Presentación de resultadosLaboratorio de Enzimas

Laboratorio de BiorreactoresIEB448

Integrantes:Luis Herrera

Eduardo OrtegaLeonardo Serrano

Nicolás Trujillo

Profesores:Zaida Cabrera

Álvaro Díaz

Introducción

•Caracterización de un preparado enzimático

•Actividad y estabilidad enzimática

•Reactor enzimático por lotes

•Comportamiento cinético de la enzima

•Elaboración de un manjar a partir de leche sin procesar

Materiales y métodos

Determinación de la actividad enzimática* Adicionamos 4 mL de una solución de lactosa en un tubo de ensayo, incubamos en un baño con recirculación a 45 °C hasta que el sustrato alcance dicha temperatura. * Adicionamos 0,1 mL de la muestra enzimática, y dejamos reaccionar por 5 minutos mas, cumplido este tiempo tomamos la solución y la colocamos en un vaso precipitado con agua hirviendo para detener la reacción.* Realizamos un blanco repitiendo lo anterior pero sin enzima. Determinamos la concentración de glucosa mediante el método del glucostat.* Repetimos la actividad pero a 55 °C.Reactor enzimático por lotes* Para la puesta en marcha del reactor, verificamos las mangueras y sellos del equipo; evaluamos la potencia de agitación, instalamos y calibramos el electrodo de pH (en nuestro caso fue fuera del equipo no in situ) finalmente ponemos en marcha el sistema de calefacción, que tenia como liquido agua en uno de los baños y aceite en el otro. Para esta actividad utilizaremos termómetros de alcohol, con el cual haremos mediciones periódicas.

Determinación de la concentración de glucosa* Si utilizamos lactosa, disponemos en un tubo eppendorf 0,1 mL de la muestra de reacción enzimática. Adicionamos 1 mL de reactivo y dejamos incubar a temperatura ambiente, luego medimos la absorbancia en un espectrofotómetro a 505 nm. Leemos contra un blanco e interceptamos con la curva de calibrado.* Si utilizamos leche como sustrato, colocamos 0,1 mL en un tubo eppendorf de la muestra de reacción enzimática (inactivada), adicionamos sulfato de zinc e hidróxido de bario, 0,5 mL respectivamente. Agitamos en un vórtex, luego llevamos a la centrifuga a 5000 rpm por 5 minutos. Tomamos 0,1 mL del sobrenadante y lo colocamos en un tubo eppendorf y colocamos 1 mL de reactivo para determinar la glucosa. Incubamos por 30 minutos a temperatura ambiente y luego leemos la absorbancia en un espectrofotómetro a 505 nm, leemos contra un blanco e interceptamos con la curva de calibrado. Hidrolisis enzimáticaPara esta operación, seleccionaremos leche semi-descremada, mediremos su pH, tomaremos una muestra en un tubo de ensayo y determinaremos la concentración de lactosa y glucosa inicial. Pondremos en marcha el sistema de calentamiento del reactor (baño con agua o aceite para calentar según corresponda), esperamos que se alcance la temperatura deseada y adicionamos la enzima; mantenemos la leche bajo agitación suave y temperatura deseada, hasta alcanzar el grado de hidrolisis prestablecido. Tomamos muestras en tubos de ensayo cada 15 minutos y le realizamos las pruebas prestablecidas.

Elaboración de manjarPara la fabricación de manjar, a partir de leche y leche hidrolizada, calentaremos en una olla, con agitación manual en base a una cuchara de palo, a unos 80 °C, la leche. Adicionaremos sacarosa de acuerdo a la dosificación sugerida. Mantenemos bajo agitación hasta alcanzar unos 65-75% de sólidos, el que se determina mediante un refractómetro y entrega un valor en ° Brix, que en nuestro caso será alcanzar unos 70% app. Todo esto sobre un anafe que nos proporcionara la temperatura deseada.

Práctico 1: Caracterización del preparado enzimático

Ejemplo de cálculo de la actividad enzimática

Actividad enzimática de Biolactasa-NTL en lactosa a distintas temperaturas

Lactosa (100 g/L) Leche Semidescremada

Seguimiento de actividad enzimática a distintas condiciones de temperatura

La estabilidad de una enzima puede definirse como la capacidad de retener su actividad en una condición ambiental determinada

Estabilidad de Biolactasa-NTL a 55ºC y 45ºC

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 1200

102030405060708090

100110120130140150160170180

45ºC55ºC

Tiempo [min]

Act

ivid

ad

Rela

tiva [

%]

Práctico 2: Hidrólisis de lactosa en un reactor enzimático por lotes

Puesta en marcha del reactor

Se verificaron las conexiones de las mangueras y el estado de los

sellos del reactor.

Se evaluó la potencia de agitación y se estableció en 200RPM.

Se verificó el electrodo de pH.

Se puso en marcha el sistema de calefacción, el cual se reguló a

55ºC.

Se verificó cada cierto tiempo que la temperatura efectivamente

fuera constante.

