumento de IgG específi ca a Map en sueros de bovinos sintomáticos y terminales está acompañado de incrementos de todas las sub-clases de IgG, principalmente de IgG1. Esta última parecería ser la Ig predominante en suero en estas etapas de la enfermedad tal como se han descripto previamente13;17.

Los animales asintomáticos presentaron niveles basales de IgGs Map-específicas en sueros. Esto podría deberse al tipo de respuesta inmune que predomina en esta etapa (celular).

Los altos niveles de IgG1 específicos encontrados en materias fecales de bovinos sintomáticos coinciden el predominio de este isotipo en la mucosa intestinal en bovinos normales4.

La respuesta de tipo Th2 no es tan clara dado que la IgG2 específi ca en suero aumentó en todos los bovinos infectados y los niveles son similares. Sin embargo, al analizar la relación IgG1/IgG2 se observa un incremento de dicha relación, coincidente con el avance de la patología (asintomáticos, sintomáticos, terminales). Estos resultados concuerdan con los expresados por Estes y Brown (2002) y Vanden Bush (2003).

Son pocos los trabajos que estudiaron la IgG3 en bovinos infectados con Map17. Y a nuestro entender, este es el primer trabajo que describe a la IgG3 bovina en mucosas. Se encontró un aumento de este isotipo en sueros de todos los bovinos infectados. Los niveles fueron levemente superiores a los hallados para IgG2 y parecería tener una cinética similar a la de IgG2. La detección de IgG3 Map-específi ca en MF del grupo control podría deberse a reacciones cruzadas con micobacterias intestinales no patógenas.

La IgG2 e IgG3 poseen cadenas pesadas similares; razón por la cual Butler4 las clasifi có como IgG2a e IgG2b. La IgG3r producida para este trabajo, incluye regiones compartidas, lo que justifi ca las reacciones cruzadas encontradas. Sin embargo, se han encontrado diferencias entre los niveles de IgG2 e IgG3 en sueros

y MFs estudiados, mostrando el poder de discriminación del reactivo (anti-IgG3r).

Es de destacar el predominio de la IgG3 específi ca en los animales asintomáticos. Dado que el diagnóstico serológico utilizado de rutina falla en la identifi cación de este grupo, se sugiere la utilización de un reactivo específi co anti-IgG3 para mejorar su detección. En este sentido, nuestro próximo objetivo será desarrollar un ELISA diagnóstico utilizando PPA como antígeno y antisuero frente a IgG3 bovina recombinante.

CONCLUSIONES

En el presente trabajo se determinó que la infección con Map no modifi ca los niveles de Igs totales séricas. Se corroboró el predominio de IgG1 en sueros de bovinos sintomáticos y terminales.

Se identifi có IgG1 específi ca en materia fecal de los sintomáticos.

Se detectó IgG3 en sueros y materias fecales de animales asintomáticos y sintomáticos.

Se demostró que los reactivos desarrollados en nuestro laboratorio permitieron ampliar el conocimiento de la respuesta inmune humoral específi ca a paratuberculosis.

AGRADECIMIENTOS

Se agradece a los veterinarios L. Gilardoni y L. Goldman por su apoyo técnico, y al doctor F. Paolicchi por sus aportes teóricos en el presente trabajo. Esta investigación fue fi nanciada por los subsidios UBA-SeCyT v038 y v023.

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