Pruebas pre transfusionales-y_administración_de_la_transfusión-r

Unidad didáctica 3: Pruebas pre-transfusionales y administración de la transfusión DUE. Ana Mateo Banc de Sang i Teixits. Reus DUE. Elisabeth Verdaguer Banc de Sang i Teixits. Badalona DUE. Sara Vilanova Banc de Sang i Teixits. Lleida

Máster para enfermería en transfusión sanguínea y terapia celular y tisular Módulo 3

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Sumario

1. Introducción

2. Objetivos

3. Solicitud transfusional y muestras de sangre

3.1 Criterios de aceptación de la solicitud

transfusional

3.2 Muestras de sangre

4. Pruebas pre-transfusionales: componente y

receptor

4.1 Identificación positiva del receptor y de la

muestra de sangre

4.2 Revisión de los registros del servicio de

transfusiones

4.3 Determinación del grupo ABO y Rh (D)

4.4 Estudio de la discrepancia sero-hemática

4.5 Resolución de las discrepancias ABO

4.6 Resolución de las discrepancias debidas a la

ausencia de antígenos esperados

4.7 Resolución de discrepancias debidas a

reacciones inesperadas con anti-A y anti-B

4.8 Resolución de las discrepancias por

reacciones séricas inesperadas

5 La prueba cruzada y la investigación de anticuerpos

irregulares

5.1 Grupo ABO y Rh

5.2 Prueba cruzada

5.3 Escrutinio de anticuerpos

5.4 Identificación anticuerpos irregulares

6 Reacciones de sensibilización, aglutinación y prueba

de la antiglobulina humana

6.1 Reacción antígeno-anticuerpo en


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inmunohematología

6.2 Teoría del potencial Zeta

6.3 Factores que influyen en la sensibilización

de los hematíes

6.4 Factores que influyen sobre la aglutinación

de los hematíes

6.5 Utilidad de la prueba directa e indirecta de

la anti-globulina humana

7 Soluciones potenciadoras de la unión antígeno-

anticuerpo

8 Bibliografía


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1. Introducción

La transfusión es generalmente un procedimiento beneficioso para el paciente.

Pero algunas veces los hematíes del donante y a veces los del receptor tienen

una destrucción acelerada. La mayoría de reacciones transfusionales hemolíticas

se originan por errores en la identificación del paciente o de la muestra, pero a

veces la hemolisis es provocada por anticuerpos irregulares que se encuentran

en el suero del receptor. Los efectos nocivos fueron observados desde los

principios de la primera transfusión, realizada en el siglo XVII por Jean-Baptiste

Denis.

Actualmente hay una gran variedad de pruebas pre-transfusionales que mejoran

la seguridad y la eficacia transfusional. Realizar les pruebas pre-transfusionals

correctamente asegura que se administren los productos sanguíneos ABO

compatibles con el receptor y que se detecten la mayoría de anticuerpos

irregulares clínicamente significativos. Así podemos seleccionar para cada

receptor los componentes sanguíneos más adecuados y que estos una vez

transfundidos tengan una superviencia aceptable y no se produzca una

destrucción clínicamente significativa de los hematíes del paciente. Así la

transfusión será lo más segura posible y habrá un mínimo riesgo para el

receptor.

2. Objetivos

Después de revisar esta Unidad, el alumno tendría que ser capaz de llevar a cabo

las siguientes tareas:

• Conocer las pruebas pre-transfusionales que se realizan para que la

transfusión de componentes sanguíneos sea lo más segura posible para

el receptor.

• Definir las características, aplicación y metodología de los grupos

sanguíneos.

• Conocer las discrepancias que nos pueden aparecer a la hora de

determinar la tipificación del grupo sanguíneo de un paciente o

receptor.

• Interpretar la prueba cruzada siendo ésta la prueba básica de

compatibilidad pre-transfusional.


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3. Solicitud transfusional y muestras de sangre

3.1 Criterios de aceptación de la solicitud transfusional

La indicación de una transfusión es un tratamiento personalizado, por lo tanto

hay que tener presente diferentes factores del paciente: la edad, la enfermedad

de base, el motivo actual de la transfusión, antecedentes inmuno-

hematològicos (transfusión previa, trasplantes, embarazos, abortos),

antecedentes clínicos, estado inmune del paciente, la sintomatología que

presenta y los resultados analíticos. Con todos los datos del receptor se tiene

que valorar el riesgo/beneficio que la transfusión comporta para el paciente ya

que los componentes sanguíneos suponen un riesgo, aunque pequeño, para el

receptor.

La administración de sangre y de sus componentes será siempre bajo

prescripción médica y siempre que sea posible, el médico que la indique

obtendrá la conformidad del paciente, después de haberle explicado los riesgos

y beneficios de ésta terapéutica, así como las posibles alternativas.

La solicitud de transfusión tendrá que contener toda la información necesaria

para identificar el centro hospitalario, el receptor y el médico que la ha indicado

así como las razones médicas que justifican la petición. También tendrán que

constar con claridad los componentes pedidos y el grado de urgencia de la

solicitud.

Requisitos de la solicitud de transfusión

Identificación del centro solicitante:

o Nombre del centro donde está ingresado el receptor.

Identificación del receptor:

o Nombre y apellidos

Fecha de nacimiento/edad.

o Sexo

o Número de historia clínica

o Diagnóstico

o Servicio que solicita la transfusión.


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o Localización del enfermo.

o Peso en caso de neonatos y en peticione de plaquetas o plasma

Identificación del producto solicitado

o Tipo de producto

o Número de unidades

o Volumen

o Características especiales del componente (irradiado, lavado...)

o Autotransfusión

Identificación del tipo de solicitud

o Inmediata: sin pruebas de compatibilidad

o Urgente

o Durante el día

o Reserva operatoria

o Reserva no operatoria

Identificación del historial transfusional

o Antecedentes transfusionales del paciente

o Reacciones transfusionales anteriores

o Embarazos, abortos

o Trasplantes

Identificación de la persona que extrae la muestra pretransfusional


o Firma o identificación inequívoca.

o Fecha de extracción

Identificación del médico que hace la solicitud


o Número de colegiado

o firma o identificación inequívoca

o fecha y hora de la solicitud

o Identificación del responsable de la aceptación de la solicitud

o Identificación

o Fecha y hora de la recepción de la solicitud.


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Solo deberían aceptarse las solicitudes transfusionales que fueran legibles y que

estuvieran correctamente cumplimentadas. Las solicitudes parcialmente o

defectuosamente cumplimentadas o con muestras insuficientes no serán

admitidas, excepto las que sean sin pruebas de compatibilidad (inmediatas).

El banco de sangre o el servicio de transfusiones siempre ha que tener un

registro de todas las solicitudes transfusionales recepcionadas.

Modelo de solicitud transfusional


8

Esquema de recepcion de solicitud transfusional

.


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3.2. Muestras de sangre

3.2.1. Identificación del paciente

Cuando se realice una extracción de sangre se tiene que identificar siempre

al paciente de manera positiva preguntándole (si está consciente y

orientado) el nombre y los apellidos. Si el paciente no está consciente u

orientado compararemos la información de la solicitud de transfusión e

identificaremos al paciente con la información de su pulsera identificativa,

con la información que nos den los acompañantes, con la información que

nos proporcione DUI de la planta o la información de la historia clínica del

paciente. No se debe extraer nunca una muestra si la identificación de la

solicitud no coincide con la identificación del paciente.

3.2.2. Identificación inmediata de les muestras después de la

extracción

Las muestras de sangre se identificaran correctamente en el momento de la

extracción en la cabecera del paciente con el nombre y los apellidos del

receptor, el número de identificación del paciente (historia clínica) y la

fecha de la extracción.

La realización correcta de este procedimiento evita la aparición de errores

en la identificación del paciente y de la muestra, previniendo posibles

reacciones transfusionales fatales.


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Esquema obtención de muestras

Para las pruebas pre-transfusionales se utiliza preferentemente sangre total

anticoagulada con EDTA.

Adulto o peso superior a 20 Kg: de 7-10 ml (no menos de 3 ml)


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Niño de menos de 20 Kg: 1-3 ml. En neonatos se aceptan capilares

heparinizados.

Se puede obtener la muestra de una vía de infusión si el paciente está

recibiendo medicación intravenosa. Antes de la extracción de la muestra se

hará un lavado de la vía con solución salina y se rechazaran siempre los

primeros 10 ml de la sangre extraída ya que la medicación que está

recibiendo podría interferir en la pruebas serológicas del paciente.

El intervalo aceptable entre la fecha de extracción de la muestra de sangre y

la de la transfusión tiene que ser:

<72 horas, si existen antecedentes de transfusiones, embarazos o

trasplantes en los últimos 3 meses.

>72 horas si no hay los antecedentes anteriores.

3.2.3. Recepción de la muestra

Cuando se recibe una muestra en el laboratorio, un miembro cualificado de

su personal tiene que confirmar que la información de la etiqueta de los

tubos y la de la solicitud transfusional son idénticas. En caso de discrepancia

o duda sobre la identidad del paciente se obtendrá una nueva muestra. Es

totalmente inaceptable la corrección de una muestra incorrectamente

identificada.

