Al revelar los numerosos métodos mediante los cuales las células procesan, añaden, eliminan y transfieren in­formación genética, los biólogos moleculares abrieron el camino para el desarrollo de sus propias manipula­ciones genéticas. En los últimos años se han desarro­llado técnicas que han permitido abordar el análisis y la manipulación del ácido desoxirribonucleico (DNA, deoxyribonucleic acid) de una forma antes inimagina­da. La tecnología del DNA recombinante ha hecho po­sible investigar más a fondo la estructura y la función de los genes, en especial de los genes eucarióticos, inaccesibles por otros métodos. Cuando los investiga­dores se enfrentaron por primera vez con el gran tamaño y la complejidad del DNA, incluso el del virus más sim­ple, la posibilidad de descifrar la información genética codificada parecía estar más allá de toda esperanza. Se hizo evidente que para estudiar un gen individual, se le debía aislar del resto del genoma, ya que cada gen representa una pequeña sección dentro de un cromoso­ma; en ese contexto, no puede individualizarse. Para el aislamiento de un gen o de fragmentos más pequeños, el DNA debe fragmentarse. Si bien la rotura del DNA puede realizarse de forma mecánica, por este medio la fragmentación se produce al azar. La obtención de fragmentos específicos de DNA fue posible mediante un método desarrollado a partir de herramientas propias de ciertos organismos procariotas, como lo son las enzimas de restricción (véase capítulo 14). Para avanzar hacia un estudio más detallado del DNA se necesitó una meto­dología que permitiera obtener grandes cantidades de fragmentos específicos de DNA. Estos fragmentos po­dían ser DNA genómico, DNA complementario (cDNA) o DNA obtenidos a partir de oligonucleótidos sintéticos. A menudo, antes de que un determinado fragmento de DNA o de RNA mensajero (mRNA) pueda manipularse de cualquier modo, primero debe localizarse. Los cro­mosomas, incluso los de las células eucarióticas más simples, contienen una enorme cantidad de DNA, por lo que localizar un segmento específico es como tratar de encontrar la proverbial aguja en el pajar. Para locali­zar fragmentos específicos se utilizan las técnicas de hi bridación de ácidos nucleicos. Entre las técnicas de hi­bridación más comunes se encuentran Southern blot, Northern blot, Slot blot, Dot blot, hibridación in situ, hibridación en solución y citometría de flujo. Antes de abordar cada metodología es importante mencionar al­gunos aspectos básicos que facilitarán el entendimiento técnico de estas herramientas de la biología molecular, como son la electroforesis de ácidos nucleicos y la defi­nición de sondas.

Introducción

Técnicas de hibridaciónCAPÍTULO

16Miriam Ruth Bueno Topete • Alejandra Natalí Vega Magaña

Electroforesis de ácidos nucleicos La electroforesis es una técnica analítica de separación de macromoléculas. La separación tiene lugar debido a la dife-rente movilidad que presentan las macromoléculas cargadas cuando se someten a la influencia de un campo eléctrico como consecuencia de su relación carga/masa. Los ácidos nucleicos son moléculas cargadas de manera negativa, de-bido a la presencia de grupos fosfato en su estructura. La naturaleza del enlace fosfodiéster de las cadenas polinu-cleotídicas condiciona la carga de un ácido nucleico, que es casi igual al número de grupos fosfato. La electroforesis en geles de agarosa se lleva a cabo en aparatos apropiados, cámaras por lo general horizontales, y requiere de dos ele-mentos indispensables: la fase móvil y la fase estacionaria. La primera es el medio amortiguado que permite la movi-lidad de las moléculas cargadas hacia los electrodos corres-pondientes cuando se genera un campo eléctrico. La fase estacionaria, o soporte, es un polímero de naturaleza gela-tinosa conocida como agarosa (originalmente obtenido de algas, como el agar-agar, pero de composición más homo-génea). Dependiendo de su concentración genera poros de cierto tamaño a través de los cuales migran los fragmentos de DNA o RNA. Por lo general, la concentración es de 0.5 a 2%. La agarosa posee la propiedad de permanecer líquida a más de 50 °C y de formar un gel al enfriarse. Los frag-mentos de ácidos nucleicos separados por electroforesis se visualizan mediante su tinción con bromuro de etidio, un colorante que se intercala entre las bases del DNA y que emite fluorescencia cuando se irradia con luz ultravioleta (véase capítulo 13).

