TAXONOMÍA MOLECULAR

Dra. Alicia Luque

CEREMIC

Taxonomía clásica

Carecen de reproducibilidad: los caracteres fenotípicos

pueden variar con las condiciones ambientales.

PLEOMORFISMO

Debido al bajo poder discriminatorio y a la frecuente

incongruencia de los datos morfológicos y fisiológicos el

sistema diagnóstico se hace bastante complicado.

Se han desarrollado un gran número de técnicas

moleculares para la identificación de hongos

filamentosos y levaduras debido a:

Rapidez y grado de simplicidad de las habilidades

requeridas.

Sensibilidad.

Reproductibilidad.

Taxonomía molecular

Caracterización de ácidos nucleicos.

El estudio del DNA de los hongos se complica por el hecho de queestas poseen un genoma complejo, consistente en DNA nuclear(nDNA), DNA mitocondrial (mtDNA) y en algunos casos DNAplasmídico.

restricción del ADN mitocondrial polimorfismos de ADN generados aleatoriamente por PCR (RAPD-PCR) electroforesis de campo pulsante amplificación y restricción del DNA ribosomal secuenciación de genes nucleares y mitocondriales

Taxonomía molecular

Zonas conservadas son útiles para comparar individuos alejados filogenéticamenteZonas variables son útiles para comparar individuos cercanos filogenéticamente

Características del ADN mitocondrialEstructura del ADN mitocondrial: la pobreza en genes del mtDNA estácompensada por la gran complejidad estructural de algunas regionesintergénicas y también por la presencia de intrones (contribuyen en gran

manera a incrementar las diferencias inter- e intraespecíficas existentes en los

genomas mitocondriales)

RESTRICCIÓN DEL ADN MITOCONDRIAL

Restricción del ADN mitocondrialDigestión del mtDNA con endonucleasas de restricción, que nos permitan generar polimorfismos en el tamaño de los fragmentos (RFLP).

Métodos basados en la utilización de la PCR

PCR-RFLP. la amplificación de un fragmento de ADN mediante doscebadores específicos que es sometido posteriormente a digestión con unaendonucleasa generando un número discreto de bandas.

rep-PCR. Este método se basa en la amplificación de secuencias repetitivasque se encuentran repartidas aleatoriamente a lo largo del genoma y cuyasecuencia se encuentra conservada a nivel de muchos miembros de la mismafamilia. Mediante el empleo de cebadores dirigidos a estas secuencias consensose obtienen directamente perfiles que reflejan la diferente disposición de estassecuencias repetitivas a lo largo del genoma.

ribotipado mediante PCR. Esta técnica aprovecha los polimorfismosexistentes en los genes o en las regiones espaciadores intergénicas asociadas alos RNA ribosomales y de transferencia.

POLIMORFISMOS DE DNA GENERADOS ALEATORIAMENTE POR AMPLIFICACIÓN POR PCR (RAPD-PCR)

Utilizando un único cebador de secuencia arbitraria y corta (normalmente de 10-12 pb) y una baja temperatura de

hibridación, que produce polimorfismo entre los patrones del DNA amplificado.

Existen otros dos métodos basados en el mismo principio pero con la diferencia principal en el tamaño del cebador, la AP-PCR (arbitrarily primed PCR)- y DAF (DNA-amplified fingerprinting).

Métodos basados en la utilización de la PCR

La amplificación se lleva a cabocon condiciones poco restrictivaspara favorecer la unión delcebador al ADN molde. Cuandoestas uniones se producen, demanera suficientemente estableentre dos zonas separadas unadistancia susceptible de seramplificada, se obtendrá unproducto de amplificación de undeterminado tamaño.Dependiendo del ADN molde, dela secuencia del cebador que seemplee, así como de lascondiciones de amplificación, elnúmero y el tamaño de losfragmentos obtenidos es variable.

POLIMORFISMOS DE DNA GENERADOS ALEATORIAMENTE POR AMPLIFICACIÓN POR PCR (RAPD-PCR)

Ventajas1.- La mayor ventaja es que no necesitamos ninguna información previa del organismo de que se trata, ya que sirve para cualquier organismo. Tampoco necesitamos conocer la secuencia del DNA que vamos a amplificar.2.- Es una técnica muy sencilla y rápida.3.- Requiere cantidades muy pequeñas de DNA, y tampoco es necesario que la calidad del DNA sea muy buena, aunque esto último afecta a la reproducibilidad.4.- Es un marcador molecular muy bueno, ya que el cambio en un solo nucleotido puede significar la unión o no del cebador, y por tanto la presencia o no de una banda en el producto de amplificación.

Inconvenientes1.- Presenta un gran inconveniente: su reproducibilidad no siempre es la adecuada, siendo los patrones, en muchos casos, dependientes no sólo de las condiciones de amplificación sino de las condiciones del laboratorio donde se realicen. Actualmente es muy empleada, aunque se suele utilizar junto con otras técnicas de tipado más reproducibles para comparar los resultados.

