Unidad 5. Diversidad del Mundo microbiano

Objetivos

ConocerLos microorganismos más importantes y sus características

Las diferentes aplicaciones de la microbiología

Asimilar-Los microorganismos evolucionan, los mutantes mejor adaptados a un medio son

seleccionados. Frecuentemente esta evolución no supone una alteración de las capacidades de los microorganismos pero permite clasificarlos filogenéticamente

Comprender y discutir-La diversidad microbiana y su cambiante clasificación

UNIDAD V.- Diversidad del Mundo microbianoTema 11.-. Taxonomía bacteriana: Introducción. Concepto de especie. Clasificación fenética y filogenética. Filogenia molecular. Principales grupos evolutivos, el árbol de la vida. Estimación de la diversidad microbiana

Importancia de la taxonomía

Ciencia de la clasificación biológica, se compone de 3 partes separadas pero interrelacionadas

• permite a los científicos organizar una gran cantidad de datos• permite a los científicos hacer predicciones y plantear hipótesis sobre los

organismos• sitúa los organismos en grupos con sentido y útiles, con nombres precisos, de

forma que se facilite la comunicación científica• esencial para la identificación precisa de los organismos

• Sistemática: estudio de los organismos cuyo objetivo final es caracterizarlos y ordenarlos siguiendo unas pautas.

• clasificación – ordenación de los organismos en grupos o taxones (taxa)

• nomenclatura – asignación de nombres a grupos taxonómicos

• identificación – determinación del taxón al que pertenece la muestra aislada

Introducción Taxonomía

Un ejemplo de rangos taxonómicos y sus nombres

Rango Ejemplo

Los organismos se agrupan en rangos taxonómicos. Cada rango constituye un grupo que puede subdividirse en uno o más grupos no solapados que constituyen otro nuevo rango

Introducción

• los nombre de todos los rangos taxonómicos se escriben en cursiva (o subrayados si se escriben a mano)

• los microbiólogos emplean frecuentemente nombres informales

– ej. bacterias púrpuras, espiroquetas, bacterias oxidantes de metano

Definición de especie procariota

• no se puede usar una definición basada en la posibilidad de cruzarse ya que los procariotas son asexuales

• dos definiciones frecuentes …y ambiguas– colección de cepas que comparten numerosas propiedades estables y

difieren significativamente de otros grupos de cepas (¿numerosas???)– colección de cepas con una composición en G + C (% de guanina + citosina)

similar y una similitud en su secuencia 70% (¿Qué secuencia?)

Género– grupo bien definido de una o más especies que está bien separado de otros géneros

concepto de especie

Cepas o variedades (Ing. Strains)• Una población de organismos que se distingue de otras entre un taxón

• Descienden de un solo organismo o cultivo puro aislado

• unas cepas pueden variar de otras por numerosas características

– biovariedad – se diferencia por propiedades bioquímicas y fisiológicas

– morfovariedad – se diferencia por la forma

– serovariedad – se diferencia por las propiedades antigénicas

– ecovariedad – se diferencia por el ecosistema en el que se encuentra

Especie tipo (Ing. Type strain) – frecuentemente la primera cepa estudiada de una especie y, en general, la mejor estudiada. No necesariamente es el miembro más representativo

Diversidad genética de Escherichia coli:….. Son de la mis especie

concepto de especie

Nomenclatura: Sistema binomial• cada organismo se describe con dos nombres

– nombre genérico – en cursiva y mayúscula (ej., Escherichia)– epíteto específico – en cursiva y minúscula (ej., coli)

clasificación fenética y filogenética

Sistemas de clasificación

• clasificación natural*– organiza los organismos en grupos cuyo miembros comparten numerosas

características– es el mejor sistema ya que refleja la naturaleza biológica de los organismos

• dos métodos principales para construir esta clasificación natural– fenéticamente (clasificación fenética)

• los organismos se agrupan juntos según las semejanzas de sus características fenotípicas

– Filogenéticamente (clasificación filogenética)• los organismos se agrupan según sus probables relaciones evolutivas

