Ruíz - 148.206.53.231
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Unidad /División J Carrera Materia / ' Título Fecha L/ Nombre / Matrícula ~ Asesora Iztapalapa CBS Biología Experimental Seminario de Investigación Efecto dela Pentoxifilina sobre la Expresión del Factor de Necrosis Tumoral alfa Inducida por Etanol en Diferentes Tipos Celulares Hepáticos. 2 Diciembre 1999-12-02 Blanca Eugenia Farfan Labonne 94327369 Concepción Gutiérrez Ruíz
Transcript of Ruíz - 148.206.53.231
Unidad
/División
J Carrera
Materia
/ ' Título
Fecha
L/ Nombre /
Matrícula
~ Asesora
Iztapalapa
CBS
Biología Experimental
Seminario de Investigación
Efecto dela Pentoxifilina sobre la
Expresión del Factor de Necrosis
Tumoral alfa Inducida por Etanol en
Diferentes Tipos Celulares Hepáticos.
2 Diciembre 1999-12-02
Blanca Eugenia Farfan Labonne
94327369
Concepción Gutiérrez Ruíz
"Efecto De La Pentoxifilina Sobre La Expresión
Del Factor De Necrosis Tumoral a (TNFa)
Inducida Por Etanol En Diferentes Tipos
Cel u la res Hepáticos"
Presenta: Blanca Eugenia Farfan Labonne
Tutora: Dra. Ma. Concepción Gutiérrez Ruíz
Sede: Universidad Autónoma Metropolitana lztapalapa
Laboratorio de Fisiología Celular
Abreviaturas empleadas
ECM
HSC
KC
MFB
PC
TGFp
TNFa
RT
PCR
ADH
MEOS
PTX
LPS
RNA
DEPC
Matriz Extracelular
Células Estelares Hepáticas
Células de Kupffer
Miofibroblasto
Hepatocito
Factor de Crecimiento Transformantep
Factor de Necrosis Tumoral CL
Reacción de Retro-transcripción
Reacción en Cadena de la Polimerasa
Deshidrogenasa alcohólica
Sistema Oxidativo Microsomal del Etanol
Pentoxifilina
Lipopolisacárido
Ácido Ribonucléico
Dietilpirocarbonato
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Introducción.
Tipos Celulares Hepáticos.
El hígado es la glándula más grande del cuerpo que está formada por células
parenquimatosas (hepatocitos) y cuatro tipos celulares no parenquimatosos
asociados con los sinusoides; las células endoteliales, las células de Kupffer
(macrófagos residentes), las células "pit", y las células estelares hepáticas (Arias,
1988).
Los hepatocitos (PC) son la unidad funcional del hígado. Se encuentran
empaquetados en forma de malla en el plano central del canaliculo biliar y están
rodeados por sinusoides en ambos lados. Son los responsables del metabolismo
hepático participando en las vías metabólicas del ciclo de la urea, en la regulación
específica del metabolismo de los lípidos, asi como en la formación de bilirubina y
de ácidos biliares (Fawcett, 1989). En forma estructural el hepatocito está
constituido por tres regiones; la superficie basolateral que contiene algunas
microvellosidades, la región contigua y el canalículo biliar.
A su vez, los hepatocitos se asocian en unidades denominadas acinos, estos se
dividen, con base en la circulación sanguínea, en una zona periportal y una zona
perivenosa, estableciendo una regionalidad metabólica en los hepatocitos en
función del flujo sanguíneo como resultado de una disminución gradual del
sustrato disponible y de oxígeno.
En lo que respecta a la secreción exocrina de bilis, esta se lleva a cabo en la
región del polo apical del hepatocito presente en la membrana canalicular
alrededor de la periferia de las células parenquimatosas. Esta polaridad del
complejo de señales intracelulares es capaz de dirigir correctamente los procesos
de síntesis y secreción del tejido hepático.
Las células endoteliales se encuentran en el límite externo de los sinusoides,
tienen numerosas funciones entre las que se encuentran el transporte activo de
distintos sustratos, la coagulación, la respuesta inmune, etc. Las células de
Kupffer (KC) se localizan en la zona periportal y están ancladas al endotelio de los
sinusoides, son macrófagos y componentes del sistema de fagocitos
mononucleares. Las células "pit" están localizadas en el límite endotelial, y son
linfocitos granulares grandes con actividad de células asesinas. Juegan un papel
importante de defensa contra infecciones virales y metástasis tumoral.
Las células estelares (HSC), también denominadas lipocitos, células de Ito ó
perisinusoidales, se localizan en el espacio perisinusoidal de Disse, adyacentes a
los hepatocitos y a la capa de células endoteliales sinusoidales. Son las
encargadas del almacenaje y metabolismo de retinoides y también producen
componentes de matriz extracelular ( ECM ) en cantidad moderada. En el hígado
A
sano, las células estelares representan alrededor del 10% del tejido hepático.
Este tipo celular puede transformarse a miofibroblasto por una variedad de
estímulos. Durante la activación estas células pueden sufrir algunos cambios, por
ejemplo, los núcleos se hacen más grandes y las vacuolas de vitamina A se
reducen. Las HSC parecen jugar un papel relevante en la fibrosis hepática, ya
que no solo producen y secretan ECM, sino también enzimas para su degradación
(Friedman, 1992; Arthur, 1992). Como se mencionará más adelante, la
transformación de estas células a un fenotipo de miofibroblasto es reconocido
como el evento central de la fibrogénesis hepática.
Metabolismo del Etanol.
El etanol (CH,-COOH) es una molécula pequeña parcialmente polar. Debido a
ello, es miscible en agua y en lípidos. Estás características le permiten moverse
por difusión simple a través de las membranas celulares, de tal manera que su
concentración se equilibra rápidamente entre la sangre y los tejidos (Crabb, 1987).
El principal órgano involucrado en el metabolismo del etanol en el humano es el
hígado, ya que en él se lleva a cabo un 90% de su oxidación (Rubin, 1981).
Después de su absorción en el intestino, el etanol pasa a la circulación portal
hepática y posteriormente a la circulación sistémica; difundiéndose rápidamente
en el organismo.
El hepatocito posee tres sistemas enzimáticos para metabolizar el etanol: el
sistema de la deshidrogenasa alcohólica (ADH) localizada en el citosol; el sistema
oxidativo microsomal (MEOS) ligado al retículo endoplásmico liso y el sistema de
la catalasa, ubicado en los peroxisomas. Estos tres sistemas llevan a cabo la
conversión del etanol a acetaldehido, el cual a su vez, es el sustrato de la
deshidrogenasa aldehídica que genera acetato. El acetato se transforma
finalmente a acetil-coenzima A que se incorpora al ciclo del ácido tricarboxílico.
Toxicidad del acetaldehído.
El acetaldehido, metabolito del etanol, es una molécula altamente reactiva, dada
su naturaleza electrofílica. Por lo tanto, su acumulación en el organismo después
de la ingestión del etanol puede producir alteraciones patológicas (Lauterberg,
1988).
La concentración del acetaldehido en los tejidos y en la circulación sistémica
después de una ingestión aguda de etanol es baja, aún en el higado; pero en los
casos de ingestión crónica se incrementa la Concentración de este tóxico (Lieber,
1988), lo que indica que podria existir un aumento en la producción de
acetaldehido a partir de la oxidación del etanol Ó bien, por una disminución del
catabolismo del acetaldehido.
