TÉCNICAS EN EL ANÁLISIS DE MICROSATÉLITESUTILIZADOS EN

IDENTIFICACIÓN HUMANA

Muestra obtenida de la escena del crimen o de

una prueba de paternidadBIOLOGÍA

Extraccion de ADN

Extraccion de ADN

Cuantificacion de ADN

Cuantificacion de ADN

Amplificación PCR de marcadores STRs

Amplificación PCR de marcadores STRs

TECNOLOGÍA

Separación y Detección de productos PCR ( Alelos de STRs)

Determinación genotipo muestra

GENÉTICAComparación del

genotipo de la muestra con otros resultados

Comparación del genotipo de la muestra

con otros resultados

Análisis de los resultados (comparación con datos

poblacionales)

Análisis de los resultados (comparación con datos

poblacionales)

Entrega de resultados (cálculos estadísiticos)

Entrega de resultados (cálculos estadísiticos)

PASOS EN EL PROCESAMIENTO DE UNA MUESTRA DE ADN

Muestras utilizadas para extracción de ADN

•Describir tipo de muestra, su color, su forma, su marca, etiqueta y talla si procede, tipo de envoltorio que lo contenía y estado de conservación.

•Muestras dubitadas

•Muestras indubitadas

EXTRACCION DE ADN

Extracción orgánica (fenol-cloroformo)

Extracción no orgánica (agentes quelantes): agentes quelantes: resina Chelex, formada por copolímeros de estirenodivinilbenceno que contienen iones iminodiacetato que actúan como grupos quelantes.

CUANTIFICACION DEL ADN

Fluorometría

Fundamento: capacidad de unión del ADN a ciertos tintes fluorescentes como H33258

Comparación de las muestras problema con muestras de cantidad de ADN conocida

Se utiliza un Fluorímetro: lámpara de mercurio y un detector para medir fluorescencia relativa a 460nm

ADN de doble cadena

CUANTIFICACION DEL ADN

Espectrofotometría Medida de la cantidad de luz

ultravioleta que absorben las bases nitrogenadas

Utiliza un espectrofotómetro, medidas de absorbancia a 260 y 280nm

OD260/OD280: pureza del ácido nucleico

Poco sensible: no dectecta concentraciones de ADN inferiores a 250ng/ml

ESPECTRO DE ABSORBANCIA ADN

http://www.cardiff.ac.uk/biosi/staffinfo/kille/Methods/Gene/Spec_Analysis.html

CUANTIFICACION DEL ADN

Minigel de agarosa Midiendo la fluorescencia

inducida por ultravioleta que se produce cuando se intercalan moléculas de bromuro de etidio entre el ADN

Comparar con patrones estandar de cantidad de ADN conocida

Poco sensible

Ventajas: se puede visualizar el grado de degradación del ADN

CUANTIFICACION DEL ADN

Hibridación con sondas (Dot Blot y Slot Blot)

Hibridación de las muestras a cuantificar con una sonda del locus humano alfa satélite D17Z11.

ADN problema se inmoviliza en una membrana de nylon (punto: dot-blot; guión:slot-blot), se pone en contacto con la sonda

Sondas marcadas

Comparación intensidad de señal de la muestra con estándares

CUANTIFICACION DEL ADN

Hibridación con sondas (Dot Blot y Slot Blot)

•Solo cuantifica ADN humano

•Altamente sensible, detecta cantidades del orden de 20pg

•Cuantifica ADN de cadena sencilla y muestras de ADN no purificadas

CUANTIFICACION DEL ADN

QuantiBlot

CUANTIFICACION DEL ADN

Cuantificación enzimática Uso de una serie de enzimas para producir una cantidad de ATP

que depende de la cantidad de AD N presente en la muestra seguida de la generación de una señal luminosa, dependiente de la concentración de ATP

AMPLIFICACION DEL ADN

Copias (extensión de primers )

ADN MOLDE 5’

5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’

Adición de primers

(alineamiento)

5’3’

3’5’

Forward primer

Reverse primer

TÉCNICA DE PCR

Cadenas separadas

(denaturación)

5’

5’3’

3’

En 32 ciclos con un 100% de eficiencia se pueden producir hasta 1.07 billones de copias de ADN molde

En 32 ciclos con un 100% de eficiencia se pueden producir hasta 1.07 billones de copias de ADN molde

MULTIPLES COPIAS DE ADN POR PCR

Original DNA target region

Thermal cycleThermal cycle

MULTIPLEX PCR

Se pueden analizar hasta 10 loci simultáneamente

Alta sensibilidad menos de 1 ng de ADN

Util en análisis de muestras degradadas y de mezclas

Ventajas: disminuye costos, tiempo, contaminación del ADN

SEPARACION de PRODUCTOS PCR

PCR Multiple: diferentes marcadores fluorocromos pueden ser usados para el análisis de loci donde se sobrelapan el tamaño de los alelos

Separación de productos PCR:

TIPIFICACION MANUAL: Tinción de nitrato de plata DETECCION FLUORESCENTE SEMIAUTOMATICA

Electroforesis capilar Electroforesis en geles de poliacrilamida

EJEMPLO DE UN KIT DE MULTIPLEX

D3 FGAvWA 5-FAM (blue)

D13D5 D7 NED (yellow)

A D8 D21 D18 JOE (green)

Estandar interno GS500

ROX (red)

AmpFlSTR® Profiler Plus™

9 STRs amplificados junto con Amelogenina en una sola reacción de PCR

100 pb 400 pb300 pb200 pb

Separación por tamaño

Sep

ara

ció

n p

or

colo

r

ELECTROFORESIS

Electroforesis convencional Geles de agarosa Geles de poliacrilamida

Fundamento El ADN está cargado

negativamente y al someterlo a una diferencia de potencial se moverá hacia el ánodo a través del gel una distancia proporcional a su tamaño, alcanzando mayor distancia las moléculas de menor peso.

ELECTROFORESIS CONVENCIONAL

ESCALERAS ALELICAS

ELECTROFORESIS CAPILAR

Cuando los fragmentos de ADN alcanzan la ventana capilar, el láser excita los colorantes fluorescentes. La fluorescencia emitida por los colorantes es colectada por el detector a longitudes de onda particulares y registrados como señales digitales en el computador.

TIPIFICACION DE STRs

TECNICAS DE HIBRIDACION

SECUENCIACION

http://www.ucm.es/info/genetica/AVG/practicas/secuencia/Automat1.jpg

http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/F/FluorDideoxySeq.gif

El instrumento de secuenciación automática genera un cromatograma mostrando la emisión de los fluorocromos cuando ellos pasan por el detector en el instrumento. El orden de estos colores corresponde a el orden de las bases en el ADN. Así una secuencia de ADN puede ser leída directamente desde el cromatograma.

BIOCHIPS