Una vez verificado que no hay errores de identificación se dará un número

de seguridad transfusional para cada tubo extraído y uno para la solicitud

transfusional.

Al recibir una muestra en el laboratorio se tiene que observar su aspecto. Si

las muestras presentan un aspecto anómalo, el responsable médico decidirá

si se acepta o se solicita nueva muestra.

Las anomalías que se observan con más frecuencia son:

Color anómalo del plasma: rojo, marrón o ámbar oscuro. Pueden

indicar presencia de hemólisis.

Muestra coagulada.

Suero muy acuoso y hematocrito muy bajo. Puede ser debido a que

la muestra se haya extraído de una línea de infusión y que la

muestra esté diluida.


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Las muestras mal identificadas, insuficientes o con aspecto anómalo se

rechazarán y se obtendrá nueva muestra.

3.2.4. Almacenamiento de muestras

- C un mínimo de 7 días

después de la transfusión.

Suero o plasma: tiempo no inferior a 10 días a una temperatura de ≤- C

El almacenamiento de las muestras del paciente y del donante (concentrado

de hematíes) hace que sea posible repetir las pruebas o realizar pruebas

adicionales si el paciente presenta una respuesta desfavorable a la

transfusión.

4. Pruebas pretransfusionales: componente y receptor

La realización de las pruebas pretransfusionales sirve para seleccionar para cada

receptor los componentes sanguíneos más adecuados para que una vez

transfundidos tengan una supervivencia óptima y no se produzca una

destrucción clínicamente significativa de los hematíes del receptor.

En las pruebas pre-transfusionals se incluyen:

• Identificación positiva del receptor y de la muestra de sangre de este.

• Revisión de los registros del servicio de transfusiones para buscar

resultados previos de las muestras del receptor (historial receptor).

• Determinación de grupo ABO y Rh (D).

• Determinación de anticuerpos irregulares.

• Pruebas de compatibilidad con el suero o plasma del receptor y los

hematíes del donante (pruebas cruzadas).

• Etiquetado de los componentes con la información del receptor.

Realizar correctamente las pruebas pre-transfusionales asegura que se

administre a un paciente los componentes sanguíneos designados, que estos

componentes sean ABO compatibles y que se puedan detectar la mayoría de

anticuerpos irregulares clínicamente significativos.


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4.1. Identificación positiva del receptor y de la muestra de sangre.

Cuando se realiza una extracción de sangre se tiene que identificar siempre

al paciente de manera positiva comparando la información de la solicitud

transfusional con la que obtendremos del paciente si está consciente y

orientado. Si no, obtendremos la información de la pulsera del paciente o

preguntando al DUI responsable o al acompañante. No se debe extraer la

muestra si la información de la solicitud y la pulsera no coinciden

4.2. Revisión de los registros del servicio de transfusiones

Las pruebas de compatibilidad han de incluir la comprobación de la historia

serológica del receptor en los registros del servicio de transfusión. Se

compararan ( si el paciente tiene ya historia transfusional anterior) los

resultados actuales con los resultados anteriores del receptor: Grupo ABO /

Rh (D), anticuerpos clínicamente significativos, dificultades en el estudio del

paciente, las pruebas de compatibilidad realizadas, los componentes

sanguíneos transfundidos, reacciones adversas a la transfusión, requisitos

especiales de la transfusión y cualquier incidencia encontrada.

Una de les informaciones más significativa que se puede obtener de los

registros es la existencia de anticuerpos clínicamente significativos. La

especificidad de los anticuerpos detectados en estudios anteriores ha de

compararse con la de los anticuerpos que se detecten en el último estudio

realizado.

4.3. Determinación del grupo ABO y Rh (D)

El examen del grupo ABO debe incluir siempre una prueba sobre los

hematíes que llamaremos parte o prueba globular, donde están los

antígenos y otra sobre el suero que llamaremos parte o prueba sérica en la

que se encuentran los anticuerpos. Estas dos partes son inseparables a la

hora de clasificar el grupo sanguíneo. Si los resultados de ambas partes no

son los esperados el grupo queda invalidado, deberán hacerse las

investigaciones oportunas para averiguar las causas de dichas discrepancias

hemático/séricas que ampliaremos más adelante.


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En la parte globular enfrentaremos los reactivos correspondientes con los

hematíes que queramos analizar ya sean del donante o receptor. Estos

reactivos son comerciales y se denominan:

Reactivo anti A que reaccionará con el antígeno A. Por lo tanto una

reacción positiva significa que hay aglutinación entre antígeno y

anticuerpo, de esta forma podemos decir que hay presencia de

antígeno A. Si por el contrario no hay aglutinación y no se ven los

hematíes aglutinados no hay antígeno A.

Reactivo anti B que reaccionará con el antígeno B. Por lo tanto una

reacción positiva significa que hay aglutinación entre antígeno y

anticuerpo, de esta manera podemos decir que hay presencia del

antígeno B. Si por el contrario no hay aglutinación y no se ven los

hematíes aglutinados no hay antígeno B.

Reactivo anti AB que reacciona en presencia del antígeno A y/o del

antígeno B. Por lo tanto una reacción positiva indica presencia del

antígeno A y/o B.

En la parte sérica enfrentaremos el suero del donante o receptor, con

hematíes A y hematíes B cuya aglutinación indicará la existencia de

Ejemplo de la aglutinación de la parte globular con los reactivos anti A, anti B i anti AB


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anticuerpos anti A y/o anticuerpos anti B en dicha parte sérica. Este

resultado siempre será coherente con la parte globular, pero si no lo es

estaremos ente una discrepancia sérica que deberemos de investigar para

llegar a la correcta determinación del grupo sanguíneo.

A continuación veremos unas imágenes que describen esta determinación

al completo, es decir parte globular y parte sérica.

Control Albúmina

Reactivo anti D

Aquí veríamos representada la opción manual con placa, pero

habitualmente este proceso de determinación tanto del grupo como del Rh

Parte globular Parte sérica

Aglutinación positiva

Grupo O

Grupo AB

Aglutinación negativa


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está automatizado con máquinas que utilizan los mismos reactivos pero

adaptados a la forma de tarjeta con microtubos. Esto lo vemos en la

siguiente figura.

GRUPO B POSITIVO

Automatización de la determinación del grupo sanguíneo y Rh. Con

tarjeta. Vemos representados los mismos reactivos. Aquí la

interpretación positiva, es decir que existe aglutinación sería ver la línea

de los hematíes arriba del todo y negativa abajo del todo.

En esta figura vemos muy bien reflejadas las aglutinaciones que

determinan que sea un B pos. En la parte globular aglutinan los hematíes

B por lo tanto hay antígeno B y en la sérica aglutinan los anticuerpos anti

A. Por lo tanto sigue el mismo patrón del grupo B. También vemos como

aglutina el Rh cuya línea de hematíes está arriba del todo. El resultado

final es de un B positivo.

Los soportes utilizados en Banco de Sangre para la realización de las

pruebas pueden ser:

Tarjeta con microtubos

Tubo de cristal

Placa de opalina o plástico

Tarjetas tipo cartulina

Los indicadores de la reacción Ag-Ac más utilizados en banco de sangre

son la aglutinación que tiene lugar cuando el Ac fijado se une a los

hematíes adyacentes formando grumos visibles.

Resultado positivo

Resultado negativo


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Los Acs IgM causan aglutinación con facilidad, sin embargo la

sensibilización por Acs IgG no produce aglutinación porque la molécula

es demasiado pequeña para cubrir la distancia entre hematíe y hematíe.

Por ese motivo, para detectar la sensibilización IgG se utiliza la prueba de

antiglobulina (prueba de coombs), que se fundamenta en la utilización

de un suero antiglobulina humana que formará puentes de unión con las

moléculas IgG o complemento ya fijadas a los hematíes actuando como

puente y favoreciendo su aglutinación.

4.4. Estudio de la discrepancia sero-hemática

Se produce una discrepancia cuando la interpretación de las pruebas de

determinación del grupo hemático no coincide con el sérico. En estos

casos deben anotarse los resultados discrepantes.

La interpretación del grupo ABO debe retrasarse hasta que se resuelva la

discrepancia. Si la sangre que se está analizando es una unidad de

donante, no puede autorizarse para transfusión hasta resolver la

discrepancia de resultados. Cuando la sangre proviene de un posible

receptor, el estado clínico del paciente puede hacer necesario

administrar hematíes del grupo O con factor Rh compatible antes de

finalizar el estudio. Es importante obtener cantidades suficientes de

sangre de un paciente antes de la transfusión para que puedan realizarse

los estudios adicionales que puedan ser necesarios para resolver la

discrepancia.

Las discrepancias entre los resultados de las pruebas hemática y sérica

pueden deberse:

Aglutinación positiva que determina resultado positivo

Aglutinación negativa que determina resultado negativo


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Errores técnicos

Los problemas técnicos pueden producir discrepancias en las

pruebas ABO bien por la obtención de resultados negativos en lugar

de positivos o positivos en lugar de negativos. Los problemas

técnicos que producen falsos negativos en las pruebas ABO

realizadas con hematíes o suero son debidas a:

o No añadir suero o antisuero a una prueba.

o Identificar la hemólisis como negativa.

o Inadecuada relación suero (o antisuero)/hematíes.

o Centrifugado incorrecto.

o No incubar a temperatura de 20-25ºC o menos.

o Uso de reactivos que no funcionen adecuadamente.

o No interpretar o registrar los resultados correctamente.