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El acetaldehido induce cambios mitocondriales que incluyen daño estructural,
fragilidad y alteración en las membranas. In vitro, se ha demostrado que el
acetaldehido tiene varios efectos sobre el metabolismo mitocondrial, inhibe el sitio
I de la fosforilación oxidativa y por lo tanto, disminuye el consumo de oxígeno.
Las mitocondrias hepáticas son más susceptibles a la acción del acetaldehído
después de una ingestión crónica de etanol (Rubin, 1974).
Enfermedad Hepática Alcohólica.
En los últimos años ha habido grandes avances en la comprensión del mecanismo
por el que se produce el daño hepático debido a la ingestión del alcohol
(Friedman, 1999; Tuma, 1998). Se considera que es un proceso complejo, en el
cual están involucrados distintos tipos celulares hepáticos que incluyen a los
hepatocitos, las células de Kupffer, las células estelares, células endoteliales
además de monocitos y neutrófilos. Los cambios en la abundancia y función de
estas células, asi como de sus matrices dentro de la región perisinusoidal del
higado, constituyen la patologia crónica progresiva. El entendimiento de los
cambios en las funciones celulares requieren de una interpretación cuidadosa del
modo como las señales intercelulares provocan cambios acumulativos lentos que
llevan de las interacciones normales a las patológicas (Dong, 1998; Kawada,
1998; Pinzani, 1998).
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En los últimos años han surgido nuevas ideas acerca de las complejas
interacciones celulares, de manera que en la actualidad se considera que algunas
de las interacciones tienen una retroalimentación positiva que desestabiliza la red
de señales celulares normales, mientras que otras tienen el efecto de tratar de
mantener el balance homeostático normal. Más aún, algunas de las interacciones
cambian la estructura y función del tejido de manera reversible, mientras que otras
producen efectos dificiles de revertir.
Es conveniente señalar ahora que la desestabilización de la red normal de
señales celulares se debe, en parte, a cambios en los patrones de expresión de
citocinas. Estas moléculas son mediadores de la comunicación celular de bajo
peso molecular (~30Kd) y se encargan de mantener la homeostasis fisiológica en
el organismo sano; sin embargo, se ha demostrado que modulan muchas de las
manifestaciones sistémicas de la ALD y ciertos aspectos del proceso de daño y
reparación hepática.
Fibrosis Hepática.
La fibrosis hepática es una consecuencia de algunas enfermedades crónicas que
se presentan en el hígado (Matsuoka, 1988). En la actualidad se sabe que la
fibrosis es el resultado de un proceso múltiple de reparación del daño al higado,
que conlleva a la acumulación de ECM en detrimento de la estructura y función
celular (Bisell, 1997).
X
Los factores etiológicos que producen daño hepático pueden ser enfermedades
debidas a parásitos, infecciones virales, enfermedades autoinmunes, daño tóxico
por agentes químicos como el haloetano y el acetaminofen (Iredale, 1997), o bien,
por la ingesta crónica de alcohol.
Una de las características principales del daño crónico hepático es la alteración en
los patrones de mediadores de comunicación celular. Trabajos recientes
demuestran que las señales celulares y moleculares que los diferentes tipos
celulares hepáticos envían como resultado del daño producido por el etanol
inciden sobre las células estelares hepáticas. Como resultado de este proceso,
estas células sufren una transformación fenotípica, de células de reserva de
retinoides a un fenotipo productor de ECM, y llegan a ser las principales
responsables de la fibrogénesis (Gressner, 1995).
Se considera que una célula estelar se ha transdiferenciado a MFB cuando
presenta las siguientes características: 1 .- su proliferación se ve estimulada; 2.- la
expresión de los genes de varios componentes de la matriz extracelular está
amplificada; 3.- adquiere contractilidad debida a la expresión de filamentos de
alfa actina característicos de músculo; y finalmente, 4.- debe expresar un amplio
espectro de citocinas.
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Modelo de Activación de las Células Estelares Hepáticas.
El conocimiento presente acerca de las interacciones moleculares y celulares que
se presentan en el datio hepático se ha integrado en un modelo de activación de
las HSC. este modelo se conoce como mecanismo de cascada de tres pasos y
fue propuesto por el grupo del Dr. Gressner en Alemania ( Gressner A. y Bachem
M., 1995).
En la fase preinflamatoria se produce un daño a los hepatocitos, y como resultado
de este daño se liberan agentes mitogénicos que actúan sobre las células
estelares.
En una fase inflamatoria subsecuente (fase ll), citocinas de las KC (macrófagos
residentes del hígado), de plaquetas y de hepatocitos dañados, estimulan a las
HSC a proliferar y transformarse en MFB. La activación de las KC residentes y de
los monocitos invasores es principalmente iniciada por la fagocitosis de los
hepatocitos dañados. Esta activación de las KC induce un nuevo daño a los
hepatocitos (necrosis, apoptosis) vía la liberación de proteasas, citocinas tóxicas
(TNFu), y radicales de oxígeno (Orrenius S.. 1997 y Amin A.,1997).
En esta fase inflamatoria, se ha propuesto a la citocina TGFp 1 como prototipo de
citocina fibrogénica ya que acelera la transdiferenciación de las HSC a MFB y
puede promover la apoptosis de los hepatocitos, lo cual puede a su vez perpetuar
el proceso fibrogénico.
Los MFB son estimulados durante la fase post-inflamatoria (fase Ill) vía una
estimulación autócrina generada por las citocinas expresadas y secretadas por los
MFB, esto ocurre debido a que además se sintetizan receptores para las mismas
citocinas que se están expresando. De esta manera los MFB pueden auto
perpetuar la fibrogénesis incluso después de que la estimulación por el agente
causal inicial ha terminado.
Finalmente, se ha propuesto que la matriz extracelular generada por lo MFB
puede modular la actividad de citocinas secretadas por la formación de zonas de
almacenamiento extracelular de dichas citocinas.
El Factor de Necrosis Tumoral Alfa.
En los últimos años, se ha realizado un gran esfuerzo para clarificar los
mecanismos de fibrogénesis por medio de la identificación de la naturaleza,
propiedades y origen de los mediadores fibrogénicos y mitogénicos que estimulan
la activación de las células estelares hepáticas. Estos trabajos han permitido
conocer algunas de las citocinas importantes en este proceso, como el TGFD y el
TNFa; este Último, ha sido propuesto como el factor inicial en la cascada de
señalización en el desarrollo del daño hepático (Bedosa, 1995;lgnotz, 1986;
Inuzuka, 1995).
El TNFa (catenina) consiste de dos péptidos diferentes con múltiples actividades
inmunológicas locales e inflamatorias sistémicas (Garcia, 1997).
El TNFa tiene efectos antitóxicos, vasculares, antiocluyentes, pirogénicos y
antitumorales in vivo. Por otro lado, el TNFa incrementa la adhesividad de las
células endoteliales y neutrófilos (Thomson, 1994; Remick, 1987; Beutler, 1987).
