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El significado genético de la replicación es el de conservar la información genética. La estructura del ADN en doble hélice permite comprender como dicha molécula puede dar lugar a copias sin perder su conformación. En principio, las dos hebras deberían separarse. Después, mediante la acción de otra enzima, a partir de desoxirribonucleótidos sueltos y según la complementariedad de bases, podría irse construyendo las hebras complementarias de las dos hebras “modelo” iniciales.

MODELOS DE REPLICACIÓN PROPUESTOS

Para explicar este proceso se propusieron tres hipótesis:

Hipótesis Conservativa. Propone que tras la duplicación, quedan, por un lado, las dos hebras antiguas juntas y, por otro, las dos hebras nuevas también espiralizadas.

La Hipótesis Semiconservativa sobre la duplicación del ADN se debe a Watson y Crick. En ella se sostiene que, en las dos moléculas de ADN de doble hélice hijas, una de las hebras sería la antigua y otra la moderna.

La Hipótesis Dispersiva supone que la primitiva molécula de ADN se fragmenta en multitud de pequeños trozos, copiándose éstos y reuniéndose tanto los fragmentos originales como las copias de modo que las dos nuevas moléculas están formadas por fragmentos antiguos y nuevos.

El experimento más definitivo para dilucidar cuál de estas tres hipótesis era la correcta fue el de Meselson y Stahl en 1957. La hipótesis confirmada fue la semiconservativa.

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REPLICACIÓN “IN VIVO” DEL ADN La enzima que lleva a cabo la replicación del ADN es la ADN polimerasa, esta enzima tiene unos requerimientos específicos para trabajar, que le imponen restricciones: 1. Sólo añade nucleótidos en la dirección 5’ 3’. 2. Necesita para poder empezar a copiar y unir nucleótidos un molde de ADN. 3. Necesita un pequeño trocito de ARN al cual unir los nucleótidos, ya que ella no

puede empezar a unir los nucleótidos sin tener una pequeña cadena ya formada. 4. Utiliza nucleótidos trifosfato.

Dadas las necesidades de esta enzima y sabiendo que la molécula de ADN está formada por dos hebras antiparalelas, se plantea un problema en la cadena de ADN que va en la dirección 5’ 3’, porque aquí la enzima estaría trabajando en la dirección contraria, y sin embargo, se observa que las dos hebras se van replicando.

La solución al dilema la dio el desabrimiento, en 1968, por Okazaki de unos fragmentos constituidos por unos 50 nucleótidos de ARN y entre 1.000 y 2.000 nucleótidos de ADN, denominados fragmentos de Okazaki. Así se podía explicar como se copia esta cadena, siendo de forma discontinua en la dirección 5’ 3’ y la otra cadena de forma continua. También quedaba solucionado el problema de que la enzima necesitara una cadena de ARN a la cual unir los nucleótidos.

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Veamos ahora como se lleva acabo el proceso: Existe una secuencia de nucleótidos en el ADN llamada origen de replicación

que actúa como señal de iniciación. Las cadenas de ADN están unidas por puentes de hidrógeno, que debemos

romper para facilitar la separación de las cadenas para ser copiadas, esta separación la lleva a cabo las enzimas helicasas.

Como el desenrollamiento de la doble hélice da lugar a superenrollamientos en el

resto de la molécula, capaces de detener el proceso, se hace preciso la presencia de las enzimas topoisomerasas que eliminen las tensiones en la fibra.

A continuación, para evitar que las dos hebras vuelvan a reunirse y formar los

puentes de hidrógeno se colocan unas proteínas llamadas SSB (Single-Strand DNA Binding proteins), que estabilizan las cadenas sencillas.

El proceso es bidireccional, es decir, hay una helicasa trabajando en un sentido y

otra trabajando en sentido opuesto. Se forman pues las llamadas burbujas u ojos de replicación.

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Como ninguna ADN-polimerasa puede actuar sin cebador, interviene primero una

ARN polimerasa (primasa) que si lo puede hacer, sintetiza un corto fragmento de ARN de unos 10 nucleótidos denominado primer que actúa como cebador.

Después interviene la ADN polimerasa III, que a partir de este cebador comienza

a sintetizar en dirección 5’ 3’ una hebra de ADN partir de nucleótidos trifosfato. La energía necesaria para el proceso es aportada por los propios nucleótidos que pierden dos de sus fósforos. Esta nueva hebra se sintetiza en el sentido que se abre la horquilla de replicación, es de crecimiento continuo y se denomina hebra conductora.