Los problemas técnicos que producen falsos positivos en la prueba

incluyen:

o Sobrecentrifugación

o Uso de antisueros, hematíes o solución salina contaminados.

o Uso de utensilios de vidrio sucios.

o Interpretación o registro incorrecto de los resultados.

Factores intrínsecos de los hematíes

o Las muestras obtenidas de pacientes que han recibido

recientemente transfusiones o trasplante de médula ósea

pueden dar lugar a reacciones inesperadas si contienen una

mezcla de hematíes no homogéneos en cuanto a su grupo

ABO.

o Las muestras de sangre de personas que han heredado

variantes de genes A o B pueden tener antígenos débilmente

expresados. También pueden detectarse antígenos

débilmente expresados en los hematíes de algunos

individuos con enfermedades como la leucemia. Las

muestras de estos pacientes pueden no producir las

reacciones esperadas en las pruebas de aglutinación directas

con anti-A y anti-B.


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o Las anomalías de naturaleza heredada o adquirida que

conducen a lo que se llaman estados poliaglutinables

pueden dar lugar a hematíes con membranas modificadas.

Los hematíes modificados pueden aglutinarse

inesperadamente por reactivos anti A, anti B o ambos.

o Las concentraciones anormales de proteínas séricas, la

presencia de macromoléculas (en muestras de sangre de

cordón, la presencia de gelatina de Wharton), pueden

producir agregaciones inespecíficas que simulan la

aglutinación si se suspenden los hematíes en su propio

suero.

o Se ha observado que, en raras ocasiones, las

concentraciones elevadas de sustancias del grupo A o B en

suero inhiben la actividad de los antisueros de tal manera

que se obtienen reacciones negativas inesperadas cuando se

utilizan hematíes resuspendidos en suero o plasma.

o Los sueros de algunas personas contienen anticuerpos

contra los colorantes utilizados para colorear los reactivos

anti A y anti B. Estos anticuerpos pueden producir falsos

positivos en las reacciones de aglutinación si se suspenden

los hematíes en suero o plasma para realizar la prueba.

Factores intrínsecos del suero

o Frecuentemente, en las pruebas de determinación del grupo

ABO que utilizan plasma o suero no totalmente coagulado se

producen pequeños coágulos de fibrina. Los coágulos de fibrina

pueden interpretarse erróneamente por una aglutinación

verdadera.

o Los sueros de pacientes con concentraciones séricas

anormalmente elevadas de proteínas anómalas, que presentan

relación suero/proteínas alterada, o que han recibido

expansores del plasma de elevado peso molecular o materiales

de contraste intravenoso pueden dar lugar a una agregación

inespecífica de los hematíes en las pruebas de determinación del


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grupo sérico. Esta agregación es difícil de distinguir de una

aglutinación verdadera.

o La muestra puede contener anticuerpos distintos a los anti A y

anti B que produzcan una aglutinación inesperada de los

eritrocitos reactivos A y B.

o Podemos obtener resultados falsos positivos si la muestra de la

prueba contiene anticuerpos contra los constituyentes químicos

de los diluyentes utilizados para conservar los hematíes A y B. La

interacción entre los anticuerpos y las sustancias químicas

produce reacciones inespecíficas con los hematíes que da lugar a

reacciones inesperadas de aglutinación.

o Pueden presentarse resultados débiles o negativos inesperados

en las pruebas séricas si la muestra que se está analizando

proviene de una persona inmunodeficiente debido a una

enfermedad o tratamiento y tiene niveles descendidos de

inmunoglobulinas. También pueden observarse pruebas ABO

séricas débiles en muestras de pacientes ancianos cuyos niveles

de anticuerpos han disminuido con la edad, y en muestras de

pacientes cuyos anticuerpos se han diluido de manera

importante en procedimientos de recambio plasmático (tema

que veremos en otro capítulo).

o Se observan resultados negativos o débiles en las pruebas

séricas si se realizan con muestras de niños de menos de 4-6

meses de edad. Las pruebas séricas no se realizan de manera

rutinaria con muestras de recién nacidos ya que los anticuerpos

que contienen provienen generalmente de la transferencia in

útero de la madre.

o En las pruebas séricas, el suero del paciente puede contener

anti-A y anti-B inusualmente potentes que fijan el componente

C1 del complemento hasta tal punto que éste interfiere con la

fijación del anticuerpo y la aglutinación. Este fenómeno ha sido

publicado por un laboratorio en pruebas de detección de grupo

en suero que utilizaban hematíes suspendidos en diluyentes sin

EDTA.


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Factores extrínsecos a la prueba

Estarían relacionados con los problemas previos a la realización de la

prueba como por ejemplo errores en la extracción del tubo, por no

ser el tipo de tubo adecuado o la proporción hematíes

anticoagulante.

A continuación indicaremos unas pautas a seguir en cuanto a la resolución de

discrepancias en función de cuál sea su posible causa.

4.5. Resolución de las discrepancias ABO

Como muchas discrepancias son producto de errores técnicos, el primer

paso a tener en cuenta para resolver el problema debe ser, simplemente,

repetir la prueba con la misma muestra. Si se realizaran las pruebas iniciales

con hematíes suspendidos en suero o plasma, la repetición debe incorporar

hematíes lavados y resuspendidos en solución salina. Si persisten las

discrepancias, pueden incorporarse los procedimientos siguientes a la

investigación:

Obtener una nueva muestra de sangre de la unidad de donante o del

paciente y repetir las pruebas con la nueva muestra. Esto ayudará a

identificar las discrepancias debidas a muestras mal etiquetadas o

contaminadas.

Lavar los hematíes problema para eliminar el suero que puedan

producir reacciones positivas inesperadas

Analizar los hematíes frente a anti-A, B, anti-A1 o anti-H, según

corresponda al problema particular.

Analizar el suero frente a hematíes del grupo A2 si se sospechan

interferencias debidas a la presencia de anti-A1.

Analizar los hematíes de grupo O de adultos, grupo O de cordón

umbilical y hematíes autólogos para detectar interferencia de auto o

alocrioaglutininas distintas a las anti A y anti B.

Incubar los hematíes y suero a temperatura ambiente durante 30

minutos para facilitar la detección de antígenos o anticuerpos


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débiles. Tambien pueden incubarse las pruebas a 4ºC siempre que se

incluyan en paralelo los controles adecuados.

4.6. Resolución de discrepancias debidas a la ausencia de antígenos

esperados

Los hematíes de los grupos A y B normales presentan reacciones de

aglutinación potentes en presencia de los anticuerpos reactivos respectivos.

La potencia de las reacciones que se obtienen en las pruebas de

determinación de grupo que utilizan hematíes o suero indica a menudo la

causa de la discrepancia. Por ejemplo, un suero que no aglutina hematíes del

grupo A pero aglutina fuertemente del grupo B sugiere que la muestra de la

prueba pertenece al grupo A aunque los hematíes correspondientes no

reaccionan con anti A y anti B. Como se ha dicho anteriormente, en personas

que han heredado alelos variantes se producen discrepancias debidas a

formas debilitadas de los antígenos A o B. Estas también se producen en

pacientes con enfermedades que han producido una disminución de la

actividad antigénica. En estos casos, los antígenos pueden deprimirse de tal

manera que no serán detectados en las pruebas de aglutinación directas de

rutina. Pueden utilizarse los siguientes procedimientos para facilitar la

detección de antígenos débilmente expresados.

Analizar los hematíes lavados con anti A y anti B durante 30 minutos

a temperatura ambiente o a 4ºC. La prolongación de la incubación a

temperatura ambiente o a 4ºC puede facilitar la detección de

antígenos A o B débiles por antisueros reactivos.

Tratar los hematíes del paciente con enzimas proteolíticos como

papaína o bromelina. Estos enzimas potencian las reacciones,

haciendo posible de esta manera visualizar más la reacción.

Incubar una parte de los hematíes problema a temperatura

ambiente con anti A o anti B (según la discrepancia) para adsorber el

anticuerpo sobre los antígenos eritrocitarios. Una vez adsorbido

lavar bien los hematíes y preparar un eluido. Analizar luego este

eluido frente a hematíes de los grupos A, B y O. Si los hematíes


23

tienen el antígeno A, el eluido aglutinará los hematíes A, pero no los

B u O.

Analizar la presencia en saliva de sustancias A o B y H con el método

para las pruebas de hemaglutinación-inhibición de antígenos

salivares. La condición de secretor se refiere a la presencia o no de

antígenos A B y H en las secreciones glandulares.

Las personas Bombay tienen genes normales A y B pero no pueden

producir sustancia H, precursora tanto del antígeno A como del B. En

consecuencia , los eritrocitos Bombay no pueden producir antígeno

A ni B de modo que su fenotipo aparente es O.