En cuanto a la actividad biológica del TNFa en el higado, esta citocina aumenta la
expresión de las proteinas de fase aguda en hepatocitos humanos in vitro; asi
mismo, aumenta la cantidad de proteinas de fase aguda en suero y reduce la
biosíntesis de albúmina (Thomson, 1994; Nagakaza, 1990). El TNFa también
estimula la biosintesis de lipidos, y la degradación de aminoácidos por los
hepatocitos. Todos estos efectos del TNFa pueden ser potenciados por otras
citocinas como las interleucinas 1 y 6.
Estudios in vivo han demostrado un incremento significativo en los niveles séricos
y número de receptores tisulares del TNFa en pacientes con daño hepático agudo
y crónico (Khoruts, 1990; Colleti, 1990; Shalaby, 1988; Ward, 1987; Tilg, 1993;
Redd, 1992).
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Finalmente, estudios in vitro han demostrado que el TNFa posee una actividad
mitogénica y que aumenta la síntesis de diferentes tipos de ECM (Knittel, 1997).
Pentoxifilina.
La pentoxifilina es una metil xantina, que ha sido empleada en el tratamiento de
enfermedades periféricas vasculares. Este fármaco tiene la capacidad de inhibir
la adhesión y agregación plaquetaria, de igual manera, inhibe la síntesis de
fibrinógeno. Por otro lado, puede amplificar los sistemas fibrinolíticos endógenos
(Lilly, 1989; Harada, 1989).
Se sabe que la PTX inhibe la actividad de células polimoríonucleares y de
monocitos por un aumento en el adenocin monofosfato cíclico intracelular
(Harada, 1989). Así mismo, se ha demostrado que la PTX disminuye la cantidad
de citocinas liberadas por monocitos y que suprime la acción pro-inflamatorio del
TNFa (Winddmeier, 1997).
Este fármaco es un inhibidor no específico de fosfodiesterasas y se ha reportado
que bloquea la síntesis de colágena en fibroblastos de epidermis (Bernam, 1992),
aunque el mecanismo de acción no se conoce.
Por otro lado, se ha demostrados que la PTX bloquea la activación de las células
estelares (Kwan, 1997) y previene la fibrosis hepática inducida por necrosis
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hepatocelular (Peterson, 1992). Finalmente, se ha demostrado que la PTX
previene los cambios histológicos en modelos de cirrosis experimental (Rames,
1990).
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Justificación.
Las enfermedades hepáticas debidas alcohol son uno de los problemas de salud
pública más graves a nivel mundial y, aunque no es fácil evaluar el impacto actual
del alcoholismo en México, existen algunos indicadores que permiten suponer que
el problema se ha incrementado en los últimos años.
En México, la cirrosis hepática es atribuible a la ingesta de alcohol en un 64% de
los casos, y a infecciones virales en los casos restantes. En 1995, en nuestro
pais, la cirrosis hepática fue uno de los principales problemas de salud pública, ya
que se consideró la sexta causa de mortalidad general y la tercera entre la
población económicamente activa, principalmente entre hombres de 15 a 64 años
(Secretaría de Salud, 1995; Organización Panamerica de la Salud-México, 1997).
La enfermedad hepática alcohólica es una consecuencia de la ingesta prolongada
de alcohol. Presenta un amplio espectro de lesiones como pueden ser la
esteatosis o higado graso, la hepatitis alcohólica, la fibrosis y finalmente la
cirrosis.
Durante la fibrosis hepática el contenido de ECM principalmente colágenas de tipo
I y Ill pueden llegar a ser 6 veces más que en el hígado normal, cambiando no
solo la cantidad sino también la distribución histológica de estas proteínas en
detrimento de la función tisular. Es por ello que las estrategias terapéuticas deben
incluir medidas que permitan prevenir o bloquear los mecanismos que estimulan la
síntesis de ECM (Brenner, 1997). Así pues, el bloqueo de la producción de
proteínas colagénicas, en particular de la colágena tipo I y 111, es un mecanismo
potencial de control de la fibrosis hepática (Gonzáles, 1997).
Por lo anteriormente señalado en el presente estudio se empleó la pentoxifilina, ya
que se ha demostrado que bloquea la síntesis de colágena en modelos in vivo
(Isbrucker, 1998). Sin embargo, poco se conoce de los mecanismos de acción de
la PTX, ni el efecto de este fármaco en la síntesis de citocinas en los diferentes
tipos celulares hepáticos.
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Objetivo General.
Estudiar el efecto sobre la inducción del Factor de Necrosis Tumoral alfa (TNFw)
del tratamiento con etanol, acetaldehído y pentoxifilina en diferentes tipos
celulares hepáticos.
Objetivos Particulares.
Evaluar el efecto del tratamiento agudo y crónico con etanol y acetaldehído sobre
la expresión de TNF a sobre las células HepG2 y células estelares tratadas con
medio condicionado de células HepG2.
Evaluar el efecto del tratamiento agudo y crónico con etanol y acetaldehído sobre
la expresión de TNF c( sobre las células HepG2 y células estelares tratadas con
medio condicionado de células HepG2 expuestas a PTX.
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Metodología.
Cultivo Celular.
Las células estelares hepáticas fueron donadas por el Dr. Rojkind del Instituto
Albert Einstein de Nueva York. El medio de cultivo que se utilizó fue el Medio
Mínimo Esencial (MEM) (Sigma), al cual se le adicionó 10% de suero fetal de
bovino (Hy-Clone), 0.5% de aminoácidos no esenciales (Microlab) y 100
unidadeslml de penicilina con 100 pglml de estreptomicina y, finalmente, 2% de L-
glutamina. Las células se sembraron sobre botellas de cultivo de plástico estériles
(Nunc) y el medio se cambió cada tercer día. Las células se levantaron de la
botella de cultivo con tripsina-verseno al 0.025% (Microlab) una vez a la semana
resembrándose nuevamente a una dilución de 1:3. Los cultivos se mantuvieron
en una incubadora con una atmósfera de 510% de CO y 90% de humedad, a
una temperatura de 37% Todos los experimentos se realizaron cuando las
células se encontraban en fase logarítmica de crecimiento.
Las células HepG2 fueron adquiridas comercialmente de la American Type
Culture Collection. Las células crecían en monocapa y se mantuvieron en medio
Williams suplementado con suero fetal bovino al 10% con penicilina-
estreptomicina al 1%. Estas células se mantuvieron en condiciones semejantes a
las mencionadas para las células estelares.
Tratamientos.
Se sembraron células HepG2 (5x10 en botellas de cultivo de 65 cm 2, pasadas
24 horas se trataron con medio Williams sin suero bovino fetal con etanol (50mM)
ó acetaldehído (175 mM); estos tratamientos duraron 48 horas. Este medio se
retiró y fue suplementado con glucosa (294, el medio así obtenido se denominó
medio condicionado.
Por otro lado, se sembraron las células estelares hepaticas (5 X 10 6) en botellas
de cultivo como las senaladas anteriormente, pasadas 24 horas se colocó el
medio condicionado proveniente de los tratamientos con etanol y acetaldehído de
las células HepG2. Este tratamiento tendrá una duración de 48 horas.
Posteriormente se adicionó al medio condicionado pentoxifilina (200 pM)
El RNA se extrajo de células estelares antes de ser expuestas a los medios
condicionados, después del tratamiento con los medios condicionados y,
finalmente, después del tratamiento con pentoxifilina.
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Preparación del RNA.