• frecuentemente estos dos métodos son coincidentes ya que la evolución da como resultado organismos similares

* otros sistemas de clasificación como los numéricos solo se emplean cuando apenas se conocen las características del organismo o como denominación provisional Ej. Synechococcus PCC 7942

Matriz de similitudse ordenan y agrupan para formar grupos (clusters)

• dendograma – diagrama en forma de árbol que se emplea para mostrar los resultados

dendograma

• Fenón – grupo de organismos con la mayor similitud

– Fenón con > 80% similitud = Especies bacterianas

Clasificación Fenética

clasificación fenética y filogenética

Clasificación filogenética• también llamado sistema de clasificación filética• filogenia

– desarrollo evolutivo de las especies• Evolución: cambio en las características genéticas de una población

• frecuentemente se basa en la comparación directa del material genético y sus productos genéticos

Características principales empleadas en taxonomía

• Dos tipos principales

– características clásicas

– características moleculares

Características clásicas• morfológicas• fisiológicas y metabólicas• ecológicas• análisis genético: Presencia o ausencia de

genes

Características moleculares

• comparación de proteínas

• composición en bases de ácidos nucleicos % G+C

• hibridación de ácidos nucleicos

• secuencias de ácidos nucleicos

clasificación fenética y filogenética

Hay un antes y un después de la implantación de la biología molecular

Antes de la biología molecular se comparaban características morfológicas

Esto sigue siendo útil para macroorganismos (pinzones, por ejemplo).........

clasificación fenética y filogenética

pero no con las bacterias...

Bacillus anthracis Bacillus japonicum

El estudio de las características moleculares (basada en secuencias de ácidos nucleicos y proteínas) frente a las morfológicas y/o bioquímicas tienen numerosas ventajes

• Estrictamente heredable e inambiguos• Hay modelos de evolución accesibles al análisis matemático• Más fácil de valorar homogéneamente (solo se comparan 4 nucleótidos y

20 amino ácidos)• Puede comparar distancias evolutivas• Muy abundante, las muestras de ADN son fáciles de preparar y secuenciar

clasificación fenética y filogenética

• las secuencias de ácidos nucleicos y proteínas pueden compararse alineándolas

• estas comparaciones se representan adecuadamente en árboles filogenéticos• identifica cronómetros moleculares y/o otras características que se emplean en

la comparación de organismos• los árboles filogenéticos representan las relaciones evolutivas

– árbol enraizado – tiene un nodo que representa el ancestro común– en el árbol sin raíz se desconoce el ancestro común

Estimación de la filogenia* microbiana

*Filogenia: Relaciones evolutivas entre organismos basadas en un ancestro común

El empleo de las características moleculares se basa en la premisa de organismos que tienen genes similares muestran la misma similitud a nivel fisiológico

La clasificación natural filogenética de bacteria, arqueas y eucariotas se basa en la secuencia de nucleótidos de un componente de los ribosomas común a todos los seres vivos

Los caracteres morfológicos y fisiológicos de las bacterias, estudiados en la microbiología clásica, son reconsiderados a la luz de la evolución ………..pero no sin dificultades

Descriptores del Árbol filogenético• Raíz: nudo ancestral de todos los

elementos del árbol

• Nudo: punto en el que confluyen dos o más ramas. Representa los acontecimientos evolutivos correspondientes a las divergencias desde un hipotético ancestro

• Clade: el nudo y todo lo que surge de él

• Linajes o ramas: líneas entre dos nudos (Rama interna) o entre un nudo y una hoja ,ó extremo (Rama externa)

• La longitud horizontal de la rama es proporcional a la distancia evolutiva entre las secuencias y sus ancestros (unidad = sustituciones / sitio)

• Topología del árbol: distribución y agrupamiento de las ramas en el árbol = orden de las ramas entre los nodos

Homo

Bos

Mus

Rattus0.011

0.025

0.012

0.011

Gallus

0.038

0.066

0.01

Raiz

Nudo

HojaOTU: Unidad Taxonómica operativa

Rama interna

Rama externa

Distancia evolutiva

Clade

filogenia molecular

• Necesitamos secuencias para comparar– Obtenidas experimentalmente– Obtenidas de bases de datos

