SISTEMA DESCENTRALIZADO DE EVALUACION Y MONITOREO DE LABORATORIO PARA PERSONAS VIVIENDO CON VIH/SIDA EN TERAPIA ANTIRETROVIRAL PERIODO 2004 - 2009

Laboratorio de Salud Publica de Tacna Blgo. Carlos Javier Oblitas Ramos

RED NACIONAL DE LABORATORIOS EN SALUD PUBLICABagua 2000 Chachapoyas Tumbes Cajamarca 09/02/99 13/11/96 Piura 17/06/94 Chiclayo 27/10/95 La Libertad Huaraz 2000 Lima Huancayo 04/09/98 Iquitos 18/12/94

Tarapoto 25/07/94 Pucallpa 2000

Cusco 16/02/97 Puerto Maldonado 2000 Abancay 26/05/99 Puno 23/09/96

1

LAB. DE REFERENCIA NACIONAL

Huancavelica 2000 Ayacucho 23/07/94 Arequipa 06/11/96

24 LAB. DE REFERENCIA REGIONAL 04 Disas en Lima

Tacna 20/12/96

CONFIRMACION DEL DIAGNOSTICO DE VIH EN EL LABORATORIO NACIONAL DE REFERENCIA VIH/SIDA/INS PERU 1988-2009MUESTRAS CONFIRMADAS1988 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 7 201 239 479 838 594 895 1050 1524 2134 TOTAL CONFIRMADOS *hasta 11 de Septiembre |2009

AO1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009

MUESTRAS CONFIRMADAS2305 2416 2899 3639 2932 3014 3585 4560 4325 4210 4679 *5378 45124

IMPLEMENTACION DE UN SISTEMA DESCENTRALIZADO DE EVALUACION Y MONITOREO DE LABORATORIO PARA PERSONAS VIVIENDO CON VIH/SIDA EN TERAPIA ANTIRETROVIRAL PERIODO 2004 - 2009

OBJETIVO GENERAL Implementar un sistema descentralizado para evaluacin y monitoreo por laboratorio de la terapia antiretroviral que utilice tcnicas validadas y desarrolladas de acuerdo a los niveles de complejidad, equipamiento de los laboratorios y recursos disponibles, que favorezca el acceso nacional de las PVVIH a la terapia y se constituya en un eje importante de integracin intersectorial.

Criterios evaluados para la designacin de los laboratorios de la red descentralizada1.Factores relacionados a las pruebas de laboratorio: Pruebas para el recuento de linfocitos CD4 Pruebas para la determinacin de la carga viral 1.Factores relacionados al entorno: Numero de personas viviendo con VIH SIDA en espera de recibir terapia antiretroviral de gran actividad (TARGA). Nivel de accesibilidad geogrfica y coordinaciones intersectoriales. 1.Factores relacionados a las capacidades de los laboratorios: Nivel de capacidad resolutiva del laboratorio Procesamiento local de prueba confirmatoria IFI VIH Nivel de desempeo del laboratorio

Componentes del sistema de la redEl Instituto Nacional de Salud Los Laboratorios regionales Otros laboratorios publicos o privados que integren la red

Fases de la implementacionEvaluar validez de la prueba 1 en el pais 2 Capacitacion de profesionales del INS 3 Seleccion de los laboratorios regionales 4 Coordinaciones y supervision de las DISAS Capacitacion en servicio de profesionales de las DISASOrganizacion del sistema en cada DISA y capacitacion de los equipos locales

5 6 7 8

Monitoreo del sistema en la Red y control de calidad del laboratorio

COBERTURA POR LABORATORIO PROCESADORES DE CD4Adultos nivel nacional Nios nivel nacional Adultos Lima/Callao Nios Lima/Callao

LABORATORIO DE LA RED

Jurisdiccin

TOTAL PVVIH

Cobertura

Macro region del Norte: SEDE LAMBAYEQUE Centro de Investigacin: Loreto Macro region del Sur: SEDE TACNA Laboratori os referencial es regionales de LimaLaboratorio regional Lima Ciudad Laboratorio regional Lima norte

Tumbes,Piura, Lambayeque, Cajamarca, La Libertad, Amazonas, San Martin Loreto

439

35

474

6.7

225 Arequipa,Puno, Cusco, Tacna, Moquegua PVVIH del Hospital Dos de Mayo, INEN y Loayza PVVIH del Hospital Cayetano, Ser.Bernales, Hospital de Huacho Ica,Ayacucho, Junin, Pasco, Apurimac, Huanuco, Ancash, Huancavelica y el resto de Hospitales de Lima(Lima Sur, Este y Callao)

14

239

3.4 3 34.2

186

17

203

2456

2456

1380

1380

19.4

784

55

1329

200

2368

Laboratorio referencial nacional del INS

33.3

TOTAL PVVIH SUJETAS A TERAPIA

1634

121

5165

200

7120

100%

SISTEMA NACIO NAL DE LABORATO RIOS P ARA EL MONITO REO DE PACIENTES CO N VIH S IDA EN TERAP IA ANTIRETROVIRAL: MO DELO MACRO REGIONALDEL P ERUIQUITOS 5%

Laboratorios pblic os proces adores de recuento de CD4: -Lima Ciudad -Lima Norte -Lambayeque (sede norte) -T ac na (s ede sur)LAMBAYEQUE 7% LIMA NORTE 20%

Areas de mayor prevalencia de VIH: Loreto (Iquitos), Lima and Callao.