Hidrólisis enzimática

Antes de comenzar la experiencia, se calculó la cantidad de enzima a adicionar, para alcanzar un grado de conversión del 99% en dos horas de operación. Se procedió a su cálculo reemplazando los datos en la ecuación siguiente:

Donde:

Reemplazando:

Despejando:

Transformando a [UI]:

Considerando que la actividad a 55ºC es 5978[UI/mL], entonces el volumen de enzima a agregar es:

0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 1500

20

40

60

80

100

120

Tiempo [min]

Gra

do d

e C

on

vers

ión

[%

]Grado de conversión de lactosa en la hidrólisis enzimática de

leche semidescremada a 55ºC

El grado de conversión fue aumentando a medida que el tiempo transcurrió, confirmando los cálculos efectuados anteriormente, donde se estimó que con un 1[mL] de enzima, se podría hidrolizar toda la lactosa en las 2 horas de tiempo de reacción, usando la ecuación de un reactor enzimático por lotes.

Tiempo [h]Azúcares

reductores [g/L]

Desviación Estándar

0 44,125 3,1471 66,760 3,1542 59,525 4,462

Tabla de concentración de azúcares reductores versus el tiempo

Se puede advertir que a tiempo 0[h] la concentración medida de azúcares reductores es similar a la declarada en el envase de la leche semidescremada (47[g/L] de hidratos de carbono).

También podemos advertir que a tiempo 1[h] la concentración de estos azúcares aumentó, debido a que por cada mol de lactosa consumido, estamos produciendo dos moles de azúcares reductores nuevos (glucosa y galactosa).

Práctico 3: Elaboración de Manjar

Elaboración de manjar a partir de leche deslactosada en un 35%.

La Hidrolisis de lactosa se llevo a cabo en un reactor enzimático de 5 Lt con 1 mL de preparado enzimático Biolactasa NTL a 45 ºC por un tiempo de reacción de 60 minutos, tiempo en el cual se debió haber llegado a un 35% de conversión de lactosa a glucosa. Tabla 3.1. Datos obtenidos a partir de elaboración de manjar con leche deslactosada.

Tiempo [min]

Concentración de Glucosa [g/l]

Grado de Conversión

[%]0 0,011 0,047

0 0,007 0,030

30 1,909 8,220

30 1,824 7,854

60 3,206 13,805

60 3,305 14,231

60 3,373 14,524

60 3,118 13,426

Tiempo [min]

Grados Brix

0 3230 4060 4290 66

Elaboración de manjar a partir de leche sin procesar.

Para la elaboración de manjar se procedió a concentrar 400 mL de leche sin procesar a 80º C adicionándole 80 g de azúcar. Llevando la reacción hasta una concentración de 70% en sólidos.Tabla 3.3. datos de °Brix en los tiempos determinados a partir de leche entera.

Tiempo [min]

Grados Brix

0 2630 3060 3290 86

Datos Referenciales respecto a la experiencia de elaboración de manjar

Humedad: máximo TREINTA POR CIENTO (30%) peso sobre peso (p/p). (Recomendación Norma FIL 15B: 1988). los sesenta Y NUEVE GRADOS BRIX (69° Brix) y SETENTA Y CUATRO GRADOS BRIX (74° Brix) (la muestra debe estar a la misma temperatura a la que se efectúa ladeterminación).Según las diferentes fabricaciones, el mechero se apaga cuando el dulce tiene un 67-68% de sólidos, (67 - 68° Brix, escala utilizada por el refractómetro), estimando que con la evaporación producida mientras el dulce se descarga y enfría, se reducirá la humedad hasta el valor final deseado (30 %). Instituto Nacional de Tecnología IndustrialSede Central: Avenida General Paz 5445 B1650KNA San Martín Buenos Aires, Argentina

El refractómetro es un pequeño instrumento que permite estimar la cantidad de sólidos presentes en un fluido, y que determina el punto final del proceso de calentamiento. Se lo usa también con el mismo fin para la elaboración de miel y mermeladas. En general la unidad de medición son los grados Brix. Un dulce de leche ya terminado y listo para consumir debería tener una concentración de sólidos correspondientes a 70º Brix.

CONCLUSIONES Del primer práctico se puede concluir que la actividad enzimática a 55º da un valor mayor que la obtenida a los 45ºC tanto si es incubada en leche o lactosa. Por otra parte, las graficas de estabilidad no se obtienen datos muy confiables a 45ºC lo cual indica error experimental, ya que no se repitió el experimento, para obtener conclusiones más acertadas del fenómeno, y en 55ºC la enzima mantuvo su valor de actividad residual lo cual es esperable contrastado con el catálogo adjunto del preparado enzimático. Se puede concluir que efectivamente se puede predecir teóricamente a partir de los datos de actividad inicial y las ecuaciones que rigen el sistema del reactor por lotes enzimático, el volumen de enzima a utilizar (1mL) y el grado de conversión a lograr. Se pudo comprobar que el grado de conversión de lactosa aumenta a medida que transcurre el tiempo de reacción. También se pudo comprobar que la cantidad de azúcares reductores en la leche semidescremada es similar al declarado en la etiqueta del envase. La cantidad de azúcares reductores aumenta a medida que el tiempo de reacción transcurre.

Claramente podemos apreciar según los resultados obtenidos que la leche deslactosada (sin el “azúcar” natural de la leche, lactosa) presentó un manjar de mejores características organolépticas que el de leche entera, o sea una mayor cremosidad, menor presencia de cristales, un tono café un poco mas tenue que el de la leche entera. A pesar que el tiempo que se empleo para ambas experiencias fue el mismo, la concentración final de sólidos marco una gran diferencia, llegando a un 66% para la leche deslactosada y un 86% para la leche entera, con una diferencia de 20 °Brix entre ellas, esto quiere decir que la concentración de sacarosa en el medio tenia una diferencia sustancial que finalmente es la que determina las características tanto de una como la otra.