Universidad Autónoma Metropolitana

Unidad Iztapalapa

División de Ciencias Biológicas y de la Salud

Licenciatura en Hidrobiología

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIBIÓTICA DE ALGUNOS

EXTRACTOS ALGALES

Alumna: María Antonieta Rosas Ramírez

Asesor: Dra. Graciela De Lara Isassi

Lug2r y fecha de realización del trabajo: Laboratorio de ficología Aplicada AS-202

Junio de 2003 enero de 2004

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIBIÓTICA DE ALGUNOS

EXTRACTOS ALGALES

INTRODUCCIÓN

Las algas marinas producen una gran cantidad de compuestos que tienen un potencia

importante en la fabricación de diversos fármacos con propiedades antibióticas,

anticoagulantes, aglutinantes, antifúngicas, citotóxicas, antitumorales, entre otras. (De Lara-

lsassi y Álvarez Hernández, 1994). Algunas algas se han usado en medicina tradicional

para combatir diferentes padecimientos como males cardiacos, parasitosis, enfermedades

fúngicas, fiebre, sarna, diabetes, etc. (Martínez, 1991), y su utilización se ha continuado en

poblaciones de Asia, Europa y América del Sur.

Un gran número de investigadores a nivel mundial se han dedicado a investigar sobre la

presencia de metabolitos secundarios biológicamente activos de las macroalgas para así dar

una posible aplicación farmacológica. (Martínez, 1991).

El primer reporte que se tiene acerca de las propiedades antibióticas de las algas fue hecho

por Shirahaina en 1942, citado por Pratt et al. (1951), el cual aisló una sustancia de

Cystophyllum hakodatense que tuvo efectos inhibitorios del crecimiento de Lactobacillus

vulgaricus y L. helveticus. Pratt et al. (1951) encontraron que algunos extractos de algas

marinas solubles en éter inhibieron el crecimiento de Staphylococcus aureus, Escherichia

coli y Pseudomonas aeruginosa. Vacca y Walsh (1954), aislaron de Ascophyllum nodossum un

fenol con principio activo. De los extractos de rodófltas hechos por Chester y Scott, en 1956,

varios probaron tener efectos inhibidores.

Estos estudios son muy poco conocidos o han recibido poca atención, ya que la mayoría de

la investigación ficológica se han enfocado primordialmente en la taxonomía y de

distribución, por lo cual es de gran utilidad realizar este tipo de investigaciones para

enriquecer y aumentar el conocimiento, de los recursos algales marinos en nuestro país.

En la actualidad los estudios sobre la utilización de los recursos marinos, están abriendo

nuevas perspectivas en el campo de la hidrobiología. Las diferentes formas de vida marina

especialmente las algas se consideran como fuentes potenciales de agentes farmacológicos,

pues producen una gran variedad de sustancias con propiedades que pueden inhibir el

crecimiento de agentes patógenos. La presencia de estas sustancia pudieran explicarse,

debido a la necesidad por sobrevivir y así, aumentar su competitividad por el espacio en el

medio marino, dando lugar a sustancias con propiedades tóxicas, antimicrobianas o con

alguna otra actividad biológica (Lozano. 1988-, De Lara, 1991. Pesando- 1990). El estudio

de las algas a pesar de su gran diversidad y abundancia, han recibido poca atención en este

aspecto. En comparación con los más de 1,100 productos quimioterapéuticos obtenido de

organismos terrestres; los obtenidos de organismos marinos que tienen una amplia

distribución no pasan de una docena (Lozano, 1988).

La actividad antibiótica en algas marinas, no es la única razón por la que se les estudia,

precisamente estas sustancias son causa de interés farrnacológico hoy en día, ya que la

aparición de cepas bacterianas resistentes a los antibióticos convencionales, conjuntamente

al surgimiento de las enfermedades totalmente nuevas, refuerzan la necesidad de iniciar

estudios en la búsqueda de encontrar nuevas sustancias antimicrobianas o con alguna otra

actividad biológica que después de ser detectados, aislados e identificados permitan

complementar o sustituir los fárinacos ortodoxos (Lozano,1988).

La identificación de las propiedades antibióticas de las rnacroalgas se realiza de forma

sencilla a través de extractos. Estas pruebas simples permiten detectar especies útiles

como fuente alternativa de sustancias antimicrobianas, capaces de combatir la resistencia

de las bacterias a los antibióticos comerciales.

La antibiosis se ha interpretado como un factor ecológico que desempeña un papel

importante en el mantenimiento de un equilibrio ínterespecífico en el ambiente marino por

medio de la liberación de metabolitos que poseen la habilidad de inhibir a otros organismos

(Cruz, 1992).

La salud humana ha sido un punto muy importante para las investigaciones científicas y es

de gran importancia fomentar y intensificar las investigaciones en el área ficológica, la

cual ha hecho un gran trabajo donde se ha enfocado a obtener diversos compuestos tales

como antibacterianos (Rao y Parekh, 1981), antifúngicos (Moreau et al., 1984, 1988),

antivirales (Caccamese et al., 1980, Caccamese et al., 1981), antitumorales (Hodgson,

1984), anticoagulantes (Deacon et al., 1989), hemaglutininas (Fabregas et al., 1985),

lectinas (Sampaiao et al., 1998) y pigmentos (Aguilera et al., 2002) entre otros.

OBJETIVOS

Objetivo general:

> Determinar la presencia de sustancias con actividad antibacteriana en macroalgas colectadas en el

estado de Veracruz.

Objetivos particulares:

> Aprender las técnicas específicas para la recolección y preservación de algas.

> Identificación de las especies algales colectadas, a nivel de especie.