Sondas Las sondas son segmentos de DNA o RNA de cadena sen-cilla marcados con moléculas reporteras, como enzimas o radioisótopos, que permiten su fácil detección. El diseño de la sonda, es decir, su secuencia nucleotídica, es lo que le permitirá, entre miles de fragmentos que forman parte del genoma de un ser humano, identificar “un solo gen” o “el fragmento de un gen”. Gran parte del éxito de este tipo de estrategias moleculares depende de la especificidad de la sonda. La longitud de las sondas puede ir de 15 a 30 ba-ses, conocidas también como oligonucleótidos, hasta miles de bases de nucleótidos. Pueden sintetizarse y purificarse con relativa facilidad por instrumentos comerciales dispo-nibles en la actualidad. En términos generales, las sondas se obtienen a partir de síntesis química o de plásmidos, que

Metodología del DNA recombinante148

se clonan con la sonda de interés. La especificidad de la síntesis de la sonda dependerá del objetivo de estudio (por ejemplo, el diagnóstico de mutaciones en enfermedades genéticas o la identificación de un polimorfismo).

Southern blot

Fundamento La técnica de Southern blot la desarrolló Edwin Southern en 1975; es una estrategia estándar para analizar DNA pre-viamente digerido con enzimas de restricción.

Esta técnica se utiliza para determinar la presencia de un gen o fragmentos del DNA específicos en una mezcla de ácidos nucleicos extraídos con anterioridad.

Se basa en la aplicación de dos procesos fundamenta-les: la desnaturalización o separación de las cadenas com-plementarias del DNA y la hibridación o unión de dos ca-denas complementarias. Este fundamento es compartido por todas las técnicas de hibridación.

Procedimiento técnico En este procedimiento, primero se aísla el DNA de cual-quier célula del organismo excepto de glóbulos rojos, ya que carecen de núcleo. Para el análisis molecular de un pacien-te, el DNA puede obtenerse de linfocitos. Sin embargo, la extracción puede hacerse también de otras fuentes: cul-tivos celulares, células de líquido amniótico, vellosidades coriónicas o cualquier órgano biopsiado. Una vez extraído el DNA, se digiere con enzimas de restricción (una o dos) y los fragmentos se separan por electroforesis en geles de agarosa, de acuerdo con su carga/masa. En algunas ocasio-nes se utilizan geles de acrilamida cuando los fragmentos que se van a separar son muy pequeños. En este procedi-miento electroforético, como ya se mencionó, las muestras se someten a un campo eléctrico; como los fragmentos de DNA tienen carga negativa se mueven hacia el electrodo

positivo y los fragmentos más pequeños migran con más rapidez.

Las moléculas de DNA separadas pueden visualizarse mediante su tinción con bromuro de etidio u otro com-puesto intercalante. En este momento el procedimiento no es informativo, debido a que el fragmento de interés se encuentra inmerso en millones de fragmentos creados por las enzimas de restricción. Con posterioridad, el DNA se desnaturaliza para obtener cadenas sencillas, median-te un proceso químico, generalmente por tratamiento con álcalis. A continuación, los fragmentos se transfieren del gel a un soporte sólido, como membranas de nitrocelulosa o de nailon. Las membranas de nailon presentan algunas ventajas; mayor capacidad de unión de ácidos nucleicos (400 ug/cc2), mayor resistencia y vienen cargadas positi-vamente o con carga neutra. Existen diferentes métodos para la transferencia, como la capilaridad, el vacío o la electrotransferencia. Es importante señalar que la finalidad de la transferencia es crear una réplica de lo que se tenía en el gel, ahora en un soporte mucho más sólido, como es una membrana (figura 16-1). Por último, para identificar uno o más fragmentos entre millones, se utiliza una son-da específica marcada con alguna molécula reportera (por ejemplo, “radiactividad”, 32P-dCTP). La sonda se pone en contacto con la membrana y en aquellos lugares en donde la sonda encuentre su secuencia complementaria se pega-rá, proceso conocido como hibridación. La sonda emitirá radiactividad, la cual se detectará mediante un proceso de revelado con placas de rayos X. La emisión de la sonda co-rresponderá únicamente al fragmento de interés. En la fi-gura 16-2 se observa un esquema de cada uno de los pasos involucrados en la técnica de Southern blot.

Marcaje de las sondas Las sondas pueden marcarse radiactivamente (en general con 32P) o enzimáticamente (biotina, digoxigenina, etc.). Una

Buffer detransferencia

Papel filtro

Gel

Membrana

Papel filtro

Transferencia

Membrana conácidos nucleicos

60 volts

(–)

(+)

Figura 16-1.