Obtención de RNA total con trizol. Se retiró el medio de cultivo de los diferentes
tratamientos, las células se lisaron directamente en la botella de cultivo agregando
1.5 ml de trizol (Sigma) por cada (5-10 millones de células). El lisado se colectó
empleando un gendarme de goma y se homogenizó. Se dejó reposar durante 5
minutos a temperatura ambiente y se adicionaron 0.2 ml de cloroformo por cada
mililitro de trizol empleado. Se agitó vigorosamente. Se agregaron 0.5 ml de
isopropanol por mililitro de trizol y se dejó reposar de 10 a 12 minutos. Se
centrifugó a 12 O00 rpm durante 10 minutos a 4°C. Se secó al vacío y se disolvió
el botón en agua DEPC. Veinticuatro horas después se cuantificó por
espectrofotometría a 260 nm. El RNA así obtenido se almacenó a -7OOC hasta su
utilización.
Ultrapurificación del RNA. El RNA se resuspendió en 200 pI de buffer de DNasa
1X (acetato de sodio 0.1 M, sulfato de Magnesio 5mM en agua DEPC, pH 5) el
buffer contenía 10 unidades de DNasa libre de RNasa (sigma). Se homogenizó y
se incubó a 37OC durante 60 minutos. Posteriormente se agregaron 200 pI de
fenol saturado se homogenizó y centrifugó 2 minutos a 12 O00 rpm a temperatura
ambiente. Se transfirió la fase acuosa a otro tubo y se adicionaron 200 pI de
SEVAG (cloroformo/alcohol isoamílico 24:1), se homogenizó y centrifugó 2
minutos a 12 000. Se transfirió la fase superior a otro tubo y se adicionaron 300 pI
?O
de etanol absoluto a 4OC y 70 plde acetato de sodio 3M pH 5.3, se hornogenizó y
se guardo a -7OOC durante 24 horas. A partir de este momento el RNA se
mantuvo siempre frío. Pasado este tiempo se centrifugó el RNA 15 minutos a 12
O00 rpm y 4OC. Se eliminó el sobrenadante y se lavó el botón con 800 pI de
etanol al 75% (preparado en agua DEPC), se hornogenizó y se centrifugó 15
minutos a 12 O00 y 4OC. Se eliminó el sobrenadante y se secó bajo vacío. Se
resuspendió el botón en agua DEPC y se almacenó a -70 OC. Se cuantificó 24
horas después por espectrofotometría (260nm).
Obtención del RNAc para los ensayos de RT-PCR semicuantitativo.
Linearización del plásmido. Se empleó el plásmido pQA-1 que fue gentilmente
proporcionado por los doctores David Shire y Pascale Legoux, del centro Sanofi
de investigación en Francia. Se disolvieron 4 pg del plásmido en 30 pI de buffer
EcoRI, y se adicionaron 2 pI de Eco RI. Se incubaron por 1 hora a 37OC. Se
adicionaron otros 10 pI de buffer y 2 p1 de la solución de Eco RI. Se incubó
nuevamente 1 hora a 37 OC. Se realizó una extracción con 1 volumen de fenol
saturado con 10 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA y entonces se adicionará 1 volumen
de cloroformo.
Transcripción. Se mezclaron en un tubo eppendorf en el siguiente orden buffer de
reacción 5X T7n3 (4 pl), 25 mM ATP, CTP, GTP, UTP (6 pl de mezcla de NTP,
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con una concentración final de 7.5 mM), 100 mM ditiotreitol (2 I, 10 mM), plásmido
linearizado (Img en 8 pl) y Ampliscribe T7 RNA polimerasa (2 pl). Se incubó
durante 1 hora a 37OC. Se adiciono RNasa libre de DNasa ( I O unidades) y se
incubó por 15 minutos a 37OC. Se enfrió en hielo y se realizó una extracción fenol-
cloroformo. El RNA así obtenido se denominó cRNA.
Purificación del cRNA. Se colocaron 2 g de Biogel p i 0 en 100 ml de buffer TE.
Se removió el sobrenadante y se adicionaron 100 ml de TE, se repartió la
suspensión de 2/3 gel, 1/3 buffer en dos tubos falcon de 50 ml a 4OC.
Por otro lado, en un tubo se lavaron aproximadamente 10 ml de una capa de
vidrio de borosilicatos (1 00-200 micrómetros de diámetro), con las siguientes
soluciones es este orden, HCI IM , NaOH I M , Tris pH 8 1M se decantó el vidrio
flotante a cada lavada, este vidrio se desechó. Se trató con dietilpirocarbonato
(IO p11100 ml de agua) y se dejó reposar toda la noche a temperatura ambiente
antes de esterilizar en autoclave por 20 minutos a 120° C.
Por otra parte, se perforó el fondo de un microtubo con una aguja estéril caliente.
Con la ayuda de un cono truncado estéril se colocaron 10 pI del vidrio antes
preparado en el tubo, con un mínimo de líquido. Se llenó completamente con el
Biogel pl0, se colocó el microtubo en un eppendorf trucado y se colocó en un
tubo de centrifuga convencional. Se centrifugó 5 minutos a 5000 rpm a
temperatura ambiente. La resina se mantuvo húmeda hasta su uso.
.ii
Se colocó el microtubo en un tubo eppendorí estéril de 1.5 cm 3. con una pipeta
se tomaron 20-30 pI de la solución de cRNa en la resina. Se centrifugó por 5
minutos a 5 O00 rpm. El eluido se liofilizó.
Cuantificación y control de calidad. Se resuspendió el botón del cRNA liofilizado
en 100 11 de agua, se homogenizó y se tomaron 2 pl de esta solución; se diluyo
en 98 pl de agua. Se leyó la absorbancia a 260 nm y 280 nm en cubetas de 50 pl.
El cRNA puede almacenarse a -20 OC.
La cantidad de cRNA se obtiene con la siguiente fórmula
cRNA= OD 260 nm/ 1000X50/2X40 pg/pl.
Para verificar la calidad del cRNA se hizo un gel de agarosa con 1% formaldehído
hecho con la solución de buffer RNA 20X (40 ml 1M MOPS, pH 7.4, 4 ml 0.5 M
EDTA, 156 ml agua), agarosa (0.5 g) y agua (43.5 mi). Se calentó a 100 OC para
disolver. Se enfrió amenos de 65OC y se adiciono el formaldehído (4 mi). Se
colocó en la cámara de electroforesis y se pre-migró en el buffer RNA 20X a 50 V.
Se diluyó 1-2 pg del cRNA en buffer RNA IX, y se adicionó 1.33X de azul dye (15
pI de una solución con formamida 674 1.11, formaldehído 216 pl, 1M MOPS pH 7.4
30 pl, 10% SDS, glicerol 57 pI y 1% de azul de bromofenol). Se desnaturalizó por
5 minutos a 65OC y se enfrió rápidamente en hielo. AI mismo tiempo se
desnaturalizó y enfrió una mezcla de marcador de peso de RNA, buffer de RNA
1X y azul dye 1.33 X. Se depositó el total del cRNA en los pozos del gel junto con
el marcador de peso,
Se corrió el gel 30 minutos a 50V. Se sumergió el gel 5 minutos en bromuro de
etidio y se inspeccionó a 365nm en un transiluminador.