• por consulta directa• mediante búsqueda de secuencias homólogas

• Necesitamos alinear “comparar” las secuencias– Para esto hay muchos programas en internet Ej. ClustalW

• http://www.ebi.ac.uk/clustalw/

• Necesitamos aplicar un modelo evolutivo para reconstruir el pasado de estas secuencias

• Necesitamos representar los resultados en forma de árbol

¿Qué necesitamos para construir un árbol filogenético?

filogenia molecular

• La secuencia de ADN se obtiene*:– se toma una muestra (un cultivo puro, una muestra de lodo, agua, etc)– se extrae el ADN: hay cientos de kits en el mercado. También se puede

extraer con materiales domésticos– se seleccionan los oligonucleótidos para la amplificación por PCR

• obtenidas de artículos• obtenidas de bases de datos i.e. RDB

– se amplifica por PCR– se envía a secuenciar

• Si la muestra corresponde a un cultivo puro se realiza una secuencia• Sí la muestra contiene muchas bacterias distintas se secuencias muchas

– La empresa manda la secuencia de ADN por correo electrónico• Las secuencias de ARN se obtienen de la traducción conceptual de

secuencias de ADN• Las secuencias de proteínas se obtienen de la traducción conceptual

de secuencias de ADN tras la eliminación de los intrones, si los hubiese• Podemos tener las secuencias de genes de organismos que nunca han

sido cultivados

¿Cómo se obtiene experimentalmente una secuencia de ADN, ARN y proteína?

* También se puede obtener una secuencia de proteína a partir de la secuencia de ADN obtenida por transcripción inversa de una molécula de mRNA

filogenia molecular

Relojes moleculares• los ácidos nucleicos o proteínas pueden emplearse como relojes para medir la cantidad de cambio

evolutivo a lo largo del tiempo• el fundamento es el siguiente

– las secuencias cambian gradualmente a lo largo del tiempo– los cambios son selectivamente neutros y ocurren al azar– para un mismo gen o producto génico, la cantidad de cambios aumentan proporcionalmente con el tiempo

• La secuencia 16S del rRNA muestra una velocidad evolutiva de 1% de divergencia de secuencias por cada 50 millones de años

filogenia molecular

La filogenia molecular ha cambiado nuestra visión de la evolución de las especies

hasta hace poco se creía que...

Las bacterias y otros microorganismos eran “fósiles vivientes” en el curso de la evolución

“Primitivos” microbios como “lineas evolutivas sin salida”

Principales grupos evolutivos, el árbol de la vida

Monera

Protista

PlantaeFungi

Animalia

Como resultado se describen los 5 reinos

Principales grupos evolutivos, el árbol de la vida

Actualmente se piensa que todos los organismos han evolucionado y continúan evolucionando en el tiempo a lo largo de líneas divergentes

Principales grupos evolutivos, el árbol de la vida

La filogenia molecular microbiana modifica el concepto de especie y lo refiere al % de identidad entre secuencias de rRNA

La filogenia molecular está cambiado el concepto de especie

Principales grupos evolutivos, el árbol de la vida

Principales grupos evolutivos, el árbol de la vida

El estudio se las relaciones evolutivas entre los seres vivos da como resultado lo que se denomina -el árbol de la vida- “The Tree of Life”:

•El árbol se elabora frecuentemente con secuencias de rRNA

•la distancia evolutiva en el árbol significa la cantidad y el orden de cambios de las secuencias pero....NO el tiempo desde el que aparecieron ya que:

1. se desconoce la raíz del árbol de la vida

2. la acumulación de mutaciones en los organismos no es idéntica en todos ellos

El árbol de la vida permite la confirmación de la teoría de la endosimbiosis

obsérvese que el organismo con la secuencia rRNA más próxima:

• a la de cloroplastos es una cianobacteria (Synechococcus)

•a la de mitocondrias es una proteobacteria (Agrobacterium)