4.7. Resolución de discrepancias debidas a reacciones inesperadas con

anti A y anti B

En algunos casos, se obtienen reacciones positivas inesperadas en las pruebas

de determinación de grupo que utilizan hematíes. Por ejemplo, los hematíes

de una muestra se aglutinan débilmente en pruebas con anti A aunque el

suero correspondiente produjera las reacciones esperadas de un grupo B u O

normal. Situaciones como esta pueden producirse por la herencia de un alelo

variente en el locus ABO, o por otros problemas sin relación con las acciones

de los genes ABO. A continuación haremos una breve descripción de aquellos

casos que pueden conducir a la aparición de reacciones inesperadas en las

pruebas de determinación de grupo y los pasos que pueden darse para

identificar sus causas.

4.7.1. Fenotipo B adquirido

El estado B adquirido debe considerarse cuando el suero de un paciente

contiene anti B y sus hematíes parecen pertenecer al grupo AB con

antígeno B débil. El fenotipo B adquirido se produce por modificación del

antígeno A debida a la acción de enzimas microbianas denominadas

desacetilasas. Los enzimas modifican los azúcares celulares A

inmunodominantes (GalNAc) transformándolos en unidades más

parecidas al azúcar B (Gal).


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Los hematíes A son el único grupo que muestra in vivo actividad B

adquirida. Cuando se encuentran presentes en número suficiente, los

antígenos B adquiridos reaccionan con anti B humano en pruebas de

aglutinación directas. Aunque muchos ejemplos de hematíes con

antígenos B adquiridos reaccionan débilmente con anti B, pueden

encontrarse algunos ejemplos que aglutinan con una gran intensidad.

Para confirmar que los hematíes A tienen estructura de B adquirida

debemos:

Comprobar el diagnóstico del paciente. Los antígenos B

adquiridos tienen tendencia a asociarse con el carcinoma de

colón o recto, infección con microorganismos gramnegativos y

obstrucciones intestinales.

Analizar el suero del paciente frente a sus propios hematíes. El

anti B en el suero del paciente no aglutinará sus propios

hematíes si éstos tienen determinante B adquirido.

Analizar los hematíes reactivo anti B monoclonal. Algunos

reactivos monoclonales, a diferencia de los anticuerpos de

origen humano, no reaccionan con el fenotipo B adquirido.

Analizar los hematíes con suero anti B humano acidificado ya

que los estos sueros no reaccionan con el receptor B adquirido.

Si el paciente es un secretor, analizar la presencia de sustancias

A y B en su saliva. Los pacientes con eritrocitos que tienen

estructuras B adquiridas tendrán sustancia A, pero no B, en su

saliva.

4.7.2. Antígenos “A-like” adquiridos

Las discrepancias ABO se asocian a veces a poliaglutinación Tn. Los

hematíes Tn-activados tienen glucoproteínas que incorporan

oligosacáridos incorrectamente formados. Estas estructuras aparecen en

caso de alteración genética en una célula madre hematopoyética que da

lugar a la carencia de una glucosiltransferasa particular. Cuando se

analizan hematíes Tn de los grupos O,B,Tn, pueden comportarse como si

hubieran adquirido un antígeno de estructura parecida a la del antígeno


25

A que reacciona con reactivos anti A. El antígeno A-like de los hematíes

Tn puede diferenciarse del A que se origina por la acción de una

transferasa genética A si los hematíes se tratan con enzima proteolíticos

antes de realizar la prueba. Los antígenos A-like de los hematíes Tn son

destruidos por enzimas.

Existen otras formas de poliaglutinación que pueden interferir con las

pruebas de determinación del grupo ABO pero que debido a su

complejidad y su baja frecuencia no es significativo comentarlas.

4.7.3. Aglutinación en campo mixto

En algunos casos, se encuentran muestras que contienen dos

poblaciones distintas y separables de hematíes. Normalmente se

produce una mezcla cuando se transfunden hematíes O a un paciente de

grupo A (o B). Las mezclas de hematíes también se producen en una

condición que recibe el nombre de quimerismo. Una quimera es una

muestra de sangre que contiene más de una población de hematíes. Hay

quimeras naturales que son el resultado del intercambio intraútero del

tejido eritropoyético entre gemelos vitelinos. Menos frecuentemente, se

presenta cuando un paciente ha recibido un trasplante de médula ósea

de un grupo ABO distinto del suyo propio. En estos casos, las pruebas

para la determinación del grupo hemático pueden dar un patrón de

aglutinación mixto. Las reacciones en campo mixto producidas por

quimerismo pueden mantenerse durante todo la vida del donante. En

caso de trasplante de médula ósea, la reacción mixta desaparecerá

cuando se hayan eliminado de la circulación los hematíes propios del

paciente. La aglutinación en campo mixto también puede observarse con

hematíes que tienen antígenos A debilitados por enfermedades como la

leucemia, o con hematíes Tn.

4.7.4. Hematíes recubiertos de anticuerpo

Los hematíes de niños con enfermedad hemolítica del recién nacido

(EHRN), o de adultos afectos de anemia hemolítica autoinmune(AHAI) o


26

reacciones hemolíticas post-transfusionales pueden estar recubiertos de

moléculas de anticuerpo tipo IgG. Estos hematíes se aglutinan a menudo

espontáneamente en presencia de reactivos ABO con un alto contenido

en proteínas como el reactivo anti D dando aglutinaciones con falsos

positivos. Deberemos utilizar técnicas de adsorción y elución para

eliminar estos anticuerpos de los hematíes para que puedan analizarse

de manera fiable con anti A y anti B.

Los hematíes recubiertos de crioaglutininas IgM se aglutinarán

espontáneamente en las pruebas realizadas con soluciones salinas. Si se

lavan los hematíes varias veces con solución salina calentada a 37ºC,

pueden eluirse los anticuerpos de las membranas eritrocitarias. Si la

aglutinación por IgM no se anula mediante esta técnica, podemos utilizar

otras soluciones como por ejemplo el DTT.

4.8. Resolución de las discrepancias por reacciones séricas inesperadas

4.8.1. Ausencia de las reacciones séricas esperadas

Los pacientes con enfermedades inmunodeficientes pueden no producir

niveles detectables de anti A y anti B. Estos anticuerpos se encuentran

también ausentes en el suero de los recién nacidos y de muchos

pacientes ancianos. En estos casos, puede inferirse el grupo ABO sólo

con las pruebas hemáticas.

4.8.2. Anti A1

El anti A1 en el suero de personas pertenecientes a los subgrupos A2, u

otros puede aglutinar hematíes A1 en pruebas de determinación de

grupo sérico. Para identificar el anti A1 como causa de la discrepancia

haremos:

Analizar el suero frente a varios ejemplos de hematíes A1,

A2 y O (preferible 3 muestras de cada uno). El anticuerpo es

anti A1, si solo aglutina todas las muestras de hematíes A1 y

ninguna de las A2 y O.


27

Analizar los hematíes del portador del anticuerpo

precedente con anti A1. El anti A1 puede hacer que las

pruebas de compatibilidad con unidades A1 den resultados

de incompatibilidad. En la mayoría de los casos estos

anticuerpos sólo reaccionan a temperaturas inferiores a los

30ºC y se consideran clínicamente no significativos. Sin

embargo, se han hallado casos que reaccionan a 37ºC. Los

anticuerpos activos a esta temperatura deben considerarse

clínicamente significativos. En estos casos sólo deben

utilizarse para transfusiones los hematíes A2 u O.

4.8.3. Autoanticuerpos fríos

Cuando crioaglutininas tienen potencia suficiente, pueden aglutinar

hematíes de todos los adultos, incluyendo aquellos utilizados para

preparar hematíes reactivos. Con pocas excepciones, la aglutinación

producida por crioaglutininas es más débil que la producida por anti A o

anti B. Pueden seguirse los pasos siguientes cuando la reactividad de las

autoaglutininas interfiere hasta el punto de dificultar la interpretación:

Calentar el suero y los hematíes reactivos a 37ºC antes de mezclarlos

y realizar la prueba.

Adsorber las crioaglutininas del suero mediante métodos de auto

adsorción en frío, así el suero adsorbido puede analizarse frente a

los hematíes reactivos A1 y B.

Tratar el suero con DTT y analizarlo frente a hematíes reactivos A1 y

B. Como el DTT destruye la actividad aglutinante de los anticuerpos

IgM, las pruebas de determinación de grupo sérico que utilizan

suero tratdo con DTT deben convertirse en pruebas AHG en las que

detectaremos la presencia de anticuerpos de la forma IgG.

4.8.4. Aloanticuerpos inesperados

Los aloanticuerpos inesperados reaccionan a temperatura ambiente y

pueden aglutinar los hematíes reactivos utilizados en las pruebas de


28

detección de grupo sérico que tengan el antígeno correspondiente. Para

determinar el grupo ABO correcto de los sueros que contengan otros

aloanticuerpos fríos:

Identificar el aloanticuerpo , tal como describiremos más adelante.

Analizar los hematíes reactivos A y B para determinar qué reactivo

tiene el antígeno correspondiente.

Analizar el suero frente a hematíes A y B que no tengan el antígeno

correspondiente. Por ejemplo , si tenemos identificado como

aloanticuerpo un anti M, analizar el suero frente a hematíes A ,M- y

hematíes B ,M-, es decir que ni los hematíes A ni B tengan el

antígeno M, para resolver la discrepancia.

