Existen 2 técnicas de observación microscópica fundamentales:

*Las basadas en métodos de montaje húmedo y gota pendiente

* Las que se basan en la observación de extensiones fijadas y teñidas

I. EXAMEN DE MICROORGANISMOS VIVOS. Es la llamada observación vital Se utiliza principalmente en la investigación

de los caracteres de movilidad microbiana, en estudios de morfología ( especialmente bacterias en espiral cuya morfología se altera al secarse y teñirse)….

Los métodos que se emplean para este tipo de examen son:

-Preparaciones húmedas -Método de la gota pendiente -Examen en fresco con nigrosina Un inconveniente es su escasa conservación.

La observación suele hacerse con el objetivo de 40 aumentos. No debe utilizarse el objetivo

de inmersión, pues al desplazar la preparación el cubreobjetos permanece adherido al objetivo y

esto crea turbulencias en el líquido de la

preparación. A. PREPARACIONES HÚMEDAS

Se obtienen colocando una gota de líquido que contiene los mo sobre un portaobjetos (limpio y seco), sobre el que se coloca un cubreobjetos

Si se parte de un producto sólido, se deposita una gota de agua estéril o suero salino estéril sobre el portaobjetos, para posteriormente con ayuda del asa (previamente flameada y enfriada) realizar una suspensión del producto en estudio

Se puede sellar con parafina o una sustancia similar, para disminuir la evaporación

B. PREPARACIONES DE GOTA PENDIENTE

Se utilizan portaobjetos excavados

1. Se coloca una gota de suspensión en el centro de un cubreobjetos (limpio y seco) con un asa previamente esterilizada

2. Se coloca el porta sobre el cubre, de forma que la gota de suspensión coincida con el centro de la excavación y, se presiona ligeramente para que el cubre se adhiera

3. Se da la vuelta a todo el conjunto, de forma rápida pero sin violencia, para que la gota quede colgando del cubre sin llegar a tocar el fondo de la excavación

C. EXAMEN EN FRESCO CON NIGROSINA Se obtienen imágenes en las que destacan los mo

incoloros sobre un fondo negro-parduzco

Se utiliza principalmente para el estudio de detalles estructurales como cápsulas y flagelos

En el centro del porta se coloca, con el asa, 1 o 2 gotas de nigrosina

A continuación con el asa, se toman unas gotas de material en estudio y se mezclan lo más homogéneamente posible

Se seca al aire

Se observa con el objetivo de inmersión

II. PREPARACIONES FIJADAS Y COLOREADAS

Son las más frecuentes en microbiología

II.1. FACTORES QUE INFLUYEN EN LA TINCIÓN

*Pureza del colorante

* Concentración del colorante

* pH de la solución colorante. La fijación del colorante sobre la célula se efectúa por mecanismos FQ (formación de enlaces, interacciones de tipo electrostático…)

*Tª, en general, Tª superiores a la ambiental disminuyen el tiempo de tinción

*Sustancias adicionales, en ocasiones, la tinción se apoya en otras sustancias como son:

-mordientes

-soluciones ácidas o básicas

- decolorantes

* Tiempo, suele oscilar entre 1-10´

II.2. COLORANTES

Son los reactivos necesarios para la coloración de las tinciones, que facilitan la observación de las mismas al microscopio

Generalmente, actúan mediante reacciones de intercambio iónico entre el colorante y los elementos celulares

Según su procedencia pueden clasificarse:

*Colorantes naturales: son los que se extraen de animales o plantas. Por ej, carmín, hematoxilina…

*Colorantes artificiales: se obtienen de forma sintética y a su vez se pueden clasificar:

Básicos: son los colorantes nucleares. Ej: fucsina básica, cristal violeta, verde malaquita, violeta de genciana, azul de metileno…

ClAM Cl- + AM+

Si el color reside en el ión positivo del colorante, se dice, que es un colorante básico

Ácidos: son colorantes citoplasmáticos. Ej ác. Pícrico. El color reside en el ión cargado negativamente

Neutros: asocian un colorante ácido con uno básico. Los más conocidos son los eosinatos de tiaminas, que suelen designarse con el nombre del autor que inventó la mezcla: May-Gründwald, Wright, Giemsa…

Indiferentes: suelen ser insolubles en agua y solubles en alcohol. Ej. Sudan III…..