Técnicas de hibridación 149

ventaja de los sistemas enzimáticos es que, una vez marcada la sonda, su vida media es muy larga (meses), mientras que el marcaje radiactivo es más corto (para 32P, de 15 días). Sin embargo, la sensibilidad varía: las sondas radiactivas detec-tan hasta 0.1 pg de ácido nucleico y las enzimáticas, entre 1 y 10 pg. Las sondas pueden marcarse en un extremo o a lo largo de toda la cadena. Para marcar en un extremo puede utilizarse la enzima polinucleótido cinasa (que introduce un único nucleótido marcado en el extremo 5′ de la sonda) o la enzima transferasa terminal (que introduce varios nucleóti-dos marcados en el extremo 3′ de la sonda).

El marcaje en toda la sonda se realiza por el procedi-miento de nick traslation (figura 16-3). En este método se combinan dos actividades enzimáticas:

1. Actividad DNasa 1, que suprime un nucleótido al azar de una de las dos cadenas de la sonda.

2. Actividad de DNA polimerasa, que, a partir del hueco dejado en la cadena de DNA por la DNasa 1, va incor-porando nuevos nucleótidos por complementariedad (entre los que están marcados), tomando como molde la otra cadena de DNA intacta.

Otro método para marcar sondas es el de random pri-mers (secuencias cortas de oligonucleótidos, normalmente hexámeros, que por su pequeño tamaño hibridan al azar a lo largo de toda la cadena). Al añadir la enzima DNA po-limerasa 1 desde el lugar donde se unen los primers, van incorporándose nucleótidos en que algunos van marcados radiactivamente hasta que finalmente se completa la ca-dena.

Aplicaciones La técnica de Southern blot ha sido de gran utilidad para identificar genes asociados con enfermedades de transmi-sión genética, e identificar mutaciones, como rearreglos, deleciones y dosis génica en caso de portadores. La figura 16-4 representa el diagnóstico de anemia falciforme a tra-vés de Southern-blot.

También se utiliza para detectar polimorfismos en los fragmentos de restricción de diversos genes y la presen-cia de DNA de ciertos microorganismos infectantes como bacterias y virus.

Figura 16-2. Esquema representativo de cada uno de los pasos involucrados en la técnica de Southern blot. Obtención del DNA genómico y digestión con enzimas de restricción, electroforesis, transferencia, hibridación específica con una sonda y detección de la secuencia de interés.

Corte con enzimas de restricción

Fragmentos de DNA

Membrana

Electroforesis

Papel absorbente

Hibridación con lasonda marcada

Detección de la secuencia de interés

Fragmentosseparados

Amortiguador

Membrana

Gel

Película

DNA genómico

Autorradiografía

Metodología del DNA recombinante150

Northern blot

Diferencias con Southern blot Ésta es la contraparte del Southern blot y como ácido nu-cleico se utiliza RNA en lugar de DNA. A diferencia del Southern blot, con esta técnica no se utilizan enzimas de restricción, ya que las moléculas de RNA son más peque-ñas y para su análisis no requieren su fraccionamiento. Sin embargo, prácticamente comparten todos los demás pasos, como son la electroforesis, la desnaturalización (aunque el RNA es de cadena sencilla, puede formar estructuras se-

cundarias), la transferencia, la hibridación con una sonda y el revelado.

Aplicaciones Es una herramienta muy útil para el estudio de los produc-tos de la transcripción génica (mRNA) y de su regulación, ya que se pueden estudiar las potenciales variaciones en la abundancia de especies del RNA en diferentes condiciones experimentales o comparar condiciones clínicas normales o patológicas.

Dot/slot blot Tras el aislamiento y separación de los ácidos nucleicos, éstos se aplican directamente a la membrana sin separar-los, según su peso molecular; es decir, no se realiza elec-troforesis. La fijación se hace por lo general con vacío y en un molde cuyo pocillo puede tener forma de punto (dot blot) o ser lineal (slot blot) (figura 16-5). Es posible reali-zar detecciones no sólo cualitativas (positivo o negativo) sino también cuantitativas, utilizando como patrón dilucio-nes seriadas de concentraciones conocidas del genoma que se está determinando. Son especialmente útiles cuando se quieren detectar fragmentos obtenidos a partir de una clo-nación en que la cantidad de fragmentos en la mezcla es pequeña y no representa mucha dificultad su localización.