POLIMORFISMOS DE DNA GENERADOS ALEATORIAMENTE POR AMPLIFICACIÓN POR PCR (RAPD-PCR)

AMPLIFICACIÓN Y RESTRICCIÓN DEL ADN RIBOSOMAL

Están presentes en todos los organismos celulares y por tantocomparten un origen evolutivo común. Las comparaciones del rDNA, handemostrado su utilidad para valorar la relación tanto entre organismosalejados como entre organismos próximos.

5.8SITS 1 ITS 218S 26SNT

S

ET

S5SNT

S

IGS ETS IGS

Esquema de los diferentes componentes que constituyen cada unidad de DNA ribosomal.IGS: intergenic spacer; NTS: non-transcribed spacer; 5S: gen del RNA ribosomal 5S; ETS:external transcribed spacer; 18S: gen del RNA ribosomal 18S; ITS1: internal transcribedspacer 1; 5.8S: gen del RNA ribosomal 5.8S; ITS2: internal transcribed spacer 2; 26S:gen del RNA ribosomal 26S.

Amplificación de diferentes zonas del complejo ribosomal por PCRRestricción del producto de amplificación

Ventajas:1.- Técnica universal: utilidad para comparar cualquier levadura u hongo filamentoso, el nivel de resolución dependerá del grupo estudiado y de los enzimas utilizados.2.- PCR - RFLPs rápidos, fáciles y reproducibles. Se pueden crear bases de datos de utilización general.

Inconvenientes:1.- La comparación del tamaño de los RFLPs de la región ITS-5.8S RNA con los patrones de las cepas de referencia, puede ser complicada debido a las escasas diferencias que pueden existir entre los patrones obtenidos para especies próximas (diferencias en pocos pares de bases no son apreciables en una electroforesis). A veces se necesita utilizar alguna otra técnica para confirmar la identificación.

AMPLIFICACIÓN Y RESTRICCIÓN DEL ADN RIBOSOMAL

ELECTROFORESIS EN CAMPO PULSANTE

Caracterización del DNA cromosómico: separación de los cromosomasintactos mediante electroforesis en campo pulsante en gel de agarosa Laelectroforesis en campo pulsante se ideó para separar fragmentos de DNA deelevado tamaño molecular. La alternancia en la dirección del campo eléctricoproducida entre pares de electrodos, hace posible que los cromosomas delevaduras y hongos filamentosos se vayan orientando según cambia la dirección delcampo eléctrico, y se muevan, en función de su tamaño, a diferentes velocidades através de los poros del gel de agarosa.

ELECTROFORESIS EN CAMPO PULSANTE

El análisis de los cariotipos electroforéticos nos permite estimarnúmero y tamaño de los cromosomas al compararlos con losmarcadores de peso molecular.Los polimorfismos en el número y tamaño de los cromosomas soncomunes en hongos filamentosos y levaduras, no solo entre distintasespecies, sino entre cepas de la misma especie

SECUENCIACIÓN DE GENES NUCLEARES Y MITOCONDRIALES

Análisis de secuencias de genes nucleares y mitocondriales

Secuenciación de genes ribosomales nuclearesEl análisis de las secuencias de los genes ribosomales y de susregiones intergénicas ha contribuido a descifrar las relacionesfilogenéticas entre los taxones de levaduras y hongosfilamentosos.

Secuenciación de genes mitocondrialesLos genes mitocondriales de levaduras y hongos filamentosospresentan características que los hacen interesantes para laobtención de reconstrucciones filogenéticas, y en algunos casospodrían resolver cuestiones que con la utilización de genesnucleares han quedado inconclusas.

Secuenciación directa a partir del producto de amplificación por PCR

Además de las regiones de rADN se conocen otros fragmentos del ADN con interés en la identificación:

gen de la Beta-tubulina

gen de la Orotidina descarboxilasa

gen de la Chitina sintetasa

gen de la Actina

gen del Factor de elongación

SECUENCIACIÓN DE GENES NUCLEARES Y MITOCONDRIALES

MÉTODOS BASADOS EN LA UTILIZACIÓN DE LA PCR

PCR y PCR-RFLP usando como blanco el gen de la Quitina Sintetasa I (CHSI)

Dermatofitos

PCR-fingerprinting de 9 especies de

Fusarium Calles: M, marcador; 1-4 F.

oxysporum; 5 F culmorum; 6 F.

tricinctum; 7 F. anthophilum; 8 F.

graminearum; 9 F. graminearum .

21226

50004900

2000

1500

1300

831

947

PCR-fingerprintingFusarium

El empleo de técnicas moleculares en complemento

con métodos fenotípicos, es necesario para los

aislamientos atípicos o dificultosos

Taxonomía molecular

Se puede obtener otra información: relaciones

filogenéticas, estudios epidemiológicos, emplearse como

métodos de referencia para la identificación a nivel de

especie, etc.