Buffer RT DNTP’s Inh. Oligo DT
RNasa
1 3 0.5 0.7
._
Preparación de muestras para RT-PCR.
MgC12 RNA Enzima
RT
1.5 0.5* 0.5
Preparación DE muestras para la reacción de Retro-Transcripción.
Se preparó de la misma forma el RNA experimental y el cRNA
Se empleó un kit (RNA PCR Perkin Elmer) que contenía todas las soluciones
necesarias para la reacción. Todos los volúmenes están dados en pl.
*Este volumen contenía 50 ng de RNA.
24
Se dejó reposar 15 minutos a temperatura ambiente y posteriormente se incubó 1
hora a 37OC. Se detendrá la reacción calentando a 95OC durante 5 minutos.
Finalmente se colocó la mezcla de reacción a 4OC.
Preparación de muestras de cDNA (provenientes de la reacción de RT) para la
PCR.
Se realizó la reacción de PCR para amplificar el cDNA de TNF a y para p2
microglobulina que servirá como control.
Los oligos empleados para el factor de necrosis tumoral a fueron
ACAAGCCTGTAGCCCATGTT (oligo sentido 5’-3’), AAGTA-ACCTG.2CAGACT
(OLIGO ANTISENTIDO 5’-3’); para la amplificación de p2 microglobulina se
emplearon los siguientes oligos CCAGCAGAGAATGGAAAGTC (oligo sentido 5’-
3‘), GATGCTGCTTACATGTCTCG (oligo antisentido 5’-3’). Los tamaiíos
esperados para cada amplicón con el plásmido son de 427 bases para el TNF a y
de 360 para p2 microglobulina; mientras que el tamaño de cada amplicón con el
RNA experimental son de 268 para p2 microglobulina y 280 para el TNF a.
La preparación de las muestras se hará de la siguiente manera
25
Todos los volúmenes están dados es pl
TNFa 28.7
I I r-1" Buffer
PCR
5
5
MgC12
-~ 2
2
___ Oligo
5
__ 5
CDNA DNTP AmpliTaq T I
TI ! !
La amplificación se llevó a cabo en un termociclador de la siguiente manera; se
realizaron 30 ciclos con un paso de desnaturalización de 1 minuto a 94'C, un
paso de hibridación de 1 minuto a 55'C y un paso de polimerización de 1 minuto a
72°C. La amplificación del cRNA que se obtuvo del plásmido pQA-1 sirvió como
un control positivo. Así mismo, se prepararon controles negativos que no
contuvieran cDNA.
Los productos del PCR se visualizaron de la siguiente manera, la mitad del
producto se colocó junto con 2 pl de azul dye (10%). Se colocó en un gel de
poliacrilamina al 10%. Se corrió la electroforesis a 60 V durante 3 horas.
Posteriormente se hizo un análisis densitométrico empleado el sofware GEL DOC.
26
Como se setialará más adelante, este protocolo sirvió como base para el montaje
de las técnicas pero se realizaron varias modificaciones a esta técnica básica.
21
Actividades Realizadas y Resultados.
Se extrajo el RNA de las células sometidas a los tratamientos descritos en la
metodología; el RNA se purificó mediante lavados con etanol hasta que el
coeficiente de pureza (260/280 nm) fuera mayor a 1.7 ya que de esta forma se
asegura que no contiene gran cantidad de proteínas que pudieran interferir en los
procesos posteriores.
En la figura 1 se muestra un gel de electroforesis en el que se colocaron alicuotas
del RNA extraído de células HepG2 después de los tratamientos con
acetaldehído, etanol y pentoxifilina después de 24 horas.
Carril 1 2 3 4 5 6
Fig 1. RNA Total extraido de células HepG2 y estelares. En esta figura se ejemplifica la calidad del
RNA obtenido por el método de extracción con Trizol, se muestran en el gel los siguientes
tratamientos; carril 1, células HepG2 control; carril 2, células HepG2 tratadas con etanol; carril 3,
células HepG2 tratadas con acetaldehido; carril 4, células estelares control; carril 5, células
estelares tratadas con los medios condicionados con etanol y carril 6. células estelares tratadas con
los medios condicionados con acetaldehido.
28
Este tipo de geles se realizaron para todas las muestras ya que nos permite
corroborar el buen estado del RNA; este hecho resulta de vital importancia ya que
si el RNA se encuentra degradado los estudios posteriores no habrían brindado
resultados confiables.
En cuanto al proceso de extracción del RNA por el método del Trizol podemos
afirmar que la técnica fue montada de manera eficiente ya que para cada
tratamiento se obtuvo la cantidad suficiente de RNA para ser utilizado en los
estudios posteriores.
En cuanto a la pureza del RNA, en la mayor parte de los casos después de la
extracción el coeficiente de pureza era mayor a 1.7, solo en algunos casos el
coeficiente de pureza del RNA fue menor al Óptimo esperado y debieron realizarse
lavados repetidos con etanol, esto presentó la desventaja de que la cantidad de
RNA disminuía notablemente; sin embargo, aun se contaba con material suficiente
para los ensayos de RT-PCR.
Una vez que se obtuvo el RNA de todos los tratamientos se procedió al montaje
de la técnica de ultrapurificación.
Se tomo una alícuota de las muestras de RNA extraído de los diferentes
tratamientos y se sometieron al proceso de ultrapurificación descrito
anteriormente.
En la figura 2 se muestra un gel del RNA después del proceso de ultrapurificación;
y podemos observar en este punto que el RNA no puede visualizarse en el gel.
29
Carril 1 2 3 4 5 6
d RNAr 4.71 kb
RNAr d I .87kb
Fig 2. RNA Total ultrapurificado. Se muestran en esta imagen el RNA de los mismos tratamientos
que se mostraron en la figura 1 una vez sometidos a un tratamiento de ultrapurificación fenólica.
Cuando realizamos la cuantificación del material pudimos constatar que el
proceso del ultrapurificación disminuye la cantidad de RNA total, al grado que en
algunas muestras se pierden totalmente.
A fin de comparar la cantidad de RNA que se tiene antes y después de
ultrapurificar, se muestra en la figura 3 un gel en el que se colocaron algunas
muestras del RNA ultrapuro junto a dos muestras de RNA sin ultrapurificar(en los
últimos carriles); se colocó en los carriles el mismo volumen de la solución final de
RNA, la imagen se obtuvo de una exposición lo suficientemente larga para permitir
la visualización del RNA ultrapuro.
Es importante señalar ahora que se realizaron algunas modificaciones a la técnica
descrita tales como la disminución del tiempo de incubación con la enzima DNasa
libre de RNasa; los tiempos empleados fueron la mitad y un cuarto del tiempo
originalmente planteado. A pesar de estas modificaciones la cantidad del RNA
seguía disminuyendo en una proporción elevada.
30
Carril 1 2 3 4 5 6 7 8
KUAr J71hh a
K h \ r a I X7hh
Fig. 3,ComparaciÓn entre la cantidad de RNA en muestras ultrapurificadas y sin ultrapurificar. En
los carriles 1 a 6 se muestran el RNA ultrapurificado de las siguientes muestras: carril 1, células
HepG2 control; carril 2. células HepG2 tratadas con etanol; carril 3, células HepG2 tratadas con
acetaldehido; carril 4, células estelares control; carril 5, células estelares tratadas con los medios
condicionados con etanol y carril 6, células estelares tratadas con los medios condicionados con
acetaldehido. En los carriles 7 y 8 se colocó RNA extraído de muestras controles para células
HepG2 (carril 7), y células estelares (carril 6).