> Realizar técnicas para hacer extractos crudos.

> Realizar técnicas microbiológicas para el cultivo, siembra y mantenimiento de cepas bacterianas.

> Determinar el efecto antibiótico de los extractos algales.

> Establecer el grado de actividad antibacteriana de los diferentes extractos algales.

ÁREA DE ESTUDIO

El estado de Veracruz representa el 3.7% de la superficie del país. Se encuentra localizado en los

19° 20' latitud norte y los 96° 40' longitud oeste, con una altitud de 10 msnm. Veracruz colinda al

norte con Tamaulipas y el Golfo de México; al este con el Golfo de México, Tabasco y Chiapas; al

sur con Chiapas y Oaxaca; al oeste con Puebla, Hidalgo y San Luis Potosí.

La hidrografla de la zona ha sido analizada por Turner (1963), De la Lanza (1965) y Vega y Arenas

(1965), entre otros. Las masas de agua presentes pueden clasificarse en tres tipos: aguas oceánicas,

aguas costeras y aguas de mezcla. Las altas salinidades son aportadas por las aguas oceánicas con

valores de hasta 36ups, en superficie hasta 36.7ups a 20 m de profundidad, y por valores inferiores a

36ups propios de las aguas costeras que reciben aportes fluviales. A pesar de la desembocadura de

ríos importantes como el Jamapa y Papaloapan, no se ha observado variaciones significativas en la

salinidad de las áreas oceánicas.

Figura 1. Localidades de recolecta, La Mancha, Veracruz

La Mancha

La Mancha está localizada en el litoral del Golfo de México, se ubica entre los 19°34' y 19°36' de

latitud norte y 96°22' y 96°24' de longitud oeste. Situada al norte del puerto de Veracruz en el

municipio de Actopan, en el kilómetro 25 de la carretera José Cardel-Nautla (Contreras, 1993).

(Fig. 1)

La vegetación circundante es predominantemente agregada a selva baja subperennifolia, selva baja

caducifolia, vegetación de dunas costeras, selva baja perennifolia inundable, tular, ceibadal y

asociaciones de algas marinas macroscópicas epilíticas.

Playa Costa de Oro

Esta localidad se encuentra en el Puerto de Veracruz, en el municipio de Boca del Río, enfrente del

Hotel Mocambo. (Fig. l). La longitud de la localidad es de 100 metros y el ancho de 40 metros

aproximadamente.

Los datos climáticos del Centro de Prevención de Desastres del Golfo en Veracruz, Ver., consideran

el clima de la Mancha y Costa de Oro (Lot-Helgueras, 1971) como cálido, subhúmedo con lluvias

en verano que corresponden al tipo Aw (w)( i ) con una temperatura promedio anual de 25.7° C,

máxima de 29° C y una mínima de 22° C. El promedio de precipitación es de 1 100 a 1200 mm.

El esquema climático del área de Veracruz puede sintetizarse en dos épocas del año.

1. Época de nortes que abarca de septiembre hasta abril, con escasas precipitaciones con

temperatura baja y frecuentes invasiones de aire frío del norte, por cuya fuerza pueden ser,

desde vientos frescos hasta violentos y huracanados.

2. Época de lluvias, de mayo a agosto, que es un periodo cálido, caracterizado por

temperatura elevada, alta precipitación entre junio y agosto y vientos débiles del este que

soplan más menos permanentemente (Lot-Helgueras, 1971).

METODOLOGÍA

Las especies algales usadas en este estudio, fueron recolectadas en los meses de julio y

octubre del año 2000 y en los meses de abril y octubre del año 2001. En la Mancha y Costa

de Oro, el estado de Veracruz.

Considerando que las macroalgas marinas crecen adheridas a un sustrato sólido, se toma en

cuenta que las localidades de recolecta presentaron rocas de origen biogénico para la

Mancha y en el caso de Costa de Oro de origen sedimentarlo en las que puedan situarse las

algas. Destaca que el Golfo de México tiene pocas localidades rocosas. En el Caribe los

organismos poseen adaptaciones para fijarse en la arena gruesa, además de contar con una

gran zona arrecifal donde vive una alta diversidad de algas (Pedroche et al, 1993).

La necesidad del proyecto hizo que se efectuaran dos recolectas por año, considerando la

época de estiaje y la época de lluvias (De Lara- Isassi et al., 1989), teniendo en cuenta que

no siempre se encuentran las especies con la misma frecuencia como respuesta a un ciclo

anual de crecimiento y reproducción.

Las algas que crecen en la zona intermareal rocosa se recolectan manualmente, en

ocasiones se necesita de la ayuda de un cuchillo y espátula para poder arrancar desde la

base del alga (Pedroche et al., 1993), una vez tomada la muestra, se registraron en una

bitácora de trabajo los parámetros fisicoquímicos como salinidad y temperatura, las

muestras se separaron por géneros y/o especies colocándose en bolsas de plásticos

etiquetadas con los siguientes datos: localidad, fecha y un número asignado para poder ser

identificada la localidad de recolecta. Inmediatamente después de arrancar el alga se

escurre el material para quitar el exceso de agua; las bolsas se colocan en recipientes con

hielo seco aproximadamente a -20 °C, el material se congela para evitar su descomposición

y pérdida de las propiedades de los metabolitos, de esta forma son trasladadas al laboratorio

(Padmini et al., 1986).

Limpieza de material alga

En el laboratorio el material algas se descongela a temperatura ambiente y se limpia bajo el

microscopio de disección de epífitas, arena, organisamos y residuos que contengan las algas, se

enjuagan con agua corriente y el último enjuague se realiza con agua destilada, terminada esta tarea

las algas se vuelven a etiquetar y posteriormente se realizan las pruebas de actividad biológica.