4.8.5. Rouleaux

El suero de pacientes con concentraciones anormalmente elevadas de

proteínas séricas, que presenta una alteración de la relación

suero/proteínas o han recibido expansores de plasma de peso

molecular elevado, pueden dar lugar a que los hematíes parezcan

aglutinados. Algunas de estas muestras producen Rouleaux. Su

formación puede reconocerse fácilmente al microscopio si los hematíes

están agregados formando las llamadas “pilas de monedas”. Más

frecuentemente, estos sueros producen agregados que se manifiestan

como masas de formas irregulares muy parecidas a las masas

aglutinadas por la acción de anticuerpos. Los resultados de las pruebas

de determinación del grupo sérico pueden a menudo corregirse si se

sigue el procedimiento siguiente:

Diluir el suero para anular sus propiedades agregantes. Hacer una

dilución ¼ del suero y analizar la dilución frente a hematíes autólogos. Si

no se observa agregación, analizar el suero diluido frente a los hematíes

reactivos. En la mayoría de los casos, aunque no en todos, los

aloanticuerpos anti A y anti B reaccionarán a esta dilución.


29

5. La prueba cruzada y la investigación de anticuerpos irregulares

Todas las pruebas pretransfusionales tienen como objetivo seleccionar para cada

receptor potencial los componentes sanguíneos adecuados de forma que una

vez transfundidos tengan una supervivencia óptima. Estas pruebas tienen su

fundamento en que el organismo está dotado de un sistema inmunológico que

reconoce los antígenos extraños y los distingue de los antígenos propios,

desencadenando una respuesta inmune específica para dicho antígeno. Las

premisas generales y que nunca debemos de pasar por alto son las siguientes:

Asegurar siempre la compatibilidad ABO. Hablaremos de isogrupo

si transfundimos el mismo grupo que el del receptor y compatible

si no es el mismo grupo pero si compatible.

Utilizar sangre del mismo grupo Rh, sobre todo en mujeres con

edad fértil. En varones con escrutinio de anticuerpos irregulares

negativo y sin antecedentes de anticuerpos anti Rh, según las

disponibilidades del banco de sangre de tener sangre Rh- podremos

transfundir distinto Rh, siempre bajo la supervisión hematológica.

Cuando el donante y el receptor pertenecen al mismo grupo ABO y

Rh, la transfusión es compatible el 98% de los casos.

Para asegurar la compatibilidad en el 2% restante, son

fundamentales :

o El estudio de anticuerpos irregulares clínicamente

importantes en el suero del receptor.

o La prueba de compatibilidad directa entre el suero del

receptor y los hematíes del donante.

No debe olvidarse que la identificación inequívoca de las muestras de sangre,

tanto del receptor potencial como del componente o los componentes a

transfundir, es un aspecto fundamental, dado que la mayor parte de las

reacciones hemolíticas tienen su origen en errores de identificación de muestras.

La base de la compatibilidad es la identificación correcta del grupo ABO y Rh

tanto en el donante como en el receptor.


30

5.1. Grupo ABO y Rh

El grupo ABO y Rh debe realizarse en cada muestra recibida, y el resultado

compararse con los registrados en estudios previos.

Toda discrepancia entre la prueba sérica y hemática en el estudio del grupo

ABO debe resolverse antes de realizar la transfusión.

Si en el paciente se dan circunstancias que indican la transfusión con urgencia

extrema, se transfundirán hematíes del grupo O y Rh -.

5.2. Prueba cruzada

La prueba cruzada tiene doble finalidad:

Detectar incompatibilidad ABO entre bolsa y receptor

Detectar incompatibilidad de anticuerpos entre bolsa y receptor.

A menos que la situación sea urgente, generalmente se analiza el suero o

plasma del receptor con hematíes del donante antes de administrar los

hematíes; esto significa que se realiza una prueba cruzada mayor. La muestra

debe obtenerse y etiquetarse de forma inequívoca y los hematíes del

donante deben proceder de un segmento de tubo originario de la bolsa. Los

métodos utilizados deben incluir aquéllos que demostraran incompatibilidad

ABO y detectarán anticuerpos irregulares clínicamente significativos, y por lo

tanto deben incluir también una prueba de antiglobulina o prueba coombs.

No obstante, cuando no se detectan anticuerpos clínicamente significativos

en las pruebas de escrutinio de anticuerpos, y siempre que el paciente no

tenga historia de anticuerpos positivos, no es imprescindible la fase de

antiglobulina en las pruebas de compatibilidad o prueba cruzada. Es raro

detectar un anticuerpo clínicamente significativo en la fase de antiglobulina

de las pruebas cruzadas cuando la prueba de detección de anticuerpos es

negativa. La decisión de omitir la fase de antiglobulina de las pruebas de

compatibilidad en pacientes que cumplen estos criterios debe ser establecida

por criterio médico.

Si se detectan anticuerpos cínicamente significativos en el procedimiento de

escrutinio, es necesario realizar la fase de antiglobulina en la pruba cruzada.


31

Para detectar la presencia de Acs contra Ags eritrocitarios, en una primera

fase de sensibilización se incuba el suero del paciente con los hematíes

correspondientes para favorecer la unión Ag-Ac. En esta fase se puede

aumentar la sensibilización de la técnica y disminuir los tiempos de

incubación añadiendo distintos potenciadores (medio potencial iónico bajo )

o albúmina.

Las pruebas para demostrar incompatibilidad ABO son siempre necesarias. El

motivo más importante para realizar las pruebas cruzadas es que sirven como

comprobación final de la compatibilidad del grupo sanguíneo ABO. No es

necesario analizar los hematíes del receptor con el suero o plasma del

donante, es decir realizar la prueba cruzada menor. Esta prueba no se utiliza

en banco. Ya se han efectuado previamente pruebas de detección de

anticuerpos en muestras de aquellos donantes con escrutinio de anticuerpos

irregulares positivo.

La mayoría de las muestras analizadas presentan un escrutinio de anticuerpos

negativo, en estos casos la práctica habitual de la prueba cruzada recibe el

nombre de salina inmediata, enfrentando suero del paciente con hematíes

del receptor a temperatura ambiente con un tiempo corto de unos 5

minutos.

El soporte para realizar la prueba cruzada puede ser en tubo o tarjeta

coombs. En el soporte tubo se lleva a cabo la prueba cruzada en salina, es

decir no incubamos el suero a 37ºC. Esta determinación en salina que es más

rápida y sólo está indicada en receptores en los que no tenemos problemas

de discrepancia con el grupo sanguíneo ni tenemos presencia de anticuerpos

irregulares.

Cuando tenemos un receptor con anticuerpos irregulares positivos la prueba

cruzada se llevara a cabo en un medio de coombs a 37ºC ya sea en tubo o

tarjeta para potenciar esta fijación del antígeno – anticuerpo. Cuando se

detecta e identifica un anticuerpo con significado clínico, se deben encontrar

unidades negativas para ese antígeno para cruzarlas con el suero del

paciente.


32

En enfermos previamente transfundidos, y sobre todo en los

politransfundidos, debe recordarse la posibilidad de que una nueva

transfusión genere una respuesta inmune secundaria y reacción hemolítica

retardada; en ellos reviste especial importancia la relización de la prueba

cruzada con suero obtenido en los 48-72 horas antes, e idealmente en las 24

horas previas. Si la transfusión precedente fue incompatible en un enfermo

sensibilizado con aloanticuerpos de bajo título, éstos pueden ser

indetectables tanto en la prueba de escrutinio como en la prueba cruzada

directa, y probablemente es más resolutivo realizar una prueba de

antiglobulina directa en las pruebas pretransfusionales siguientes.

Si se han identificado aloanticuerpos en el receptor, la sangre seleccionada

para la prueba cruzada debe ser negativa para el antígeno correspondiente.

No debe olvidarse que, además de la aglutinación, la hemólisis es un signo de

incompatibilidad.

5.3. Escrutinio de anticuerpos

Implica la investigación en el suero o en el plasma del receptor de

anticuerpos frente a antígenos eritrocitarios (diferentes de las aglutininas

naturales anti A y anti B), utilizando para ello tres suspensiones distintas de

hematíes O, que deben poseer los antígenos eritrocitarios necesarios para

detectar anticuerpos clínicamente importantes desde el punto de vista

transfusional, es decir, capaces de inducir reacción hemolítica con

acortamiento de la vida media de los hematíes transfundidos.


33

5.4. Identificación anticuerpos irregulares

Una vez que se ha detectado la existencia de un anticuerpo irregular en las

pruebas, debe determinarse su especificidad y su significación clínica. Los

aloanticuerpos irregulares son anticuerpos distintos de los anticuerpos

naturales anti A y anti B. Estos aloanticuerpos se encuentran presentes

aproximadamente en un 0,3-2% de la población, según el grupo de pacientes

o donantes estudiados y la sensibilidad de los métodos utilizados. Algunos

anticuerpos producen la destrucción de los hematíes en pocas horas o incluso

minutos, mientras que otros acortan la supervivencia prevista en sólo unos

pocos días. La determinación de la especificidad de los anticuerpos

detectados en los análisis pretranfusionales es importante para valorar la

necesidad de seleccionar para la transfusión sangre antígeno negativa. Los

pacientes con anticuerpos clínicamente significativos deben recibir, siempre

que sea posible, sangre que carezca del antígeno contra el que han hecho

anticuerpos.