Mac ro regin Norte: T umbes, Piura, Lambayeque, Cajamarca, La Libertad, Amazonas y San Martin.3 1 1

Ins tituto Nacional de Salud dirige el sistema nacional de monitoreo para la terapia ARV : procesa CD4 para las regiones no descentralizadas y el 100% de las pruebas carga viral de todo el pais.

PERUVIAN NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH 35%

Mac ro region Sur: T acna, Arequipa, Cusc o, Moquegua y Puno.

LIMA CIUDAD 30%TACNA 3%

Regiones que dependen direc tamente del INS (incluye Loreto).

Fortalecimiento del acceso a la terapia antiretroviral en el PeruRESPUESTA INSTITUCIONAL ORGANIZADA: Extender el sistema descentralizado de evaluacion y monitoreo laboratorial para PVVIH en terapia antiretroviral II fase : Implementar metodos alternativos para el recuento de CD4. En 5 regiones del pas (San Martn, Madre de Dios, Ucayali, Loreto y Ayacucho)Instituto Nacional de Salud Red Nacional de Laboratorios en Salud Publica Medicos Sin Fronteras

SISTEMA NACIONAL DE LABORATORIOS PARA EL MONITOREO DE PACIENTES CON VIH S IDA EN TERAPIA ANTIRETROVIRAL: II FASE DE DESCENTRALIZACION IMPLEM ENTACION DE M ETODO ALTERNATIVO PARA CD4 EN CINCO REGIONES11 Lab oratori os pb licos procesa dores d e recue nto de CD4: -Lima Ci uda d -Lima Norte -Lima Sur (pi loto nu evo metodo) -Lambay equ e (sede n orte) -Tacna (sede sur) -Loreto -Ucayal i -Madre de D ios -San Martin -Ayacuah o LAMBAYEQUE 7% LIMA NORTE 20% PERUVIAN NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH 35% Instituto Nacion al de Salud d irig e el sistema nacio nal d e monitor eo para la tera pia ARV : procesa C D4 par a las regio nes no descentra liza das y el 100% d e las pru ebas carga vira l Lima Sur Ucayal i San Martin IQUITOS 5%

Areas de mayor prevalencia de VIH: Loreto (Iquitos), Lima and Callao. Macro regin Norte: T umbes, Piura, Lambayeque, Cajamarca, La Libertad, Amazonas y San Martin.

3 1 1

Madre de D ios

Macro region Sur: T acna, Arequipa, Cusco, Moquegua y Puno. Regiones que dependen directamente del INS.

LIMA CIUDAD 30%Ayacucho

TACNA 3%

Nuevas regiones con prueba CD4 implementada por mtodo alternativo

SISTEMA NACIONAL DE LABORATORIOS PARA EL MONITOREO DE PACIENTES CON VIH SIDA EN TERAPIA ANTIRETROVIRAL: I Y II Y III FASE DE DESCENTRALIZACIONprocesadores de recuento de CD4 11 Laboratorios pblicos San Martin IQUITOS 5%

Areas de mayor prevalencia de VIH: Loreto (Iquitos), Lima and Callao.

-Lima Ciudad -Lima Norte -Lima ESTE metodo) -Lambayeque (sede norte) -Tacna (sede sur) -Loreto -Ucayali -Madre de Dios -San Martin LAMBAYEQUE 7% LIMA NORTE 12% Huancavelica INSTITUTO NACIONAL Lima DE Ciudad SALUD 58% CALLAO Huanuco Pasco Ucayali

Macro regin Norte: Tumbes, Piura, Lambayeque, Cajamarca, La Libertad, Amazonas y San Martin.

3 1 1

Junin Madre de Dios

Macro region Sur: Tacna, Arequipa, Cusco, Moquegua y Puno. Macro Region Centro : Huanuco, Pasco, Junin, Huancavelica Regiones que dependen directamente del INS.