Una parte de la muestra se fija con formol al 4% glicerinado y se guarda como material de

referencia.

Preparación de extractos

Para la realización de las pruebas antibióticas se preparan para cada especie tres tipos de extractos

uno acetónico, uno etanólico y otro acuoso. Para la obtención de cada uno de los extractos se

mezclan 30 gr de alga (peso húmedo) con 150 ml de solvente (acetona, alcohol o agua), y se tritura

en un mortero o en un mixer Waring con ciclos de 1 minuto obteniendo el extracto, posteriormente

se centrífuga a 3400 rpm durante un lapso de 20 minutos. Inmediatamente el sobrenadante se

deposita en una caja de Petri esterilizada donde se dejará evaporar a sequedad a temperatura

ambiente.

Los cristales obtenidos a temperatura ambiente se resuspenden en 4.5 ml del solvente, alcohol,

acetona o agua según el caso, (Sreenivasa y Parekh, 1981). El extracto recolectado se vacía en tubos

de Eppendorf de 1.5 ml estériles y etiquetados; los extractos pueden guardarse a -20°C y utilizarse a

la brevedad posible

Bioensayos de Actividad Biológica

Para probar la actividad biológica de los extractos, se usaron discos de papel filtro

Whatman No. 42 con un diárnetro de 6 mm esterilizados, los cuales se cargaron del

extracto algal en condiciones asépticas con ayuda de una micropipeta de 100 a 250ul.. Se

depositó en los filtros un volumen de 100ul de extracto algal poco a poco para que se

absorbiera, y posteriormente se dejaron secar (Duff, 1966). Cuando los filtros estuvieron

totalmente secos estos pueden mantenerse en refrigeración (- 20 °C) para su pronta

utilización.

Los bioensayos se hicieron en cajas de Petri desecharles de 100 X 15 mm a las que se le

agregaron aproximadamente 15 ml de medio (agar-soya tripticaseína) posteriormente se

inoculó la bacteria en el medio nutritivo (Chabbert,1963) en condiciones estériles en una

campana de flujo larninar y teniendo cuidado de no contaminar el equipo de trabajo. Todos

los extractos algales fueron probados en contra de seis cepas puras de bacterias (Tabla l).

Tabla 1. Cepas puras bacterianas usadas en los bioensayos.

Las pruebas se realizaron por triplicado en cajas de Petri sobre el medio nutritivo ya

solidificado, se colocaron tres filtros con el extracto, mas un filtro cargado con el solvente

de extracción como testigo.

Las cajas fueron incubadas a 37°C y se examinaron a las 24, 36 y 48 horas; midiendo los

halos de inhibición en mm, en aquellas que presentaron la actividad biológica (Chabbert,

1963). En ocasiones es necesario mantenerlas en un lapso de tiempo mayor, porque se ha

observado que pueden presentar resultados posteriores.

Mantenimiento de cepas puras.

Las cepas de microorganismos generalmente utilizados para análisis microbiológicos se

cultivan en medios artificiales. Un medio de cultivo generalmente se considera como un

sustrato que favorece el crecimiento de los organismos, por lo cual debe reunir las

características apropiadas, para el tipo de organismo de que se trate. Sin embargo, algunos

factores son comunes a cualquier tipo de medio de cultivo.

Los medios de cultivo preparados, listos para el uso tienen sólo un tiempo de conservación.

Cuando no se indique otra cosa, pueden contarse con un período de viabilidad de varios

meses, bajo condiciones adecuadas de conservación (Merck, 1982).

Para la elaboración de los medios de cultivo, así como cualquier material que éste en

contacto con las bacterias, tendrá que ser esterilizado como medida de precaución para

evitar su contaminación. El autoclave es el medio eficaz de esterilización para los medios

de cultivo, así como el material que se empleará para la siembra y mantenimiento de las

cepas bacterianas.

Una vez que se tiene la cepa pura de la bacteria con la cual se va a trabajar, y durante el

desarrollo de las pruebas se realizará réplicas con la finalidad de crear nuevos cultivos de

trabajo y así no utilizar las originales; se utilizan matraces Erlenmeyer de 150 ml con caldo

nutritivo para sembrar la bacteria, que se manejarán durante las pruebas antibióticas. Las

resiembras de las bacterias serán incubadas a 37°C, habitualmente se reconoce la presencia

de crecimiento bacteriano por el desarrollo de colonias sobre el medio sólido o de turbidez

en medio líquido. El tiempo necesario para que se produzca un crecimiento visible es una

variable importante, por que la mayoría de las bacterias sólo necesitan algunas horas para

producir un crecimiento visible.

Se hace una resiembra de las cepas bacterianas cada 30 días para evitar la contaminación de

las mismas, es necesario tener condiciones estériles ya que las bacterias son muy

susceptibles a cualquier tipo de contaminación ambiental.

ACTIVIDADES REALIZADAS

> Búsqueda bibliográfica

> Separación de muestras

> Limpieza de muestras

> Preparación de extractos

> Pruebas para la detección de actividad biológica

> Mantenimiento de cepas bacterianas

Análisis de resultados

> Elaboración de infonne final

OBJETIVOS Y METAS ALCANZADAS

El objetivo general fue alcanzado con éxito, a través de las pruebas especificas y se logró

comprobar la actividad antibacteriana de algunos extractos de macroalgas marinas del

estado de Veracruz.

Se realizaron las técnicas especificas para la recolección, así como su preservación

cubriéndose el primer objetivo.