Cuando se habla de identificación de anticuerpos irregulares, en Banco de

sangre nos referimos a la realización de un panel. Este consiste en enfrentar

el suero problema con hematíes, en este caso de 11 células más un

autocontrol. Esta tabla la tenemos representada en la tabla siguiente.

Estos paneles de hematíes pueden adquirirse en casas comerciales. En cada

panel comercial se facilita una lista que recoge de forma detallada, el

fenotipo de cada muestra de hematíes. Para que sea eficaz un panel de

hematíes reactivos debe permitir identificar con confianza aquellos

aloanticuerpos clínicamente significativos que se detectan con mayor

frecuencia, como anti D, anti E, anti K y anti Fya.

Es importante también conocer cómo reacciona el suero problema con los

hematíes autólogos. Esto ayuda a determinar si están presentes

aloanticuerpos, autoanticuerpos o ambos.

A continuación presentamos una tabla con los diferentes sistemas antígenos

distintos del ABO con su importancia clínica:


34

Sistema antigénico Aloanticuerpo Importancia clínica

Rh (D, C/c, E/e) IgG HTR - EHRN

Lewis (Lea/Leb) IgG-IgM Rara HTR

Kell (Kell/k ) IgG HTR - EHRN

Duffy (Fya/Fyb) IgG HTR - EHRN

Kidd (Jka/Jkb) IgG HTR (a menudo tardía) EHRN (leve)

I / i IgM Ninguna

MN,Ss,U IgG/IgM EHRN rara anti-M; HDN-anti-S, anti-s

HTR, reacción transfusional hemolítica; EHRN, enfermedad hemolítica del recién nacido.

La identificación de anticuerpos irregulares la llevaremos a cabo en dos medios

Medio de coombs con hematíes sin papainizar y con tarjeta coombs. Es

un medio que se lleva a 37ºC.

Medio enzimático utilizando hematíes papainizados con tarjeta neutra.

Las técnicas enzimáticas más adecuadamente en las pruebas de

identificación de anticuerpos que en las pruebas pre-transfusionales.

Son especialmente útiles en los casos en los que se desea un aumento

de la sensibilidad, como en el estudio de las reacciones post-

transfusionales hemolíticas retardadas en las que ciertos anticuerpos

pueden no ser detectados por otros métodos. No obstante, si se utiliza

rutinariamente para la detección de anticuerpos un método enzimático,

nunca debe ser la única técnica utilizada debido a que habitualmente se

destruyen los antígenos M, N, S, Fya, Fyb y no se detectarían los

anticuerpos contra estos antígenos.

Todos los resultados obtenidos tanto positivos como negativos los

registraremos en el folleto adjunto marcando la intensidad de los resultados

positivos. La interpretación de estos resultados podríamos decir que consiste en

ver el patrón de resultados con que patrón antigénico coincide, esto es en líneas


35

generales sin embargo hay que hacer una secuencia de pasos para resolver la

identificación de estos aloanticuerpos. Estas secuencias las describimos a

continuación:

Autocontrol. Evaluar las reacciones de autocontrol. Si son negativas, se

excluye la presencia de autoanticuerpos. Si son positivas, considerar la

presencia de autoanticuerpos o aloanticuerpos producidos en respuesta

a una transfusión previa reciente.

Hematíes reactivos. No considerar inicialmente los antígenos presentes

en las muestras no reactivas. Es decir no considerar inicialmente los

resultados negativos.

Hematíes autólogos. No considerar los anticuerpos contra antígenos

presentes en los hematíes autólogos.

Hematíes tratados con enzimas. Examinar los fenotipos de las muestras

que reaccionan con los hematíes no tratados, pero no son reactivas (o

más débiles) frente a hematíes tratados con enzimas.

Patrón de reacción. Examinar los patrones de reacción en cada fase de

la prueba, recordar las posibles especificaciones implicadas y considerar

posibles especificaciones e relación a la fase de la prueba y el tipo de

reactividad.

Pruebas adicionales. Analizar un número suficiente de muestras de

hematíes de fenotipo adecuado. Analizar el suero frente a hematíes con

dosis doble de los antígenos contra los cuales el suero puede contener

anticuerpos, si éstos no se encontraban presentes en las muestras

anteriormente no reactivas.

6. Reacciones de sensibilización, aglutinación y prueba de la

antiglobulina humana

6.1. Reacción antígeno-anticuerpo en inmunohematología:

La interacción antígeno-anticuerpo puede ser detectada por diversas técnicas

serológicas. Los métodos utilizados con mayor frecuencia en el banco de

sangre tienen como resultado la hemólisis o la aglutinación de los hematíes.


36

La hemólisis de los hematíes se produce si se activa la secuencia completa del

complemento después de la interacción antígeno- anticuerpo. Muchos

anticuerpos activan el complemento, pero la secuencia se interrumpe a

menudo a nivel de C3; por ello la lisis in vitro raras veces se produce.

La aglutinación de los hematíes es el indicador de la reacción antígeno-

anticuerpo más comúnmente usado.

Los anticuerpos aglutinan a los eritrocitos en 2 etapas:

1. La primera es la sensibilización, mediante la cual el anticuerpo se une

físicamente al antígeno en la superficie del hematíe.

2. La segunda es la aglutinación. En ésta los hematíes, a los cuales los

anticuerpos se unieron, aglutinan formando puentes entre ellos para crear

una estructura de enrejado.

Para que la sensibilización produzca aglutinación visible, es preciso que la

porción Fab del anticuerpo pueda unirse a los hematíes adyacentes, para lo

cual éstos deberán estar suficientemente próximos.


37

En algunas reacciones antígeno-anticuerpo las 2 etapas ocurren casi

simultáneamente, mientras que en otras sólo ocurre la primera etapa de la

reacción, es decir, hay sensibilización de los eritrocitos por anticuerpos no

aglutinantes.

La sensibilización por IgG no produce aglutinación debido a que la molécula

de anticuerpo es demasiado pequeña para cubrir la distancia entre hematíe y

hematíe.

Por lo contrario, la molécula de IgM puede causar la aglutinación con

facilidad. Para que tenga lugar la aglutinación deben ser vencidas las fuerzas

de repulsión que normalmente mantienen separados los hematíes.

6.2. Teoría del potencial Zeta

En inmunohematología eritrocitaria, el fenómeno de aglutinación de los

glóbulos rojos producido por la reacción entre anticuerpos y antígenos de

grupos sanguíneos, constituye la base de casi todas las técnicas aplicadas en

la “serologia de los grupos sanguíneos”.


38

Existen varias teorías para explicar por qué los hematíes no aglutinan en

condiciones normales. La teoría del potencial Zeta, es la más aceptada.

Para la comprensión de los fenómenos de hemoaglutinación, necesitamos de

un modelo más complejo, con base en procesos físico-químicos, donde el

factor más importante a ser considerado es la distancia media que separa los

glóbulos en suspensión. Esta distancia puede ser disminuida por la adición de

anticuerpos u otras substancias al medio, hasta un punto crítico en que la

aglutinación ocurre.

Los glóbulos rojos se comportan como partículas electronegativas. Los grupos

carboxílicos de las sialo-glucoproteínas (ácido siálico ) de la membrana

eritrocitaria son los mayores responsables de esta electronegatividad.

En medio salino (NaCl al 0,85%), los iones positivos de sodio (Na+) son

atraídos por las cargas negativas de los glóbulos rojos, creando una nube de

cargas positivas, que genera una fuerte repulsión interglobular.

La nube de iones positivos que involucra cada glóbulo, se vuelve menos

densa mientras se aleja del glóbulo. La diferencia de potencial eléctrico

creada entre la nube de iones positivos (Na+) cerca del glóbulo y el medio con

iones de sodio y cloruro en equilibrio (neutro), se llama “Potencial Zeta”. La

fuerza de repulsión entre los glóbulos rojos, en medio salino, depende del

valor del potencial zeta.


39

Considerando la carga eléctrica del glóbulo rojo , la fuerza iónica del medio

de la suspensión ( ) y la constante dieléctrica del medio , Pollack desarrolló la

siguiente expresión del potencial zeta (Z):

“Z = f ”, o sea, la diferencia del potencial zeta es una función que varia

directamente con la electronegatividad de la membrana eritrocitaria e

inversamente con la constante dieléctrica del medio de suspensión (D) y con

la raíz cuadrada de su fuerza iónica ( u).

Desde el punto de vista físico-químico, la aglutinación ocurre por la

agregación de los glóbulos rojos (aglutinados), cuando la distancia media

entre ellos se reduce hasta un valor mínimo. Esta distancia depende de los

valores de dos fuerzas antagónicas: la “tensión interfacial” (fuerza de

cohesión), que tiende a agregar los glóbulos rojos y la “fuerza de repulsión”,

debida a los escudos de cargas positivas creados alrededor de los glóbulos

(cargas iguales se repelen).

En la ausencia de agentes aglutinantes, la fuerza de repulsión predomina y

mantienen la suspensión globular estable en medio salino.