MACRO CENTRO-JUNIN

Instituto Nacional de Salud dirige el sistema nacional de monitoreo para la terapia ARV : procesa CD4 para las regiones no descentralizadas y el 100% de las pruebas carga viral

Ayacuaho

ICA20% Ayacucho TACNA 3%

Nuevas regiones con prueba CD4 implementada por mtodo alternativo

COBERTURA NACIONAL DE ATENCIONES 2004 Diciembre 2008|Establecimiento Ministerio de Salud 47 hospitales MINSA 04 ONG 02 hospitales militares 04 instituciones penitenciarias COPRECOS EsSALUD TOTAL N 47 N PVVS en TARGA 12503 (PVVIH monitorizadas en el INS)

213 3836 16552 *estrategia sanitaria VIH-MINSA

PVVIH ATENDIDAS CON PRUEBAS DE MONITOREO 2004-2009PVVIH EN TARGA : 35 % PVVIH EN PRE TARGA : 65 % SEXO FEMENINO : 34 % SEXO MASCULINO : 66 %

ATENCION DE RED DE MONITOREO DESCENTRALIZADALa red descentralizacin actualmente incluye a 47 hospitales de MINSA, 4 ONG, 2 hospitales de instituciones militares y 4 instituciones penitenciarias . La red descentralizada cuenta con 6 laboratorios procesadores de CD4/CD8/CD3 por citometria de flujo (INS, Lab. Macroregin Norte, (Tumbes, Piura, Lambayeque, La Libertad, Amazonas, Cajamarca) Lab. Macroregin Sur (Tacna, La. Ref. Lima Ciudad, Lab. Referencial Lima Norte. Macroregin centro sede Junin (Pasco, Huancavelica, Huanuco,Junin, Apurimac) 5 laboratorios procesadores de CD4 por mtodo alternativo por Inmunofluorescencia (San Martn, Madre de Dios, Ucayali, Loreto y Ayacucho) Y un laboratorio procesador de carga viral (Lab. De Referencia Nacional INS) Se han realizado 174335 pruebas de monitoreo, 84643 determinaciones para recuento de CD4 y 89692 determinaciones para carga viral

ESTRUCTURA DEL VIH

HIV genes y su funcin

VIH Genes y su FuncinTRES GRUPOS DE GENES ESTRUCTURALES env: Glucoprotenas de transmembrana y superficie pol: transcriptasa reversa,integrasa y proteasa gag: antgeno de grupo, protenas de matriz y cpsideGENES REGULADORES :

tat : regulador de expresin vira rev:regulador expresin mRNA vif:incrementa la infectividad viral vpr:replicacin viral vpu (VIH-1) : liberacin viral Vpx(VIH-2) : infectividad viral nef:regulador inmunolgico

Targets of Antivirals

TIPO VIH VIH-1Grupo M (Grupo principal) A B C D E F G H O

V I HAfrica central

SUBTIPO

Norte y Sur Amrica,Europa,Asia,Oceana Sur y Este de Africa Africa Central Tailandia,Africa Central,Sur-Este Asia Africa central,Brasil,Rumana Africa Central,Taiwan,Rusia Africa Central. Camern, Gabn

Grupo O (Grupo de exclusin)

VIH-2

Africa Occidental,Francia,India

PATHOGENESIS

Progression to AIDS

PRUEBAS DE MONITOREO

RECUENTO DE LINFOCITOS CD4/CD8/CD3 DETERMINACION DE LA CARGA VIRAL

INVESTIGAR PARA PROTEGER LA SALUD

MONITOREO DE LA TERAPIA y TRATAMIENTO-PERUCriterios Inmunolgicos y Virolgicos para inicio de TARGA Criterio Inmunolgico : Implica el recuento de las cepas de glbulos blancos que contienen marcadores de superficie CD4 y que constituyen el principal blanco del VIH Recuento de clulas T CD4 < 200 cel/mm Criterio Virolgico: Determinacin de la carga viral de VIH-1 Carga viral > 55000 copias/ml.

RECUENTO DE LINFOCITOS T CD4

QUE ES LA CITOMETRIA DE FLUJO?

La citometra de flujo es una tecnologa que permite la medicin simultanea de mltiples caractersticas fsicas y qumicas de las clulas en suspensin

Qu informacin entrega un citometro de flujo sobre una celula?1. Su tamao. 2. Su granularidad o complejidad interna. 3.Evaluacin de caractersticas qumicas: - Fluorocromos - Anticuerpos conjugados con fluorocromos FACS: Fluorecence activated cell sorter

Cmo son detectadas estas caractersticas?Usando un sistema ptico-electrnico, se registra como la clula interacta como un rayo lser. Se detecta la capacidad de la clula para: - Desviar la luz incidente (lser) - Emitir fluorescencia Deteccin de molculas especificas (Ac. Conjugados)

Data AnalysisTeido de las muestras con perlas de referencia Celulas T marcadas con Ac CD3

Celulas ayudadoras marcadas con Ac CD4 y CD3.