Sobre la otra hebra (hebra discontinua o retardada) la ARN polimerasa

sintetiza unos 40 nucleótidos de ARN en un punto que dista unos 1.000 nucleótidos de la señal de iniciación. A partir de ellos la ADN polimerasa III sintetiza unos 1.000 nucleótidos de ADN, formándose un fragmento de Okazaki. Este proceso se va repitiendo a medida que se van separando las dos hebras patrón.

A continuación interviene la ADN polimerasa I, que, primero, gracias a su función

exonucleasa, retira los segmentos de ARN, y que luego, gracias a su función polimerasa, rellena los huecos con nucelótidos de ADN.

Finalmente la ADN ligasa unirá los dos extremos, tanto en la cadena continua

como los sucesivos fragmentos de Okazaki que se van formando en la cadena discontinua.

Cuando se observa como se produce la replicación se ve que la cadena continua va más rápida que la discontinua, esto es debido a que cada vez que se forma un fragmento de Okazaki hay que realizar todo este proceso como si se comenzara la síntesis de nuevo, formando el primer y el resto de pasos, sin embargo, en la continua solo se realizará una vez.

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REPLICACIÓN DEL ADN EN EUCARIOTAS

Es similar a la de los procariontes, es decir, semiconservativa y bidireccional. Existe una hebra conductora que sintetiza de manera continua y la retardada de forma discontinua con fragmentos de Okazaki.

Sin embargo, la replicación en eucariotas presenta ciertas peculiaridades:

El ADN de los eucariontes está fuertemente asociado a los octámeros de histonas, en forma de nucleosomas, por lo que además de replicarse el ADN, deben duplicarse también las histonas. Al parecer, tanto los nuevos nucleosomas como los antiguos se reparten de manera aleatoria entre las dos nuevas hebras hijas: en la retardada y en la conductora.

La longitud del ADN de un cromosoma eucariótico es mucho mayor que el ADN bacteriano, de ahí que no haya un único origen de replicación. Para que el proceso sea más rápido, existen numerosas burbujas de replicación a lo largo de cada cromosoma.

CORRECCIÓN DE ERRORES La actividad de la ADN polimerasa debe ser exacta, rápida y fiel, ya que la vida entera y su continuidad de generación en generación dependen de la exactitud y precisión con que se transmite la información, es decir de la fidelidad de la duplicación del ADN. La selección de nucleótidos por la ADN polimerasa y su actividad autocorrecctora, constituyen mecanismos de prevención de errores, pero aún así se comete un error de apareamiento por cada 10 millones de bases. Esta precisión podría resultar suficiente para una bacteria, cuyo genoma contiene 3 millones de pares de bases, pero resulta insuficiente para el genoma humano que contiene 3.109 pares de bases.

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Un error por cada 10 millones de bases supondría 300 equivocaciones en cada duplicación del ADN humano, y teniendo en cuenta que durante el desarrollo embrionario a partir del zigoto el genoma humano se duplica casi mil millones de veces, se produciría una acumulación del trescientos mil billones de errores, lo que evidentemente, es incompatible con la vida, ya que la formación inicial se perdería pronto como consecuencia de las divisiones celulares. Por ello, para aumentar todavía más la precisión de la duplicación, existe una maquinaria enzimática que corrige los posibles errores cometidos por el ADN polimerasa en ADN recién sintetizados (corrección postreplicativa), con lo que la exactitud de la réplica alcanza la increíble perfección de un error por cada diez mil millones de bases (1010). Esta corrección se realiza por medio de un conjunto de enzimas agrupados en un complejo multienzimático que detecta el nucleótido mal emparejado, lo elimina y regenera la secuencia correcta, del siguiente modo: Para detectar el nucleótido mal emparejado,

el aparato de corrección debe reconocer la cadena recién sintetizada, donde se encuentra el error y diferenciarla de la cadena molde. Ambas cadenas son complementarias, pero mientras que la cadena molde tienen metiladas las adeninas de las secuencias GATC, existe un lapso de tiempo durante el cual las adeninas de estas secuencias en la cadena réplica aparecen sin metilar, y es en este intervalo cuando actúa el complejo multienzimático y detecta los posibles errores.

La eliminación se realiza mediante una endonucleasa que corta el segmento en el lugar donde se encuentra el error.

Por último, la secuencia correcta se regenera cuando la ADN polimerasa I rellena el hueco utilizando como molde la cadena original, y por último una ligasa unirá los fragmentos.

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TELÓMEROS: ENVEJECIMIENTO Y MUERTE CELULAR

Los cromosomas eucariotas son lineales y presentan en sus extremos unas regiones, denominadas telómeros constituidas por secuencias repetitivas del tipo TTAGGGTTAGGG….Cuando se replica el ADN lineal, los extremos 5’ de los telómeros, no pueden ser replicados.