El potencial Zeta de un sistema puede ser cambiado de dos maneras:

• Por la reducción de la carga eléctrica de la membrana eritrocitaria:

Se incluye en esta categoría, los efectos debidos al tratamiento de

los glóbulos rojos con enzimas proteolíticas, que sacan fragmentos

de glucoproteínas de la membrana, reduciendo su

electronegatividad y al efecto de la fijación de anticuerpos sobre la

membrana eritrocitaria.

• Cambios en la composición del medio:


40

Los efectos debidos a los cambios de la fuerza iónica y de la

constante dieléctrica del sistema. La aglutinabilidad de un sistema

es más alta mientras más bajo sea el valor del potencial Zeta.

Los cambios indicados pueden afectar a la sensibilización y a la aglutinación.

Si se disminuye la densidad de la nube de cationes, los anticuerpos pueden

acercarse más fácilmente a la superficie de los hematíes, favoreciendo así a la

sensibilización de los mismos.

La reducción del potencial Zeta permite un mayor acercamiento entre los

hematíes, con lo cual se facilita la aglutinación.


41

6.3. Factores que influyen sobre la sensibilización de los hematíes.

6.3.1 Proporción relativa del antígeno y del anticuerpo

La velocidad de formación del complejo antígeno-anticuerpo varía con el

número de moléculas de anticuerpo presentes en el medio y con el número de

sitios antigénicos presentes en cada célula. Al aumentar la cantidad de

anticuerpos en el medio puede aumentar la sensibilidad de la prueba, asimismo,

al aumentar la proporción de suero (que contiene el anticuerpo) en relación con

los hematíes (que contienen el antígeno) se proveen más anticuerpos por zonas

antigénicas.

6.3.2. pH del medio donde se produce la reacción

El punto isoeléctrico de la mayoría de los anticuerpos es aproximadamente 7,5.

A un pH inferior al punto isoeléctrico el anticuerpo tiene carga positiva. Esto

facilita su unión con los eritrocitos (carga negativa). Anticuerpos como los anti-M

reaccionan mejor a pH bajo, y para los anti-D se reporta el pH óptimo entre 6,5 y

7,0. Por esta razón el pH óptimo para la sensibilización está entre 6,5 y 7,5.

6.3.3. Temperatura

La mayoría de los anticuerpos de grupos sanguíneos reaccionan en un rango

restringido de temperatura. Las reacciones antígeno – anticuerpo son

exotérmicas; por lo tanto, a temperaturas más bajas la velocidad de reacción

disminuye y existe menor grado de fijación de anticuerpo. Los anticuerpos de la

clase IgM son más reactivos a bajas temperaturas (4-27 °C), mientras que los de

la clase IgG lo son a 37 °C. Por este motivo, las técnicas de detección de

anticuerpos abarcan gamas de temperaturas de 22-37 °C ó 30-37 °C.

La temperatura también puede afectar la accesibilidad del antígeno situado en la

membrana del glóbulo rojo. Algunos anticuerpos del tipo IgM se fijan a sus

correspondientes antígenos a temperaturas inferiores a 37 ºC. Dichos

anticuerpos se denominan anticuerpos fríos.


42

Esta influencia de la temperatura se explica porque dependiendo de la misma, se

producen cambios de configuración en el antígeno.

Aquellos anticuerpos que reaccionan in vitro a temperaturas por debajo de 37

°C, no se consideran clínicamente significativos y rara vez destruyen eritrocitos

transfundidos. Algunos anticuerpos de la clase IgM pueden activar el

complemento a temperaturas por debajo de 30 °C, pero sólo acortan de forma

mínima la supervivencia de eritrocitos incompatibles transfundidos. Los

anticuerpos clínicamente significativos son aquellos que tienen actividad in vivo

que se manifiesta in vitro al reaccionar a 37 °C.

Anticuerpos fríos

6.3.4. Potencial iónico del medio

En una solución salina normal, los iones Na+ y Cl- se agrupan alrededor de las

moléculas de antígeno y anticuerpo, y neutralizan parcialmente sus cargas

opuestas.

Cuando los hematíes están en suspensión salina de bajo potencial iónico, la nube

de cationes que rodea a los hematíes es menos densa. La concentración

disminuida de cationes alrededor de los glóbulos rojos permite a las moléculas

de anticuerpo tener más fácil acceso a los lugares antigénicos de la membrana

eritrocitaria, aumentando así la tasa de sensibilización.

6.4. Factores que influyen sobre la aglutinación de los hematíes.

La aglutinación se produce cuando los hematíes están lo bastante próximos para

permitir a una molécula de anticuerpo hacer de puente entre células

adyacentes. Este proceso puede estar afectado por varios factores entre los que


43

se incluyen las propiedades del medio utilizado para la suspensión globular y las

características del antígeno y del anticuerpo.

6.4.1. Potencial iónico del medio

Si bien la sensibilización aumenta cuando los glóbulos rojos están en suspensión

salina de bajo potencial iónico, la aglutinación de estos glóbulos rojos

sensibilizados se ve desfavorecida por un aumento del potencial Zeta. La

densidad de la nube iónica alrededor de los eritrocitos disminuye cuando el

potencial iónico desciende; ahora, el espesor de la nube aumenta por ser menor

la concentración de iones en el medio. Esto se traduce en un aumento del

potencial Zeta y por lo tanto, la aglutinación se hace más difícil.

Para aumentar la aglutinación, se debe separar a los eritrocitos de este medio,

lavándolos con suero salino isotónico normal.

6.4.2. Presencia de albúmina en el medio

Los anticuerpos que no aglutinan eritrocitos suspendidos en solución salina, en

ocasiones, los aglutinan cuando están suspendidos en albúmina bovina, esto es

posible porque la albúmina provoca un incremento en la constante dieléctrica

del medio en el que están suspendidos los eritrocitos y una disminución del

potencial zeta. La constante dieléctrica de un medio es una medida de su

habilidad para disipar cargas.

No todos los anticuerpos de los grupos sanguíneos aumentan su actividad en las

pruebas de albúmina. Los anti-A, anti-B y anti-Lewis muestran reducción de su

actividad en presencia de albúmina.

6.4.3. Tratamiento enzimático de los eritrocitos

Enzimas proteasas como la bromelina, tripsina, papaína y ficina se utilizan en las

pruebas serológicas porque reducen la carga de la superficie de los eritrocitos al

hidrolizar las sialoglicoproteínas de la superficie celular.


44

Cualquier mecanismo que elimine las cargas negativas de los eritrocitos reducirá

la distancia que los separa al disminuir el potencial zeta y así facilitar su

aglutinación por parte de anticuerpos de la clase IgG. La disminución de la carga

superficial de los glóbulos rojos permite un mayor acercamiento de éstos,

facilitando su aglutinación por las moléculas de anticuerpo. El tratamiento

enzimático de los eritrocitos también incrementa la accesibilidad de algunos

antígenos cuando las glicoproteínas son eliminadas.

Además de estas acciones, las enzimas proteolíticas eliminan zonas antigénicas

de otros anticuerpos como anti-M, -N, -S, -s, -Fya, -Fyb y Xga. Esta propiedad de

las enzimas proteolíticas son de gran utilidad en la identificación de anticuerpos

eritrocitarios.

6.4.4. Temperatura

El Tiempo de incubación afecta a la aglutinación. Los anticuerpos de los diversos

grupos sanguíneos tienen diferentes tiempos para alcanzar el equilibrio, en esto

interviene de manera significativa la clase de inmunoglobulina y la forma en que

se une con antígeno específico.

Estudios con eritrocitos suspendidos en suero o solución salina han demostrado

que del 100 % de anticuerpos RhD que se fijan, aproximadamente el 25 % lo

hace en los primeros 15 minutos y el 75 % restante lo hace durante la primera

hora. La adición de varios agentes potenciadores, por ejemplo disminución de la

fuerza iónica, puede aumentar la cantidad de anticuerpos fijados durante los

primeros 15 minutos, y con esto disminuir el tiempo de incubación necesario

para alcanzar el equilibrio.

6.4.5. Densidad del antígeno

Cuanto mayor es el número de antígenos en la superficie del eritrocito, mayor es

el grado de sensibilización. La fijación de moléculas de anticuerpos disminuye el

potencial Zeta y aumenta la aglutinación.

Por otra parte la mayor densidad del antígeno también aumenta las

probabilidades de que el anticuerpo pueda establecer puente entre los

hematíes.


45

El efecto de dosis es una vía por la que algunos antígenos pueden afectar la

fuerza de la reacción antígeno-anticuerpo. Algunos anticuerpos muestran

diferencias en la fuerza de sus reacciones, en dependencia de la cantidad de

antígeno presente en las células. A veces estas cantidades son proporcionales al

genotipo del individuo, por ejemplo, los eritrocitos M+ de un individuo de

genotipo MM contienen más antígeno M que los eritrocitos M+ de un individuo

de genotipo MN.

6.4.6. Agrupación y movilidad de los antígenos

La situación próxima de los antígenos en la membrana eritrocitaria facilita la

aglutinación ya que supone un mayor número de probabilidades para la fijación

del anticuerpo en el lugar antigénico determinado.