Se cumplió el segundo objetivo ya que todas las muestras se identificaron a nivel de

especie, con ayuda del Laboratorio de Macroalgas Marinas del Departamento de

Hidrobiología. UAM-1

El tercer objetivo planteado se cumplió ya que se elaboraron los correspondientes extractos

para cada una de las muestras sin ninguna dificultad.

Se llevaron a cabo las técnicas microbiológicas para el estudio de la actividad

antimicrobiana, como también la conservación de las cepas bacterianas, la siembra y

cultivo de las cepas cubriendo exitosamente el objetivo cuatro.

Se realizaron las pruebas específicas para determinar el efecto antibiótico de los extractos

algales, cumpliendo así con el quinto objetivo. La actividad antibacteriana quedo

claramente demostrada mediante los halos de inhibición , comprobando que el efecto de la

inhibición no permite el crecimiento de las colonias bacterianas y esto se debe a las

sustancias que contiene el extracto. Así mismo se comprobó si existe una relación entre la

temporada de recolecta (secas y lluvias) de las muestras, con el efecto de la actividad

antibiótica.

RESULTADOS

De un total de 52 especies colectadas durante los años 2000 y 2001, 12 especies

corresponden a la División Chlorophyta, 8 especies a la División Phaeophyta

y 32 especies a la División Rhodophyta.

Se llevaron a cabo las pruebas antibióticas con los extractos algales de la localidad la

Mancha y Costa de Oro de los ejemplares colectados en julio y octubre del año 2000, las

muestras procesadas fueron 22 especies, 5 especies de la División de Chlorophyta, 4

especies de la División Phaeophyta y 13 especies de la División Rhodophyta.

La Tabla 2 muestra la actividad antibiótica de los extractos algales acetónicos, etanólicos y

acuosos. Se observó que los extractos de Caulerpa racemosa, Cymopolia barbeta, Ulva

lactuca, Dictyopteris delicatula, Padina boergesenii, Amasia multifida, Digenea simplex,

Gracilaria caudata, Gracilaria cervicornis, Grateloupia filicina, Laurencia poitei y

Prionitis ptetocladina presentaron una respuesta antibiótico en contra de Staphylococeus

aureus, Bacillus subtilis y/o Mierococeus luteus. Solo cinco especies produjeron halos de

inhibición de moderada actividad antibiótica, con un diámetro de 11 a 12 mm (Tabla 2). En

las seis especies algales restantes se presentaron halos de inhibición de menor diámetro de 7

a 9 mm. Los extractos acuosos fueron los que presentaron menor actividad en contra de

alguna cepa bacteriana, siendo solo Ulva lactuca, Amasia multifida y Gracilaria

cervicornis las que produjeron una respuesta en contra de las bacterias S. aureus y B.

subtilis. El extracto acuoso de G. cervicornis produjó un halo de inhibición de 11 mm. en

contra de B. subtilis.

En las pruebas efectuadas se observó que sólo Cymopolia barbeta mostró tener mayor

actividad que las demás especies, además de ser notable la respuesta antibiótico con los

extractos acetónicos y etanólicos en contra de tres de las seis cepas bacterianas; también se

observó un halo de inhibición mayor a 13 mm de diámetro contra Bacillus subtilis con el

extracto acetónico.

Las especies Caulerpa racemosa y Dictyopteris delicatula fueron las que podujeron el

mayor halo de inhibición con 12 mm de diámetro en extracto etanólico, Caulerpa racemosa

contra de Staphylococcus aureus y D. delicatula contra B.subtilis (Tabla 2).

No se reportan resultados con las cepas bacterianas (grain - ), Escherichia col¡,

Pseudomonas aeruginosa y Enterobacter aerogenes, debido a que ninguna fue sensible a la

acción de los extractos algales.

De las muestra álgales recolectadas en el mes de octubre del 2000, Cymopolia barbata una

vez más fue la que produjo mayor respuesta antibiótica inhibiendo el crecimiento de

Staphylococcus aureus en extracto acetónico y etanólico y con el extracto etanólico a

Micrococcus luteus, esto es interesante ya que no varió la actividad antibiótico de los

extractos obtenidos de esta especie de las muestras recolectadas en el mismo año.

Los extractos acetónicos y etanólicos de Gracilaria caudata inhibieron tres de las seis

cepas bacterianas las cuales fueron: S. aureus, B. subtilis y Micrococcus luteus, además de

registrarse el mayor halo de inhibición con 13 mm de diámetro en el extracto acetónico en

está alga contra B. subtilis; de igual manera se observó que Caulerpa sertularioides,

Cladophora prolifera y Gracilaria cervicornis presentaron una moderada actividad

antibiótica con unos halos de inhibición de 8 a 1 1 mm de diámetro contra las cepas

bacterianas S. aureus, B. subtilis y M. luteus.

De las muestras colectadas en Costa de Oro Gracilaria cervicornis fue la única que

presentó actividad, y su actividad fue alta ya que inhibió a tres de seis cepas bacterianas: S.

aureus, B. subtilis, con extractos acetónicos y etanólicos; para el caso de M. luteus solo

presentó actividad con extracto acetónico.

Los extractos acuosos no presentaron actividad en contra de las cepas bacterianas

Escherichia col¡, Pseudomonas aeruginosa y Enterobacter aerogenes.

Con las 20 muestras colectadas en los meses de abril y octubre del 2001 en la Mancha y

Costa de Oro; se hicieron los extractos y las pruebas de actividad biologica, las muestras

procesadas fueron 5 especies de la División de Chlorophyta, 4 especies de la División

Phaeophyta y 11 de la División Rhodophyta.