Cuando se elimina el ARN cebador del extremo 5’ de cada una de las hebras recién sintetizadas, el hueco que queda no lo pueden rellenar los enzimas ADN polimerasas, porque no encuentran extremos hidroxilo libres sobre los que añadir nuevos nucleótidos.

La imposibilidad de replicar los extremos de cada cromosoma da lugar a que el telómero se vaya acortando en cada ciclo de replicación, hasta llegar a una cantidad crítica. Esta pérdida deja al descubierto los extremos de los cromosomas que se unen unos a otros produciéndose la imposibilidad de replicación. Este acortamiento de los telómeros está relacionado con el envejecimiento celular y la muerte programada o apoptosis de las células.

El acortamiento de los telómeros, puede ser remediado mediante una enzima, la telomerasa, que repara el daño y hace a las células inmortales, es el caso de las células embrionarias y tumorales.

La telomerasa es una ribonucleoproteina que actúa como trasncriptasa inversa (sintetiza ADN a partir de un molde de ARN), ya que tienen una hebra de ARN con la secuencia apropiada para actuar como molde para la síntesis de la secuencia telomérica de ADN que se añade en los extremos 3’ de cada cromosoma para evitar su acortamiento en cada proceso de duplicación.

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AGENTES MUTAGÉNICOS

El ADN es un compuesto que se encuentra sometido continuamente a las agresiones de sustancias químicas, tanto de nuestro propio metabolismo como del exterior. También es alterado por agentes físicos.

EFECTO DE LA TEMPERATURA. Las células humanas por el mero hecho de encontrarse a 37º, pierden diariamente y de forma espontánea unas 5.000 bases púricas (A y G) en un proceso que implica la rotura del enlace N-glucosídico denominado despurinización.

EFECTO DE LOS RAYOS ULTRAVIOLETA DE LA RADIACIÓN SOLAR. Esta radiación induce la formación de enlaces covalentes entre dos bases pirimidínicas sucesivas en la misma cadena, lo que da lugar a dímeros de timina y de citosina; como consecuencia se rompen los puentes de hidrógeno que mantenían con sus bases complementarias y la doble hélice se desorganiza alrededor de los dímeros. Estos dímeros pueden repararse fotoquímicamnete, pues las células poseen unas enzimas que pueden activarse por la acción de la luz ultravioleta.

METABOLITOS REACTIVOS. Algunos residuos del metabolismo, sobre todo los radicales libres derivados del oxígeno, son compuestos altamente reactivos y capaces de inducir lesiones en el ADN.

RADIACIONES IONIZANTES. Se conocen con este nombre a determinadas radiaciones electromagnéticas de longitud de onda muy corta y por ello altamente energéticas, como los rayos γ (gamma) y los rayos X y los flujos de neutrones y protones originados en los reactores nucleares, que al colisionar con los átomos y las moléculas que encuentran en su camino, los transforman en iones y radicales muy reactivos, capaces de atacar a numerosas moléculas de las células, entre ellas el ADN, produciendo la rotura de sus cadenas.

Las consecuencias derivadas de su acción dependen de la intensidad de la radiación y del tiempo de exposición, ya que sus efectos son acumulativos. Si la radiación es muy intensa, llegan a romperse los cromosomas y se produce la muerte celular.

Son más sensibles las células que s encuentran en división que las que no se dividen; por ello cuando se aplica radioterapia en el tratamiento contra el cáncer, la radiación destruye preferentemente a las células cancerosas, que están continuamente dividiéndose, y deja intactas las restantes células del organismo. Si la radiación afecta

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a una mujer embarazada, se producen mutaciones de ADN en el feto que pueden ocasionar la parición de malformaciones en el recién nacido, de ahí que nunca se utilicen rayos X como método de exploración en las mujeres gestantes.

RADIACIÓN CORPUSCULAR: PARTÍCULAS α y β. Son las partículas que se emiten en los procesos de desintegración de isótopos radiactivos, y sus efectos sobre el ADN son similares a los producidos por las radiaciones rayos o los rayos X, que ocasionan la rotura de las cadenas de ADN. El caso más grave fue el sucedió en el accidente nuclear de Chernóbil.

SUSTANCIAS QUIMICAS. Constituyen una auténtica legión de sustancias, habitualmente utilizadas y que nos rodean.

El benzopireno y otros hidrocarburos policíclicos, que son moléculas planas que al intercambiarse entre los pares de bases establecen puentes, mediante enlaces covalentes, entre las dos hebras de ADN. El ácido nitroso, que provoca la desaminación de la citosina y la adenina. Los agentes alquilantes como el gas mostaza, que introducen grupos metilo, etilo… en las bases del ADN y alteran la replicación.

Como la mayoría de estos agentes mutagénicos favorecen el desarrollo de tumores carcinógénicos.