En este punto del trabajo se decidió hacer un análisis de la calidad del RNA en
cada paso del proceso de ultrapurificación y se llegó a la conclusión de que el
tratamiento con fenol era demasiado agresivo para el RNA; por ello emplearon
tres tipos de fenol comercial con el fin de obtener mejores resultados en el
proceso; pero pudimos comprobar que en todos los casos el RNA se perdía casi
en su totalidad.
Con el fin de estudiar la posibilidad de que el RNA ultrapurificado fuera viable para
los estudios de RT-PCR se realizó un ensayo preliminar empleando los oligos
para p 2 rnicroglobulina y el resultado se muestra en la figura 4.
31
Carril I 2 3 4 5 6 7 8
* * * * TNF * * * * D2P
IIC HA HC IIA HC HA HC IIA
Fig 4. Productos de RT-PCR de muestras de RNA ultrapurificado y sin ultrapurificar.. En esta figura pueden
observarse los productos de amplificación de TNI' alfa y beta2 microglohulina en células HepG2. En los
primeros cuatro carriles se colocaron los productos de amplificación de muestras ultrapurificadas; carril 1 y 3.
células HepG2 control (HC); carril 2 y 4, células HepG2 tratadas con acetaldehido 175 pM 24 horas (HA).
En los carriles 5 al 8 se muestran los productos de amplificación de las muestras de RNA sin ultrapurificar;
carril 5 y 7 , células HepG2 control (HC); carril 6 y 8, células HepG2 tratadas con acetaldehído 175 pM 24
horas (HA).
Como puede observarse en los primeros cuatro carriles no puede observarse
nada; en ellos se colocaron los productos de PCR que se elaboraron con RNA
ultrapuro mientras que, en los últimos cuatro carriles se observan varios
productos; estos carriles corresponden a los productos de PCR que se obtuvieron
con muestras de RNA de células HepG2 sin ultrapurificar; aunque pueden
observarse varios productos inespecíficos, al menos si se está produciendo una
amplificación.
Por lo anteriormente señalado se decidió continuar con la preparación de las
reacciones de RT-PCR con RNA no ultrapurificado, ya que además de la
disminución de la cantidad de RNA el proceso de ultrapurificación incrementa en
mucho el costo del experimento.
32
Montaje de la técnica de RT-PCR.
Se contaba con dos protocolos generales para la realización de la reacción de RT-
PCR, uno proporcionada por el Dr. Kersenovich del Instituto Nacional de Nutrición
Salvador Subirán por conducto de la M. en C. Gabriela Gutiérrez; y el otro
protocolo era el propuesto por el fabricante del Kit (RNA PCR Perkin Elmer)
empleado para la realización de la técnica. Partimos del protocolo proporcionado
por el Dr. Kersenovich y que se describió en la sección de metodología.
Se manejaron como variables la concentración de MgCI, empleado durante la
reacción de PCR (0.5, 1 y 2pi) así como la temperatura de hibridación de la PCR
(53, 55 y 57oc ).
Cuando realizamos las reacciones de RT-PCR, se utilizó el RNA que se obtuvo de
células estelares y HepG2 tratadas 24 horas con acetaldehído 175 pM, estas
muestras de denominaron Controles Positivos.
En los geles en los que se colocaron los productos de PCR que se obtuvieron con
los oligos de p 2 microglobulina se veían claramente varios productos
amplificados, mientras que con los oligos de TNF a no se visualizó ningún
producto; cabe señalar que la reacción de RT-PCR se realizó por lo menos en tres
ocasiones independientes para verificar que la falta de producto no se debiera a
algún error de tipo humano.
Se realizaron reacciones con las diferentes cantidades de MgCI, y las
temperaturas de hibridación señaladas antes y con ninguna de las condiciones
pudo mejorarse la eficiencia de las reacciones.
Se procedió entonces a emplear el protocolo propuesto por el fabricante que se
describe a continuación: para la reacción de RT se colocan en este orden 2 pI del
33
MgCI,, 1 pI de buffer de PCR, 1 pI de cada dNTP, 0.5 pI de lnhibidor de RNasa,
0.5 pI de Oligo dT y 0.5 pI de la enzima Retro Trasncriptasa Murina. Esta mezcla
se coloca en un tubo eppendorf de pared delgada y 200 pl de capacidad. La
cantidad de RNA se mantuvo constante, 1.25 pg disueltos en la cantidad de agua
suficiente para completar un volumen total de reacción de 10 pl.
En lo que respecta al protocolo para PCR es el siguiente: Se colocan 4 pI de
buffer para PCR, 2.5 pl de cada uno de los oligos (sentido y antisentido), 0.25 pI
de Enzima Polimerasa, 3 pI del producto de RT. También debe agregarse MgCI,
pero la cantidad de este se varió desde 0.5 hasta 2 pl.
En la figura 5 se muestra uno de los geles que se realizaron con los productos de
PCR para la amplificación de p 2 microglobulina en donde puede observarse que
la amplificación se realizó de manera satisfactoria ya que se eliminan
completamente los productos inespecíficos
Carril MP 1 2 3 4 5 6 7 8 9 IO 11 12
500pb c;,
268pb c2,
Fig 5. Productos de Amplificación de f32microglobulina . En esta figura se muestran los productos
de RT-PCR que se obtuvieron con muestras de RNA siguientes: carril 1, control de células HepG2;
carril 2, HepG2 acetaldehido; carril 3, etanol; carril 4, células estelares control; carril 5, células
estelares medio condicionado con etanol; carril 6, células estelares medio condicionado con
acetaldehido; carril 7, estelares control; carril 8, células estelares medio condicionado etanol; carril
9, células estelares con pentoxifilina; carril I O . células estelares medio condicionado con etanol y
pentoxifilina; carril 11, células estelares medio condicionado con acetaldehido y, carril 12, células
estelares medio condicionado con acetaldehido y pentoxifilina. Puede observarse que el amplicón
tiene un tamaño cercano al esperado de 268 pares de bases.
34
A continuación se realizó una curva en la que se varía la concentración inicial de
plásmido pQA-1 empleado, esta curva se puede ampliar para la realización de
RT-PCR competitiva.
Carril MP 1 2 3 4 5 6 7 8 9 I O I 1 12
Fig 6.Curva patrón de p2 microglobulina. Se presenta la amplificación del cRNA que se obtuvo con
diferentes concentraciones iniciales del plásmido pQA-1. Las diluciones fueron las siguientes: I ng/pl, 500
pg/wl, 250 pg/pl, 125 pgipl, 62.5 pg/pl, 31.2 pg/pl, 15.6 pgipl, 7.8 pg/pl. 3.9 pgípl, 1.95 pg/pl, 0.975
pg/pI, 0.487 pgipl, del carril 1 al 12 respectivamente. El tamaño del amplicón es de aproximadamente 360
pares de bases como se esperaba.