En bacteriología se emplean preferentemente los colorantes artificiales básicos , debido a la gran basofilia del citoplasma bacteriano, rico en ARN

Los colorantes ácidos se utilizan preferentemente como colorantes de contraste, los neutros y los indiferentes para algunas coloraciones particulares

Los pasos a seguir para la realización de una preparación fijada y coloreada son generalmente:

CONFECCIÓN DEL FROTIS

SECADO

FIJACIÓN

COLORACIÓN

Se pretende obtener una película lo más homogénea posible de la muestra sobre el portaobjetos

Puede prepararse a partir de productos líquidos o sólidos

A.- PRODUCTO LÍQUIDO:

Se coloca sobre el porta de vidrio limpio y seco, una gota del material a estudiar y se extiende con ayuda de un asa de platino

B.- CULTIVOS EN MEDIO SÓLIDO:

Se pasa sobre la superficie del portaobj. El hisopo con el que se ha tomado la muestra. También puede prepararse una suspensión del material en una gota de agua o SS colocada previamente en el porta, extendiéndola con ayuda del asa de platino en una superficie aproximada de 1 cm2

Tiene como finalidad eliminar el agua de la extensión para proceder a la fijación.

Se dejará secar el frotis a Tª ambiente. Para ello se puede agitar varias veces el porta al aire hasta comprobar, por el cambio de aspecto de la preparación, que ésta se ha secado

Consigue dejar la extensión adherida al portaobj. Para que resista las operaciones siguientes.

Tiene por objeto la inmovilización de las estructuras del material a estudiar en un estado lo más próximo posible al estado vivo.

Consiste en una muerte rápida de los mo, debida a la coagulación de las albúminas protoplasmáticas.

Las formas más habituales de fijación son:

Por calor: se pasará varias veces, la parte inferior de la preparación por la llama azul del mechero Bunsen (sujetando el porta con unas pinzas), hasta que se note caliente al colocarlo en el dorso de la mano, pero sin que queme

Alcohol en frío, se cubre la preparación con etanol o metanol. Se deja actuar durante varios minutos. Se escurre y se deja secar.

Exposición a vapores de un compuesto fijador.

Es el proceso de tinción de los mo.

Para teñirlos, existe un gran nº de productos químicos con propiedades colorantes

Su elección está condicionada al tipo de tinción a realizar

Todos los tiempos recomendados en las tinciones son orientativos, debiéndose ensayar el tiempo para cada lote y cada técnica en particular

Eliminación del exceso de colorante.

Se utilizará el frasco lavador o la goma del grifo, teniendo la precaución de no dirigir el chorro directamente al frotis

Se secará la preparación al aire o presionando entre 2 papeles de filtro, pero

nunca se debe frotar el porta.

Se utiliza principalmente el procedimiento basado en la decantación de los líquidos empleados

Una forma cómoda, simple y limpia de trabajo es la utilización de cristalizadores sobre los que se dispone un puente formado por 2 varillas de cristal, unidas por sus extremos, con un separación entre ellas de varios cm.

Sobre el puente se colocan las preparaciones secas y fijadas, y se realiza la técnica de tinción según el protocolo a seguir.

Para procesar un nº elevado: automatizarse o cubetas de tinción ( cambiar frec. Líq baños)

Las prep. Fijadas y coloreadas se clasifican en:

Tinciones simples: Son las que utilizan un solo colorante y permiten conocer la morfología y tipo de agrupación bacteriana. Ej azul de metileno

Tinciones diferenciales: utilizan más de un colorante y sirven para poner de manifiesto las características de afinidad por ciertos colorantes de los mo. Ej. Gram, AAR…

Tinciones estructurales: utilizan más de un colorante y sirven para poner de manifiesto estructuras bacterianas. Ej. Flagelos, esporas, cápsulas….