Los eritrocitos sensibilizados con anticuerpos de la clase IgM pueden crear la

estructura de enrejado en la segunda etapa de la reacción de aglutinación,

porque los anticuerpos de esta clase son capaces de cubrir la distancia que

separa a los eritrocitos entre sí por la repulsión de cargas iguales. De forma

contraria, los anticuerpos de la clase IgG son generalmente sensibilizantes, pero

no aglutinantes. El ser moléculas de pequeño tamaño y con 2 sitios de

combinación con el antígeno, les imposibilita vencer la distancia que existe entre

los eritrocitos y aglutinarlos.

6.4.7. Características del anticuerpo

La capacidad de un anticuerpo para aglutinar a los hematíes depende de la clase

de inmunoglobulina a que pertenece.

Dos de las características de los anticuerpos que deben considerarse son el

tamaño y el número de sitios de combinación con el antígeno, ya que entre los

anticuerpos de las clases IgG e IgM existen considerables diferencias físicas.

Los anticuerpos IgM pueden establecer puentes entre los eritrocitos y

aglutinarlos aún suspendidos en solución salina, mientras que los anticuerpos

IgG no. Esto es posible porque las moléculas de IgM son circulares y poseen 10

sitios de combinación con el antígeno, separados a una distancia de 300 Å; la


46

distancia que separa a 2 células normales es 184 Å y estos anticuerpos para

provocar la aglutinación de las mismas pueden combinar 2 ó 3 de sus sitios con

una, y el resto de los sitios con otra.

Las moléculas de IgG, a diferencia de las IgM, poseen sólo 2 sitios de

combinación con el antígeno y estos están separados a una distancia de 140 Å,

por lo tanto, para aglutinar 2 células sólo dispone de un sitio de combinacion

para cada una, estos a su vez se encuentran más cercanos uno del otro que los

sitios de la IgM.

6.5. Utilidad de la prueba directa e indirecta de la anti-globulina humana

La prueba de la anti-globulina humana o prueba de Coombs representa la

técnica más importante de aglutinación artificial en inmunohematología.

Por un procedimiento inmunológico, esta reacción nos permite revelar la

presencia de anticuerpos “no aglutinantes” en la membrana eritrocitaria.

Como se puede observar más abajo en el gráfico, la capacidad de aglutinación de

los anticuerpos de la clase IgG ligados a la AGH es similar al de los de clase IgM

que son naturalmente “aglutinantes”.

Decimos “procedimiento inmunológico”, porque los sueros de Coombs son

compuestos de anticuerpos contra anticuerpos humanos. Son producidos por la

inyección de cadenas leves y pesadas de IgGs humanas en animales (conejos u

ovejas), que producen anticuerpos contra las fracciones “Fc” de las

inmunoglobulinas humanas.


47

Los sueros de Coombs pueden ser “poliespecíficos o monoespecíficos”. Los

llamados poliespecíficos contienen, además de los anticuerpos contra fracciones

“Fc” de las inmunoglobulinas humanas, anticuerpos contra la fracción C3d del

Complemento que puede estar presente sensibilizando la membrana

eritrocitaria, en la presencia o ausencia de anticuerpos fijados. Los sueros

monoespecíficos contienen anticuerpos contra solamente un tipo de

inmunoglobulina (IgG, IgM o IgA) o contra fracciones del Complemento (C3c o

C3d).

La prueba de Coombs puede ser realizada de dos maneras: Coombs directo e

indirecto.

Por la prueba de Coombs directo (PCD), demostramos glóbulos rojos

sensibilizados in vivo por anticuerpos y/o fracciones del complemento. Se usa en

el diagnóstico de la Enfermedad Hemolítica del Recién-Nacido (EHRN), de la

Anemia Hemolítica Auto-Inmune (AHAI), de la hemólisis inducida por drogas y en

el diagnóstico de las reacciones hemolíticas pos transfusionales.


48

La prueba de Coombs indirecto (PCI) representa la reacción clave y de más

grandes posibilidades en inmunohematología y nos permite ejecutar una serie

de pruebas como investigación y identificación de anticuerpos antieritrocitarios,

pruebas de compatibilidad pre-transfusionales (prueba cruzada) y determinación

de antígenos eritrocitarios que no pueden ser evidenciados por aglutinación

directa (ejemplos: variantes débiles de RhD, antígenos Duffy, Kidd, Kell, etc).

La sensibilidad de la prueba de Coombs indirecto (PCI) puede ser aumentada por

procedimientos que cambian la primera etapa de la reacción, o sea, de la fijación

de los anticuerpos durante la incubación. Los más utilizados son: adición de

albúmina al 22% (BSA) o polietilenoglicol (PEG) al medio, uso de medios de baja

fuerza iónica (LISS) y la utilización de glóbulos rojos ya tratados por enzimas

proteolíticas.

La adición de albúmina o polietilenoglicol (PEG) aumenta la constante dieléctrica

(D) del medio de suspensión y baja el valor del potencial zeta (Z), favoreciendo la

aglutinación de los glóbulos rojos. Favorece también, la fijación inicial de los

anticuerpos a la membrana eritrocitaria por la disipación de iones positivos cerca

de la membrana, sin embargo este procedimiento es menos eficaz que la

disminución de la fuerza iónica del medio.

El uso de un medio isotónico de baja fuerza iónica (LISS), en la etapa de

sensibilización de los glóbulos rojos, aumenta considerablemente la velocidad de

fijación y la cantidad de anticuerpos fijados sobre la membrana eritrocitaria. Este

hecho nos permite aumentar la sensibilidad y disminuir el tiempo de incubación

de la prueba.

El uso de glóbulos rojos pre-tratados con enzimas proteolíticas (tripsina o

papaína) en prueba de Coombs indirecto (PCI), es un procedimiento indicado

para mejorar la detección de auto y aloanticuerpos como el anti-Rhessus y anti-

Kidd.


49

7. Soluciones potenciadoras de la unión antígeno-anticuerpo

Los potenciadores son las substancias que se utilizan para modificar el medio de

la prueba para promover la aglutinación de hematíes antígeno-positivos con los

anticuerpos correspondientes. Con esta finalidad se han desarrollado

potenciadores para la detección de anticuerpos irregulares en les pruebas de

rutina. Entre estas substancias potenciadoras, la albúmina bovina, las soluciones

de baja fuerza iónica y el polietilen glicol PEG), son las más utilizadas.

• Albúmina bovina:

El uso de la albúmina bovina se introdujo en 1945 y se utiliza para

potenciar la aglutinación directa de los hematíes por anticuerpos de la

clase IgG.

El 1965, Pollack y sus colaboradores investigaron el mecanismo de

acción de la albúmina y concluyeron que reducía el potencial zeta y así

permitía que los hematíes se aproximasen los unos con los otros y así se

produjera la aglutinación.

Posteriormente se demostró que el efecto de la albúmina por sí misma

en la primera fase de la reacción es mínimo y que el aumento de la

captación del anticuerpo puede ser debido a la fuerza iónica del

diluyente de la albúmina.

• Soluciones de baja fuerza iónica:

El uso de soluciones de baja fuerza iónica para incrementar la captación

de anticuerpo en la prueba de antiglobulina indirecta fue ser descrito en

1964 per Hughes-Jones y Elliot y colaboradores.

Existen dos clases de soluciones de baja fuerza iónica: el LISS simple o

tradicional y el LISS al que se han añadido macromoléculas para

potenciar la aglutinación directa por algunos anticuerpos,

principalmente los del sistema Rh.

Les soluciones de baja fuerza iónica aumentan la velocidad de asociación

entre los anticuerpos y los antígenos correspondientes y así se puede

reducir el tiempo de incubación necesario para detectar la mayoría de

anticuerpos.


50

• Polietilen glicol (PEG):

El uso de polietilen glicol (PEG) como potenciador de la reacción

antígeno-anticuerpo se describió en 1985 por Nance y Garraty.

PEG es un polímero linear de etilen glicol que afecta la primera fase de la

aglutinación. Provoca que los hematíes y los anticuerpos se aproximen y

así se incrementa la velocidad y la cantidad de la captación de

anticuerpo.

El uso de PEG incrementa la sensibilidad de las pruebas de detección de

anticuerpos irregulares clínicamente significativos mediante la prueba

de la antiglobulina indirecta.

• Enzimas:

En 1946 Pickles describió por primera vez el uso de las enzimas. Algunas

enzimas proteolíticas como la ficina, la papaína, la tripsina y la bromelina

se utilizan para la potenciación de reacciones serológicas, sobre todo la

de los anticuerpos de los sistemas Rh y Kidd.

Pero hay algunas desventajas en el uso de las enzimas en les pruebas de

laboratorio. Los antígenos M, N, S, Fya y Fyb son destruidos si están

tratados con enzimas, por lo tanto estos anticuerpos no podrán ser

detectados. Además las enzimas potencian anticuerpos fríos y eso hace

que algunos anticuerpos no significativos se puedan detectar y eso

interferiría en las pruebas de laboratorio.

No existe un reactivo perfecto para la potenciación de todos los anticuerpos de

importancia clínica. Cada uno de estos potenciadores tiene sus aplicaciones así

como sus limitaciones. La selección del medio de potenciación depende de la

experiencia del personal y de su preferencia.


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