En este punto se comenzó con el montaje de la técnica para RT-PCR de TNFa;
en la figura 7, 8 y 9 se muestran geles donde se colocaron productos de
amplificación del RNA de células HepG2 y estelares tratadas con acetaldehído
175 pM y con el plásmido pQA-1 respectivamente. Puede observarse que
mientras el plásmido amplifica satisfactoriamente con todas las concentraciones
de magnesio, los productos de PCR de las células HepG2 y estelares muestran
una gran cantidad de bandas inespecíficas que no fueron eliminadas en ninguna
de las condiciones empleadas.
35
Carril I 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 12
MgCl 0.2 0.5 1 2 3 4 0.2 0.5 I 2 3 4 Temp. Hibri. 53°C 55°C
* * * * * I
* * * * * *
Fig. 7. Productos de RT-PCR para R J F a en muestras de células HepC2. En esta imagen se muestran los
productos de PCR para TNF a en células HepG2 tratadas con acetaldehído 175 1iM durante 24 horas. En los
carriles I a 6 se muestran los productos obtenidos cuando la temperatura de hibridación fue de 53°C con
diferentes concentraciones de MgCl, (0.2. 0.5. I , 2, 3, y 4 iil de la solución estándar por reacción). En los
carriles 7 a 12 se muestran los productos de PCR cuando la temperatura de hibridación fue de 55°C. Los
productos de amplificación que se obtuvieron a la temperatura de hibridación de 57°C no se presentan ya que
son similares a los aquí mostrados. Se señalan en la figura los diferentes productos amplificados.
MgCI, 0.2 0.5 I 2 3 4
Fig 8. Productos de RT-PCR para TNF a en muestras de celulas estelares . En esta imagen se
muestran los productos de PCR para TNF alfa en células estelares tratadas con acetaldehido 175
pM durante 24 horas. En los carriles 1 a 6 se muestran los productos obtenidos cuando la
temperatura de hibridación fue de 55'C con diferentes concentraciones de MgCI, (0.2, 0.5, 1, 2, 3, y
4 111 de la solución estandar por reacción). Los productos de amplificación que se obtuvieron a la
temperatura de hibridación de 53 y 57% no se presentan ya que son similares a los aquí
mostrados. Se señalan en la figura los diferentes productos amplificados.
36
MgCll 0.2 0.5 I 2 3 4 0.2 0.5 I 2 3 4 Temp. Hibri. 53°C 55°C
* * * * * * * * * * * *
Fig 9. Productos de RT-PCR de TNF a para el plásmido pQA-1. En esta imagen se muestran los
productos de PCR para TNF alfa el plásmido pQA-1 con diferentes condiciones de astringencia ya
que se vario la concentración de MgCI, y la temperatura de hibridación. En los carriles 1 a 6 se
muestran los productos obtenidos cuando la temperatura de hibridación fue de 53°C con diferentes
concentraciones de MgCI, (0.2, 0.5, 1, 2, 3, y 4 pl de la solución estándar por reacción). En los
carriles 7 a 12 se muestran los productos de PCR cuando la temperatura de hibridación fue de
55OC. Los productos de amplificación que se obtuvieron a la temperatura de hibridación de 57OC no
se presentan ya que son similares a los aquí mostrados.
Ya que ni la temperatura de hibridación ni la cantidad de MgCI, tuvieron algún
efecto en la calidad del producto de PCR se realizaron las siguientes
modificaciones a la técnica descrita, por un lado se disminuyó el tiempo de
hibridación durante el proceso de amplificación, ya que se pensó que los
productos inespecíficos podían ser resultado de una amplificación incompleta; se
realizaron las reacciones de PCR con todas las variaciones de temperatura y
concentraciones de MgCI, pero con tiempo de hibridación de un minuto y medio y
dos minutos en lugar de un minuto como se había realizado anteriormente. En la
figura 10 se muestra uno de los geles que se ejemplifica la calidad de los
productos de amplificación de las muestras de RNA con un tiempo de hibridación
de minuto y medio.
37
Carril I 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 l 3
MgC12 2 2 2 0.2 0.5 I 2 3 4 0.2 0.5 1 2 3 Temp. Hibri. 5 3 “C 55°C
* * * * * * * * * * * * * *
Fig. 10. En esta imagen se muestran los productos de PCR para TNF alfa en células HepG2
tratadas con acetaldehido 175 pM durante 24 horas. En los carriles 1 y 2 se muestran los productos
obtenidos para beta 2 microglobulina a 53 y 55’C de temperatura de hibridación respectivamente;
en el carril 3 se muestra el producto de amplificación de TNF actuando sobre el plasmido pQA-1. En
los carriles 4 a 9 se muestran los productos cuando la temperatura de hibridación fue de 53°C con
diferentes concentraciones de MgCI, (0.2, 0.5. 1, 2, 3, y 4 pl de la solución estándar por reacción).
En los carriles 10 a 13 se muestran los productos de PCR cuando la temperatura de hibridación fue
de 55% Los productos de amplificación que se obtuvieron a la temperatura de hibridación de 57OC
no se presentan ya que son similares a los aqui mostrados. Se setialan del lado izquierdo de la
imagen los amplicones obtenidos.
Puede observarse que la calidad de los productos no es satisfactoria. Se
muestran en el mismo gel algunos productos de amplificación obtenidos con los
oligos de p 2 microglobulina así como con los oligos de TNF actuando sobre el
plásmido pQA-I. De estos resultados podemos afirmar que la calidad del RNA
era buena ya que se logra la amplificación del RNA mensajero de 2
38
microglobulina y, por otro lado, las condiciones empleadas son propicias a la
amplificación de TNF a ya que el plásmido amplifica satisfactoriamente.
Otra variación que se intentó para mejorar el desempetio de la amplificación fue
un proceso de desnaturalización del RNA antes de llevar a cabo la reacción de
RT-PCR, ya que consideramos que el problema podía deberse a que el RNA
estuviera plegado por lo que se generarían diferentes productos de amplificación
dependiendo del estado de plegamiento. Para llevar a cabo la desnaturalización
del RNA se emplearon dos estrategias, por un lado se calentó el RNA a 75 OC
durante 5 minutos seguidos los cuales se colocó el RNA en hielo durante 5
minutos; y por otro lado, se empleó DTT 1 pM como agente desnaturalizante, este
se adicionó directamente a la mezcla de reacción de la RT.
En la figura 11 se muestra uno de los geles que se realizaron para verificar la
calidad de los productos de PCR y como puede observarse no hubo amplificación
alguna; por ello podemos afirmar que los procesos de desnaturalización
combinados con las variantes ya empleadas no son adecuados para mejorar la
calidad de los productos de reacción.
Por las pruebas antes realizadas solo nos restaba pensar que los oligos
empleados para la amplificación del TNF a no eran óptimos para los tipos
celulares empleados a pesar de que estos se construyeron para reconocer una
región altamente conservada de la secuencia de RNA mensajero del TNFw, para
verificar que las modificaciones empleadas en el presente estudio hubieran sido
las adecuadas se emplearon oligos para la amplificación de TGFP, IL 1 p e IL 8.
Se realizaron las reacciones de RT-PCR partiendo del RNA extraído de las células
sometidas a los tratamientos con acetaldehído 175 pM y de los diferentes
tratamientos realizados para este estudio.