Se detectaron tres especies activas colectadas en la Mancha: Colpomenia sinuosa que

presentó un halo de inhibición contra B. subtilis en extracto acetónico y etanólico;

Cymopolia barbata y Gracilaria cervicornis que produjeron halos de inhibición contra S.

aureus con extracto acetónico y etanólico. El extracto de Gracilaria cervicornis produjó un

halo de inhibición de 16 mm de diámetro contra S. aureus en extracto acetónico. (Fig.2)

La única especie que presentó actividad antibiótica en su extracto acuosos fue: Laurencia

obtusa contra Micrococcus luteus y contra Enterobacter aerogenes. (Tabla 4)

Figura 2. Fotografía de halo de inhibición de 16 mm. Gracilaria cervicornis

Para el caso de las muestras colectadas en Costa de Oro, Cymopolia barbeta presentó una

gran actividad antibiótica ya que inhibió el crecimiento de S. aureus, con los tres extractos:

acetónico, etanólico y acuoso, también el extracto acuoso produjo un halo de inhibición

contra Pseudornonas aeruginosa.

Se observó que Acanthophora spicifera, Gracilaria caudata y Galaxaura obtusa inhibieron

el crecimiento S. aureus, con el extracto acetónico y con el extracto etanólico solo

Gracilaria caudata y Galaxaura obtusa. Los extractos acetónicos y etanólicos de

Acanthophora spicifera y Galaxaura obtusa

presentaron actividad en contra de B. subtilis.

La especie que presentó mayor actividad colectada en Costa de Oro fue Galaxaura obtusa

ya que los tres extractos: acetónico, etanólico y acuoso, fueron activos contra S. aureus y B.

subtilis, registrándose halos de inhibición de 14 mm de diámetro; seguido de la especie

Cymopolia barbata que inhibió a

S. aureus, con los tres tipo de extractos; así como extracto acuoso inhibió a P. aeruginosa;

por último el extracto acetónico a B. subtilis

(Tabla 4). También es importante señalar que la especie Centroceras clavulatum, presentó

actividad en contra de E. aerogenes, en extracto etanólico en extracto acetónico y en contra

P. aeruginosa (Tabla 5).

Cabe mencionar que Gracilaria caudata fue la que produjó el mayor halo de inhibición que

fue de 16 mm de diámetro (Fig.3) contra B. subtilis en extracto acetónico, y es la primera

vez que se reporta actividad en esta especie.

Figura 3. Diámetro obtenido en las pruebas de inhibición

En el mes de octubre de 2001 solo se colectaron tres especies de la División de Chiorophyta

y cinco de la División Rhodophyta. Los extractos de Caulerpa sertularioides, Uva lactuca,

Gracilaria caudata y Gracilaria mammillaris, registraron una moderada actividad

antibiótica ya que solo presentaron halos de inhibición de regular tamaño entre los 7 y 9

mm. de diámetro siendo el halo más grande el producido por Gracilaria caudata con un

diámetro de 12 mm en extracto acetónico contra S. aurcus. Caulerpa sertularioides, Uva

faciata y Gracilaria caudata registraron actividad en sus extracto acetónico y etanólico

contra S. aureus. El extacto acetónico de Ulva faciata fue la único que tuvo actividad en

contra de B. subtilis. El extracto etanólico de Gracilaria mammillaris fue el único que

produjo un halo de inhibición contra de M. luteus.

Tabla 4. Extractos que produjeron inhibición del crecimiento bacteriano contra gram negativas 2001.

Tabla 2. Resultados de las pruebas antimicrobianas con las algas colectadas en el año 2000.

Tabla 3. Resultados de las pruebas antimicrobianas con las algas colectadas en el año 2001.

DISCUSIÓN

Se ha demostrado en gran medida que los extractos algales, tienen efectos inhibitorios sobre el

crecimiento de un gran número de bacterias gram positivas y gram negativas. Así mismo, se ha

demostrado que los extractos elaborados con solventes lipofílicos resultan ser más efectivos para

demostrar dicha actividad biológica (Rao et al., 1988).

La actividad antibacteriana de los extractos algales activos no fue la misma con los tres tipos de

solventes usados, presentando los extractos acetónicos el mayor número de casos con actividad, en

segundo lugar están los extractos etanólicos y en tercero los acuosos. De Lara- Isassi (1991) cree

que esto pueda deberse a que el residuo algas es poco soluble en agua, ya que algunos extracto

algales sí presentan actividad en otro tipo de solventes; en este trabajo se observó coincidencia con

los resultados de la autora, ya que casi todos los extractos algales acetónicos y etanólicos

presentaron actividad; solamente se obtuvieron unos casos aislados de actividad antibiótico con los

extractos acuosos y esto puede observarse en las tablas 2, 3 y 4. Es importante señalar que por

primera vez se reporta actividad con el extracto acuoso de Gracilaria cervicornis.

Karl-Gunnar y Srivastava (1987) demostraron en una investigación que los solventes orgánicos

mostraron una eficiencia similar a la encontrada en este estudio para extraer los compuestos

antimicrobianos de las algas mientras que la extracción con agua resultó menos eficiente. Los

resultados de la extracción con solventes de diferentes polaridades sugieren que los compuestos

algales responsables de la actividad antibacterial son lipofilicos.

En la investigación hecha por Rao y Parekh, 1981 se encontró que Staphylococcus aureus y Bacillus

subtilis son más susceptibles a la acción inhibitorio de los extractos algales que otras cepas

bacterianas, encontrando también que los extractos crudos de la mayoría de las algas no tuvieron

actividad en contra de las bacterias gram negativas. De igual manera, Allen y Dawson (1960),

reportaron que los extractos algales fueron activos contra bacterias gram positivas pero inactivos

contra cepas gram negativas, por lo cual coincide en términos generales con los resultados

encotrados en este trabajo.