Sangre Entera Lisada800 1000Neutrfilos

Side Scatter

400

600

Monocitos

200

Linfocitos

00

200

400

600

800 1000

Forward Light Scatter

COMPONENTESSistema de Fluidos Sistema ptico: - Fuente de luz - Separacin espectral Sistema Electrnico: - Control electrnico de luz y detectores - Coleccin y anlisis de pulsos Sistema Informtico: - Anlisis y presentacin de datos

Fluorescencia1. El fluorocromo absorve energia del laser incidente 2.El fluorocromo libera energa absorvida: -Vibrando y emitiendo color - Emitiendo fotones de una longitud de onda mayor (fluorescencia) Fluorocromos utilizados: - Fluoresceina (FITC) - Phycoeritrina (PE) - Alophycocianina (APC)

Coloracin Directa a Dos Colores

Analiza r Incubar Lavar

Anlisis Celular a Tres ColoresCD4 FITC10 24 10 3 10

10 1

CD8 PE

10 2

0

10 10 3 4

10 1

0

CD3 APC

CD8 PE

10 0

10 1

10 2

10 3

10 4

1010 0

0

10 1

CD4 FITC

10 2

10

10 3

10 0

10 1

10 2

10 3

10 4

10 4

10

10 1

10 2

10 3

10 4

CD3 APC

BD FACSCount System

Sumario:El BD Facscount mide rapidamente caractersticas mltiples fluorescentes de una clula o partcula. El sistema de fluidos , opticos , y electrnicos trabajan juntos para proveer informacin acerca de las caractersticas fluorescentes de poblaciones mliples. Los datos del paciente son automticamente analizadas y reportadas en la impresora.

CONTEO DE CD4 ALTERNATIVOLos linfocitos CD4 son marcadores indirectos de la enfermedad por VIH, tan sensibles y especficos que ayudan a la patognesis del padecimiento, de tal manera que sus variaciones se relacionan con el curso del proceso patolgico. Son ms utilizados en el seguimiento clnico de PVVS y su empleo es tanto en el tratamiento con ARV, como en la profilaxis de infecciones oportunistas.

CONTEO ALTERNATIVO DE CD4OPCIONES ACEQUIBLES DISPONIBLES

METODO CD4 T-CELL

AUTOMATIZADA CITOMETRIA DE FLUJO

METODOS MANUALES CONTEO DE CD4 DYNAL

DETERMINACIONES INDICADORAS DE COMPLEJIDAD DEL LAB VIROLOGIA

CARGA VIRAL PARA LA DETERMINACION DE VIH1

NUESTRA EXPERIENCIA-INSTITUTO NACIONAL DE SALUD

1999-2002 AL 2008 CARGA VIRAL PARA VIH INSTITUTO NACIONAL DE SALUD1999 piloto : PCR-AMPLICOR 2002 : Marzo-Nios de Lima y Callao :AMPLICOR 2004: Abril-NoviembreAdultos Lima y Callao: AMPICOR 2004-2005: Nov. Nios y Adultos todo el pais :AMPLICOR 2005-2007: Nios y adultos de todo el pais : Amplicor y Nuclisens 2008 _ 2009 Tiempo real

HIV-1 Carga ViralMonitoreo de la terapia y Tratamiento Detectar cepas resistentes emergentes Diagnstico de HIV Primario

Carga Viral VIH-Definiciones Cantidad de virus circulante que se encuentra en el plasma Cuantificacin de RNA vrico existente en una muestra de plasma Nmero de partculas de VIH libres en el plasma de los pacientes Carga Viral VIH = Nmero de copias de ARN/ml de plasma CARGA VIRAL VIH = VIREMIA

Utilidad clnica de la Carga ViralEstablecer el nivel basal de CV: Prognsis Para determinar cuando iniciar terapia Para determinar la eficacia de drogas Para determinar cuando cambiar terapia En mujeres gestantes: Indicacin del riesgo de transmisin al beb

PCR CuantitativoAplicaciones clnicasPronstico: El nivel de Carga Viral correlaciona directamente con el tiempo de progresin a SIDA y de supervivencia del paciente Control de la terapia: Fluctuaciones significativas de la Carga viral permiten determinar si el tratamiento es uso esta siendo efectivo Desarrollo de nuevas terapias: Usado en los estudios clnicos para evaluar drogas potenciales anti-VIH

PCR Cuantitativo AMPLICOR HIV-1 MONITORCarga Viral del VIH Mide la cantidad del ARN del VIH que esta circulando en la sangre. Se expresa en copias de ARN del VIH por mililitro (copias/mL) Muestra Plasma obtenido con EDTA/ACD (0.2 ml) Rangos de Medicin Estndard : 400 - 750,000 copias /ml Ultrasensible : 50 - 75,000 copias/ml Gen amplificado Gen gag, 155 bp de largo Primers SK 145/SKCC1B