39
Las reacciones se realizaron utilizando las diferentes condiciones para
temperatura de hibridación y concentración de MgCI,. Algunos de los resultados
se muestran en la figura 12 en los que se muestran los productos de PCR para la
amplificación de TGFp, IL 8 e IL 1 p respectivamente.
Carril MP 1 2 3 4 5 6 7 8
MgCI, DTT CdiiFrío
0.5 I 2 3 0.5 1 2 3 * * * *
* * * *
Fig 11.Productos de RT-PCR de muestras de RNA sometido a un proceso de desnaturalización. En
esta figura pueden observarse los productos de amplificación de TNF alfa en células estelares. En
los primeros cuatro carriles se colocaron los productos de amplificación de las células estelares
tratadas con acetaldehido 175 pM 24 horas, con un tratamiento previo de desnaturalización con
DTT, la reacción de PCR se llevó a cabo con las concentraciones de MgCI, señaladas. En los
carriles 5 al 8 se muestran los productos de amplificación células estelares con un pre tratamiento
de calor/ frío (75T durante 5 minutos y hielo durante 5 minutos).El resultado que se obtuvo con
células HepG2 no se muestra ya que tampoco hubo amplificación de ningún producto.
Como puede observarse en la los tres casos se encontraron las condiciones
adecuadas para la amplificación de las citocinas elegidas dentro del rango de
variaciones que elegimos para este estudio. Las variaciones en la amplificación
que se observan pueden deberse a la expresión diferencial de los RNA’s
40
mensajeros en los diferentes tratamientos. Con esto podemos corroborar que los
rangos de variación de concentraciones de MgCI, y temperaturas de hibridación
son las adecuadas para la amplificación de varias citocinas por la técnica de RT-
PCR.
Ahora bien, dado que no se logró la amplificación del RNA mensajero del TNF a
en las diferentes condiciones podemos suponer que el problema se debe a que
los oligos empleados (uno o ambos) no reconocen específicamente el RNA
mensajero del TNF, por ello se observan en la mayoría de los casos varios
productos inespecíficos. La afinidad con que se dan estas interacciones es lo
suficientemente fuerte para que a pesar de emplear diferentes condiciones de
astringencia no fuera posible eliminar la amplificación de estos productos.
Lo que correspondería hacer sería cambiar los oligos, sin embargo debe
recordarse que los oligos se construyeron sobre la base del plásmido pQA-1, cuyo
empleo es indispensable para poder realizar los ensayos de RT-PCR cuantitativo.
Es decir, de modificar los oligos el ensayo perdería su calidad de cuantitativo. En
la actualidad se están montando técnicas de RT-PCR semicuantitativo y se están
realizando los ensayos con un par de oligos diferentes que fueron construidos a
partir de secuencias registradas para células de origen murino y que fueron
amablemente proporcionados por el Dr. Rogelio Hernández Pando del
Departamento de Patología Experimental del Instituto Nacional de Nutrición
Salvador Zubirán.
Sin embargo, los resultados preliminares indican que dicha secuencia no
reconoce los RNA mensajeros del TNFa de ninguno de los tipos celulares
empleados en este estudio; esperábamos que con estos nuevos oligos pudiera
llevarse a cabo la amplificación del TNFa de las células estelares ya que estas
fueron aisladas de rata y, por lo tanto, esperábamos que existiera una alta
homología entre los RNAm de ambas especies.
41
A. TCFg
B. IL 6
C. IL 8
Carril
200pb e
Carril
260pb d
247vb I
MP I 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0
MP I 2 3 4 5 6 7 8 9 I O II 1213 14
Fig 12. Productos de RT-PCR de tres citocinas diferentes con RNA experimentales. A) En esta
figura se muestran los productos de amplificación de TGF p. En los carriles 1 a 5 se colocaron los
productos obtenidos de células HepG2 en el siguiente orden: carril 1, control; carril 2 control
negativo; carril 3, tratamiento con etanol; carril 4, tratamiento con acetaldehido y, carril 5,
tratamiento con etanol y Pentoxifilina, en los carriles 6 a 10 se muestran los productos de
amplificación obtenidos de células estelares; las muestras se colocaron de la siguiente manera:
carril 6, control; carril 7, control negativo; carril 8. tratamiento con medio condicionado con etanol;
carril 9, tratamiento con el medio condicionado con acetaldehído; carril 10 tratamiento con medio
condicionado con etanol y pentoxifilina. B) En esta figura se muestran los productos de
amplificación de IL6 las muestras se colocaron de la siguiente manera: carril 1, control HepG2;
carril 2. control negativo; carril 3, Células HepG2 tratadas con acetaldehído; carril 4, células HepG2
tratadas con etanol; carril 5, control de células estelares; carriles 6 y 7, células estelares tratadas
con medios condicionados de etanol; carriles 8 y 9. células estelares tratadas con medios
condicionados con acetaldehido; carriles 10 y 11, células estelares con medios condicionados con
etanol y pentoxifilina; carriles 12 y 13, células estelares con medios condicionados con acetaldehido
y pentoxifilina; y finalmente, carril 14, control de células estelares. En la figura 12 C) Se muestran
los productos de amplificación de IL 8, las muestras se colocaron como se mencionó anteriormente
para'lL 6 hasta el carril 13.
42
Conclusiones y Metas alcanzadas.
En el calendario propuesto en el proyecto inicial de servicio social se planificaron
las siguientes actividades; por un lado, desarrollar los experimentos, montar la
técnica de extracción del RNA por el método del Trizol; el montaje de la técnica
de RT-PCR para la amplificación del RNA de p2 microglobulina, y el montaje de la
técnica de RT-PCR para la amplificación de TNFn para finalmente realizar los
análisis competitivos. De estas metas planteadas se alcanzaron todas ellas salvo
el montaje de la RT-PCR de TNFa, en la que no se tuvo éxito a pesar de que se
emplearon dos tipos diferentes de oligos (humanos y rnurinos). Como se
mencionó con anterioridad la técnica de RT-PCR fue montada para diferentes
citocinas así como para P2pglobulina; sin embargo, los oligos para TNFa parecen
no ser los más adecuados al modelo de estudio.
El plásmido pQA-I y los oligos empleados durante el presente trabajo fueron
construidos en base a secuencias descritas para humanos; así pues,
esperábamos que dichos oligos tuvieran una alta homología con el RNA del TNF
n de las células HepG2 ya que estas son de origen humano. Por otro lado, las
células estelares fueron aisladas de rata; sin embargo, decidimos emplear los
mismos oligos ya que, a pesar de sus diferentes orígenes, ambos tipos celulares
presentan homologías.
Ahora bien, la amplificación del TNFa no pudo llevarse a cabo de manera eficiente
para ninguno de los dos tipos celulares empleados ya que los oligos utilizados
resultaron no tener una especificidad suficientemente alta por el RNAm del TNFn,
podemos afirmar esto ya que no se logró la eliminación de productos
inespecíficos a pesar de todas las modificaciones que se hicieron a la técnica
original.
Por otro lado, para confirmar que las modificaciones realizadas fueran las
pertinentes, se realizaron los montajes de la técnica de RT-PCR para otras
citocinas que no fueron contempladas en el proyecto inicial. Así pues, como parte
del trabajo realizado para este proyecto se logró la amplificación de TGF P I , y de
las interleucinas 1 y 8 de manera satisfactoria.
44
Referencias.
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