Diferentes fracciones obtenidas de extractos algales fueron probadas por Parekh et al.

(1984), quienes reportaron que tanto la porción lipofilica como la hidrofilica fueron activas

contra varios organismos gram positivos y gram negativos.

Padmakumar y Ayyakkannu (1997) revelaron que Staphylococcus aureus es el organismo

más susceptible y Pseudomona aeruginosa fue el organismo más resistente a la acción

inhibitorio de los extractos algales probados, Karl-Gunnar y Srivastava (1987) han

encontrado que Micrococcus luteus es mas susceptible a la acción de los extractos que

Bacillus subtilis y este más susceptible que S. aureus.

Sin embargo los resultados obtenidos en este trabajo coinciden con Padmakwnar y

Ayyakkannu (1 997) ya que la bacteria más susceptible fue S. aureus, seguido de B. subtilis

y por último M. luteus, lo cual es totalmente contrario a lo obtenido por los autores Karl-

Gunnar y Srivastava (1 987).

Se corroboró que S. aureus es totalmente sensible a los metabolitos algales lo cual coincide

con los resultados de otros autores (Burkholder et al., 1960; Padma et aL, 1984; Ballantine

et al., 1987).

Con respecto a la diferencia de la actividad inhibitorio de los extractos contra bacterias

gram positivas y gram negativas, Lustigam y Brown (1 99 l), establecen que probablemente

es debida a las diferencias estructurales de la pared celular, que es más compleja en las

bacterias gram negativas causando un decrernento en la susceptibilidad a substancias

antimicrobianas. Asimismo se observó en este estudio que para la cepa bacteriana gram

negativa Escherichia col¡ no se reportó ningún resultado, es decir ningún extracto inhibió

su crecimiento, y esto es semejante a los resultados obtenidos por Lustigam y Brown

(1991) y De Lara-lsassi et al., (1999) encontrando además, que no todas las especies dentro

de un mismo género muestran igual actividad, lo cual concuerdan con los resultados

que se han obtenido en este estudio.

La actividad antibiótica que mostró Cymopolia barbeta fue notable y solamente

Gracilaria caudata superó su acción antibactetiana. Es la primera vez que se reporta

resultados inhibitorios, seria de gran importancia realizar más estudios relacionados a esta

macroalga ya que representa una fuente potencial de metabolitos antibacterianos.

Una explicación de la actividad de Cymopolia barbata podría ser que contiene el

compuesto aromático llamado cimopol. Además puede ser que presenta actividad

antibacterial por el antibiótico de amplio espectro que contiene llamado sarganina.

(Martínez, 1991). Para el caso de Gracilaria caudata no existen reportes algunos donde se

registre actividad antibiótico de la especie.

Con respecto a la variación estacional en la actividad antimicrobiana, se observó que

Cymopolia barbeta y Gracilaria caudata presentaron actividad en las dos épocas del año;

además se observó que en época de secas se obtuvo una mayor actividad que en época de

lluvias; cabe mencionar que algunas muestras algales que se recolectaron en las dos épocas

del año no presentaron actividad antimicrobiana. Así mismo se observó que todas las

especies mostraron tener una variación estacional en la actividad antibiótico, ya que los

talos colectados durante la época de secas presentaron una actividad mayor, que las

muestras de la época de lluvias.

Se ha observado que en otros organismos marinos como las esponjas y las ascidias, a

mayor temperatura se increínenta la actividad antimicrobiana de sus compuestos

Lozano(1988), en este trabajo se observó algo similar para las algas. Esto quizás explica el

comportamiento de la actividad antimicrobiana, por que en el momento de la colecta se

registraron temperaturas diferentes, para el mes de octubre de 27°C y en abril de 32°C en

temporada de secas.

Los resultados nos muestran claramente un aumento de la actividad antimicrobiana hacia

los meses cálidos (secas) y lo mismo sucede si se observa los diámetros de los halos de

inhibición, esto seiíala de forma general un incremento de la intensidad de la actividad

antimicrobiana en la estación cálida. Se nota que la actividad antimicrobiana de los

extractos de las algas colectadas en la temporada cálida es mayor en contra las bacterias

gram positivas. La misma situación se reporta con las esponjas y ascidias en el estudio de

Lozano (1988), además el porcentaje de esponjas sin ningún tipo de actividad fue más alto

en la temporada fría.

Un porcentaje de los extractos algales se reportó sin actividad antimicrobiana y este

fenómeno fue más alto en la época de lluvias y esto quizás se deba a que en el momento de

la recolecta era la época donde se presentaba el pico más alto de lluvias, según Contreras y

Castañeda (1993) la temporada fuerte de lluvias es septiembre y octubre, fechas en las que

se acerca el invierno además de la influencia de los "nortes" además de un enfriamiento en

el ambiente.

El significado de la presencia de este tipo de sustancias antimierobianas, posiblemente sirva

como control de las bacterias epífltas principalmente en la época en que aparecen las

estructuras reproductoras, también se cree que esta actividad antibacteriana está asociada

posiblemente a otro tipo de factores, tales como la herviboría o la competencia (De Lara et

al, 1989).

De igual manera sería de gran importancia poder corroborar lo que se informó en este

estudio y profundizar el estudio de la variación estacional en las macroalgas, realizando una

investigación cuya finalidad sea la recolecta de algas en los picos mas altos de secas y

lluvias, para así confirmar que existe diferencias en la actividad antibiótica de las

macroalgas.