AMPLICOR HIV-1 MONITORPaso 1: Preparacin de reactivosMg Mn2 +

and OR and

Taq DNA Polymerase rTth DNA Polymerase

2 +

dCTP dGTP dUTP dATP

AmpErase Biotinylated Primer

AMPLICOR HIV-1 MONITORPaso 2: Preparacin de la muestraCentrifuge, And Recover Plasma Within 6 Hrs. Of Draw 200 L GuSCN Lysis Buffer With QS RNA 600 L Isopropanol 800 L

Mix, Incubate 10 @ RT

Centrifuge 15, Remove Supernatant

Whole Blood ACD/EDTA

400 L 50L

Specimen Diluent

70% Ethanol 1.0 mL

Resuspend Pellet

Wash Pellet, Centrifuge 5 Remove Supernatant

Micro Amp Tube With Master Mix

AMPLICOR HIV-1 MONITORClculo de resultadosElegir el pocillo HIV con el valor en rango 0.200

HIV Copias/ ml =

(OD * Factor de dilucin) HIV (OD * Factor de Dilucin) QS

X

Copias QS

X

4 0

NASBA - Nuclisens

Kits NucliSens liberacindecidosnucleicos extraccindecidosnucleicos amplificacindecidosnucleicos deteccindelproductoamplificado

Amplificacin (NASBA) NucliSens Isotrmica, 41C (sin termociclador) Alta sensibilidad Alta especificidad Factor de amplificacin: billones de copias en 90 minutos.

Deteccin ECL

pho ton 620 nm

R u++

Magnetic Particle

RN A amplicon

Ele ctrod e

R u++

= sonda de deteccin = sonda de captura

Este futuro es ya nuestro presente ? Tecnologa Real time-VIHTaqman-ROCHE Syber Green Easy Q (Molecular Beacon) BiomeruexSISTEMA m2000 Abbott

CARGA VIRAL EN TIEMPO REALPCR en tiempo real es una modificacin de la tecnologa PCR convencional, comparada con la realizacin de una fotocopiadel cido nucleico. Durante este proceso, se amplifican copias de las molculas de ADN, de forma que se pueda analizar mejor el cido nucleico. Se denomina PCR en tiempo real porque el ADN amplificado puede ser detectado durante el proceso PCR en tiempo real, en lugar de al final del proceso. Esto garantiza una cuantificacin mas adecuada y precisa del cido nucleico. El proceso se desarrolla de forma automtica, sin intervenciones del usuario, lo que proporciona mas productividad y reduce las posibilidades de error humano y los resultados son mas exactos y reproducibles

PCR convencional y PCR en Tiempo Real: Evolucin del procesoPCR Convencion alExtraccin del ADN Amplificacin Deteccin7 horas a 2 das

PCR en Tiempo Real

1 hora a 1.5 horas

Extraccin del ADN Amplificacin y Deteccin

PCR en Tiempo Real Cmo se realiza?Metodologa de baseUsa la fluorometra como base metodolgica. Usa sustancias fluorescentes o sondas marcadas con agentes fluorognicos las cuales se incluyen en la reaccin de PCR, generando productos fluorescentes. Existe correlacin lineal entre los productos generados de la reaccin y la intensidad de la fluorescencia.

DeteccinDeteccin de la fluorescencia se realiza en cada ciclo. Pero se muestra al final de la reaccin de PCR.

Anlisis de la dataq Los resultados de fluorescencia son analizados mediante un software que elimina el background y normaliza los valores . Existen softwares ms complejos que brindan opciones adicionales.

Extensi nPolymerase & dNTPs

Annealing de los Primers

AmplificacincDNA

Primers

Transcripcin ReversaDenaturaci n

y Polymerase Chain ReactionTranscripcin ReversacDNA Virus RNA (VIH)

Amplificacin y Deteccin del ARN del VIHCada muestra es monitoreada en cada pozo por su propia fibra de Exitacin y de Emisin. Las lecturas se realizan en la fase de annealing en cada ciclo de la PCR.

PCR en Tiempo Real

Fibra Optica de Exitacin

Fibra Optica de Emisin

Tubo de Reaccin

Controles de la Carga Viral del VIH Estndar de Cuantificacin Sirve de Control Interno y como Patrn de Referencia de cuantificacin AmpErase Enzima con capacidad de detectar y eliminar los posibles amplicones contaminates. Controles Positivos y Control Negativo Dos controles Positivos (01 Alto y 01 Bajo) ms un Control Negativo

PCR en Tiempo Real

PCR en tiempo real permite identificar los productos en la fase exponencial Es sensible y cuantitativa Es un proceso homogneo, que no requiere proceso de deteccin, reduciendo el tiempo total de la reaccin de PCR Amplio rango dinmico de deteccin. Permite la trazabilidad de las muestras y reactivos. Versatilidad de aplicaciones en todas las reas de la medicina clnica y la industria Nos dirigimos hacia la automatizacin total.