Hibridación in situEste es un método histoquímico que emplea a la biología molecular de la misma manera que la inmunohistoquímica utiliza los métodos de la inmunología. Los principios de ambos métodos son semejantes y el resultado final es el mismo: la identificación de componentes tisulares en una laminilla que pueden observarse al microscopio (figura 16-6). La especificidad de la inmunohistoquímica se basa en la unión antígeno/anticuerpo, mientras que la especifi-cidad de la hibridación in situ se basa en la unión de una sonda con una secuencia complementaria de DNA o RNA dentro de un tejido. A diferencia de Southern blot y Nor-thern blot, la hibridación in situ no requiere de la extrac-ción de ácidos nucleicos, sino que en el mismo tejido se lleva a cabo el procedimiento de detección e hibridación; de ahí el nombre de in situ (en el mismo lugar). Las sondas que se utilizan para la hibridación in situ pueden ser ra-diactivas y no radiactivas. En la actualidad, las más utili-zadas son las no radiactivas de las cuales existen variantes; marcadas con fluorescencia, modalidad conocida como hi-bridación in situ acoplada a un sistema de fluorocromos (FISH) (figura 16-7), diogoxigenina (DIG), biotina, fosfa-tasa alcalina o peroxidasa. Un aspecto relevante de este tipo de sondas es que el detalle morfológico no se pierde, a diferencia de lo que ocurre con las sondas radiactivas. Otra modalidad de marcaje es con anticuerpos antihaptenos, ofrece la ventaja de usar etiquetas fluorescentes diferentes

A AG G GT T

T TC

Actividad DNasa

Actividad DNA pol

C CG G GA AA

TC CC

A GT TTC CC

A G TTC CC

G*A G T

G*A G

A G TT CC

G* G*A AG T C* TT C*C*

A G

OH

T TC C CG G GA AA

T TC C CG G G

C*

G*T

A

A AA

T TC C CG G GA AA

T TC C CG G GA AA

OH

Figura 16-3. Marcaje de una sonda del DNA por nick transla-tion. En el primer paso de la reacción, la enzima DNasa 1 produce una pequeña rotura (nick) en una de las cadenas del DNA. A partir de ésta, la DNA polimerasa 1 añade nucléotidos al extremo 3′ OH generados. Dicha enzima tiene, además, actividad de exonucleasa 5′-3′, que libera nucleótidos del 5′ del nick. La eliminación de nucleótidos del extremo 5′ y la adición de nuevos nucleótidos al extremo 3′ provoca el movimiento del nick a lo largo del DNA (nick translation). La sustitución de uno o más de los nucleótidos que van a ser incorporados de nuevo por nucléotidos marcados radiactiva-mente origina la formación de moléculas marcadas (sondas).

Técnicas de hibridación 151

simultáneamente para la detección de secuencias distintas. Esta estrategia es utilizada generalmente para la hibrida-ción de cromosomas y de mRNA. Una nueva alternativa es el marcaje de anticuerpos con moléculas de oro coloidal, usadas para la detección por microscopia electrónica.

Aspectos técnicos El primer paso para la hibridación es la preparación y fi-jación del tejido, en el cual deben conservarse los ácidos nucleicos lo más íntegramente posibles, mantener la mor-fología del tejido y permitir una accesibilidad suficiente para que la sonda penetre. La fijación con formalina, segui-da de una inclusión con parafina es el procedimiento más usado. Después de la fijación las secciones de tejido deben adherirse al portaobjetos y no deben desprenderse durante el procedimiento de hibridación. Para la adhesión, por lo general se utiliza gelatina crómica o polilisina. Antes de la hibridación, los tejidos se pretratan con HCl (que extrae proteínas e hidroliza parcialmente las secuencias diana) y proteinasa K (que incrementa la penetración y la acce-sibilidad de la sonda) y se someten a una posfijación con paraformaldehído (incrementa la especificidad de la señal). Se realizan diferentes lavados para remover las sondas que no hibridaron y finalmente se procede a la detección

o revelado. En el caso de sondas radiactivas se realizará autorradiograf ía. Se cubren las secciones con emulsión fo-tográfica y se exponen durante tres a siete días a –70°C. En

Figura 16-5. Esquema de la visualización del dot blot y slot blot. El tipo de soporte que se utiliza durante el proceso de fijación de los ácidos nucleicos en una membrana o filtro es lo que determina la forma en que se visualiza esta técnica molecular. A) Soporte que se utiliza para realizar un dot blot, en que los orificios están en forma de puntos. B) Soporte que se utiliza para realizar un slot blot, en que los orificios se encuentran en forma de líneas.