CONCLUSIONES

El 61% de las especies estudiadas presentó actividad en contra de cuando menos una de las cepas de

bacterias usadas. El 48% de las especies probadas tuvieron actividad contra S. aurcus. El 30% de

las especies probadas tuvieron actividad contra B. subtilis y el 25 % de las especies procesadas

mostró actividad contra ambas cepas bacterianas

Los resultados muestran que los extractos hechos con acetona y alcohol etílico fueron los que

presentaron mayor actividad y son los que contienen compuestos lipofilicos; los extractos acuosos

fueron los que presentaron menor actividad, siendo solo seis extracto los que presentaron actividad

Las bacterias gram positivas resultaron ser las más sensibles a la actividad antibiótico en

comparación de las gram negativas. La especie bacteriana más susceptible a la acción los extractos

algales de este estudio fué S. acureus y la especie bacteriana que no presentó ningún tipo de

inhibición en su crecimiento en los extractos fue E. Coli.

El extracto de Gracilaria caudata y Cymopolia barbeta (ambas recolectadas en la Mancha y Costa

de Oro), resultaron ser los extractos más activo ya que fueron las únicas que inhibieron el

crecimiento bacteriano de al menos un extracto de cuatro cepas bacterianas.

De las 32 muestras que se recolectaron el la Mancha solo siete no presentaron actividad

antibacteriana, esto representa que el 21% de no activas y en la localidad de Costa de Oro se

recolectaron 20 especies de las cuales nueve (21%) no presentaron actividad. Así mismo se observó

que la mayor actividad que se registro fue en época de secas y la menor actividad en época de

lluvias.

Debido a que el 61% de los extractos algales probados resultaron tener actividad antibiótico contra

cepas bacterianas, las cuales pueden afectan a la salud humana, considero de gran importancia

fomentar e intensificar las investigaciones en esta área de ficología aplicada, para explotar el

potencial antibiótico de las microalgas marinas.

LITERATURA CITADA

Aguilera, J., K. Bischof, U. Karsten, D. Hanelt, y C. Wiencke. 2002. Seasonal variation in

ecophysiological patterns in macroalgae from an Artic fjord II. Pigment accumulation and

biochemical defence systems againt hih light stress. Marine Biology 140: 1087-1095.

Allen, M. y Dawson, E. 1960. Production of antibacterial sustances by benthic tropical marine

algae. Journal of bacteriology 79: 454-460.

Amade, P., D. Pesado y Chevolot. 1982. Antimicrobial Activities of Marine Sponges

from French Polynesia and Brittany. Marine Biology 70: 223-228.

Ballantine, D. L., W. H. Gerwick., S. M. Velez, E. Alexander y P. Guevara, 1987.

Antibiotic activity of lipid-soluble extracts from Caribbean marine algae.

Hydrobiologia 116/117: 463-469.

Burkholder, P. R., L. M. Burkholder y L. R. Almodóvar. 1960. Antibiotic activity of

some marine algae of Puerto Rico. Botanica Marina 23: 285-288.

Caccamese, S., Azzolina, R., G. Furnari, M. Cormaci y W. Grasso, 1980. Antimicrobial

and antiviral activities of extracts from Mediterranean algae. Botanica Marina 23: 285-

288.

Caccamese, S., Azzolina, R., G. Fumar¡, M. Cormaci y S. Grasso , 1981. Antimicrobial and

antiviral activities of some marine algae from Mediterrancan algae. Botanica Marina 24:

365- 367.

Contreras, E. F. y Castañeda, L. O. 1993. Serie: Bibliografia comentada sobre Ecosisternas

Costeros Mexicanos. Vol. 111 : Golfo de México 1. CONABIO/UAM-

I/CDELM. (3): 309-345.

Chabbert, Y.A., 1963. L' antibiogramme. Coll. " Techniques de base ". Ed. Tourelle. Saint

Mandé. 257 p.

Chester, C. G. y J. A. Scott. 1956. The production of antibiotic substances by seaweeds.

In: ( T. Braarud and N.A. Sorenssen, Eds.) Second. Int. Seaweeds Symp. Pergamoon, New

York. 49-53 pp.

Cruz, S. F. 1992. Las esponjas marinas como fuente de sustancias antimicrobianas. Ciencias

43: 429-435.

De La Lanza, E.G., 1965. Estudio preliminar de algunos factores físicos y químicos de las

aguas costeras de Veracruz, Ver. Tes. Prof. Fac. Quim., UNAM. 160 pp.

De Lara-lsassi, G., A. Sobrino, C. Lozano, E. Ponce y K. Dreckman. 1989. Evaluación de

la actividad antibiótico de las macroalgas de las costas de Michoacán, México. Bol. Inst.

Oceanogr. Venezuela. Univ. Oriente, 28 (1-2): 99-104,

De Lara-lsassi, G. 1991. Propiedades antibióticas de algunas especies de algas marinas

bentónicas. Hidrobiológica. 1(2):21-27.

De Lara- Isassi, G. y S. Álvarez-Hernández. 1994. Actividad biológica de las macroalgas

marinas mexicanos. Rev. Soc. Mex. Hist Nat., 45: 51-60

De Lara-lsassi , G., S. H. Álvarez-Hernández, C. Lozano-Rarnírez y N. Hemández- Soto,

1999. Nuevas adiciones al conocimiento de la actividad antibiótico de macroalgas marinas

mexicanos. Hidrobiológica 9 (2): 159-169.

Deacon, S. R. A., Lee, P. y D. J. Rogers, 1989. Anticoagulant activity in extracts of British

Marine Algae. Botanica Marina 28(8): 333-336.