PCR en Tiempo Real Resumen

PCR en Tiempo Real ImplementacinCOBAS AMPLIPREP COBAS TAQMAN 48

Amplificacin, deteccin y anlisis de resultados automatizado

Automatizacin total de la preparacin

Interpretando los resultados de la Carga Viral ( segn gua de NIH- USA ) El doctor y el paciente debe considerar cambio de terapia si : Carga viral falla en caer por lo menos 3 a 5 veces, en 4 a 6 meses o < 40 copias/ml en 6 a 8 meses Carga viral menor de 40 copias niveles no detectables x c.v tiempo real Carga viral cae niveles indetectables y luego se eleva sugiriendo resistencia Conteo de CD4 falla en elevarse Si hay deterioro clnico

El propsito del tratamiento es reducir la carga viral a niveles indetectables tanto como sea posible

MONITOREO DE LA TERAPIA y TRATAMIENTO-PERU* PACIENTES NAIVE: 55000 COPIAS/mL * PACIENTES CON INFECCION HIV ESTABLECIDA: Infeccin asintomtica Enfermedad sintomtica : todosGUIDELINES FOR THE USE OF ANTIRETROVIRAL AGENTS IN HIV-1-INFECTED ADULTS AND ADOLESCENTS; 2003 NIH

INFECCION ASINTOMTICA:

MONITOREO DE LA TERAPIA Y TRATAMIENTOTRATAMIENTO

< 200 CD4+ T Cells/mm3

201- 350 CD4+ T Cells/mm3 : RIESGO DE PROGRESION 38.5% 350 CD4+ T Cells/mm3 : RIESGO DE PROGRESION 14.3 % CARGA VIRAL : < 20000 COPIAS/mL : RIESGO DE PROGRESION 4.1% >20000 55000 COPIAS/mL : RIESGO DE PROGRESION 36.4% >55000 : RIESGO DE PROGRESION 64.4%GUIDELINES FOR THE USE OF ANTIRETROVIRAL AGENTS IN HIV-1-INFECTED ADULTS AND ADOLESCENTS; 2003 NIH A. Martinez-Lab Virologa-CEMIC

Interpretando los resultados de la Carga Viral ( segn gua de NIH- USA ) El doctor y el paciente debe considerar cambio de terapia si : Carga viral falla en caer por lo menos 5 veces Carga viral no cae bajo los niveles no detectables (< 400 copias /ml) con metodo PCR Amplicor, en 4 a 6 meses o < 40 copias/ml con metodologia de Tiempo Real en 6 a 8 meses Carga viral menor de 80 copias niveles no detectables x Nuclisens Carga viral cae niveles indetectables y luego se eleva sugiriendo resistencia Conteo de CD4 falla en elevarse Si hay deterioro clnico El propsito del tratamiento es reducir la carga viral a niveles indetectables tanto como sea posible

Consideraciones especiales en Diagnstico Peditrico:Conteo de linfocitos de CD4 en nios saludables son mucho mayor que en adultos El conteo normal de CD4 disminuye lentamente a niveles de adultos a la edad de 6 aos Porcentaje de CD4 puede ser mejor marcador de progresin de la enfermedad Uso de conteo de CD4 para decisin de terapia antiretroviral (ARV)

Consideraciones especiales en Diagnstico Peditrico: DiagnsticoInfeccin Perinatal = infeccin primaria Diagnstico temprano de infantes infectados da la oportunidad de empezar la terapia durante la infeccin primaria /temprana Se debe ofrecer las pruebas de VIH para Identificacin temprana de infantes mediante las mujeres embarazadas

Interpretando los resultados de la Carga ViralPuede ser dificil de entender La tendencia de niveles de HIV RNA es lo ms importante

Tamao y duracin de la disminucin Indetectable no significa que el virus es eliminado-el nivel del virus es menor que la sensibilidad del test Ejm. CV 10,000 copias/ml = 104 copias/ml = 4 logs Un cambio de 2-veces es 0.3 log

Cambios son en trminos logartmicos o logs

RECOMENDACIONES Ensayos no deben realizarse despus de un mes de vacunados o de un proceso infeccioso agudo (vacunas contra la gripe, hepatitis provocan aumento de carga viral)