Gel de electroforesis teñido

Membrana de hibridación

Normal portador afectado

Kb

20

9

6

4

2

1

Figura 16-4. Southern blot para el diagnóstico de anemia falciforme. El esquema de la izquierda representa el DNA digerido con enzimas de restricción, separado por electroforesis y teñido con bromuro de etidio. Al extremo del gel, se observa un marcador de peso molecular como referencia, expresado en kilobases (kb). El esquema de la derecha muestra el resultado de la hibridación, en que se observan las bandas que se reconocen por la sonda. En este caso, el diagnóstico se dirigió hacia una hemoglobinopatía (anemia falciforme), una enfermedad autosómica recesiva. Por el método de Southern blot se observa claramente la dotación génica en caso de sujetos portadores y afectados por la enfermedad.

slotsdots

B) Slot blotA) Dot blot

Metodología del DNA recombinante152

el caso del uso de sondas no radiactivas, las laminillas se incubarán con un anticuerpo secundario dirigido contra la sustancia con la que estaba marcada la sonda (p. ej., anti-cuerpo antidigoxigenina o antibiotina) siguiendo el protoco-lo según lo ya establecido en las técnicas inmunohistoquí-micas (figura 16-8).

Aplicaciones 1. La hibridación in situ tiene un alto grado de resolu-

ción, que permite la localización de secuencias génicas a nivel cromosómico, con lo que se pueden detectar translocaciones y otras alteraciones cromosómicas, así como el estudio de expresión de genes (mRNA) a nivel celular y subcelular. Las principales aplicaciones son la identificación de infecciones virales en tejidos, así como el mapeo cromosómico.

2. La translocación bacteriana es la migración de bacte-rias o productos bacterianos desde el lumen intestinal hacia el exterior. En pacientes con cirrosis hepática, es un detonador importante de infecciones bacterianas, lo cual contribuye a la mortalidad de estos pacientes. La hibridación in situ con fluorescencia (FISH) es una herramienta importante para la detección de este pro-ceso; mediante una sonda dirigida a una secuencia conservada de la subunidad ribosomal 16S de bacte-rias, permite la detección y localización de bacterias en la mucosa intestinal. Para este proceso es funda-mental la fijación rápida de pequeños fragmentos de colon con contenido fecal para preservar la mayoría de bacterias adheridas a la mucosa (cuadro 16-1).

Hibridación en solución: captura de híbridosEste método utiliza sondas de RNA que tienen la capaci-dad de hibridar con el DNA viral en solución. Los híbridos formados podrán detectarse por unión de anticuerpos es-pecíficos marcados con sustancias luminiscentes. Los mo-dernos métodos comerciales, a diferencia de las versiones anteriores que se consideraban como subóptimas, tienen una adecuada relación entre sensibilidad y especificidad si se establecen límites de señal lumínica adecuados (1 pg de DNA; equivalentes a 100 000 copias del genoma viral). La utilización de un cóctel de sondas de alto riesgo, que en la última versión incluye 13 tipos (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68) y otro para el grupo de bajo riesgo que incluye cinco tipos (6, 11, 42, 43 y 44), permite la detección de cualquiera de estos tipos en dos únicas reacciones. Tie-ne como ventaja la posibilidad de semicuantificar la carga viral, aunque esta cuantificación solamente indica núme-ro de copias virales y no puede corregirse en función del número de células obtenidas en la toma. El inconveniente principal es que no permite distinguir entre los diferentes

Muestra fijada enportaobjetos

Desnaturalización

Hibridación

Visualización

Sonda

DNA blanco

Fluorocromo

Figura 16-6.

Figura 16-7. Técnica de FISH. Identificación del gen HER2/NEU en cáncer de mama por la técnica de FISH. El gen HER2/NEU se encuentra localizado en el cromosoma 17q, y su amplificación está presente en 25 a 30% de las neoplasias de mama; se relaciona estrechamente con los estadios avanzados, metastásicos, que implican un mal pronóstico. En la actualidad existe un tratamiento con anticuerpos monoclonales humanizados dirigidos específicamente contra el producto del gen HER2/NEU que mejora el pronóstico y la sobrevida del paciente.

CEP 17HER-2/neu

Laboratorio de Genética - INEN

Técnicas de hibridación 153

tipos virales ni la presencia de infecciones múltiples; varios estudios refieren inespecifidades debidas a reacción cruza-da entre las sondas de alto riesgo y ciertos tipos virales de bajo riesgo que pueden superar 10% de los casos.