Duff, D. C. B., D. L. Bruce y N.J. Antia. 1966. The antibacterial activity of marine

planktonic algae. Canadian Journal of Microbiology 12 (5): 877-884.

Fabregas, J., Llovo, J., y A. Muñoz, 1985. Hemagglutinins in rec seaweeds. Botanica

Marina 28 (12): 517-520.

Hodgson, L.M., 1984. Antimicrobial and antineoplastic activity in some South Florida

seaweeds. Botanica Marina 27: 3 87-390.

Karl-Gunnar, R. y L. M. Srivastava. 1987. Fatty acud as antimicrobial substances in brown

algae. Hidrobiología (151/152): 471-475.

Lot-Helgueras, 1971. Estudio sobre fanerógamas marinas en las cercanías de Veracruz,

Ver. An. In. Biol.. UNAM., Ser. Bot. 1: 1-48.

Lozano, R. C. 1988. Determinación de las propiedades antimicrobianas e ictiotóxicas de

esponjas y ascidias del Golfo de California y Caribe Mexicano. TESIS. Fac. Cienc. UNAM.

México.

Lustingam, B. y Brown, C., 1991. Antibiotic production by marine algae isolated from the

New York/ New Jersey coast. Bull. Environ. Contam. Toxicol 46: 329-335.

Martínez, L. S., 1991. Algas marinas de aplicación fannacéutica 1. Publicaciones

Biológicas. F.C.BIU.A.N.L. 5(2): 81-88.

Merck. 1982. Manual de Medios de cultivo. Frankfurter Strasse 250 D-6100 Darmstadt 1.

Alemania.

Moreau, J., Pesando, D. Bernard, B. Carrain y J.C. Pionnat, 1988. Seasonal variations in

the production of antifungal substances by some dictyotales (brown algae) from the french

Mediterranean coast. Hydrobiologia 162: 157-162.

Moreau, J., Pesando, D. y B. Carram, 1984. Antifungal and antibacterial sereening of

dictyotales from the french Mediterranean coast. Hydrobiologia 116/117: 521-524.

Nigrelli F. R., Stempien F. M., J. R, Ruggieri D. G., Liguori R. V. y Jack T. C. 1967.

Substances of potential biomedical importance from marine organisms. Federation

Proceedings 26(4): 1197-1205 pp.

Padma, S. V., V. Lakshimi, H. Polasa, V. Santhosh, C. H. Prasad Rao y G.

Srimannarayana, 1984. Biological activity of some marine algal extract. Indian

Journal ofmarine Sciences 13: 90-91.

Padmakumar, K. y Ayyakkannu, K, 1997. Seasonal variation of antibacterial and activities

of the extracts of marine algac from southem coasts of India. Botanica

Marina, 40: 507-515.

Padmini, S. R. P., P. Sreenivasa y S. M. Karmarkar. 1986. Biological investigations of Genus

Sargassum. Antifungal activity of crude extracts of different species of

Sargassum (Phaeophyceae). Seaweed Res. Untlin. 9: 25-29.

Parekh, K. S., H. H. Parekh and P. S. Rao , 1984. Antibacterial activity of Indian

seaweeds. Phykos. 23: 216-221

Pedroche, F., K. Dreckmann, A. Senties y R. Margain-Hemandez. 1993. Diversidad algal

en México. Rev. Soc. Mex. De Hist. Nat., No. Esp. XLIV: 69-92.

Pesando, D. y B. Caram. 1984. Screcning of marine algac from the firench Mediterranean

coast for antibacterial and antifungal activity. Botanica Marina 27: 381-386.

Pesando, D. 1990. Antibacterial and antifungal activities of marine algac. Introduction to

applied Phycology. 3-26 pp

Pratt, R. Mautner, H., Gardner, G. M., Y¡-hsien, S. y Dufrenoy, J., 1951. Report on antibiotic

activity of seaweed extracts. J. Amer. Pharm. Assoe. SCT Ed. 40: 575- 579.

Prescott, L. M., Harley, J. P. y D. A. Klein. 1999. Microbiología. Edi. McGraw-Hill.

Interamericana. 4ta. Edición. España.

Rao, P. P. S., P. Srecnivasa-Rao y S. M. Karrnarkar, 1988. Antibacterial activity from India species

of Sargassum. Botanica Marina. 31: 295-298.

Sampaiao, A. H., Rogers and C. J. Barwell, 1998. Isolation and characterization of the lectin from

the green marine alga Ulva lactuca. Botanica Marina 41(4): 427-434.

Sreenivasa, P. P., P. Sreenivasa, y S.M. Karmarkar. 1988. Antibacterial Activity from Indian

Species of Sargassum. Botanica Marina. 31: 295-298.

Sreenivasa-Rao, P. y K. S. Parekh, 1981. Antibacterial activity of indian seaweeds extracts.

Botanica Marina 24: 557-582.

Turner, K., 1963. Notas preliminares sobre la flora marina de la isla de Sacrificios, Veracruz., Res.

11 Congr. Mex. Bot. San Luis Potosí, México. 47 pp.

Vacca, D. and R. Walsh, 1954. The antibacterial extract obtained from Ascophyllum nodosum.

Journal of America Pharmacology Association, Scientific Edition. 43: 24-26.

Vázquez, B. A. 1993. Bibliografla comentada sobre ecosisternas costeros mexicanos. Vol,

111 Golfo de México. CONABIO/UAM

Vega, R. F. y Arenas, F. 1965. Resultados preliminares sobre la distribución de plancton y

datos hidrográficos del arrecife "La Blanquilla", Ver. An. Inst. Biol.. UNAM 36 (1-2): 53-

59.