Evaluacin de la correlacin de Carga viral para VIH-1 mediante las tcnicas de PCR Amplicor HIV-1 Monitor V. 1.5 y carga viral por Tiempo Real COBAS TaqMan HIV-1 en el Laboratorio de Referencia Nacional de VIH/SIDA del Instituto Nacional de Salud-Per Ada Valverde R1. ,Fany Crdenas B1.,Soledad Romero R1.,John Caldern E1.,Gabriela Salinas C1., Flor Urcia A1. 1Laboratorio de Referencia Nacional de VIH/SIDA-Instituto Nacional de Salud (Per) RESUMEN Antecedentes: Determinar el nivel de correlacin de la carga viral para VIH-1 mediante las tcnicas Amplicor HIV-1 Monitor Versin Estndar y carga viral Tiempo Real COBAS Ampliprep/COBAS TaqMan HIV-1 Mtodo: Se seleccionaron 152 muestras de plasma de personas viviendo con VIH/SIDA pertenecientes al Sistema de Monitoreo TARGA del Instituto Nacional de Salud, con C.V en el rango de 400 a 750,000 copias/ml., las muestras fueron procesadas por el Mtodo Amplicor HIV-1, la tcnica utilizada es RT-PCR, que realiza la extraccin de ARN manual, la amplificacin se realiz en un termociclador modelo 9700, deteccin colorimtrica a longitud de onda de 450 nm., los resultados obtenidos con este mtodo se tomaron como valores referenciales comparndolos con los resultados del Mtodo COBAS Ampliprep/TaqMan HIV-1, tecnologa automatizada, utiliza PCR en Tiempo Real. Los resultados obtenidos fueron comparados por correlacin Pearson, regresin lineal para dos variables cuantitativas. Resultados: Las 152 muestras procesadas por las tcnicas Amplicor y Tiempo Real muestran medias de log 4.31 y log 4.22, una media valor mximo para Amplicor de 6.03 C.V(2.67) y Tiempo Real con log. 6.7 C.V(2.22), regresin lineal R=0.89 con una confianza del 95%, coeficiente de correlacin Pearson = 0.87 con valor significativo del 95% y los valores del coeficiente de correlacin interclase (CCI) calificada como bueno. Conclusiones: Las dos tcnicas para cuantificacin de carga viral muestran un alto nivel de correlacin, la determinacin de la C.V por Tiempo Real permite contar con una tecnologa automatizada para procesar mayor numero de muestra en menor tiempo que la plataforma manual. Palabras clave: Carga viral VIH; Tiempo Real PCR; correlacin; TARGA

Relationship between baseline viral load and median survival time. The median time for the patients in each of these viral load categories was more than 10 years, 7.7 years, 5.3 years and 3.5 years

GARANTIA DE CALIDAD PARA VIH

Control de calidad de CD4

La citometra de flujo es la prueba que se implemento en la fase inicial de la organizacin del sistema por su elevada precisin y por ser el mtodo patrn en el que se basar el control de calidad. Dado que no pueden adquirirse equipos para cada una de las regiones, estos fueron instalados en los laboratorios que seran designados como procesadores de CD4, que recibiran muestras de la jurisdiccin cercana. El mtodo Dynabeads es implementado en una II fase en aquellos lugares en donde la demanda de pacientes que reciben tratamiento es menor y exista poca accesibilidad geogrfica hacia el laboratorio procesador de CD4.

GARANTIA DE CALIDAD MARCO CONCEPTUAL Es el conjunto de medidas adoptadas por el personal de laboratorio para asegurar la calidad de trabajo que permita obtener resultados confiables ,exactos y oportunos a traves de los cuales se contribuya a mejorar la calidad de la atencin de los pacientes. El control de calidad se define como el estudio de aquellas causas de variacin de las cuales es responsable el laboratorio y de los procedimientos y normas utilizadas para reconocerlos y minimizarlos.

CONTROL DE CALIDAD CD4CAPACITACION

CONTROL DE CALIDAD

SUPERVISION DE SUPERVISION DE LABORATORIOS LABORATORIOS CONTROL DE CALIDAD interno/externo

ASEGURAMIENTO DE LA CALIDADEl propsito del AC es mantener la calidad global de los resultados de recuentos CD4 de los pacientes Toma en cuenta todos los factores que afectan los resultados de la prueba desde el momento en que se ordena la prueba hasta el momento en el que se reporta el resultadoPre-analtico Analtico

Post-analtico

Toma de la muestra Reporte de resultados Registros para paciente Transporte muestra Precisin del Resultado y CC Calidad de la muestra Errores administrativos Errores de anlisis ndice de repeticin de pruebas

RESULTADOS DE CONTROL DE CALIDAD EXTERNO PARA RECUENTO DE LINFOCITOS CD4/CD8/CD3 CON MUESTRA COMERCIAL-2007REFERENCIA RANGO MULTICHECK CONTROL INS LIMA NORTE LIMA CIUDAD JUNIN LAMBAYEQUE TACNA CD4 382,2-679,5 CD8 160,8-302,0 CD3 589,3-961,6 CD4/CD8 2,25-2,38 CD4/CD3 0,65-0,71 CD8/CD3 0,27-0,31