Citometría de flujo acoplado a sondas La citometría de flujo es una técnica de análisis multipa-ramétrico cuyo fundamento se basa en hacer pasar una

suspensión de partículas (por lo general células) alineadas por un láser focalizado. La citometría es un proceso que permite medir de manera simultánea distintas moléculas en una sola célula.

Aspectos técnicosEn el contexto de analizar el DNA mediante citometría de flujo, es necesaria la utilización de sondas acopladas

DIG

DIG

HPR TSA

HPR TSA

a)

b)

c)

d)

e)

f)

Sonda

DNA

Fluorocromo

DIG

Anticuerpo

HPR

TSA

Biotina

Estretavidina

Símbolos

Figura 16-8.

Técnica Detección Sondas Técnicas alternativas

Southern blot DNA Secuencias complementarias (antisentido) de DNA o RNA

PCR, PCR en tiempo real, FISH

Northern blot RNA Secuencias complementarias de DNA o RNA

RT­PCR, RT­PCR en tiempo real

Cuadro 16-1.

Metodología del DNA recombinante154

a fluorocromos o colorantes que se puedan intercalar en el DNA. La unión sonda-DNA no es tan fuerte como la unión antígeno-anticuerpo; como consecuencia, cambios en la concentración de la sonda o la muestra pueden influir en la intensidad de fluorescencia emitida. Una caracterís-tica de las sondas de DNA es que son estequiométricas, lo cual significa que el número de moléculas de sondas unidas al DNA es equivalente al número de moléculas de DNA presente en la solución. Dependiendo de las propiedades de la sonda, ésta podrá requerir o no tratamientos para su correcto funcionamiento, ya que si la sonda tiene caracte-rísticas liposolubles puede penetrar directamente a la cé-lula; de lo contrario será necesario realizar un proceso de permeabilización celular.

Aplicaciones Dentro de las aplicaciones de esta técnica se encuentra el estudio de ploidías. La ploidía de una célula indica el nú-mero de cromosomas en dicha célula. Se pueden encontrar variaciones dentro de una población individual debido a mutaciones, ciertas enfermedades (incluyendo el cáncer) y apoptosis. Otras aplicaciones, utilizadas en su mayoría en el campo de investigación son la muerte celular, expresión de genes reporteros, así como las etapas del ciclo celular.

Ejercicios de integración

1. Consulte la secuencia del mRNA de NFkB número (NM_001077494.1) del banco de genes (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Según la información allí indicada, responda lo siguiente:

¿En qué posición del mRNA se unen las siguientes sondas?

a) 5′agctctgctggatcggcatggag3′ b) 5′acgcggacccgcgggcgtctaaaatt3′

¿En qué exón se localizan estas secuencias?

¿Cuál es la secuencia complementaria de cada sonda?

Según lo mencionado en este capítulo, ¿cuál técnica de hibridación es la más adecuada para detectar el mRNA?

2. ¿Cuál de los siguientes enunciados es verdadero para la técnica Southern blot?

a) Se extrae RNA celular, separado por electroforesis y transferido a una membrana, se hibrida con una sonda marcada específica para un gen.

b) Se extrae DNA, se digiere con enzimas de restric­ción, los fragmentos generados son marcados con radiactividad, se separan por electroforesis y se transfieren a una membrana, donde hibridan con una sonda marcada específica para un gen.

c) Se utilizan fragmentos de DNA cortados con enzi­mas de restricción, que se separan por electrofo­resis y se transfieren a una membrana, donde se hibridan con una sonda marcada específica para un gen.

3. ¿Cuál frase es correcta para describir la hibridación in situ?

a) La técnica permite localizar un segmento concreto de DNA en una posición determinada de un cromo­soma eucariótico.

b) Si el marcaje es de tipo quimioluminiscente, la téc­nica se denomina FISH.

c) Consiste en detectar determinados mRNA marcados con fluorescencia, utilizando sondas de DNA marca­das procedentes del cromosoma deseado.

4. La siguiente fotografía muestra la hibridación de una sonda en el DNA digerido con enzimas de restricción de los miembros de una familia con alteraciones en el gen de distrofina. ¿Puede identificar cuáles individuos presentan el gen alterado?

1 2 3 4 5 6

5. La siguiente fotografía muestra la hibridación de una sonda en el mRNA del virus del papiloma humano en pacientes con sospecha de presentar la infección. ¿Puede identificar cuáles individuos están infectados?

D

1 2 3 4 5