Orgánulos

Principales grupos evolutivos, el árbol de la vida

• actualmente se sostiene que hay 3 dominios entre los seres vivos (Bacteria, Archaea, Eucarya). Esto se basa en el análisis del rRNA

Principales grupos evolutivos, el árbol de la vida

Manual Bergey’s de sistemática bactereológica• descripción detallada de todas las especies procariotas actualmente identificadas• El Manual está constantemente actualizándose

Visión general (y rápida) de la diversidad

Archaea

Cuatro phylaocho clases12 órdenes

metanógenas

halobacteria

Korarchaeota Nanoarchaeota

Principales grupos evolutivos, el árbol de la vida

Bacteria

• metabólicamente y morfológicamente diversas

• divididos en 23 phyla

Principales grupos evolutivos, el árbol de la vida

¿Es muy frondoso el árbol de la vida? o lo que es lo mismo cuál es su diversidad

¿Cómo es la punta del árbol?

Dos preguntas

Principales grupos evolutivos, el árbol de la vida

La punta de un iceberg?

Principales grupos evolutivos, el árbol de la vida

Diversidad genética de Escherichia coli:

Principales grupos evolutivos, el árbol de la vida

¿Es significativa la microheterogeneidad?

Principales grupos evolutivos, el árbol de la vida

Por lo expuesto anteriormente parece que no hay ningún problema a la hora de estimar la diversidad microbiana

• Nada más lejos... el problema es que.....– los microorganismos se estudian principalmente

desde una perspectiva antropocéntrica• en general la mayoría de los microorganismos son

desconocidos salvo aquellos implicados en patologías• se presta poca atención a los estudios de

biodiversidad microbiana, por ejemplo– Se conocen más de 500,000 especies de insectos...– y menos de 5,000 “especies” de procariotas

“Si diseccionasemos cualquiera de estos insectos encontraríamos en su interior cientos, incluso miles de especies distintas de microorganismos”

N. Pace ‘97

Diversidad del mundo microbiano

¿Por qué se tiene una perspectiva tan limitada?• Por el pequeño tamaño de los procariotas• Por su limitada diversidad morfológica• La caracterización bioquímica requiere cultivos puros (no siempre

posibles) y el número de reacciones bioquímicas y respuestas fisiológicas estudiadas son limitadas

Pero.... todo esto cambió con:

1. la introducción de herramientas moleculares en el estudio de la diversidad microbiana

2. el desarrollo de algoritmos que permitan la comparación de secuencias de ADN y proteínas (bioinformática)

• Ahora podemos establecer las relaciones filogenéticas de todos los seres vivos

• Ahora podemos estimar la biodiversidad microbiana

Diversidad del mundo microbiano

La mayor diversidad reside en el mundo microbiano

Si podemos estudiar la biodiversidad podemos contestar a las siguientes preguntas

¿Cuántos organismos diferentes hay?

¿Qué grado de similitud nos permite decir que son los mismos o diferentes?

¿Cómo están relacionados entre ellos?

Su respuesta nos permite caracterizar los ecosistemas microbianos

Diversidad del mundo microbiano

52 Phyla

desde 1987 (26) no cultivables

pre-1987 (12)

Rappé and Giovannoni (2003) The uncultured microbial majority.Annu Rev Microbiol, 57: 369-394 ,

desde 1987 (14 más, cultivadas)

Bacteria, 2003

Diversidad del mundo microbiano

La mayor diversidad se encuentra en organismos no cultivables

1.045 billion base pairs

1.2 million new genes

1.800 species

148 new phyla

Ej. Sargasso Sea:

Venter JC et al. 2004 Environmental genome shotgun sequencing of the Sargasso Sea. Science. 2004 304(5667):66-74.

Diversidad del mundo microbiano

El número de phyla no para de crecer a medida que se desarrolla la metagenómica

La filogenia molecular microbiana modifica el concepto de especie y lo refiere al % de identidad entre secuencias de rRNA

La filogenia molecular está cambiado el concepto de especie

Estimación de la diversidad microbiana