531 553 538 568 577 547 571

231 243 241 241 242 240 237

776 845 819 834 858 834 826

2,30 2,28 2,23 2,35 2,39 2,29 2,41

0,68 0,65 0,66 0,68 0,67 0,66 0,69

0,30 0,29 0,29 0,29 0,28 0,29 0,29

* REPRODUCIBILIDAD

MUESTRA CC MULTICHECK LOTE BM097N

GRAFICO DE VALORES CD4/CD8/CD3 2007

1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 CD4 CD8 CD3RA NGO INFERIOR RA NGO SUPERIOR MULTICHECK CONTROL INS LIMA NORTE LIMA CIUDA D JUNIN LA MBA Y EQUE TA CNA

MUESTRA CC MULTICHECK LOTE BM097N

REPORTE DE CONTEO ABSOLUTO

20 0 0 ,0

10 0 0 ,0IN S L AC D D IM IU A L AN R IM O TE

0 0 ,0 C4 D -1 0 0 0 ,0 C8 D C3 D

L MA QE A B YE U TA N CA JU IN N

-2 0 0 0 ,0

RESULTADOS DE CONTROL DE CALIDAD EXTERNO PARA RECUENTO DE LINFOCITOS CD4 CON MUESTRA COMERCIAL-2007-2009

200.0

100.0 LAMBAYEQUE residual TACNA residual 0.0 LIMA NORTE residual LIMA CIUDAD residual J UNIN residual -100.0 INS residual

-200.0 Dic- Ene- Feb- Mar- Abr- May- J un- J ul- Ago- Sep07 08 08 08 08 08 08 08 08 08

RESULTADOS DE CONTROL DE CALIDAD EXTERNO PARA RECUENTO DE LINFOCITOS CD4 CON MUESTRA COMERCIAL-2007-2009

200.0

100.0 LAMBAYEQUE residual TACNA residual 0.0 LIMA NORTE residual LIMA CIUDAD residual J UNIN residual -100.0 INS residual

-200.0 Dic- Ene- Feb- Mar- Abr- May- J un- J ul- Ago- Sep07 08 08 08 08 08 08 08 08 08

RESULTADOS DE CONTROL DE CALIDAD EXTERNO PARA RECUENTO DE LINFOCITOS CD8 CON MUESTRA COMERCIAL-2007-200920 0 .0 10 0 .0 0 .0 -1 0 0 .0 -2 0 0 .0 LAM BAYEQ E U r sid a e ul T ACN r sid a A e ul LIM N RT r sid a A O E e ul LIM CIU AD A D r sid a e ul JU IN r sid a N e ul May-08 Ene-08 J un-08 Ago-08 Sep-08 Feb-08 Mar-08 Abr-08 Dic-07 J ul-08 IN r sid a S e ul

RESULTADOS DE CONTROL DE CALIDAD EXTERNO PARA RECUENTO DE LINFOCITOS CD3 CON MUESTRA COMERCIAL-2007-200920 0 .0 10 0 .0 0 .0 -1 0 0 .0 -2 0 0 .0D ic E -07 ne F 08 eb M 08 ar A 08 br M -08 ay J u 08 n0 Ju 8 l A -08 go S -08 ep -0 8

LAM BAYEQ E U r sid a e ul T ACN r sid a A e ul LIM N RT A O E r sid a e ul LIM CIU AD A D r sid a e ul JU IN r sid a N e ul IN r sid a S e ul

EVALUACIN DE LA CALIDAD Y NORMALIZACIN INMULOGICA DE MEDIDAS NECESARIAS PARA VIH / SIDA ( QASI)200 100 0 -100 200 -200Ju lS e 07 p0 No 7 vE n 07 e0 M 8 ar M 08 ay -0 8 Ju l-0 Se 8 p0 No 8 vE 08 ne -0 9

CD8 CQ:26,28,30,32,34,3 6 CD8 CQ:27,29,31,33,35,3 7

100 0 -100 -200Ju lSe 07 p0 No 7 vEn 07 e0 M 8 ar M 08 ay -0 8 Ju l-0 Se 8 p0 No 8 vE 08 ne -0 9

CD4 CQ:26,28,30,32,34,3 6 CD4 CQ:27,29,31,33,35,3 7

200 100 0 -100 -200Ju lS e 07 p0 No 7 vE n 07 e0 M 8 ar M 08 ay -0 8 Ju l-0 Se 8 p0 No 8 vE 08 ne -0 9

CD8 CQ:26,28,30,32,34,3 6 CD8 CQ:27,29,31,33,35,3 7

GRACIAS

carlosjavieroblitasramos@hotmail.com